新的肠球菌和链球菌菌株及细菌素.pdf

使用由新的肠球菌和链球菌菌株生产的新的肠球菌和链球菌细菌素来至少降低至少一种目标细菌在动物、尤其是禽类中的定植水平。

1.  一种分离的由肠球菌菌株或链球菌菌株生产的细菌素，所述肠球菌或链球菌菌株具有选自由NRRL B-30746和NRRL B-30745组成的组的菌株的识别特征。

2.  如权利要求1所述的细菌素，具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列。

3.  如权利要求1所述的细菌素，具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。

5.  具有NRRL B-30746的识别特征的分离的屎肠球菌菌株。

6.  具有NRRL B-30745的识别特征的分离的仓鼠链球菌菌株。

7.  一种治疗组合物，包括：
(a)至少降低至少一种目标细菌定植水平的有效量的至少一种分离的由肠球菌菌株或链球菌菌株生产的细菌素，所述肠球菌菌株或链球菌菌株具有选自由NRRL B-30746、NRRL B-30745及其混合物组成的组的菌株的识别特征；以及
(b)合适的治疗载体。

8.  如权利要求7所述的治疗组合物，其中所述细菌素具有选自由SEQ ID NO.1、SEQID NO 2或其混合物组成的组的氨基酸序列。

9.  一种用于动物的治疗性饲料，包括：
(a)至少降低至少一种目标细菌的定植水平的有效量的至少一种由肠球菌菌株或链球菌菌株生产的分离的细菌素，所述肠球菌菌株或链球菌菌株具有选自由NRRL B-30746、NRRL B-30745及其混合物组成的组的菌株的识别特征，
(b)治疗载体，以及
(c)动物饲料。

10.  如权利要求11所述的治疗性饲料，其中所述至少一种细菌素具有选自由SEQ IDNO1、SEQ ID NO 2及其混合物组成的组的氨基酸序列。

11.  一种用于至少降低至少一种目标细菌在动物中的定植水平的方法，包括：
将至少降低至少一种目标细菌的定植水平的有效量的包括至少一种分离的由肠球菌菌株或链球菌菌株生产的细菌素以及治疗载体的治疗组合物施用给动物，所述肠球菌菌株或链球菌菌株具有选自由NRRL B-30746、NRRL B-30745及其混合物组成的组的菌株的识别特征。

12.  如权利要求11所述的方法，其中所述的细菌素具有选自由SEQ ID NO 1、SEQ IDNO 2及其混合物组成的组的氨基酸序列。

13.  具有NRRL B-30744的识别特征的乳酸乳球菌的分离菌株。

14.  一种用于由细菌提高细菌素产量的方法，包括：
(a)向产细菌素细菌的培养物中添加细菌素提升量的乳酸乳球菌以形成共同培养物，所述乳酸乳球菌具有NRRL B-30744的识别特征，以及
(b)在大约37℃培养所述的共同培养物。

15.  一种用于分离细菌素的方法，其包括：
(a)共同培养产细菌素细菌和诱导者细菌以在培养介质中生产细菌素，
(b)通过离心收获所述培养介质和细胞以获得上清液和细胞小团，
(c)将所述含细菌素的上清液应用于疏水作用色谱柱以获得分离的细菌素制备物，
(d)在洗脱缓冲液中温育所述来自步骤b的所述细胞小团以形成第一混合物，
(e)通过离心从所述细胞小团与所述缓冲液分离细胞，
(f)通过离子交换色谱从所述缓冲液分离细菌素。

