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本发明涉及至少包含gp41衍生的抗原或其类似物的病毒体样小泡，所述的gp41衍生的抗原位于所述小泡的外表面和/或包囊在其内部并且为简便的构型以便赋予所述的病毒体样小泡诱导对人免疫缺陷病毒(HIV)的gp41蛋白的免疫应答的能力。

1.  至少包含gp41衍生的抗原或其类似物的病毒体样小泡，所述gp41衍生的抗原位于所述小泡的外表面和/或包囊在其内部并且为简便的构型以便赋予所述的病毒体样小泡诱导对人免疫缺陷病毒(HIV)的gp41蛋白的免疫应答的能力。

2.  上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的gp41衍生的抗原对于细胞膜不具有融合性。

3.  权利要求1或2所述的病毒体样小泡，其中所述的位于外表面的所述gp41衍生的抗原：
-与所述的病毒体样小泡的脂质共价连接；或
-通过不同于野生型gp41蛋白的野生型肽跨膜结构域的肽跨膜结构域嵌入所述病毒体样小泡的脂双层。

4.  上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的共价连接的gp41衍生的抗原包含至少一个N-或C-末端定位的交联残基。

5.  上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的交联残基选自Cys或Lys。

6.  权利要求4或5所述的病毒体样小泡，其中所述的共价连接的gp41衍生的抗原进一步包含至少一个在所述的N-或C-末端定位的交联残基与相应N-或C-末端gp41衍生的抗原端之间的间隔残基。

7.  上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的间隔残基选自Gly，Ala，Ser，Asp，Lys，Gln，His，Ile和Leu残基。

8.  权利要求3-7中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的脂质选自两亲PEG衍生物，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，胆固醇或其混合物。

9.  上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的共价连接的gp41衍生的抗原通过双官能琥珀酸酯连接基，特别是γ-马来酰亚氨基丁酸N-羟基琥珀酸亚胺酯或N-γ-马来酰亚氨基丁酰氧基-琥珀酰亚胺-酯与所述的脂质连接。

10.  权利要求3-9中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的gp41衍生的抗原不具有其肽跨膜结构域。

11.  上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的位于外表面的gp41衍生的抗原由其C-末端定位。

12.  上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的gp41衍生的抗原为单，二，三或四聚体及其混合物的形式。

13.  上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的抗原gp-41衍生的抗原选自HIV A，B，C或D型进化枝。

14.  上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的gp41衍生的抗原为由SEQ ID NO 1所述序列的全部或部分表示的氨基酸序列的肽或其类似物。

15.  权利要求1-13中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的gp41衍生的抗原为由选自SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3的序列的全部或部分表示的氨基酸序列的肽或其类似物。

16.  上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的融合小泡包括包含脂质的脂双层，所述的脂质选自阳离子脂质，合成脂质，糖脂类，磷脂类，磷酸甘油脂类，鞘糖脂类类，鞘脂类，胆固醇及其衍生物。

17.  上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中它还包含至少一种增强和/或介导免疫应答的佐剂，所述的免疫应答选自先天免疫应答或适应性免疫应答。

18.  上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的适应性免疫应答选自Th₁和/或Th₂免疫应答。

19.  权利要求17或18所述的病毒体样小泡，其中所述的佐剂选自：铝盐；磷酸铝凝胶；分枝杆菌，诸如BCG，母牛分枝杆菌(M.Vaccae)或小棒杆菌(corynebacterium parvum)；肽类；匙孔血蓝蛋白；胞壁酰二肽和三肽衍生物；单磷酰脂质A；白细胞介素-2(IL-2)；IL-12；GM-CSF；来自趋化因子家族的配体，诸如RANTES(活化表达和分泌的正常T细胞时调节的)；Gram⁺菌的脂蛋白；酵母细胞壁成分双链RNA；Gram^-菌的脂多糖；鞭毛蛋白；富含U的单链病毒RNA；含CpG的DNA；细胞因子信号传递小干扰RNA的阻抑物(SOCS siRNA)，蜂毒素衍生的肽类，panDR表位(PADRE)及其混合物。

20.  权利要求17-19中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的佐剂包囊在所述的小泡内部和/或掺入所述小泡的脂双层和/或自由地与所述的小泡合并。

21.  上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，进一步包含组织或细胞-特异性靶向部分，其选自细胞-表面受体，趋化因子，细胞因子，生长因子，抗体或抗体片段，具有与黏着分子互补的特异性或比电荷的肽序列。

22.  上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的组织或细胞-特异性靶向部分被掺入所述小泡的脂双层中或附着于其上。

23.  上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中它包含1-10个额外的抗原。

24.  上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的额外的抗原选自衍生于由env(gp120，gp41)，gag(p9，p17，p24)和pol(p66，p32)基因编码的结构蛋白和衍生物由nef，rev或tat基因编码的调节蛋白的HIV肽类及其混合物。

25.  药物组合物，包含权利要求1-24中任意一项的病毒体样小泡。

26.  上述权利要求所述的药物组合物，其中它包括：包含位于所述小泡外表面的gp41衍生的抗原的小泡和包含包囊在所述小泡内部的gp41衍生的抗原的小泡，它们作为在免疫疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。

27.  权利要求25或26所述的药物组合物，进一步包含额外的病毒体样小泡，其包含不同于所述的gp41衍生的抗原的抗原，它们作为在免疫疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。

28.  权利要求1-24中任意一项的至少一种病毒体样小泡在制备打算用于诱导针对人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的适应性免疫应答和/或先天免疫应答的药物组合物中的应用。

29.  治疗和/或预防HIV感染的方法，至少包括对有此需要的个体给予有效量的权利要求1-24中任意一项的病毒体样小泡的步骤。

30.  上述权利要求所述的方法，其中通过注射或通过粘膜途经或其组合给予所述的病毒体样小泡。

31.  上述权利要求所述的方法，其中所述的粘膜途经选自泌尿生殖道，胃肠道，肛门直肠途经，呼吸道，上部粘膜组织，口腔-鼻途经及其混合途径。

32.  权利要求29-31中任意一项所述的方法，其中所述的病毒体样小泡包括包含位于外表面的gp41衍生的抗原的小泡和包含包囊在所述小泡内部的gp41衍生的抗原的小泡，它们作为在免疫疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。

33.  权利要求29-32中任意一项所述的方法，其中将所述的病毒体样小泡与不同于所述gp41衍生的抗原的额外抗原联合给药。

34.  用于诱导对人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的免疫应答的试剂盒，包括：
-至少第一种权利要求1-24中任意一项的病毒体样小泡，其至少包含第一种gp41衍生的抗原；和
-至少第二种权利要求1-24中任意一项的病毒体样小泡，其至少包含第二种gp41衍生的抗原，
所述的第一种和第二种gp41衍生的抗原彼此不同。

35.  上述权利要求所述的试剂盒，其中所述的第一种gp41衍生的抗原为由选自SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3的序列的全部或部分表示的氨基酸序列的肽或其类似物，并且所述的第二种gp41衍生的抗原为由SEQ ID NO 1中所述序列的全部或部分表示的氨基酸序列的肽或其类似物。

