针对典型性猪瘟病毒的嵌合疫苗抗原.pdf

本发明描述了针对引起典型性猪瘟的病毒(CSFV)的嵌合疫苗抗原。所述疫苗抗原基于与刺激细胞和体液免疫系统的蛋白质分子相偶联的病毒亚单位。所述嵌合抗原可以在保证嵌合分子(其构成了本发明的基础)的正确三维折叠的表达系统中产生。包含所述嵌合抗原的疫苗组合物在经疫苗接种的猪中诱导诱导早期且强有力的免疫应答，其中赋予针对CSFV的完全保护。此外，所产生的疫苗组合物阻止病毒从母猪传播给其后代。所述嵌合抗原以及所得的疫苗组合物可以作为用于在猪中的预防用途的疫苗而应用于动物健康领域。

1.  针对典型性猪瘟病毒(CSFV)的嵌合疫苗抗原，其特征在于，所述嵌合疫苗抗原包含CSFV的病毒包膜的E2糖蛋白的细胞外区段和充当分子佐剂的免疫系统刺激性蛋白质。

2.  根据权利要求1的嵌合疫苗抗原，其中所述免疫系统刺激性蛋白质是α干扰素，或CD154分子的细胞外区段。

3.  根据权利要求2的嵌合疫苗抗原，其中所述α干扰素或CD154分子的细胞外区段可以来自任何哺乳动物。

4.  根据权利要求3的嵌合疫苗抗原，其特征在于，所述嵌合疫苗抗原实质上包含CSFV的E2糖蛋白的细胞外区段(Seq.ID.No.1)和猪CD154分子的细胞外区段(Seq.ID.No.2)的氨基酸序列。

5.  根据权利要求1的嵌合疫苗抗原，其经由重组方法、合成方法或者通过化学缀合来获得。

6.  根据权利要求1的嵌合疫苗抗原，其从经基因改造的哺乳动物的乳中获得。

7.  根据权利要求6的嵌合疫苗抗原，其通过乳腺的直接遗传转化而从非转基因哺乳动物的乳中获得。

8.  根据权利要求7的嵌合疫苗抗原，其中乳腺的直接遗传转化通过使用腺病毒载体来进行。

9.  根据权利要求6的嵌合疫苗抗原，其从转基因哺乳动物的乳中获得。

10.  根据权利要求5的嵌合疫苗抗原，其从经基因改造的酵母中获得。

11.  能够产生针对CSFV的保护性免疫应答的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含权利要求1-10中所描述的嵌合抗原。