16.  如权利要求15所述的方法，其中所述离子交换色谱使用Superose SP FF柱。

新的肠球菌和链球菌菌株及细菌素
发明背景
发明领域
[0001]本发明涉及通过使用新的产细菌素的肠球菌和链球菌菌株和/或由这些菌株生产的新细菌素控制动物、特别是家禽中的疾病。本发明还涉及新细菌素，所述新细菌素的氨基酸序列，以及涉及生产所述新细菌素的肠球菌或链球菌，并涉及乳球菌属的诱导者菌株。进一步地，本发明涉及含有所述新细菌素和/或生产它们的肠球菌或链球菌的治疗组合物，以及所述治疗组合物的应用。
相关领域描述
[0002]食用未正确处理的家禽产品已经导致人的肠疾病。早已认识到沙门氏菌(Salmonella spp.)是这类疾病的致病菌，最近认识到弯曲杆菌(Campylobacter spp.)，特别是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)也被牵连其中。这两种微生物都可以定植于家禽的胃肠道中，而对这些鸟类没有任何有害效果，虽然一些已被定植的鸟类可以被检测到，但无症状的带菌者可以在生产和处理过程中自由传播这些微生物，导致进一步感染活的鸟类和尸体。家禽在食物供应中作为沙门氏菌和弯曲杆菌的原始贮主(Jones等，Journalof Food Protection(食品保护杂志)，第54卷，No.7，502-507，1991年7月)。在养成生产期间预防在活家禽中的定植可以消除家禽污染的问题。
[0003]许多因素促成细菌在动物消化道内的定植和继续存在。这些因素已被Savage(Progress in Food and Nutrition Science(食品和营养科学进展)，第7卷，65-74，1983)详尽地评述。在这些因素中所包括的是：(1)胃酸度(Gilliland，Journal of Food Production(食品生产杂志)，第42卷，164-167，1979)；(2)胆汁盐(Sharpe和Mattick，Milchwissenschaft，第12卷，348-349，1967；Floch等，American Journal of Clinical Nutrition(美国临床营养学杂志)，第25卷，1418-1426，1972；Lewis和Gorbach，Archives of InternalMedicine(内科学档案)，第130卷，545-549，1972；Gilliland和Speck，Journal of FoodProtection(食品保护杂志)，第40卷，820-823，1977)；Hugdahl等，Infection and Immunity(感染和免疫)，第56卷，1560-1566，1988)；(3)蠕动；(4)消化酶(Marmur，Journalof Molecular Biology(分子生物学杂志)，第3卷，208-218，1961)；(5)免疫响应；和(6)本源微生物(indigenous microorganism)以及它们生产的抗菌化合物。前四种因素取决于宿主的表现型，可能不是实际上可控的变量。胃肠(GI)道的免疫响应不易调节。涉及本源微生物及其代谢物的因素取决于GI道的正常菌群。
[0004]控制弯曲杆菌和/或沙门氏菌的定植的一种可能的方法是通过使用竞争性排斥(CE)。Nurmi和Rantala(Nature(自然)，第241卷，210-211，1973)证明通过将来自健康家禽肠内物质的细菌管饲给微生物群落还没有建成的年幼的雏鸡(chick)抵抗沙门氏菌定植，有效控制沙门氏菌的感染。给雏鸡施用不确定的CE制备物加速新孵出鸟类的消化道菌群的成熟，并提供由成年雌禽向其后代传送微生物群落的自然过程的替代者。实验室和实地调查的结果提供通过给雏鸡施用正常微生物群落控制弯曲杆菌的优点的证据；降低的鸟群受弯曲杆菌感染的频率(Mulder和Bolder，IN：Colonization Control of human bacterialenteropathogens in poultry(家禽中人细菌性肠道病原体的定植控制)；L.C.Blankenship(编)，Academic Press，加利福尼亚圣地亚哥，359-363，1991)以及降低的被定植的鸟类的粪便中空肠弯曲杆菌(C.jejuni)水平已有报道(Stern，Poultry Science(家禽科学)，第73卷，402-407，1994)。
[0005]Schoeni和Wong(Appl.Environ.Microbiol.，第60卷，1191-1197，1994)报道了通过一起应用碳水化合物添加剂和三种已被识别的拮抗剂(差异柠檬酸杆菌(Citrobacterdiversus)22，克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)23和大肠杆菌(Escherichia coli)25)显著减少了肉仔鸡(broiler)中空肠弯曲杆菌的定植。也有在用嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和屎链球菌(Streptococcus faecium)的家禽分离培养物治疗以后，感染肉仔鸡的肠内样品中空肠弯曲杆菌显著减少的证据(Morishita等，Avian Diseases(禽类疾病)，第41卷，850-855，1997)。
[0006]Snoeyenbos等(美国专利号4,335,107，1982年6月)通过冻干粪便并厌氧培养这种制备物开发了预防沙门氏菌定植的竞争性排斥(CE)微生物群落技术。Mikola等(美国专利号4,657,762，1987年4月)用肠道粪便和盲肠内容物作为CE微生物群落源用于预防沙门氏菌定植。Stern等(美国专利号5,451,400，1995年9月和美国专利号6,241,335，2001年4月)公开一种粘膜CE组合物以保护家禽和家畜抵抗沙门氏菌和弯曲杆菌的定植，其中预先洗涤的盲肠的粘蛋白层被刮下，被刮下的刮屑保持在无氧环境中，进行厌氧培养。Nisbet等(美国专利号5,478,557，1996年12月)公开了一种确定的益生菌，其可以得自各种家养动物，是通过连续培养直接由成年目标动物的粪便、盲肠和/或大肠内容物产生的分批培养物获得的。
[0007]微生物生产多种证明有抗细菌性质的化合物。一类这样的化合物，细菌素，由杀菌蛋白组成，其作用机制类似于离子载体抗生素。细菌素通常具有抵抗与其生产者密切相关的菌种的活性。它们在由复杂微生物种群，例如肠道，口腔或其他上皮表面分离出的细菌菌种中的广泛存在表明细菌素可能在细菌生态系统的种群动态方面具有调节作用。细菌素被定义为由细菌生产的具有生物活性蛋白部分和杀菌作用的化合物(Tagg等，Bacteriological Reviews(细菌学评论)，第40卷，722-256，1976)。其他特性可以包括；(1)窄谱抑制活性，集中于密切相关的菌种；(2)与特定的细胞受体结合；以及(3)质粒携带细菌素生产和宿主细胞细菌素免疫性的遗传决定簇。不完全确定的拮抗性物质被称为“细菌素样物质”。一些有效对抗革兰氏阳性菌、相反不对抗革兰氏阴性菌的细菌素，具有较广谱的活性。已有建议术语细菌素，当用于描述由革兰氏阳性菌生产的抑制剂时，应满足(1)是一种肽和(2)具有杀菌活性的最低标准(Tagg等，同上)。