包含gp41衍生的抗原的病毒体样小泡
本发明涉及适合于诱导对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的新病毒体样小泡，包含所述的病毒体样小泡的药物组合物，治疗方法和诱导对人免疫缺陷病毒的免疫应答的试剂盒。
HIV为逐步破坏免疫系统的逆转录病毒并且最终导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
HIV以许多补体形式存在，如大家族中的成员。
通过对病毒基因组测序，研究人员已经能够图示HIV的家族树。在树的根部，有三族称作M，N和O，M族导致目前的AIDS大范围流行。
将M族分成9个遗传亚型，也称作9个进化枝(命名为A-K，其中无E或I)。进化枝的最初定义基于大部分位于HIV包膜蛋白内的短的基因组序列(Env：gp160)。
这9个进化枝具有不均匀的地理分布模式。进化枝C在南美，印度和中国的地区传播。进化枝A和D通常出现在东非而进化枝B常见于北美和南美以及西欧。根据统计学，4个进化枝A，B，C和D占世界上全部感染的90％以上而进化枝C自身代表了在世界上占主导的HIV(>60％)。
到目前为止，疫苗的研发集中于进化枝B株，其在工业化国家中具有占主导的传染性，但在全球仅导致约12％的感染。
大部分针对HIV-1的疫苗手段靶向病毒包膜(Env)糖蛋白，因为它们为在病毒体上并且由HIV-1感染细胞表达的主要表面抗原。天然HIV-1包膜糖蛋白为含与三种gp41糖蛋白非共价结合的三种gp120蛋白的异三聚体。
而鉴定的三种最有效的HIV-1中和抗体b12，2G12和2F5对所述的天然三聚体具有高度亲和力。
研发作为候选疫苗的重组蛋白的尝试日益增加，这些疫苗为优于天然包膜糖蛋白复合物，诸如gp120/gp41的抗原模拟物。
然而，由于gp120/gp41与免疫系统分子之间的众多(至少15种)分子同源性，所以可能发生导致可能有害的自身免疫现象的许多潜在的交叉反应性事件。
描述了各种策略来减缓那些交叉反应性以便获得与人蛋白无或仅有低交叉反应性的抗-HIV疫苗，如US6,455,265和WO 2005/010033中所述的导入gp41蛋白不同部分中的突变和/或缺失。
然而，对能够诱导对HIV感染且特别是HIV-1型感染的通用免疫应答的疫苗仍然存在需求。
还存在对研发非进化枝B疫苗，诸如，例如，进化枝C株的需求。
还存在对研发具有能够进行交叉进化枝抑制的广抑制谱的疫苗的需求。
对能够诱导对HIV感染的体液和/或细胞免疫应答的疫苗存在需求。
对能够在粘膜表面水平和血液水平上诱导对HIV感染的免疫应答的疫苗存在需求。
对适合于诱导粘膜sIgA抗体和能够干扰HIV通过粘膜进入和粘膜下的早期细胞感染的系统性IgG抗体的疫苗存在需求。
对适合于抑制或减少HIV通过各种机制，诸如转胞吞作用通过粘膜组织进入的疫苗存在需求。
本发明的目的在于满足上述所有那些需求。
因此，本发明在其第一个方面之一中涉及病毒体样小泡，其至少包含gp41衍生的抗原或其类似物，所述的gp41衍生的抗原位于所述小泡的外表面和/或包囊在其内部，并且为便利性构型以便赋予所述的病毒体样小泡诱导对人免疫缺陷病毒(HIV)的gp41蛋白的免疫应答的能力。
特别地，HIV可以属于1型。
本发明人令人意外地观察到通过肌内或鼻内给家兔免疫接种病毒体，如包含附着在外表面上的gp41衍生的抗原的小泡可以诱导粘膜表面水平的免疫应答和全身免疫应答。
更具体地说，本发明人已经观察到在来自肌内或鼻内免疫接种后家兔的子宫颈阴道和肠分泌物中存在特异性抗体抗-gp41蛋白(粘膜IgA和IgG)。
在那些家兔的血清中也鉴定了特异性IgG抗-HIV抗体。
另外，那些特异性抗体能够在不同实验中抑制HIV的转胞吞作用。
本发明人还观察到可以在免疫接种了肌内和/或鼻内给予的本发明疫苗的雌性猕猴阴道分泌物和直肠洗涤液中获得抗体抗-gp41(粘膜IgA和IgG)。
那些分泌物和洗涤液显示出明显抑制人体上皮模型上各种初级进化枝(B和C)的HIV转胞吞作用。
因此，本发明的HIV疫苗表现出在血液中以及在为生殖道和肠/直肠粘膜组织的主要进入部位上引起免疫应答(CTL和/或抗体)的能力作为特性。
该特性特别有利，因为HIV感染可以包括有利于病毒转移和传播入体内的粘膜表面上的转胞吞作用步骤。
精液和子宫颈阴道分泌物可能将HIV传播至胃肠道，肛门直肠和泌尿生殖道，因为它们包含无细胞的HIV颗粒和大量HIV感染的单核细胞。
还认为在HIV感染的受试者的早期病毒复制的主要部位为肠和其它粘膜部位。这主要是因为大部分易感细胞(肠CD4+T细胞)居留于粘膜组织内，并且在接触HIV后前几周内，这些细胞被破坏。
在本发明的含义中，“病毒体样小泡”这一表述是指包含至少部分病毒体脂质和融合蛋白或其片段的小泡，所述的片段具有完整融合蛋白的融合活性和特征，至少在用于与靶细胞的生物膜融合的程度上。
WO 2004/07800已经提出了病毒体样小泡作为与所述小泡的外表面交联的疟疾抗原的载体。
在本发明的含义中，“gp41衍生的抗原”这一表述是指在任何或包含任何修饰(氨基酸突变或化学修饰)的HIV株中天然存在的gp41蛋白的任何部分或片段以及完整蛋白，所述的修饰基本上不会影响其抗原特性。
本发明的病毒体样小泡的抗原特性是从包囊在所述小泡内部和/或位于其表面上的gp41-抗原的简便构型得出的。
WO 2004/045582中描述了病毒体样小泡的制备，该小泡可以包含gp41/gp120蛋白，但不涉及该蛋白的抗原特性，而仅涉及其融合特性。
本发明在其另一个方面中涉及包含本发明病毒体样小泡的药物组合物。
本发明在其另一个方面中还涉及至少一种本发明的病毒体样小泡在制备旨在诱导针对人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的适应性免疫应答和/或先天性免疫应答的药物组合物中的应用。
根据本发明的一个实施方案，本发明的目的在于诱导IgG和粘膜IgA。粘膜IgA可以混合于IgA与分泌性IgA应答之间。
根据本发明的另一个实施方案，本发明的目的在于抑制或降低HIV转胞吞作用，特别是在粘膜水平上。
在本发明的含义中，“适应性免疫应答”表述是指依赖于免疫系统成分的活化的免疫应答，所述的免疫系统成分是指在抗原或病原体方面的特异性和记忆。
这种应答可以对抗原或病原体具有高度特异性并且在二次和随后遇到抗原或病原体时更有效。
这种适应性免疫应答可以依赖于淋巴细胞，诸如T-细胞或B-细胞活化。
在本发明的含义中，“先天性免疫应答”这一表述是指依赖于非特异性识别系统并且在随后遇到抗原或病原体时不会改变的应答。
这种系统可以依赖于免疫细胞，诸如，例如，单核细胞，巨噬细胞或天然杀伤(NK)细胞。
本发明在其另一个方面中还涉及治疗和/或预防HIV感染的方法，至少包括对有此需要的个体给予有效量的本发明的病毒体样小泡的步骤。