12.  根据权利要求11的疫苗组合物，其可以通过全身或粘膜途径施用于动物。

针对典型性猪瘟病毒的嵌合疫苗抗原
技术领域
本发明涉及动物健康领域，特别地涉及在猪中形成针对此类病毒的早期且强有力的免疫应答的新型嵌合抗原，其包含与刺激细胞和体液免疫系统的蛋白质分子相偶联的典型性猪瘟病毒(Classic SwineFever Virus，CSFV)的病毒亚单位。
现有技术
典型性猪瘟(CSF)也称为猪霍乱，由于其高传染性特征及其世界范围的分布而被视为猪中最重要的疾病，并且它被包括在世界动物卫生组织(World Animal Health Organization)的通报疾病列表中。这种疾病的病原体即CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)的瘟病毒属的病毒。已知它是具有脂质包膜的病毒，其直径为40-60nm和呈现六方对称，并且具有单链核糖核酸(RNA)作为遗传物质(Kummerer等人(2000).The genetic basis for cytopathogenicity ofpestviruses.Vet.Microbiol.77：117-128；Moenning等人(2003).Clinical signs and epidemiology of Classical Swine Fever；areview of new Knowledge.Vet.Journal 165：11-20)。
CSF是高度接触传染性的疾病，在其急性形式中呈现出发热、毛细管变性、内脏器官坏死和死亡。主要临床征象在2-6天的潜伏期后出现，最初产生发热、运动减少和食欲缺乏，这在接下来的时间内变得更糟并且体温可以达到42℃。此外，出现白细胞减少症，其中白细胞系列(white series)的值小于8000/mm³血液。猪还形成结膜炎、便秘，随后为在末期中的腹泻、呕吐、缺乏运动协调、抽搐和肌肉轻瘫。在整个腹部、猪口鼻部、耳和腿的内部部分中扩展的红色肤色是明显的。在大多数致死病例中，脑的组织病理学显示具有高度血管化的非化脓性脑炎(Moenning等人(2002)Clinical Signs andEpidemiology of Classical Swine Fever.A review of new knowledge.Vet.Journal 161：1-10)。
CSFV在感染期间的行为如同免疫抑制剂(Susa等人(1992)Pathogenesis of Classical Swine Fever：B-lymphocyte deficiencycaused by Hog Cholera virus.J.Virol.66：1171-1175)，并且在感染后2-3周时开始检测到中和抗体(Laevens等人(1998).Anexperimental infection with a classical swine fever virus inweaner pigs.II.The use of serological data to estimate theday of virus introduction in natural outbreaks.Vet.Q.20：46-49)。感染的末期与循环系统中以及淋巴组织中B淋巴细胞显著减少相关联(Susa等人(1992).Pathogenesis of Classical SwineFever：B-lymphocyte deficiency caused hog cholera virus.J.Virol.66：1171-1175)。大多数得病的猪在感染后10-20天死亡，其死亡率超过95％。CSF特征性的尸检损害属于出血素质，其中在大多数器官系统中出现瘀斑。这些瘀斑在肾、膀胱和淋巴节中更常见，尽管它们还可以出现在脾、喉、粘膜和浆膜中(Mouwen等人(1983)Atlas of Veter inary Pathology，Bunge，Utrecht The Netherlands)。
经胎盘感染是CSF的其他临床形式；在这种情况下，病毒能够通过怀孕母猪胎盘感染胎儿。这种感染的后果可以是流产、产出死亡的后代、木乃伊化、畸形、产出虚弱的猪和在器官分化中的问题。取决于感染出现时的怀孕时间，可以由于通过母猪进行的感染而生出CSFV免疫耐受性后代(垂直传播)。小猪保持受感染状态和病毒血症直至死亡，其中导致CSFV散布稳定地集中于该兽群中(Moenning等人(2003)Clinical Signs and Epidemiology of Classical SwineFever：a review of new knowledge.Vet.Journal 165：11-20)。与CSF相关的死亡率构成了受影响国家的经济问题，其中对发展中国家的经济和社会形势的损害具有影响。由于这些原因，在具有高的猪密度和高的病毒流行的国家中，必须应用基于疫苗接种的控制计划。在其中猪生产主要由政府以津贴补助的高度发达的国家例如欧洲、美国和加拿大中，应用通过扑杀进行的根除法。然而，成本是极高的并且那些国家仍易受可能的地方性动物病的影响。