[0008]乳酸细菌是最重要的益生菌微生物之一。它们是革兰氏阳性的，不产生孢子的，过氧化氢酶阴性的缺乏细胞色素的生物。它们是厌氧但耐氧的、有复杂营养要求的、耐酸的以及严格可发酵的，并以乳酸作为糖发酵的主要终产物。产乳酸细菌包括乳酸杆菌(Lactobacillus)菌种，双歧杆菌(Bifidobacterium)菌种，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，嗜酸芽孢乳酸菌(Sporolactobacillus inulinus)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等。这些菌种在其中广泛存在细菌素方面是受到特别关注的，也广泛应用于发酵奶、食品和肉加工工业中。它们在食品的保存和风味特征中的作用已有详尽记载。大部分由这些菌种生产的细菌素仅仅具有抵抗其他乳酸细菌的活性，但有几种显示出对较大种系差异的革兰氏阳性菌以及，在特定条件下，对革兰氏阴性菌的抗菌活性。
[0009]乳酸杆菌已被广泛研究其拮抗剂的生产。其中包括充分定性的细菌素(DeKlerk，Nature(自然)，第214卷，609，1967；Upreti和Hinsdill，Anticmicrob.Agents Chemother.第七卷，139-145，1975；Barefoot和Klaenhammer，Anticmicrob.Agents Chemother.第45卷，1808-1815，1983；Joerger和Klaenhammer，Journal of Bacteriology(细菌学杂志)，第167卷，439-446，1986)；可能的细菌素样物质(Vincent等，Journal of Bacterioll(细菌杂志)，第78卷，479，1959)，和其他与细菌素不必然相关的拮抗剂(Vakil和Shahani，Bacteriology(细菌学)，Proc.9，1965；Hamdan和Mikolajcik，Journal of Antibiotics(抗生素杂志)，第8卷，631-636，1974；Mikolajcik和Hamdan，Cultured Dairy Products(发酵乳制品)，1975，第10页；以及Shahni等，Cultured Dairy Products Journal(发酵乳制品杂志)，第11卷，14-17，1976)。
[0010]Klaenhammer(FEMS，Microbiol.Rev.(微生物学综述)，第12卷，39-86，1993)将当时所知的乳酸细菌细菌素分为四个主要类别：
第I类——羊毛硫抗生素(Lantibiotics)，其是<5kDa的小肽，含有不常见的氨基酸羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。它们受到特别关注是因为它们具有相对于其他细菌素而言非常广谱的活性。实例包括乳酸链球菌素(Nisin)、乳酸链球菌素Z、串珠菌素(carnocin)U149、产乳杆菌素(lacticin)481、和产乳杆菌素5。
第II类——小的不含羊毛硫氨酸的肽：一类非均质的<10kDa的小肽。这一类包括具有抵抗李斯特氏菌(Listeria spp.)的活性的肽。
第III类——大的热不稳定的>30kDa的蛋白质。实例是Helveticin。
第IV类——含有额外部分例如脂类和碳水化合物的复杂细菌素-蛋白质。
[0011]Raczek(2002年11月28日公布的美国专利申请US2002/0176910)公开了使用含有活着或死亡的分泌细菌素的微生物、或者细菌素自身或其组合形式的组合物以与农业牲畜的饲料一起使用。
[0012]在相关技术领域里描述了各种产细菌素的肠球菌和链球菌属以及其细菌素。然而，本发明提供新的组合物，其含有至少一种新的肠球菌和链球菌和或至少一种由所述新菌株生产的新细菌素；一种使用所述的菌株和/或细菌素的方法、所述新菌株、所述新细菌素的氨基酸序列以及其使用方法，所有这些与相关技术领域的菌株、细菌素以及使用方法是不相同的。
发明简述
[0013]因此本发明的目的是提供至少一种产新细菌素的新的肠球菌和链球菌菌株。
[0014]本发明进一步的目的是提供具有NRRL B-30745识别特征的新的仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)。
[0015]本发明再进一步的目的是提供具有NRRL B-30746识别特征的新的仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)菌株。
[0016]本发明的另一目的是提供由新的肠球菌和链球菌的菌株生产的新的细菌素。
[0017]本发明再进一步的目的是提供具有如在SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的新细菌素50-52。
[0018]本发明再进一步的目的是提供具有如在SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的新细菌素760。
[0019]本发明进一步的目的是提供通过向动物施用治疗组合物而至少降低由至少一种目标细菌在动物中的定植水平的方法，所述组合物包括至少一种产新细菌素的新的肠球菌和链球菌的菌株、至少一种由新的肠球菌和链球菌的菌株生产的新细菌素或所述新菌株和/或所述新细菌素的组合。
[0020]本发明的更进一步的目的是通过向动物施用治疗组合物而至少降低由至少一种目标细菌在动物中的定植水平的方法，所述组合物包括具有NRRL保藏号B-30746的识别特征的新的肠球菌的菌株、具有NRRL保藏号B-30745的识别特征的新的链球菌的菌株及其混合物。
[0021]本发明更进一步的目的是提供通过向动物施用治疗组合物而至少降低至少一种目标细菌在动物中的定植水平的方法，所述组合物包括具有如在SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的新细菌素50-52。
[0022]本发明更进一步的目的是提供通过向动物施用治疗组合物而至少降低至少一种目标细菌在动物中的定植水平的方法，所述组合物包括具有如在SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的新细菌素760。
[0023]本发明的另一目的是提供通过向动物施用治疗组合物而至少降低至少一种目标细菌在动物中的定植水平的方法，所述组合物包括由具有识别特征NRRL B-30746的新的肠球菌的菌株、具有识别特征NRRL B-30745的新的链球菌的菌株及其混合物生产的细菌素。
[0024]本发明的另一目的是提供乳球菌属(Lactococcus)诱导者菌株，所述诱导者菌株通过提高生产者菌株的细菌素的产量。
[0025]本发明的进一步的目的是提供具有识别特征NRRL B-30744的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的诱导者菌株。
[0026]本发明的进一步的目的是提供通过生产者菌株提高细菌素产量的方法，其中所述生产者菌株与乳球菌诱导者菌株共培养。
[0027]本发明的进一步的目的是提供通过生产者菌株提高细菌素产量的方法，其中所述生产者菌株与具有NRRL B-30744的识别特征的乳球菌菌株共培养。
[0028]本发明更进一步的目的是提供用于纯化细菌素的方法，所述方法包括收获培养液以及细胞作为分开的样本，通过用含有氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱来分离已经吸附到生产者和诱导者菌株两者的细胞表面上的细菌素，接着通过用疏水作用色谱一步离子交换色谱分离培养液中的细菌素。
[0029]本发明进一步的目的和优点将从以下说明中变得明显。
微生物的保藏