本发明在其另一个方面中还涉及用于诱导对人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的免疫应答的试剂盒，包括：
-至少第一种本发明的病毒体样小泡，其至少包含第一种gp41衍生的抗原，和
-至少第二种本发明的病毒体样小泡，其至少包含第二种gp41衍生的抗原，
所述的第一种和第二种gp41衍生的抗原彼此不同。
病毒体样小泡
适合于本发明的病毒体样小泡至少包含病毒体脂质并且表现出融合膜特性。
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以包含单层脂双层。
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以为双-或多层脂质体。
按照一个实施方案，病毒体样小泡可以具有一般在100-600nm的直径且特别是100nm-300nm直径且特别是200nm-400nm。
本发明的病毒体样小泡可以为具有约150nm平均粒径的球形单层脂质体。
病毒体样小泡包含掺入脂双层中的融合蛋白或其片段。
“融合蛋白或其片段”这一表述是指能够诱导和/或促进病毒体样小泡膜与靶细胞生物膜之间的融合反应的蛋白或其片段。
例如，融合蛋白可以为流感膜糖蛋白，诸如血凝素(HA)。
按照一个实施方案，可以使用至少两种不同的融合蛋白或其片段，它们可以展示出不同的融合特性。
按照另一个实施方案，不同的融合特性可以为，例如，对温度，离子浓度，酸性，细胞类型和组织类型特异性的不同易感性。
按照一个实施方案，病毒体样小泡可以包含在两种不同温度下介导融合的融合蛋白。
按照另一个实施方案，不同的病毒血凝素(HA)融合蛋白可以用于构建病毒体样小泡。
作为实例，来自X-31和PR8/34病毒体的HA分子能够在不同温度下催化两种不同的融合反应。
具有不同融合特性的融合蛋白可以来源于不同的流感株，如其它病毒，诸如水疱性口炎病毒(VSV)E1蛋白，塞姆利基森林病毒(SFV)E1蛋白或仙台病毒F蛋白。
特异性融合机制能够靶向主要组织相容性复合物I类(MHC I)或II类(MHC II)的病毒体样小泡。
位于病毒体样小泡外表面上的抗原可以在内体中内体融合时降解并且可以由MHC II类受体呈递给免疫系统。
包囊在病毒体样小泡内部的抗原可以在融合过程中被递送至胞质溶胶中并且可以进入MHC I类途经。
因此，病毒体样小泡可能能够诱导体液和/或细胞免疫应答。
特别地，病毒体样小泡可能能够诱导IgA，诸如分泌性IgA以及IgG。
制备方案是本领域技术人员众所周知的。例如，在WO 2004/045582或EP 0 538 437中描述了用于本发明的合适的方案，将这两篇文献引入本文作为参考。
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以获自病毒体小泡本身或获自由病毒体小泡与脂质体小泡融合产生的小泡。
可以通过任何本领域技术人员公知的方法，如Bron等在MethodsEnzymol.22 0：313-331，30 19 93中描述的方法制备病毒体小泡，将该文献引入本文作为参考。
例如，可以在使用八乙二醇一十二烷基醚增溶完整流感病毒，沉积核壳(病毒糖蛋白和脂质仍然保留在上清液中)和使用疏水性树脂(Big-Beads SM2)除去上清液中的洗涤剂后由最初的病毒膜脂质和刺突糖蛋白重构病毒体小泡(Stegmann等Traffic 1：598-604，1987)。
可以使用等量的用非离子型洗涤剂八乙二醇一十二烷基醚增溶的那些病毒的蛋白制备含来自不同病毒株的HAs的病毒体小泡。
在使用Bio-Beads SM2除去洗涤剂后，可以形成含不同类型融合蛋白的病毒体样小泡。
按照一种实施方案，本发明的病毒体样小泡可以获自病毒体小泡与脂质体小泡的融合体。
因此，按照一种实施方案，本发明的病毒体样小泡可以包含病毒体和脂质体脂质。
按照一种实施方案，本发明的病毒体样小泡可以包含脂双层，其包含选自阳离子脂质，合成脂质，糖脂类，磷脂类，磷酸甘油脂类，鞘糖脂类，如半乳糖神经酰胺，鞘脂类，胆固醇及其衍生物的脂质。
这类脂质可以用于更好地模拟病毒膜并且膜筏微域，以便有利于最佳gp41寡聚体，诸如二-，三-或四聚体。
按照另一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以包含有利于gp41衍生的抗原折叠的脂质，以便更有效地模拟所述抗原的天然折叠。
磷脂类特别可以包括具有不同脂肪酰组成的磷脂酰胆碱，鞘磷脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酸，心磷脂和磷脂酰肌醇。
阳离子脂质可以选自DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲铵氯化物)，DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲铵氯化物，DODAC(N，N-二油酰基-N，N，-二甲铵氯化物)，DDAB(双十二烷基二甲铵溴化物)和十八酰胺或其它脂肪族胺类等。
可以将用于本发明的脂质配制成与DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)的混合物形式的小的单层脂质体，所述的DOPE被广泛用作促进内体膜破裂的辅助脂质。
按照一个实施方案，脂质体的脂质体脂质可以包括POPC/DDAB。
按照另一个实施方案，还可以使用辅助乳化剂以便改善小泡的刚性和/或密封性。
作为辅助乳化剂的实例，可以提及的有胆甾醇和衍生物，例如带电荷或中性的胆固醇，如硫酸胆固醇；具有固醇主链的衍生物，例如植物来源的衍生物，如植物甾醇(谷甾醇，σ甾醇，...)；神经酰胺类；及其混合物。
可以在与病毒体融合前将gp41衍生的抗原掺入脂质体小泡内部。
可以通过本领域公知的任何方法如下所示将至少一种抗原和/或佐剂包囊入脂质体，包括Monnard等Biochim.Biophys.；Acta 1329：39-50；1997，Wagner等J.Liposome Res.，12(3)271-283，2002或Oberholzer等Biochim.Biophys.Acta1416：57-68i 1999所述的方法以及许多其它众所周知的方法。
在一个具体的实施方案中，可以通过用于制备纯脂质小泡的冷冻/融化技术达到脂质体包囊的高效率。
按照本发明的一种实施方案，可以对病毒体-脂质体融合体反应的反应产物进行核孔挤压步骤以便减小其大小。
实如，通过200nm孔挤压可以产生近似原始大小一半的小泡。
大部分颗粒可以在100-300nm。
在重新调整大小后，脂质体-病毒体融合体的产物可以为病毒体样小泡，它可以在其内腔中包含gp41衍生的抗原并且在不同条件下可能仍然能够经历第二个与生物膜的融合步骤，以便递送所述的抗原。
如下所述gp41衍生的抗原可以位于本发明小泡的外表面和/或包囊在其内部。