欧盟(EU)被视为这种疾病再度出现的高危地区，这是由于猪群的高密度、不接种疫苗的政策以及其与东欧国家(在那里CSFV是地方性动物病)在地理学上相接近。与这个区域中这种疾病再度出现相关的问题之一是存在具有CSF的地方性感染的野猪(Laddomada(2000)Incidence and control of CSF in wild boars in Europe.Vet.Microb，73：121-30)。这种再度出现已经发生，尽管在欧盟内部实现了一致的控制计划，其包括整个接触传染性群体的卫生处死和限制猪从受影响地区输出到无病地区(vanOirschot(2003)Vaccinologyof Classical Swine Fever：from lab to field.Vet Microbiol，96：367-384)。因而，当务之急是必需开发诱导早期且安全的免疫应答的疫苗，其保证针对感染和病毒传播的保护。
已开发了基于完整病毒的针对CSFV的疫苗：具有经结晶紫或福尔马林灭活的病毒的疫苗(Biront等人(1988)Classical swine feverrelated infections.Liess B.M.Ed.Martinus Nijhoff Publishing，Boston：181-200)，具有通过在兔中进行传代而减毒的病毒的疫苗，例如Sinlak毒株(Baibikov等人，RU2182495)和Lapinizied Chinese毒株(Dahle等人(1995)Assessment of safety and protecti vevalueof a cell culture modified strain C vaccine of hogcholera/classical swine fever virus.Berl-Munch.Tieraztl.Wsch，108：20-25)，或者具有在兔、豚鼠和猪的细胞培养中进行减毒的病毒的疫苗(Kachiku等人，JP 73001484；Terpstra等人(1990)Development and properties of a cellculture produced for hogcholera based on Chinese strain.Ditsh.Tierarztl.Wsch.97：77-79)。由于可能包含活性病毒的级分，这些类型的疫苗构成危险，所述活性病毒在易感动物上进行接种后将产生新的CSF爆发。此外，在某些情况下，需要重复免疫接种以获得保护性免疫应答，因为灭活影响病毒的免疫原性性质。
在具有减弱的毒力的活疫苗的特定情况下，它们具有潜在的风险，即发生部分减毒或毒力回复。在任何一种情况下，它们都将产生致病性病毒颗粒，所述致病性病毒颗粒在对易感动物接种后允许兽群中CSF的感染、临床疾病和传播。这些问题对怀孕母猪造成更大的危险，因为该病毒可以感染高度易感的胎儿，并且被感染的后代传播该疾病。
存在基于已证实减毒的CSFV毒株的疫苗，如C Chinese毒株、PAV250毒株、Thierval毒株和IFFA/A-49毒株(，H.JV.等人(1998)Molecular characterization of the 3’noncoding regionof classical swine fever virus vaccine strains.Virus Genes 16：307-312；Launais等人(1978)Hog Cholera Virus：Activeimmunization of piglets with the Thiverval strain in thepresence and absence of calostral passive immunity.Vet.Microbiology 3：31-43)。这些毒株仅在其中该疾病是地方性动物病的国家中使用，因为它们具有无法区分已接种疫苗的动物和感染了天然病毒的动物的不便。用这些毒株进行疫苗接种的动物在血清学测试中产生如同受感染动物中相同的应答。用基于减毒病毒的疫苗产生的特异性抗CSFV抗体干扰CSF感染的诊断。所述诊断通过免疫检测在扁桃体中的传染性病毒来进行，而所述疫苗病毒毒株恰恰在扁桃体中进行增殖。由于这些原因，减毒的毒株不适合在根除计划中使用。用LK-VNIIVVM毒株进行疫苗接种和用以弗氏佐剂配制的经纯化的Shi-Myng毒株进行另外的超免疫是另一个例子。但是，在40-45个位置中的免疫接种在其中每天必须对数百只动物进行疫苗接种的疫苗接种活动中是不可行的(Balashova等人，RU2183972)。