[0030]仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)，标明为NRRL B-30745(菌株760)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)标明为NRRL B-30746(菌株50-52)以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)标明为NRRL B-30744(菌株320)已按照布达佩斯条约的规定于2004年5月3日保藏于美国农业部农业研究服务中心专利培养物保藏中心(国家农业应用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research，1815 N.University Street，Peoria，Illinois 61604)。
附图的简要说明
[0031]图1A和1B是显示SDS-PAGE(1A)和等电聚焦(1B)后对细菌素760直接检测的照片。
[0032]图2A和2B是显示SDS-PAGE(2A)和等电聚焦(2B)后对细菌素50-52直接检测的照片。
发明详述
[0033]肠感染在人类中的重要性已经被日益充分地认识到。家禽污染和人类感染之间的关系也已有详尽记载。通过干预家禽加工厂消除这种健康危险的能力也是众所周知的。在肉仔鸡生产和加工过程中，含有病原体的粪便物被转移到肉上，并继续存在于加工食品的厨房中。
[0034]竞争性生物的代谢物可能有助于控制例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和沙门氏菌的病原体。已经从肉仔鸡的盲肠和嗉囊粘膜表面分离出了新的拮抗菌株。鉴定的拮抗剂的天然组分是具有广谱拮抗活性的低分子量肽，细菌素。
[0035]本发明提供新的肠球菌菌株、新的链球菌菌株、新的乳球菌菌株、新的细菌素，所述细菌素的氨基酸序列、含有所述新的细菌素和/或生产所述新的细菌素的菌株的治疗组合物、以及使用这些新的治疗组合物的方法。本发明还提供生产和纯化所述新的细菌素的方法。
[0036]屎肠球菌，NRRL B-30746，是一种兼性需氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37℃生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生不规则形状的边缘。在约37℃微需氧培养约24小时后，所述的菌落直径约2mm。
[0037]仓鼠链球菌，NRRL B-30745，是一种兼性需氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37℃生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生规则形状的边缘。在约37℃微需氧培养约24小时后，所述的菌落直径约1mm。
[0038]分离的肠球菌和链球菌用于生产新菌素活性的筛选是在接种由不同的所关注的目标细菌的营养琼脂上进行的。其他试验菌株在约37℃需氧条件下培养约18-24小时。小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶尔森菌(Y.pseudotuberculosis)在约28℃需氧条件下培养约18-24小时。抵抗空肠弯曲杆菌的活性试验是在由空肠弯曲杆菌接种的含约5％细胞溶解血液(lysed blood)的弯曲杆菌琼脂上进行的。血的使用在本领域普通技术中是充分的并且包括例如羊、马等。抵抗空肠弯曲杆菌的活性试验在约5％O₂、约10％ CO₂以及约85％ N₂的微需氧条件下在约42℃进行约24-48小时。约0.1ml的悬浮在生理盐水中的所述拮抗细菌被涂布到MRS琼脂上并温育约24-48小时。约0.5cm³的MRS琼脂立方体被切下并转移到由细胞溶解血液、约10微克/毫升的利福平、约2.4U/ml的多粘菌素补充的、并由约10⁷个空肠弯曲杆菌细胞接种的布氏琼脂或弯曲杆菌琼脂上。平板在约42℃微需氧条件下温育约24-48小时。通过测量生长抑制的区域评价活性。
[0039]评价用于细菌素生产的发现为拮抗性的分离物。由硫酸铵从拮抗菌株的培养物中沉淀制备粗抗微生物制备物(CAPs)，所述拮抗菌株在约37℃需氧条件下在约10％的布氏肉汤和细菌素增强量的用作诱导者的乳酸乳球菌(菌株320；NRRL-30744)中生长约14小时。细菌素增强量的诱导者定义为与没有诱导者菌株时培养的生产者菌株相比至少提高了生产者菌株的细菌素生产所需的诱导者细菌的量。共培养物中诱导者对生产者菌株的浓度比的实施例是约10:1(诱导者：生产者)。所述培养物然后在约2,500×g下离心约10分钟。拮抗肽通过硫酸铵沉淀、用Superose 12 HR凝胶过滤、用Sepharose SP FF阳离子交换色谱的组合从上清液中分离。分泌的细菌素可能与共培养物一起吸附到生产者和诱导者细胞两者的细胞表面上。为了获取这些细菌素，由离心步骤所得的细胞小团与具有约0.7％ NaCl，pH约8.0的磷酸盐缓冲液构成的洗脱缓冲液混合。混合该悬浮液并温育约20分钟，接着在约10,000g离心约15分钟。经在Superose SP FF上的离子交换色谱从上清液分离细菌素。由SDS-PAGE电泳确定所述肽的分子量。由等电聚焦确定所述肽的pIs。采用例如491 cLC自动测序仪(Applied Biosystems，Inc.)由Edman降解确定氨基酸序列。
[0040]为了本发明的目的，术语“肽”意为至少两个或更多个氨基酸或氨基酸类似物的化合物。所述氨基酸或氨基酸类似物可以通过肽键相连。在另一个实施方案中，所述氨基酸可以通过其他键，例如酯，醚等相连。肽可以是任何结构构型，包括线性、分支，或环状构型。本文所用的术语“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体两者，以及氨基酸类似物。
[0041]本发明的肽衍生物和类似物包括但不限于包含作为一级氨基酸序列的肽的全部或部分氨基酸序列的那些，所述肽的全部或部分氨基酸序列包括其中用功能等同的氨基酸残基替换序列中的残基从而导致保守氨基酸替换的改变的序列。
[0042]例如，所述序列中的一个或更多个氨基酸残基可以由具有相似极性的另外的氨基酸取代，所述氨基酸起功能等同物的作用，导致沉默改变。序列中氨基酸的替代物可以选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天门冬酰胺，和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸，和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这种改变不会显著影响聚丙酰胺凝胶电泳确定的表观分子量或等电点。非保守氨基酸替换也可以被引入以替换氨基酸，使之具有特别偏好的性质。例如，Cys可以被引入到可能的位置以与另一个Cys形成二硫桥。Pro可以因其特别的平面结构而被引入。
[0043]本发明的肽可以被化学合成。合成肽可以用熟知的固相、液相，或肽缩合(peptidecondensation)技术，或任何其组合制备，并且可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是使用Merrifield的原创的固相程序的标准去保护、中和、耦联和洗涤方法(J.Am.Chem.Soc，第85卷，2149-2154，1963)的标准Boc(N^α-氨基保护的N^α-t-丁基氧羰基)氨基酸树脂，或碱敏感的N^α-氨基保护的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino和Han，J.Org.Chem.，第37卷，3403-3409，1972)。此外，本发明的方法可以使用本领域技术人员熟知的其他N^α-保护的基团。固相肽合成可以用本领域的普通技术(参见例如Stewart和Young，Solid Phase Synthesis(固相合成)，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，I11.，1984；Fields和Noble，Int.J.Pept.Protein Res.，第35卷，161-214，1990)或用自动合成仪完成。