按照一种实施方案，本发明的病毒体样小泡可以进一步包含靶向部分，它使所述的小泡靶向至特定的细胞或组织。
合适的靶向部分可以选自细胞表面受体，趋化因子，生长因子，抗体或抗体片段，具有与黏着分子，诸如整联蛋白互补的特异性或比电荷的肽序列。
可以通过任何本领域技术人员公知的技术将靶向部分掺入所述小泡的脂双层或附着于其上。
按照另一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以进一步包含额外的抗原。
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以进一步包含1-10种额外的抗原并且特别是2-4种额外的抗原。
额外的抗原可以选自HIV衍生的肽类且特别是衍生自如env(gp120，gp41)，gag(p9，p17，p24)和pol(p66，p32)基因编码的结构蛋白和如nef，rev或tat基因编码的调节蛋白的肽类及其混合物。
GP41衍生的抗原
适合于本发明的gp41衍生的抗原可以为gp41蛋白的任何部分，和完整的gp41蛋白及其类似物。
在本发明含义中，“其类似物”这一表述就gp41衍生的抗原而言是指与所述的gp41衍生的抗原氨基酸序列具有基本上(至少85％，特别是至少90％且更特别是至少95％)氨基酸序列同一性或同源性(即被例如相同家族，类似极性或电荷的氨基酸残基置换的氨基酸残基)并且特别是就针对gp41蛋白的免疫球蛋白的结合抗原部分而言具有类似或保守生物特性的肽。
按照一个实施方案，适合于本发明的gp41衍生的抗原对于细胞膜可以不具有融合特性。
按照一种实施方案，位于本发明的病毒体样小泡外表面的gp41衍生的肽可以：
-与所述的病毒体样小泡脂质共价连接，或
-通过不同于野生型gp41蛋白的野生型肽跨膜结构域的肽跨膜结构域嵌入所述病毒体样小泡的脂双层。
因此，共价连接的gp41衍生的抗原可以包含使所述的gp41衍生的抗原定位于本发明的病毒体样小泡外表面所需的任何修饰。
适合于本发明的gp41-抗原的修饰和使所述修饰的gp41-抗原与病毒体样小泡外表面交联的方法可以是WO 2004/078099中所述的那些方法。
按照一个实施方案，gp41衍生的抗原可以通过交联脂质或磷脂与病毒体样小泡外表面共价连接。
按照另一个实施方案，gp41衍生的抗原可以通过与碳水化合物交联与病毒体样小泡外表面共价连接。
按照一个实施方案，共价连接的gp41衍生的抗原可以包含至少一个位于N-或C-末端的交联残基。
例如，交联残基可以选自半胱氨酸(Cys)或赖氨酸(Lys)。
按照另一个实施方案，共价连接的gp41衍生的抗原可以进一步包含在所述的位于N-或C-末端的交联残基与相应的N-或C-末端gp41衍生的抗原端之间的至少一个间隔残基。
合适的间隔残基可以选自：例如Gly(甘氨酸)，Ala(丙氨酸)，Ser(丝氨酸)，Asp(天冬氨酸)，Lys(赖氨酸)，Gln(谷氨酰胺)，His(组氨酸)，Ile(异亮氨酸)和Leu(亮氨酸)残基.
2-12，特别是3-10且更特别是4-8个间隔残基可以连接而形成间隔序列。
合适的间隔序列可以选自，例如Gly-Gly或Lys-Gly。
例如，可以通过使用易于掺入脂双层的两亲PEG衍生物，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰丝氨酸，胆固醇或其混合物使gp41衍生的抗原与病毒体样小泡的表面交联。
可以通过任何本领域技术人员公知的方法使gp41衍生的抗原与本发明的病毒体样小泡的脂质交联。
交联可以在脂质溶液中操作并且随后可以将脂质-肽缀合物掺入病毒体样小泡。
按照本发明的一个实施方案，例如，可以使gp41衍生的抗原与本发明的小泡脂质通过双官能琥珀酸酯连接基，特别是γ-马来酰亚氨基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-γ-马来酰亚氨基丁酰氧基-琥珀酰亚胺-酯连接。
按照一个实施方案，gp41衍生的抗原且更特别是嵌入的gp41衍生的抗原可以不具有其肽跨膜结构域。
合适的嵌入的gp41衍生的抗原可以具有被不同肽跨膜结构域置换的其肽跨膜结构域。
这种修饰的gp41衍生的抗原可以为嵌合蛋白。
在本发明含义中，“嵌合蛋白”这一表述是指可以包含来自蛋白质的一个或多个区和来自一种或多种其它不同蛋白质的一个或多个区的蛋白质。
为了本发明的目的，任何蛋白质的任何跨膜结构域均可以适合于使gp41衍生的抗原嵌入本发明的病毒体样小泡的脂双层。
按照一个实施方案，可以使用有利于寡聚化的跨膜结构域(就获得二聚体，三聚体或四聚体而言)，诸如来自病毒的生长因子受体或包膜蛋白的跨膜。
作为可以集合成本发明的跨膜结构域的实例，可以提及的有获自细胞表面受体，如CD4受体(例如SEQ ID NO5中所示)，细胞因子受体，例如IL-1受体，EGF受体，VEGF受体，任何G-蛋白偶联受体，任何酪氨酸激酶受体，来源于诸如弹状病毒家族或痘病毒家族的病毒这类病毒包膜蛋白的病毒跨膜结构域的跨膜结构域。用于本发明的合适的病毒蛋白可以为，例如水泡性口炎病毒蛋白G(VSV-G)。
这类跨膜结构域是本领域众所周知的并且易于由本领域技术人员鉴定。
可以通过本领域技术人员公知的任何遗传工程技术获得适合于本发明的嵌合蛋白，诸如描述在“Molecular Cloning A Laboratory Manual”(2^NDEd.)Sanbrook等1990，Coldspr ing Harbor Laboratory，ColdspringHarbor Press N.Y.(Sanbrook)中的技术。
按照另一个实施方案，可以为病毒体样小泡外表面提供一-，二-，三-且更特别是四聚化形式及其混合物形式的gp41衍生的抗原。
因此，可以通过本领域技术人员公知的任何常规方案调节用于制备本发明的病毒体样小泡的gp41衍生的抗原的量以便获得所需的单-或多聚化形式。
按照一个实施方案，可以使gp41衍生的抗原位于其外表面的N-或C-末端。
按照一个实施方案，可以使gp41衍生的抗原位于外表面的C-末端。
按照一个实施方案，可以使gp41衍生的抗原位于外表面的N-末端。
按照一个实施方案，可以使gp41衍生的抗原包囊在本发明病毒体样小泡内部。
可以通过本领域众所周知的方法用病毒体包囊gp41衍生的抗原。
例如，可以通过将离心到溶于含八乙二醇一癸基醚(OEG)的PBS的PBS-OEG(磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)溶液中的血凝素沉淀溶解制备如之前由J.J.Skehe和G.C.Schild(The polypeptidecomposition ofinfluenza A viruses.Virology 44(1971)396-408)所述获得的纯化A型流感/新加坡血凝素的溶液。