用包含完整病毒的这些疫苗进行免疫接种还干扰在由CSFV引起的感染和由可以感染猪的瘟病毒属的其他成员(如牛病毒性腹泻病毒(缩写为BVDV)和边界病病毒(缩写为BDV))引起的感染之间的区别性诊断(Dahle等人(1991)Clinical Post Mortem and VirologicalFinding safter Simultaneous Inoculation of Pigs with HogCholera and BVD Virus.J.Med.Vet.38：764-772)。
为了避免基于完整病毒的疫苗的那些不便，合适的结果是使用完全无害的疫苗，如基于通过重组方式获得的病毒亚单位或蛋白质的变体。这些变体应当保护兽群免于病毒毒株的再引入，并且还允许通过简单的血清学方法来区分已接种疫苗的动物和被感染的动物。在这个意义上，已开发出了基于病毒亚单位的疫苗。包含病毒蛋白质如病毒包膜的E2糖蛋白的疫苗(Bourna等人(2000)Duration of the onsetof the herd immunity induced by E2 subunit vaccine againstclassical Swine Fever virus.Vaccine 18：1374-1381)是安全的，因为它们的使用不涉及毒力回复的任何风险并且不干扰诊断。这些疫苗允许区分被感染的动物和已接种疫苗的动物，因为产生的抗体仅针对病毒区段具有反应性。因此，它们对于CSF根除计划是方便的。
已开发出了在原核生物中表达E2蛋白质的几种重组疫苗和基于此类蛋白质的合成肽的疫苗(Chen等人，WO200232453)。在这些情况下，蛋白质是非糖基化的，因此它的免疫原性和保护能力受到影响。另一种疫苗候选物使用病毒载体以用于在真核生物细胞中表达E2的异源基因，所述病毒载体如猪假狂犬病病毒(Peeters等人(1997).Biologically safe，non-transmissible pseudo rabies virus vectorvaccine protects pigs against both Aujeszky’sdisease andclassical swine fever.J.Gen.Virol.78：3311-3315)、猪天花病毒(Gibbs等人，US62117882)和猪腺病毒(Nagy等人，WO200183737)。在这些情况下，由野生型病毒进行的病毒感染产生针对相同血清型的病毒载体的中和抗体。因此，针对CSFV的免疫应答的诱导受到影响。此外，由于规章问题，基于猪假狂犬病病毒和猪天花病毒的表达载体不能在已宣布没有这些病毒的国家中应用。此外，痘苗病毒已用作载体，但世界卫生组织(World Health Organization)的条例阻碍其使用(Meyeers等人，EP 1087014)。
基于用于在肌细胞和骨细胞中表达E2蛋白质的裸露脱氧核糖核苷酸(DNA)的疫苗具有这样的不便，即需要较高浓度的DNA以诱导应答，因为使用裸露DNA的转染效率极低。这种疫苗服从于阻碍其应用的强有力的规章控制(Audonnet等人，WO 20152888)。
使用由杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统来产生作为抗原的E2导致可行的替代方案(Van-Rjin等人(1999).An experimental markervaccine and accompanying serological diagnostic test both basedon enveloped glycoprotein E2 of classical swine fever virus.Vaccine，17：433-440；Kretzdorn等人，US 20040028701)。在这个系统中，重组E2作为糖蛋白产生，这相对于非糖基化的变体而言增加了其免疫原性。不产生针对杆状病毒的抗体，因为杆状病毒进一步被灭活，并且不存在对于猪的致病影响。然而，在疫苗接种后3周之后诱导出针对感染的有效保护，并且不存在针对子宫内感染的完全保护。
因此，在CSF预防中的重要问题是不存在这样的亚单位重组疫苗，其允许在已接种疫苗的动物和被感染的动物之间的区别性诊断，并且在疫苗接种后能够产生早期保护，从而消除从怀孕母猪向其后代的经胎盘传播。
发明详述
本发明解决了上文提及的问题。新型疫苗包含嵌合抗原，所述嵌合抗原包含与免疫系统刺激性分子相组合的病毒亚单位，这允许形成保护猪不受CSFV感染的早期免疫应答。所提出的解决方案的另一个优点是，由于嵌合抗原中与病毒蛋白质相组合的刺激性分子的免疫增强效应，它消除了从受感染的怀孕母猪到其后代的病毒传播。
特别地，本发明涉及针对CSF的嵌合抗原，其具有CSFV包膜的E2糖蛋白作为主要组分。E2糖蛋白的细胞外区段用作与免疫系统刺激性蛋白质(在本发明背景中称为“分子佐剂”)相偶联的免疫原，以增强早期细胞免疫应答的刺激和更高CSFV中和抗体滴度的诱导。