[0044]根据本发明，所述多肽和新的细菌菌株可以以治疗可接受的载体形式局部地、肠道外地、经粘膜地(例如经口、经鼻、经直肠或经皮)给药。本发明的肽如果需要的话可以被修饰以增加所述肽穿过细胞膜的能力，所述修饰例如通过增加所述肽的疏水性质、将所述肽作为载体的共轭物(例如针对某特定受体的配体)引入，等等。
[0045]本发明还提供将目标分子缀合(conjugate)到本发明的肽上的操作。本发明目的的目标分子意指当体内给药时定位到期望的一个或多个位置的分子。在本发明的各种实施方案中，所述的目标分子可以是肽或蛋白、抗体、凝集素、碳水化合物，或类固醇。目标分子可以是目标细胞上受体的肽配体或者抗体，例如单克隆抗体。为促进交联，所述抗体可以被简化为重和轻链杂合二聚物，或者F(ab′)₂片段可以被简化，并通过还原的巯基交联到所述的肽上。
[0046]本发明的另一方面涉及提供治疗组合物。所述组合物可以是针对口、鼻、肺给药、注射等等。所述治疗组合物包括有效量的至少一种本发明的细菌素以及其衍生物和/或至少一种新的菌株以至少降低至少一种目标细菌的定植水平，以及可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。稀释剂可以包括例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐的缓冲液；添加剂例如可以包括去污剂和增溶试剂，例如吐温80，聚山梨酯80等；抗氧化剂包括例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠等等；防腐剂可以包括，例如Thimersol、苯甲醇等等；以及增量物质例如乳糖、甘露糖醇等等。
[0047]本发明的治疗组合物可以被并入聚合化合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚乳酸、聚羟基乙酸等)特殊制备物中，或并入脂质体中。脂质体包封包括各种聚合物的包封。多种高分子载体可以用来包含和/或递送一种或更多种上面讨论的治疗剂，包括例如可生物降解和不可生物降解的组合物两者。可生物降解的组合物的代表性实例包括白蛋白、胶原蛋白、明胶、透明质酸、淀粉、纤维素(甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、醋酸琥珀酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素)、酪蛋白、右旋糖苷、多糖、纤维蛋白原，聚(D，L乳酸)、聚(D，L-乳酸-共聚-甘醇酸)、聚(乙交酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(烷基碳酸酯)和聚(原酸酯)、聚酯、聚(羟基戊酸)、聚二氧环己酮、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(苹果酸)、聚(羟基丙二酸)、聚酸酐、聚磷腈、聚(氨基酸)及其共聚物(一般地，见Ilium，L.，Davids，S.S.(编辑)的“Polymers in Controlled Drug Delivery(受控药物递送中的聚合物)”，Wright，Bristol，1987；Arshady，J.Controlled Release(受控释放杂志)17：1-22，1991；Pitt，Int.J.Phar.(国际药物杂志)59：173-196，1990；Holland等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)4：155-0180，1986)。
[0048]不可降解的聚合物的代表性实施例包括聚(乙烯-醋酸乙烯酯)(“EVA”)共聚物、硅橡胶、丙烯酸聚合物(聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkylcynoacrylate))、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(尼龙6，6)、聚氨酯、聚(酯聚氨酯)、聚(醚聚氨酯)、聚(酯-脲)、聚醚(聚(环氧乙烷)、聚(环氧丙烷)、Pluronics和聚(四亚甲基二醇))、硅橡胶和如聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚醋酸邻苯二甲酸乙烯酯的乙烯基聚合物等)。也可以开发阴离子(如海藻酸盐、角叉菜胶、羧甲基纤维素和聚(丙烯酸))或阳离子(例如，壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺以及聚烯丙胺)(一般地，见Dunn等，J.Applied Polymer Sci.(应用聚合物杂志)50：353-365，1993；Cascone等人，J.Materials Sci.：Materials in Medicine(材料科学：医药材料)5：770-774，1994；Shiraishi等，Biol.Pharm.Bull.(生物药物快报)16(11)：1164-1168，1993；Thacharodi和Rao，Int’l J.Pharm.(国际药物杂志)120：115-118，1995；Miyazaki等，Int’l J.Pharm.(国际药物杂志)118：257-263，1995)。
[0049]聚合物载体可以塑造成具有期望的释放特征和/或特定的期望性质的各种形式。例如，聚合物载体可以制成一旦暴露给特定的触发事件例如pH就释放治疗剂的形式(见，例如，在药物中的聚合物III(Polymers in Medicine III)，Heller等“Chemically Self-RegulatedDrug Delivery Systems(以化学的方式自调节的药物递送系统)”，Elsevier Science PublisherB.V.，阿姆斯特丹，1988，第175-188页；Kang等人，J.Applied Polymer Sci.(应用聚合物科学杂志)48：343-354，1993；Dong等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)19：171-178，1992；Dong和Hoffman，J.Controlled Release(受控释放杂志)15：141-152，1991；Kim等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)28：143-152，1994；Cornejo-Bravo等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)33：223-229，1995；Wu和Lee，Pharm.Res.(药物研究)10(10)：1544-1547，1993；Serres等人，Pharm.Res.