可以将Gp41衍生的抗原和磷脂类加入到血凝素-溶液中，混合，超声处理，然后离心。随后如上所述通过例如使用BioRad SMBio-Beads除去洗涤剂形成病毒体。
按照另一个实例，可以使用诸如上述或如Christodoulides等Microbiology 144：3027-3037(1998)中所述的方法将gp41衍生的抗原包囊入脂质体，此后使所述的脂质体小泡与病毒体小泡融合。
按照另一个实施方案，当包囊入本发明的病毒体样小泡时，还可以如上所示提供单-或多聚化形式的gp41衍生的抗原。
按照一个实施方案，可以用于本发明的gp41衍生的抗原可以选自任何HIV进化枝。
用于本发明的合适的HIV进化枝可以为例如来自A，B，C或D进化枝的HIV。
更具体地说，gp41衍生的抗原可以来自HIVC型进化枝。
合适的gp41衍生的抗原可以部分包含天然存在的gp41衍生的抗原方面的任何保守氨基酸置换(和/或插入和/或缺失)和/或化学修饰(诸如环化)，其实施依赖于本领域技术人员。
按照一个实施方案，可以聚集以便实施本发明的gp41衍生的抗原可以为如获自HIV-1株HxB2的SEQ ID NO 1中所示序列的全部或部分表示的氨基酸序列肽或其类似物。
在一个实施方案中，gp41衍生的抗原可以为来源于HIV gp41糖蛋白的野生型氨基酸序列的gp41改造的环蛋白。
作为可以用于实施本发明的gp41衍生的抗原的实例，可以提到的有通过在免疫显性区中导入某些突变(缺失，置换和/或插入)获得的gp41衍生的抗原，以便降低与人白细胞介素-2(IL-2)的同源性，从而避免或降低引起自身免疫反应风险。这类gp41衍生的抗原特别描述在WO 2005/010033中，将该文献引入本文作为参考。
在本申请中，“突变”是指通过物理方式，化学方式(共价或非共价修饰)和/或生物方式(通过置换，缺失和/或插入一种或多种氨基酸的突变)对多肽区的任何修饰(任选地还原成单个氨基酸残基)，从而产生所述区的组成氨基酸的功能性潜能的改变，称作“突变区”。作为实例，可以进行突变而导致L系列氨基酸改变成D系列，二硫键，氢键，静电作用和/或疏水作用特性的消除，获得和/或调节，蛋白质形成杂络物能力的改变，或就寡聚蛋白质而言寡聚化状态或寡聚体稳定性的改变。
免疫显性区的改变可以导致在环中引入亲水性和非或弱免疫原性的柔性接头和任选地引入突变或该环的一部分被它们置换。
Gp41衍生的抗原在其免疫显性区中还可以包括至少一种突变，这在体外产生与宿主蛋白且特别是与IL-2的B型和/或T型交叉反应。
某些对影响这种抗原性改变具有决定性的突变披露在US6,455,265和WO 2005/010033中，将这些文献的教导完整地引入本文作为参考。
按照一个实施方案，适合于本发明的gp41衍生的抗原可以为称作P1的肽并且可以为由选自SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3的序列全部或部分表示的氨基酸序列的肽或其类似物。
肽P1相当于存在于位于病毒颗粒表面上的HIV包膜蛋白胞外域gp41中的氨基酸序列，此后该病毒与靶细胞发生相互作用。作为实例，在HIV-1 HxB2株中，该序列由野生型gp41蛋白的649位氨基酸到683位氨基酸组成。
如WO 2005/010033中所述或如上所述，用于本发明的gp41衍生的抗原还可以包括修饰，诸如将N-或C-末端上的部分氨基酸序列截短或添加肽序列以便产生嵌合蛋白。
作为适合于本发明的gp41衍生的抗原的实例，可以预见肽P1序列包含在C-末端位置上添加Lys-Gly-Cys间隔区，例如SEQ ID NO 4所示。
佐剂
按照一个实施方案，可以通过使那些病毒体样小泡与至少一种佐剂结合增加本发明的病毒体样小泡的免疫调节作用。
可以将所述的佐剂包囊在所述的小泡内部和/或掺入其脂双层和/或与之自由合并。
按照一个实施方案，病毒体样小泡还可以包含至少一种增强和/或介导免疫应答的佐剂，所述的免疫应答选自先天性免疫应答和/或适应性免疫应答。
适应性免疫应答可以选自T_H1和/或T_H2免疫应答。
可用的佐剂可以通过活化抗原呈递细胞(APC)，巨噬细胞和/或刺激特异性组淋巴细胞来增强免疫应答。
可以集合成本发明的佐剂可以是适合于活化在树突细胞(DC)或其它抗原呈递细胞中和其上表达的病原体识别受体(PRR)的配体。
活化Toll样受体(TLR)的配体还可以集中用于本发明的目的。那些受体为PRR家族中的成员并且在各种先天性免疫细胞，包括DC，巨噬细胞，肥大细胞和中性白细胞上广泛表达。
作为活化TLR的配体的实例，可以提及的有：就TLR4而言为来自大肠杆菌(E.coli)的LPS，红豆杉醇，RSV融合蛋白和宿主热激蛋白60和70；就TLR2而言为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的肽多糖，来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的脂蛋白和啤酒糖酵母(Sacharomyces cerevisiae)酵母多糖和高度纯化的P.gingivalis LPS；就TLR3而言为dsRNA；就TLR5而言为鞭毛蛋白；就TLR7而言为合成化合物咪唑并喹啉类；而就TLR9而言为某些类型的富含CpG的DNA。
用于本发明的其它有用的佐剂可以为T辅助细胞表位。
T辅助细胞表位为通常来源于在抗原呈递细胞(APC)胞吞途经内已经进行蛋白水解降解和加工的外源性蛋白的肽。在那些细胞中，转运至胞吞途经内体的II类主要组织相容性复合物(MHC II)与那些肽类结合。这种转运至APC表面的复合物可以与T淋巴细胞的CD4⁺特异性T细胞受体发生相互作用。
根据助细胞表位，T细胞应答可以属于T_H1和/或T_H2类型。
有利于CTL应答的T_H1表位和有利于体液应答的T_H2表位为本领域公知的。
作为T_H1-定向应答表位的实例，可以提及的有WO 2005/049647中鉴定的蜂毒素衍生的肽类。
作为其它T_H2-定向应答表位的实例，可以提及pan DR辅助性T细胞表位(PADRE)。改造该表位以便以高度亲和力结合最常见的HLA-DR分子并且起强力免疫原的作用。已经证实PADRE HTL表位可增进为刺激细胞免疫应答而设计的疫苗的效力(Alexander J.等，Immunol Res.1998；18(2)：79-92)。
按照一个实施方案，可以用于本发明的病毒体样小泡的佐剂可以选自铝盐；磷酸铝凝胶；分枝杆菌，诸如BCG，母牛分枝杆菌(M.Vaccae)或小棒杆菌(corynebacterium parvum)；肽类；匙孔血蓝蛋白；胞壁酰二肽和三肽衍生物；单磷酰脂质A；白细胞介素-2(IL-2)，IL-12，GM-CSF；来自趋化因子家族的配体，诸如RANTES(激活后可调节的正常T细胞表达和分泌的)；Gram⁺菌的脂蛋白；酵母细胞壁成分；双链RNA；Gram^-菌的脂多糖；鞭毛蛋白；富含U的单链病毒RNA；含CpG的DNA；细胞因子信号传递小干扰RNA的阻抑物(SOCS siRNA)，蜂毒素衍生的肽类，panDR表位(PADRE)及其混合物。