在本发明的一个具体实施方案中，所述免疫系统刺激性蛋白质是α干扰素，或CD154分子的细胞外区段。在一个优选实施方案中，所述α干扰素或CD154分子的细胞外区段可以来自任何哺乳动物。
基于嵌合蛋白质的本发明的疫苗抗原从免疫接种后第1周开始保证在已接种疫苗的猪中的保护，当以10⁵LD₅₀(引起50％被CSFV感染的动物死亡的病毒剂量)攻击它们时。此类保护由针对CSFV的强烈细胞免疫应答介导，该强烈细胞免疫应答与合并在嵌合抗原中的元素组合直接相关。还观察到中和抗体诱导的时间减少，所述中和抗体诱导在疫苗接种后第2周出现。这有助于增加在已接种疫苗的猪中的针对CSFV的保护。经免疫的动物不呈现临床疾病的迹象，并且在用此类病毒攻击后任何一天中都不能从体液中分离出CSFV。
E2-分子佐剂这样的嵌合抗原阻止CSFV从母猪向其胎儿的垂直传播。这些蛋白质在怀孕母猪中诱导早期保护，这延迟临床疾病的形成，并且在用10⁵LD₅₀的CSFV攻击后，不仅在母体中而且在胎儿中均不允许病毒增殖。
在一个优选实施方案中，所述嵌合疫苗抗原的特征在于实质上包含CSFV的E2糖蛋白的细胞外区段(或结构域)的氨基酸序列，其在序列表中作为Seq ID.No.1呈现；和猪的CD154分子的细胞外区段的氨基酸序列，其为Seq ID.No.2。所述嵌合疫苗抗原实质上包含此类氨基酸序列，但它还可以包括来自CSFV的任何分离株的E2的细胞外区段。
本发明的另一个方面是，嵌合疫苗抗原可以通过重组方法、合成方法或者通过化学缀合来获得。在本发明的一个具体实施方案中，作为融合蛋白来产生基于包含E2his(与6组氨酸尾巴融合的E2的细胞外区段)和分子佐剂的嵌合蛋白质的变体。为此，将由4个重复的Gly₄Ser(4G₄S)单元组成的间隔肽和免疫系统刺激性分子加至E2his的C-末端。4G₄S肽的掺入允许多肽链具有一定程度的松弛。这保证蛋白质结构的正确三级结构折叠，以获得具有类似于天然蛋白质的三级结构的融合蛋白质。本发明的目的疫苗抗原之一具有在其C-末端处融合的猪CD154分子的细胞外区段以作为分子佐剂(E2his-CD154)。
迄今为止，仍未探究用于生产针对CSFV的重组疫苗候选物的在动物中的表达系统如生物反应器。然而，乳腺以正确折叠蛋白质三级结构的方式表达糖基化重组蛋白质的能力构成了足够的表达系统，以产生具有高免疫原性和保护能力的E2糖蛋白。由腺病毒载体介导的在反刍动物的乳腺中的瞬时表达系统构成了以快速且简单的方式获得重组蛋白质的高表达水平的工具(Toledo等人，WO 2004/034780)。这种方法对于重组E2的生产非常有用，目的是应用旨在根除CSF的疫苗接种计划。
在本发明的一个实施方案中，本发明的目的疫苗抗原在泌乳过程中表达于经基因改造的哺乳动物的乳腺上皮细胞中，并且分泌到乳中。重组嵌合分子在转基因哺乳动物的乳中产生，或者通过使用腺病毒载体直接转化非转基因哺乳动物的乳腺上皮来产生。在本发明的其他实施方案中，所述嵌合疫苗抗原在经基因改造的酵母中产生。此类抗原在酵母的培养基中获得，所述酵母用嵌合基因和允许重组蛋白质表达并分泌到培养基中的调控序列进行转化。
天然CSFV的E2蛋白质作为同二聚体暴露在病毒包膜上，通过链间二硫桥而得到稳定。这决定了，产生针对呈现在同二聚体上的构象表位的保护性中和抗体。在本发明过程中开发的疫苗抗原在允许这些重组蛋白质正确折叠的表达系统中产生。遗传构建体的设计保证融合蛋白的三级结构不改变。重组疫苗抗原通过简单的金属离子亲和层析步骤而容易地纯化。
遗传构建体的设计、表达系统的使用和纯化操作的相对简单性保证了，在本发明中描述的针对CSFV的疫苗抗原保持了类似于病毒E2蛋白质的抗原性和免疫原性性质。用在表达系统例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或山羊乳腺中产生的嵌合分子进行免疫接种导致早期且强有力的免疫应答。E2的细胞外结构域产生同二聚体，其提供了用于产生保护性中和抗体的构象表位。来自CD154的区段充当分子佐剂，其刺激已接种疫苗的猪的免疫系统，从疫苗接种后第1周开始产生保护动物不受CSFV影响的细胞免疫应答。这两种分子在包含间隔肽的嵌合蛋白质中的组合保证了每种分子的正确折叠。所使用的表达系统允许重组蛋白质以其糖基化形式进行表达。它还帮助获得具有正确的三级结构的分子。
本发明的另一个方面是能够产生针对CSFV的保护性免疫应答的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含前面所描述的嵌合抗原，所述嵌合抗原包含E2糖蛋白的细胞外结构域和分子佐剂。此类疫苗组合物可以通过全身或粘膜途径施用于动物，目的为预防CSF以及避免在猪群中由CSFV感染所产生的物料和经济损失。