(药物研究)13(2)：196-201，1996；在Gurny等人编辑的Pulsatile Drug Delivery(脉冲药物递送)中Peppas的“Fundamentals ofpH-and Temperature-Sensitive Delivery Systems(pH敏感和温度敏感的递送系统基础)”，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft GmbH，斯图加特，1993，第41-55页；在Peppas和Langer编辑的Biopolymers I(生物聚合物I)中Doelker的“Cellulose Derivatives(纤维素衍生物)”1993，Springer-Verlag，柏林)。代表性的pH敏感聚合物的实施例包括聚丙烯酸以及其衍生物(包括，举例来说，均聚物，例如聚氨基羧酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸，这些均聚物的共聚物，以及聚丙烯酸和例如以上讨论的丙烯酰类单体(acrylmonomer)的共聚物)。其他pH敏感的聚合物包括多糖例如醋酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、醋酸偏苯三酸(trimellilate)纤维素；以及壳聚糖。还有其他的pH敏感的聚合物包括pH敏感的聚合物和水溶性聚合物的任何混合物。
[0050]相似地，聚合物载体可以被制成温度敏感的形式(见，例如，Chen等人在受控释放生物活性材料国际会议论文集22：167-168中的“Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal DrugDelivery(用于阴道药物递送的接枝到生物黏附的聚丙烯酸骨架上的新型温敏普朗尼克水凝胶)”，Controlled Release Society，Inc.，1995；Okano在受控释放生物活性材料国际会议论文集22：111-112中的”Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for TemporalControlled Drug Delivery(用于时间控制药物释放的刺激相应水凝胶的分子设计)”Controlled Release Society，Inc.，1995；Johnston等人Pharm.Res.(药物研究)9(3)：425-433，1992；Tung，Int′l J.Pharm.(国际药物杂志)107：85-90，1994；Harsh和Gehrke，J.ControlledRelease(受控释放杂志)17：175-186，1991；Bae等人，Pharm.Res.(药物研究)8(4)：531-537，1991；Dinarvand和D′Emanuele，J.Controlled Release(受控释放杂志)36：221-227，1995；Yu和Grainger，＂Novel Thermo-sensitive Amphiphilic Gels：PolyN-isopropylacrylamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamide Network Synthesis andPhysicochemical Characterization(新型热敏型两亲性凝胶：聚N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸钠-共聚-n-N-烷基丙烯酰胺网络合成和物理化学表征)”，Oregon Graduate Institute ofScience & Technology化学和生物科学系，，俄勒冈州，比弗顿，第820-821页；Zhou和Smid，“Physical Hydrogels of Associative Star Polymers(缔合型星状聚合物的物理水凝胶)”，纽约州立大学环境科学和林业学院化学系聚合物研究所，纽约州锡拉丘兹(Syracuse)，第822-823页；Hoffman等人，“Characterizing Pore Sizes and Water’Structure‘inStimuli-Responsive Hydrogels(刺激响应性水凝胶中孔径和水’结构’的表征)”，华盛顿大学生物工程中心，华盛顿州西雅图，第828页；Yu和Grainger，“Thermo-sensitive SwellingBehavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks：Cationic，Anionic and AmpholyticHydrogels(交联N-异丙基丙烯酰胺网络中的热敏膨胀行为：阳离子、阴离子和两性水凝胶)”，Oregon Graduate Institute of Science & Technology化学和生物科学系，俄勒冈州比弗顿，第829-830页；Kim等人，Pharm.Res.(药物研究)9(3)：283-290，1992；Bae等人，Pharm.Res.(药物研究)，8(5)：624-628，1991；Kono等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)30：69-75，1994；Yoshida等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)32：97-102，1994；Okano等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)36：125-133，1995；Chun和Kim，J.ControlledRelease(受控释放杂志)38：39-47，1996；D′Emanuele和Dinarvand，Int′l J.Pharm.(国际药物杂志)118：237-242，1995；Katono等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)16：215-228，1991；在Migliaresi等人编辑的“Polymers in Medicine(医药中的聚合物)III”中Hoffman的“Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species(含生物活性物种的热可逆水凝胶)”，Elsevier Science Publisher B.V.，阿姆斯特丹，1988，第161-167页；在第三届药物递送系统新进展国际研讨会，犹他州盐湖城，1987年2月24-27日，第297-305页，Hoffman的“Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeuticsand Diagnostics(在治疗学和诊断学中热可逆聚合物和水凝胶的应用)”；Gutowska等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)22：95-104，1992；Palasis和Gehrke，J.Controlled Release(受控释放杂志)18：1-12，1992；Paavola等人，Pharm.Res.(药物研究)12(12)：1997-2002，1995)。