药物制剂
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以用于制备指定诱导针对人免疫缺陷病毒gp41蛋白的适应性免疫应答和/或先天免疫应答的药物组合物。
这类药物组合物可以包含悬浮于药学上可接受的载体，例如含水载体的病毒体样小泡的溶液。
可以使用各种含水载体，例如水，缓冲水，0.4％盐水，0.3％甘氨酸，透明质酸等。可以通过常规的众所周知的灭菌技术给药物组合物灭菌或可以将其进行无菌过滤。
可以将所得水溶液作为包装应用或将其冻干，可以在给药前将该冻干制剂与无菌溶液合并。
药物组合物可以包含接近生理条件所需的药学上可接受非辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂，张度调节剂，湿润剂等，例如乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，失水山梨糖醇单月桂酸酯，油酸三乙醇胺酯等。
这类制剂通常可以包含药学上可接受浓度的盐，缓冲剂，抗氧化剂，防腐剂，相容性载体，如上所述的佐剂和任选的其它治疗剂。
可以通过注射或通过粘膜途经或其组合给予本发明的病毒体样小泡，且特别是包含它的药物组合物。
注射途经可以为，例如，腹膜内，真皮内，皮下血管内或肌肉途经。
可以使用任何粘膜途经，诸如泌尿生殖道，例如阴道途经，胃肠道途经，肛门直肠途经，呼吸道途经，上部粘膜组织，口腔-鼻部途经及其混合途径。
在一个实施方案中，可以将本发明的药物组合物制成口服剂型，诸如片剂，胶囊(各自包括定时释放和缓释制剂)，丸剂，粉末，颗粒，酏剂，酊剂，溶液，混悬液，糖浆剂和乳剂。
所有这些剂型均为制药领域普通技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，病毒体样小泡可以用于制备以疫苗形式给药的药物组合物。可以使用本领域中标准的任何免疫接种方案。
按照一个实施方案，本发明的药物组合物可以包含：小泡，其包含位于所述小泡外表面的gp41衍生的抗原；和小泡，其包含包囊在所述小泡内部的gp41衍生的抗原，它们作为免疫疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。
按照另一个实施方案，本发明的药物组合物可以进一步包含额外的病毒体样小泡，其包含不同于所述gp41衍生的抗原的抗原，它们作为在免疫疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。
所述的不同可以如上所述。
本发明的药物组合物可以包含有效量的本发明病毒体样小泡。
有效量为单独或与额外剂量共同可以刺激所需反应的病毒体样小泡用量。有效量可以依赖于各种因素，诸如给药途径，是单剂量还是多剂量给药和个体患者参数，包括年龄，身体情况，大小，体重和疾病阶段。这些因素为本领域技术人员众所周知的并且可以不经过度实验确定。
因此，按照一个实施方案，药物组合物可以包含单独或与至少一种如上所述佐剂组合的本发明病毒体样小泡。
本发明的另一个方面还涉及治疗和/或预防HIV感染的方法，至少包括对有此需要的个体给予有效量的本发明病毒体样小泡的步骤。
按照一种实施方案中，可以如上所述通过注射或粘膜途经或其组合给予本发明的病毒体样小泡。
按照另一个实施方案，可以按照本发明使用的病毒体样小泡可以为：病毒体样小泡，其包含位于外表面的gp41衍生的抗原；和病毒体样小泡其包含包囊在所述小泡内部的gp41衍生的抗原，它们作为免疫疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。
按照另一个实施方案，可以将可以用于本发明方法的病毒体样小泡与不同于所述gp41衍生的抗原的额外抗原联合给药。
作为可以集中用于本发明的额外抗原的实例，可以提及的有上述不同的抗原。
本发明在其另一个方面中还涉及用于诱导对人免疫缺陷病毒gp41蛋白免疫应答的试剂盒，包括：
-至少第一种本发明的病毒体样小泡，其至少包含第一种gp41衍生的抗原；和
-至少第二种本发明的病毒体样小泡，其至少包含第二种gp41衍生的抗原，
所述的第一种和第二种gp41衍生的抗原彼此不同。
按照一个实施方案，第一种gp41衍生的抗原可以为由选自SEQ IDNO 2，SEQ ID NO 3的序列全部或部分表示的氨基序列肽或其类似物。
按照另一个实施方案，第二种gp41衍生的抗原可以为由SEQ ID NO1所示序列全部或部分表示的氨基酸序列肽或其类似物。
通过下列实施例进一步理解本发明，提供这些实施例是为了例证，而不应将其解释为限制本发明的范围。
进一步通过下列实施例例证本发明的各方面，在任何情况下均不应将其视为限制本发明的范围。
附图说明
图1：例证了来自(form)HxB2进化枝B病毒(SEQ ID NO 1，SEQID NO 3，SEQ ID NO 4)和来自HIV进化枝C(SEQ ID NO 2)的gp41衍生的抗原序列。
图2：例证了CD4⁺分子跨膜结构域序列(SEQ ID NO 5)。
图3：例证了在第0，14，18，23和28周时总抗体，IgG和sIgA在来自免疫接种实施例1的病毒体样小泡P1的家兔的子宫颈阴道分泌物中的剂量，所述的实施例1的病毒体样小泡P1不含佐剂(36&37，肌内途经)，含hRANTES(61，鼻内途经)或含不耐热毒素(64 & 65，鼻内途经)。
图4：例证了在第0，14，18，23和28周时总抗体，IgG和IgA在来自免疫接种实施例1的病毒体样小泡P1的家兔的血清中的剂量，所述的实施例1的病毒体样小泡P1不含佐剂(36 & 37，肌内途经)，含hRANTES(61，鼻内途经)或含不耐热毒素(64 & 65，鼻内途经)。
图5：例证了通过HT-29细胞进行的HIV-1转胞吞作用的抑制，其中使用感染了初级病毒的PBMC和如实施例2中所述获得的子宫颈阴道分泌物(1/50稀释)(第14，18和23周，不含佐剂36 & 37的病毒体样小泡P1，肌内途经；含hRANTES 61 & 63，鼻内途经；或含不耐热毒素64 & 65，鼻内途经)。
图6：例证了通过ELISA测定的在第0，4，12和24周时在使用实施例1的病毒体样小泡P1以40μg/剂量进行疫苗接种的雌性猕猴阴道分泌物中IgG的剂量。
图7：例证了通过ELISA测定的在第0，4，12和24周时在使用实施例1的病毒体样小泡P1以40μg/剂量进行疫苗接种的雌性猕猴阴道分泌物中IgA的剂量。
图8：例证了通过ELISA测定的在第0，4，12和24周时在使用实施例1的病毒体样小泡P1以40μg/剂量进行疫苗接种的雌性猕猴阴道分泌物中IgA的剂量。