附图简述
图1.在还原条件下经由SDS-PAGE来分析在用Ad-E2his-sec腺病毒载体转导的PK-15细胞中的E2his表达。(A)SDS-PAGE，泳道1：来自经转导的细胞的培养基，泳道2：来自未处理的细胞的培养基，MWM：分子量标准参照物。(B)使用针对组氨酸尾巴的单克隆抗体通过Western印迹法免疫鉴定E2his，泳道1：来自经转导的细胞的培养基；泳道2：来自未处理的细胞的培养基；泳道3：关于组氨酸尾巴的阳性对照，MWM：分子量标准参照物。(C)使用来自被CSFV感染的猪的多克隆血清通过Western印迹法免疫鉴定E2his，泳道1：来自未处理的细胞的培养基；泳道2：来自用Ad-E2his转导的细胞的培养基，MWM：分子量标准参照物。
图2.分析在用Ad-E2his-sec和Ad-E2hisCD154-sec腺病毒载体转导的PK-15细胞中E2his和E2his-CD154的表达条件。在非还原条件下通过SDS-PAGE分开培养基中的蛋白质。目的分子的免疫鉴定通过使用针对CSFV的E2蛋白质的单克隆抗体(Mab)(Mab-1G6)的Western印迹法来进行。泳道1：来自用Ad-E2his-sec载体转导的细胞的培养基；泳道2：来自用Ad-E2hisCD154-sec载体转导的细胞的培养基，MWM：分子量标记。
图3.在用Ad-E2his-sec载体转导的山羊的乳中E2his的表达动力学。在非还原条件下通过SDS-PAGE分开存在于相应于每个挤奶日的乳清样品中的蛋白质。E2his的免疫鉴定通过使用Mab-1G6的Western印迹法来进行。泳道PK：在用Ad-E2his-sec载体转导的PK-15细胞的培养基中表达的E2his阳性对照；泳道C-：来自未处理的山羊的乳清样品；泳道1-8：来自用Ad-E2his-sec载体转导的山羊的乳清样品，相应于腺病毒转导后8个挤奶日中的每一天。
图4.在用Ad-E2hisCD154-sec载体转导的山羊的乳中E2his-CD154的表达动力学。在非还原条件下通过SDS-PAGE分开存在于相应于每个挤奶日的乳清样品中的蛋白质。E2his-CD154分子的免疫鉴定通过使用Mab-1G6的Western印迹法来进行。泳道1-5：来自用Ad-E2hisCD154-sec载体转导的山羊的乳清样品，相应于腺病毒转导后5个挤奶日中的每一天；泳道C-：来自未处理的山羊的乳清样品；泳道PK：在用Ad-E2hisCD154-sec载体转导的PK-15细胞的培养基中表达的E2his-CD154阳性对照。
图5.在非还原条件下在SDS-PAGE中分开的E2his的纯度和鉴定分析。蛋白质在用Ad-E2his-sec载体转导的山羊的乳中表达，并且纯化通过金属离子亲和层析来进行。(A)纯化的不同步骤的SDS-PAGE。(B)通过使用Mab1G6的Western印迹法进行的免疫鉴定。泳道1：在用Ad-E2his-sec载体转导的PK-15细胞的培养基中表达的E2his阳性对照；泳道2：来自未处理的山羊的乳清样品；泳道3：来自用Ad-E2his-sec载体转导的山羊的乳清样品，其作为用于层析的起始材料而获得；泳道4：不与基质结合的材料；泳道5：用20mM咪唑洗涤；泳道6：用50mM咪唑洗涤；泳道7：以200mM咪唑洗脱。
图6.存在于被CSFV强毒株感染的猪血清中的抗体对于E2his疫苗抗原的2种同种型所进行的抗原识别的比较。从用Ad-E2his-sec腺病毒载体转化的山羊的乳中纯化出的E2his通过电泳法和Western印迹法在还原条件(单体)和非还原条件(同二聚体)下进行分析。(A)SDS-PAGE。(B)使用被CSF感染的猪的多克隆血清的Western印迹法，泳道1：在非还原条件下分开的E2his；泳道2：在还原条件下分开的E2his。