[0051]热胶凝聚合物的代表性实施例以及其凝胶温度(LCST(摄氏度))包括均聚物，例如聚(N-甲基-N-n-丙基丙烯酰胺)，19.8；聚(N-n-丙基丙烯酰胺)，21.5；聚(N-甲基-N-异丙基丙烯酰胺)，22.3；聚(N-n-丙基甲基丙烯酰胺)，28.0；聚(N-异丙基丙烯酰胺)，30.9；聚(N，n-二乙基丙烯酰胺)，32.0；聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)，44.0；聚(N-环丙基丙烯酰胺)，45.5；聚(N-乙基甲基丙烯酰胺)，50.0；聚(N-甲基-N-乙基丙烯酰胺)，56.0；聚(N-环丙基甲基丙烯酰胺)，59.0；聚(N-乙基丙烯酰胺)，72.0。此外，热胶凝聚合物可以由制备以上两种(多种)单体之间的共聚物而制得，或者通过组合这些均聚物和其他的水溶性聚合物而制备，所述水溶性聚合物例如丙烯酰类单体(例如，丙烯酸及其衍生物，例如甲基丙烯酸、丙烯酸酯和其衍生物，例如甲基丙烯酸丁酯、丙烯酰胺，以及N-n-丁基丙烯酰胺)。其他热胶凝聚合物的代表性实施例包括纤维素醚衍生物，例如羟丙基纤维素，41摄氏度；甲基纤维素，55摄氏度；羟丙基甲基纤维素，66摄氏度；以及乙基羟乙基纤维素和普朗尼克类，如F-127，10-15摄氏度；L-122，19摄氏度；L-92，26摄氏度；L-81，2O摄氏度；以及L-61，24摄氏度。
[0052]可以通过本发明的聚合物载体制成各种形式，包括例如棒形的设备、小丸、厚片或胶囊(见，例如，Goodell等人，Am.J.Hosp.Pharm.(美国医院药学杂志)43：1454-1461，1986；在Biomedical Polymer，Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use(生物医学聚合物，生物医学用途的聚合物材料和药物)中的Langer等人，“Controlledrelease of macromolecules from polymers(从聚合物受控释放大分子)”，Goldberg，E.P.，Nakagim，A.编辑，Academic Press，第113-137页，1980；Rhine等人，J.Pharm.Sci.(药物科学杂志)69：265-270，1980；Brown等人，J.Pharm.Sci.(药物科学杂志)72：1181-1185，1983；以及Bawa等人，J.Controlled Release(受控释放杂志)1：259-267，1985)。
[0053]治疗剂可以通过包藏(occlusion)在聚合物基质中，通过共价连接而束缚，或者包封在微胶囊里而被连接。在本发明某些优选的实施方案中，治疗组合物以非胶囊配方形式提供，所述非胶囊配方形式例如微球(尺寸从纳米到微米)，各种尺寸的糊剂和细丝(thread)、膜和喷雾。
[0054]本发明的另一方面是提供治疗组合物和动物饲料。本发明的治疗组合物如上所述可以用聚合物载体包覆并随后通过任何已知的将其施用于饲料的方法添加至饲料，所述的已知方法例如通过机械混合、喷雾等等。所述治疗组合物包括，一用量的至少一种细菌素，所述的用量对至少降低至少一种目标细菌在动物中的定植水平是有效的，例如约0.5克的一种或多种细菌素/100克，约1.25克的聚合物载体(例如聚乙烯基吡咯烷酮)/100克，以及约8.6％的稀释剂(例如水/100克)，与可消化的任意颗粒状组分混合，所述可消化的颗粒状物包括，碾磨玉米籽粒、研磨谷粒(例如燕麦、小麦、荞麦)、研磨水果(例如梨)等。然后所述治疗组合物以对至少降低至少一种目标细菌的定植水平有效的量被添加到任意种类的动物饲料中，所述的有效的量例如，举例来说细菌素对饲料的比例约1：10到约1：100。为了本发明的目的，动物饲料的实例包括青饲料、青贮饲料、干青饲料、根、块茎、肉质果、谷粒、种子、啤酒糟(brewer’s grain)、果渣、啤酒酵母、蒸馏残渣、碾磨副产品、生产糖、淀粉或油的副产品，以及各种食物废料。该产品可以添加到用于牛、家禽、兔、猪、或羊饲养等的动物食料中。可以与其他饲料添加剂混合用于这些家畜。
[0055]下述实施例仅仅是为了进一步举例说明本发明，并非要限制由权利要求确定的本发明的范围。
实施例1
[0056]从约1.0克肉仔鸡的盲肠的粘膜表面分离出的两种新的拮抗菌株，屎肠球菌菌株50-52(NRRL B-30746)以及仓鼠链球菌菌株760(NRRL B-30745)，被悬浮在约10ml灭菌的0.85％(w/v)的盐溶液(生理盐水)中并加热到约80℃约15分钟。约0.10ml的约1：50以及1：2500的悬浮液被铺展涂布到平板计数琼脂或MRS琼脂上。平板在微需氧条件下在约37℃温育约24小时。具有不同形态的菌落在MRS琼脂上划线。这些培养物在微需氧条件下在约37℃温育约24小时。
[0057]菌株760在约37℃在MRS琼脂上生长约24小时。所述菌株是兼性需氧菌和革兰氏阳性球菌，可以在约37℃和45℃间生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长，在约37℃需氧温育约24小时后产生规则圆形、低凸起、略灰色的菌落，具有波状边缘，直径约为2mm。菌株760的生物化学性质由APJ 50 CLH系统确定(Bio-Merieux，法国)。所述菌落分解乳糖、甘露醇、核糖、水杨苷、山梨糖醇、海藻糖、阿拉伯糖和蜜二糖。它略微水解棉子糖和菊糖(inulin)，不水解精氨酸和七叶苷。其不能α和β溶血。其在约6.5％氯化钠存在下不生长。该菌株是过氧化氢酶阴性的。
[0058]菌株50-52在约37℃在MRS琼脂上培育约24小时。所述菌株是兼性需氧菌和革兰氏阳性球菌，能够在营养琼脂或平板计数琼脂上生长，在约37℃需氧温育约24小时后产生不规则圆形、低凸起、略灰色的菌落，具有波状边缘，直径约为1mm。菌株50-52的生物化学性质由EN-Coccus试验确定。所述菌株分解精氨酸、阿拉伯糖和甘露醇；不水解山梨糖、山梨糖醇、蜜二糖、棉子糖和meticitose。其在约6.5％氯化钠存在下生长。
[0059]用于评价菌株50-52和760拮抗活性的目标细菌包括空肠弯曲杆菌(C.jejuni)NCTC 11168，肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)以及大肠杆菌(E.coli)0157：H7的分离物。在约5％ O₂、约10％ CO₂以及约85％ N₂的微需氧条件下，将空肠弯曲杆菌的培养物在含约5％的部分细胞溶解血液的布氏琼脂或弯曲杆菌琼脂上在约42℃下生长约24-48小时。其他的菌株在营养琼脂上在约37℃下培育约24小时。评价分离物对弯曲杆菌的拮抗活性。将约0.2ml生理盐水的悬浮液涂布到MRS琼脂上并在约37℃温育约24小时。切下约0.5cm³的MRS琼脂立方块并转移到每块板用约5％-10％的部分细胞溶液血液、约10mg/ml的利福平和约2.5u/ml的多粘菌素补充的、用约10⁷个细胞的空肠弯曲杆菌接种的布氏琼脂或弯曲杆菌琼脂上。平板在如上面所描述的微需氧条件下在约42℃下温育约24-48小时。通过测量空肠弯曲杆菌抑制区域的直径的大小来评价拮抗活性。
实施例2：
[0060]由两种拮抗菌株：肠球菌50-52和链球菌760的培养物提取粗抗微生物制备物。在37℃下将拮抗物在约250ml的10％的布氏肉汤中与诱导者菌株乳酸乳球菌菌株320(NRRL B-30744，如上)一起在需氧条件下培育约14小时。生产者菌株的浓度是约106CFU/mL而诱导者菌株是约10⁷CFU/mL。所得的培养物在约2,500×g离心约10分钟，去掉大部分活细胞。倾析掉的上清液与约60％的饱和硫酸铵混合并在约4℃温育约24小时以沉淀细菌素化合物。在以约10,000×g离心约20分钟后，沉降物被重新悬浮在约1.5ml约10mM pH约7.0的磷酸钠缓冲液中，并对约2.5L相同的缓冲液渗析过夜。所得溶液被称为粗抗微生物制备物(CAP)。所述制备物的样本通过经过0.22微米孔径的滤膜(Millipore，马萨诸塞州贝德福德，USDA)灭菌。表1显示使用和不使用诱导者菌株的细菌素生产。
表1：使用和不使用诱导者菌株乳酸乳球菌菌株320的细菌素生产