图9：例证了通过HT-29细胞进行的R5 HIV株的抑制(来自NIH的V29初级HIV进化枝B或来自NIH的V25初级HIV进化枝C)，其中使用来自如实施例4中所述获得的第25周的阴道分泌物(1/25稀释)感染了V29或V25的PBMC。
图10：例证了通过HT-29细胞进行的R5 HIV株的抑制(来自NIH的V29初级HIV进化枝B或来自NIH的V25初级HIV进化枝C)，其中使用来自如实施例4中所述获得的第25周的直肠洗涤物(1/25稀释)感染了V29或V25的PBMC。
实施例1：
包含位于外表面的gp-41衍生的抗原的病毒体样小泡的制备如WO 2004/045582中所述制备病毒体样小泡。
简言之，将32mg卵磷脂酰胆碱(PC)和8mg磷脂酰乙醇胺(PE)溶于含100mM八乙二醇一癸基醚(OEG)(PBS/OEG)的2 ml PBS。
如所述的纯化A型流感/Singapore血细胞凝集素(HA)(Skehel和Schild，Virology 44：396-408，1971)，在磷酸缓冲盐水(PBS)中以100,000xg离心4mg血细胞凝集素(HA)并且将沉淀溶于含100mM OEG的1，33 ml PBS。
如下使在C-末端位置上具有间隔区Gly-Lys-Cys(SEQ ID NO 4)的修饰的gp41衍生的抗原(P1)通过N-末端上的琥珀酸酯连接基与磷脂酰乙醇胺(PE)的区域异构体结合。
将磷脂酰乙醇胺(PE)溶于甲醇并且加入0.1％(v/v)三乙胺。然后将该溶液与预先溶于二甲亚砜(DMSO)(20μl)的异双官能交联剂N-γ-马来酰亚氨基丁酰氧基-琥珀酰胺-酯(GMBS)(Pierce ChemicalCompany，Rockford，IL)(比例PE:GMBS＝5:1)混合。在室温下30分钟过程中孵育后，在真空中用真空离心蒸发浓缩器离心将溶剂蒸发1小时。然后将GMBS-PE溶于含100me八乙二醇(OEG)(FlukeChemicals，Switzerland)的1 ml PBS(PBS-OEG)并且加入修饰的gp41衍生的抗原P1(SEQ ID NO 4)(比例PE-GMBS:肽＝5:1)。在该步骤中，使磷脂酰乙醇胺-GMBS与修饰肽P1的游离C-末端半胱氨酸反应。在30分钟孵育时间后，加入游离半胱氨酸以使游离GMBS失活(比例为半胱氨酸:GMBS＝10:1)。
将肽P1-磷脂酰乙醇胺结合物(4mg)，磷脂酰胆碱(32mg；Lipoid，Ludwigshafen，Germany)和(ans)磷脂酰乙醇胺(6mg)溶于2.66 ml PBS-OEG总体积。混合磷脂类和血细胞凝集素溶液并且超声处理1分钟。
以100 000g将该溶液离心1小时并且通过过滤对上清液灭菌。通过除去洗涤剂形成病毒体(SM BioBeads，BioRad，Glattbrugg，Switzerland)。
实施例2：
包含具有位于外表面的gp-41衍生的抗原肽P1的病毒体样小泡的疫苗组合物对家兔的免疫接种
准备3组新西兰白色雌性家兔接受如实施例1中所述制备的病毒体样小泡。
通过肌内给予不含任何佐剂(家兔36和37)或通过鼻内给予含hRANTES(家兔61和63)或通过给予含不耐热毒素(HLT)(家兔64和65)的病毒体样小泡。
应用下列给药方案。
在首次给予制剂前4周，家兔接受肌内注射失活的A型流感(100μl失活的A型流感，0，01mg/ml)。
此后，家兔在0，4和12周时接受病毒体样小泡给药(20μg，100μl)并且在第16和22周时接受肌内加强注射(10μg)。
在第28周时处死动物并且采集各种样品用于研究抗体反应-功能。
将预先免疫的样品(在第0周前取)用作对照组。
在第14，18，23和28周时取血液和阴道分泌物。
将HLT病毒体样小泡进行疫苗接种的家兔用作针对hRANTES病毒体样小泡进行疫苗接种的家兔的对照组。
按照下列ELISA方案测定总抗体，IgG和IgA水平。
将在碳酸氢盐缓冲液50mM，pH9.6中的肽P1(100ng/100μl/孔，SEQ ID NO 3)用于在4℃下包被Nunc平板过夜。
用BSA 3％或牛奶5％将平板饱和2小时/37℃，然后用PBS-Tween0，5％缓冲液洗涤。
在37℃下将用BSA 3％按照1/1000稀释的血清或用BSA3％按照1/50稀释的子宫颈阴道分泌物的样品孵育2小时。
此后用PBS-Tween 0.5％缓冲液冲洗平板并且与初级抗体一起孵育。
为了检测总抗体，使用用辣根过氧化物酶(HRP)(1/4000)标记的抗-家兔总Ig山羊抗体。
为了检测家兔IgA，使用抗-家兔IgG山羊抗体(Vector，France)(1/20 000)，随后与按照1/50 000稀释的链霉抗生物素-HRP(Immunotech)一起孵育。
为了检测IgG家兔抗体，使用抗-家兔IgA山羊抗体(Sigma)(1/20000)，随后与标记的抗-山羊抗体生物素(Vector)(1/1000)一起孵育并且使用链霉抗生物素-HRP(1/50 000)显示。
将2F5-IgG单克隆抗体用作阳性对照，随后与抗-人IgA生物素标记的山羊Fab’2，(1/5000)(Caltag)一起孵育并且使用链霉抗生物素-HRP(1/50 000)显示。
将2F5-IgA单克隆抗体用作阳性对照，随后与抗-人IgG山羊Fab’2(1/20 000)一起孵育并且使用链霉抗生物素-HRP(1/50 000)显示。
将抗体在37℃下孵育1小时。
通过添加底物TMB引起比色反应并且通过添加H₂PO₄ 1M终止。
在450nm处读取光密度(OD)。
在图3(子宫颈阴道分泌物)和图4(血清)上例证了获得的结果。
在来自按照免疫接种条件在第14或18周时具有峰值的免疫接种家兔的子宫颈阴道分泌物和血清中观察到存在抗体。
实施例3：
获自来自实施例2的免疫接种家兔的子宫颈阴道分泌物对HIV转胞吞作用的抑制
对在可透性滤膜支持物(0.45微米孔径)上生长为致密极化单层达7天的上皮细胞系HT-29实施通过上皮细胞的HIV-1转胞吞作用和用抗体中和转胞吞作用，从而在独立的室之间形成界面，上部浸浴了上皮单层的上(腔)表面，而下部浸浴了基底外侧(浆膜)表面。
获得初级PBMC并且如Lagaye等(J.Virol，2001，75：4780)所述制备。然后使用植物凝集素(PHA)将PBMCs活化48小时并且与初级HIV-1进化枝C一起孵育并且在感染后第7天时使用。
将如实施例2中所述获得的含抗体的子宫颈阴道分泌物(1/50稀释)(第14，18和23周，不含佐剂的病毒体样小泡P1，36 & 37 i.m.，含hRANTES 61 & 63 i.n.或含不耐热毒素64 & 65 i.n.)在18℃下与1.10⁶ HIV-1+PBMC一起孵育1小时。
为了引起病毒转胞吞作用，向上部室中加入含抗体的2.10⁶HIV-1+PBMC。HIV-1⁺PBMC与上皮单层之间的接触导致HIV-1病毒体快速萌发，随后它们从上部转胞吞至上皮细胞的基底外侧孔。