图7.在用单剂量的E2his疫苗抗原进行疫苗接种的2组猪中获得的中和抗体的动力学，其中抗体滴度通过过氧化物酶联中和测定法来测定。组A以30μg/动物的剂量进行接种，和组B以50μg/动物的剂量进行接种。这2个组在疫苗接种后3周以10⁵LD₅₀的CSF病毒剂量进行攻击。结果显示为滴度倒数的几何平均值。
图8.淋巴组织增生测定法，其使用在用E2-CD154抗原(组D和E)和E2his(组F)疫苗接种后第5天从猪中分离的淋巴细胞。结果表示为刺激指数(SI)，其被定义为经刺激的培养物的每分钟计数(count per minute，cpm)值和未处理的对照培养物的cpm值之间的比率。诱导了SI≥2的淋巴组织增生应答被视为是阳性的。评估了在用CSFV处理的培养物中的增殖，以及在用CSFV和针对猪CD4结构域的Mab处理的培养物中的增殖抑制。
图9.PK-15细胞中的抗病毒活性测定法，其使用来自用E2-CD154(组D和E)和E2his(组F)抗原进行疫苗接种的猪的血清。结果表示为滴度倒数的几何平均值。
图10.在用E2-CD154(组H)和E2his(组I)抗原进行疫苗接种的2组猪中获得的中和抗体的动力学，其中使用50μg/动物的剂量。抗体滴度通过过氧化物酶联中和测定法来测定。结果显示为滴度倒数的几何平均值。
实施例
实施例1：编码CSFVE2和猪CD154的细胞外结构域的基因区段的获得，和pMOS-E2his-CD154质粒的克隆。
通过逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)从Cuban CSFV“Margarita”分离株的病毒基因组(在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的数据库中的登记号为AJ704817)中扩增出编码363个氨基酸的E2的细胞外结构域的基因区段。在3′oligo中包括关于6组氨酸尾部的编码序列，以便允许抗原的简单纯化。
编码210个氨基酸的猪CD154的细胞外结构域的序列通过化学合成来获得，其中采用欧洲野猪(Sus scrofa)的CD154基因(NCBI登记号AB040443)作为序列原型。在编码该分子的序列的5′末端中包括编码4个重复的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(4G₄S)单元的肽的区域。通过亚克隆入pMOS-BLUE质粒(Amersham，USA)中，紧在E2his编码序列中的6组氨酸尾巴后插入合成的序列(4G₄S-CD154)。获得pMOS-E2his-CD154质粒。
实施例2：具有用于哺乳动物细胞的分泌信号的E2his和E2his-CD154分子的遗传构建。
将通过RT-PCR获得的、相应于E2his的序列插入质粒pAEC-SPT的BglII-EcoRV位点中(Herrera等人(2000)Biochem.ByophysRes.Commun.279：548-551)。由此，获得载体pE2his-sec，其包含编码E2his的序列，在该序列之前为人组织纤溶酶原激活物(htPA)的分泌信号，并且在人巨细胞病毒的立即早期启动子(CMVP)的转录控制下。
将亚克隆在pMOS-BLUE载体中的、相应于E2his-CD154的序列插入质粒pAEC-STP中关于核酸内切酶BglII-SalI的限制位点中。由此，获得载体pE2hisCD154-sec，其包含编码E2his-CD154的序列，在该序列之前为htPA的分泌信号，并且在CMVP的转录控制下。
实施例3：产生重组腺病毒载体，其包含具有关于哺乳动物细胞的分泌信号的编码E2his和E2his-CD154的序列。
基于AdEasy系统(AdEasy^TM-Vector system，QuantumBiotechnologies，EE.UU)来产生复制缺陷的腺病毒载体(Ad-ΔE1，ΔE3)。将质粒pAdTrack-CMV用作转移载体。