实施例3
[0061]采用斑点试验确定所述CAPs的抗微生物性谱。将约1ml在上面实施例2中获得的灭菌粗抗微生物制备物(CAP)用约1ml磷酸盐-钠盐缓冲液(pH约7.0)稀释并如实施例2中灭菌。每种样品约10微升被涂布到预先用目标细菌的细胞接种的血补充的弯曲杆菌琼脂或营养琼脂(MPA或Meta蛋白胨琼脂)上。约42℃下在微需氧条件下生长含有空肠弯曲杆菌的平板，在约28℃下需氧培养小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)和假结核耶尔森菌(Y.pseudotuberculosis)，其他细菌菌株在约37℃下需氧温育约24或48小时。识别基于目标细菌所产生的抑制区域。CAP的活性以在培养物生长抑制的可见区域出现时的任意单位(AU)每毫升制备物表示(Henderson等人，Archives of Biochemistryand Biophysics(生物化学和生物物理档案)，第295卷，5-12，1992，通过参考并入本文)。所有实验都进行两次。见下面实施例4中的表2。
实施例4
[0062]CAPs和细菌素在三甘氨酸缓冲液中在约15％的琼脂糖凝胶重量，约1％SDS(9×12cm)中电泳。在约100mA电泳约4小时后，凝胶用含有约15％乙醇和约1％醋酸的溶液固定。然后用蒸馏水洗涤所述凝胶约4小时。为了确定蛋白级份的分子量，所述凝胶用含有约0.21％的考马斯兰G-250、约40％的乙醇以及约7％的醋酸染色。洗涤过的凝胶通过Bhunia等的方法对三种目标细菌：空肠弯曲杆菌NCTC 11168、大肠杆菌0157：H7904以及肠炎沙门氏菌204进行试验(Journal of Industrial Microbiology(工业微生物杂志)，第2卷，319-322，1987；通过参考并入本文)。所述凝胶放置在细菌培养皿(Petri Dishes)中，用5％血-半固态弯曲杆菌琼脂(约0.75％)或半固态MPA覆盖，并用试验菌株的细胞接种。含空肠弯曲杆菌的平板在微需氧条件下在约42℃温育约48小时，大肠杆菌0157：H7以及肠炎沙门氏菌在约37℃温育约24小时。评定基于存在细菌素时试验细菌抑制生长的可见区域。
[0063]等电聚焦识别两种等电点上不同的迥异级份(pI：CAP760，含有具有pI＝约9，2和约9，5的级份。CAP 50-52含有具有pI＝约7.7和8.4的级份。在制备物760中具有pI＝约9.5的级份中观察到对空肠弯曲杆菌的拮抗活性，而在制备物50-52中，此抑制在pI＝约8.4的级份中被观察到(图1A-B和2A-B，下表1)。
[0064]用空肠弯曲杆菌盖覆的凝胶来确定哪个或哪些带对应抗微生物性、其分子量和等电点。针对细菌素760的图1A和1B，显示活性组分的分子量(1A)和活性组分的等电点(1B)。用空肠弯曲杆菌盖覆凝胶以确定抗微生物活性、分子量和等电点。在图1A中，道1显示LMW范围为14,400-94,000的分子量标记物(Amersham Pharmacia Biotech)：14,000、20,100、30,000、43,000、67,000以及94,000Da。道2中是胰岛素，β链的分子量标记物(Sigma，USA)：3,500Da。道3显示对应抗微生物活性的纯细菌素760，生长抑制区域(箭头)具有约5,500Da的质量。图1B，道1显示pI标准物(蛋白试验混合物，pI标记物蛋白，Serva)。道2显示的是对应抗微生物活性的纯细菌素760，生长抑制的区域(箭头)具有约9.5的pI。其他带不显示抗微生物活性。
[0065]图2A和2B显示利用SDS-PAGE(2A)和等电聚焦(2B)直接检测细菌素50-52。用空肠弯曲杆菌盖覆凝胶以确定哪个或哪些带对应抗微生物活性以及分子量(如图2A所示)。道1显示LMW范围为1,600-26,000的分子量标记物(Amersham Pharmacia Biotech)：1,600、3,500、6,500、14,200、17,000以及26,000Da。含有对应抗微生物活性的纯细菌素50-52的道2中的带，生长抑制区域具有约3,900Da的分子量。图2B，道1含有pI标准物(蛋白试验混合物，pI标记物蛋白，Serva)。对应抗微生物活性的道2中的带(纯细菌素50-52)，生长抑制的区域(箭头)具有约8.4的pI。其他带不显示抗微生物活性。
[0066]细菌素标本被放置在IEF凝胶上(pH约4.4-10.0)(Novex，加利福尼亚州圣迭哥)。在XCM II^TM Mini-Cell(Novex)中使所述凝胶在约100V跑约1小时，200V跑约2小时，在500V跑约30分钟。用蒸馏水洗涤凝胶约4小时而不固定，接着用考马斯蓝G-250染色以确定所述细菌素的等电点(Pi)以及它们抑制试验菌株生长的能力，如在图1和2中以及在表2中所示。
表2：通过斑点试验、SDS-PAGE以及等电聚焦(IEF)的方法评价的细菌素粗抗微生物制备物的抗菌活性