2小时后，通过用ELISA(Coulter，France或PASTEUR SANOFI，FRANCE)检测基底外侧培养基中HIV的蛋白p24测定抗体对转胞吞作用的抑制。分别将在没有阴道分泌物存在或在P1非特异性Fab存在或有对照IgA 2F5存在下的p24水平测定为阴性对照和阳性对照。将阴性对照值取为100％转胞吞作用并且用于表示结果。
将实验至少进行两次。
获得的结果如图5中所示。
结果表明来自免疫接种不含佐剂的(36和37)或含人RANTES(61和63)或含不耐热毒素(HLT)(64和65)的病毒体样小泡-P1的家兔的子宫颈阴道分泌物能够抑制通过HT-29细胞的HIV-1进化枝C的转胞吞作用。
在不使用佐剂和使用HLT情况下，使用来自第18周的子宫颈阴道分泌物观察到了70-90％的抑制作用。
在使用hRANTES的情况下，使用来自第23周的子宫颈阴道分泌物观察到了85-90％以上的抑制作用。
实施例4：
包含具有位于外表面的gp-41衍生的抗原肽P1的疫苗组合物对猕猴的免疫接种
准备年龄约为5岁的3组5-6只雌性猕猴接受如实施例1中所述制备的病毒体样小泡。
通过肌内给予(猕猴G1.1-G1.5)或通过鼻内给予(猕猴G2.1-G2.5)或通过肌内和鼻内给予(猕猴G3.1-G3.6)病毒体样小泡。
应用下列给药方案。
在首次给予制剂前4周，猕猴接受肌内注射失活的A型流感(100μl失活的A型流感，0，01mg/ml)。
此后，猕猴在0，4，12和24周时接受病毒体样小泡给药(40μg，100μl)。
在第25和26周时取直肠灌洗液和阴道分泌物。
按照下列ELISA方案测定总抗体，IgG和IgA水平。
将在碳酸氢盐缓冲液50mM，pH9.6中的肽P1(100ng/100μl/孔，SEQ ID NO 3)用于在4℃下包被Nunc平板过夜。
用BSA 2％/PBST 0.1％将平板饱和1小时30分钟/37℃，然后用PBS-Tween 0，1％缓冲液洗涤。
将未稀释的直肠灌洗液或用PBST 0.1％稀释1/2的阴道分泌物在4℃下孵育过夜。
此后用PBS-Tween 0.1％缓冲液冲洗平板并且与用BSA 2％/PBST0.1％稀释的初级抗体一起孵育。
为了检测猕猴IgG抗体，使用抗-猕猴IgG山羊抗体(Rockland)(1/15 000)，随后与按照1/50 000稀释的链霉抗生物素-HRP(Immunotech)一起孵育。
为了检测猕猴IgA猕猴抗体，使用抗-猕猴IgA山羊抗体(Rockland)1/15 000)，随后与按照1/50 000稀释的链霉抗生物素-HRP(Immunotech)一起孵育。
将2F5-IgG单克隆抗体用作阳性对照，随后与抗-人IgG山羊Fab’2(最终0.1μg/ml)(Rockland 609106123)一起孵育并且使用链霉抗生物素-HRP(1/50 000)显示。
将2F5-IgG单克隆抗体用作阳性对照，随后与抗-人IgG山羊Fab’2(1/20 000)一起孵育并且使用链霉抗生物素-HRP(1/50 000)显示。
将抗体在37℃下孵育1小时。
比色反应通过添加底物TMB引起并且通过添加H₂PO₄1M终止。
在450nm处读取光密度(OD)。
在图6和7(IgG和IgA阴道分泌物)和图8(直肠灌洗液)上例证了获得的结果。
结果表明90-95％的雌性猕猴具有良好的进入其生殖器分泌物的特异性IgG和IgA抗体抗-gp41水平，并且95％以上具有进入其直肠洗涤液的特异性IgA抗体抗-gp41。
总之，在来自免疫接种雌性猕猴的阴道分泌物和直肠灌洗液中观察到存在IgG和IgA抗体。
结果揭示出可以使用本发明的疫苗获得使用粘膜抗体的免疫应答。
另外，观察到IgA和IgG抗体甚至在免疫粘膜佐剂存在下肌内注射进行的疫苗接种后也可以重新分布入生殖和肠区室。
实施例5：
获自来自实施例4的免疫接种猕猴的阴道分泌物和直肠灌洗液对HIV转胞吞作用的抑制
对在可透性滤膜支持物(0.45微米孔径)上生长为致密极化单层达7天的上皮细胞系HT-29实施通过上皮细胞的R5 HIV-1株(来自NIH的初级HIV进化枝B的V29和来自NIH的初级HIV进化枝C的V25)转胞吞作用和用抗体中和转胞吞作用，从而在独立的室之间形成界面。
获得初级PBMC并且如Lagaye等(J.Virol，2001，75：4780)所述制备。然后使用植物凝集素(PHA)将PBMC活化48小时并且与初级HIV-1进化枝B(V29)或初级HIV-1进化枝C(V25)一起孵育并且在感染后第7天时使用。
将如实施例4中所述获得的来自第25周含抗体的(1/25稀释)或直肠灌洗液(1/25稀释)在18℃下与1.10⁶ HIV-1+PBMC一起孵育1小时。
为了引起病毒转胞吞作用，向上部室中加入含抗体的2.10⁶HIV-1+PBMC(V29或V25)。HIV-1⁺PBMC与上皮单层之间的接触导致HIV-1病毒体快速萌发，随后它们从上部转胞吞至上皮细胞的基底外侧孔。
2小时后，通过用ELISA(Coulter，France或PASTEUR SANOFI，FRANCE)检测基底外侧培养基中HIV的蛋白p24测定抗体对转胞吞作用的抑制。分别将在没有阴道分泌物存在或在P1非特异性Fab存在或有对照IgA 2F5存在下的p24水平测定为阴性对照和阳性对照。将阴性对照值取为100％转胞吞作用并且用于表示结果。
将实验至少进行两次。
获得的结果如图9(阴道分泌物)和图10(直肠灌洗液)中所示。
结果表明所述抗体能够预防至少60％的HIV通过体外人粘膜上皮模型进入并且在16只动物中有2只达98％。
因此，本发明的疫苗能够引起IgG和粘膜IgA免疫应答。粘膜免疫应答能够显著减少来自不同HIV进化枝的HIV粘膜转胞吞作用。
序列表
<110>MYMETICS· CORPORATION
     INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE(INSERM)
     PEVION BIOTECH LTD.
     Sylvain，FLEURY
     Morgan，BOMSEL
     Rinaldo，ZURBRIGGEN
<120>包含gp41衍生的抗原的病毒体样小泡
<130>BR83281/DC1
<150>PCT/IB2006/000466
<151>2006-03-03
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>143
<212>PRT
<213>人
<400>1


<210>2
<211>35
<212>PRT
<213>人
<400>2

<210>3
<211>35
<212>PRT
<213>人
<400>3


<210>4
<211>38
<212>PRT
<213>人
<400>4

<210>5
<211>26
<212>PRT
<213>人
<400>5