通过用Nco I和EcoR V限制性核酸内切酶进行酶促消化从质粒pE2his-sec中提取出具有htPA的分泌信号的编码E2his的序列(E2his-sec)，并且将它插入pAdTrack载体的EcoR V限制位点中。获得质粒pAdT-E2his-sec，其中E2his的可分泌变体处于CMVP的转录控制下。
通过用Nco I和Sal I限制性核酸内切酶进行酶促消化从质粒pE2his-CD154-sec中提取出编码可分泌的E2his-CD154的序列，并且将它插入pAdTrack载体的Kpn I-Xho I限制位点中。获得重组质粒pAdT-E2hisCD154-sec，其中E2his-CD154的可分泌变体处于CMVP的转录控制下。
转移腺病毒载体pAdT-E2his-sec和pAdT-E2hisCD154-sec通过用Pme I限制性核酸内切酶进行酶促消化来线性化，以便产生重组腺病毒基因组。将每种线性载体各自与pAdEASY-1载体一起共电穿孔到大肠杆菌(Escherichia coli)BJ5183菌株中。pAd-E2his-sec和pAd-E2hisCD154-sec载体的重组基因组通过同系物的重组来获得。其中之一包含编码E2his-sec的序列，和另一个包含编码E2his-CD154-sec分子的序列。在这两种情况下，它们保持在CMVP的转录控制下。
重组腺病毒基因组进一步用Pac I核酸内切酶进行消化，并且分开地在HEK-293A补充细胞系中进行转染，其中获得感染性病毒粒子。产生了2种腺病毒载体：Ad-E2his-sec和Ad-E2hisCD154-sec。所述载体独立地在HEK-293A细胞系中进行扩增，直至获得1 x 10¹²集落形成单位/mL(CFU/mL)的滴度，并且它通过在CsCl梯度中的双重离心进行纯化。所述载体进一步逆贮存缓冲液(10mM Tris pH 8.0，2mM MgCl₂，4％蔗糖)进行透析，并且保持于-70℃。
Ad-E2his-sec和Ad-E2hisCD154-sec腺病毒载体转化哺乳动物细胞以及介导E2his和E2his-CD154分子的表达和分泌到培养基中的能力通过在PK15猪细胞系中的感染测定法进行确证。在非还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分开在受感染细胞的培养基中存在的蛋白质样品，并且使用针对CSFV的E2的单克隆抗体(αE2-1G6)通过Western印迹法进行分析(图1和2)。
E2his和E2his-CD154糖蛋白的分子量分析证明它们相应于所述蛋白质的二聚和三聚同种型。在图2的泳道1中，观察到相应于E2-CD154的二聚同种型(180kDa)和三聚同种型(270kDa)的2个条带。
实施例4：原位转导山羊乳腺上皮以用于在乳中生产E2his和E2his-CD154。
对于使用表达盒E2his和E2his-CD154的乳腺上皮转化，使用Ad-E2his-sec和Ad-E2hisCD154-sec重组腺病毒载体。在这两种情况下，通过经乳头的通道对乳房进行直接输注而将所述载体接种在正在泌乳的山羊的乳腺中。腺病毒载体感染符合乳腺上皮的分泌性上皮细胞，这允许重组蛋白质的表达。
使用处于天然泌乳的第二个月并且平均产量为1L/天的山羊。最初对雌性山羊进行挤乳直至从乳房中去除乳以便转导腺病毒载体，随后通过乳头的通道将等渗盐水溶液直接输注到池(cistern)中，其中对乳房进行轻柔的按摩以保证充分洗涤乳腺。通过乳房的彻底挤乳来去除盐水溶液，并且该过程重复2次。随后，以在包含36mM EGTA的盐水溶液中10⁹CFU/mL的滴度输注腺病毒接种物。每个乳房的输注体积是可变的，并且保证池的全部充满，这取决于乳房的容量。输注后，对乳房实施按摩，以便促进腺病毒接种物均匀分布到乳腺中并达到腺泡的分泌性上皮细胞。腺病毒接种物在24小时后通过挤乳来去除。为了消除池中或乳腺管中的残留腺病毒载体，通过输注盐水溶液再次冲洗乳腺。
24小时后，通过人工挤乳开始从经转化的动物中收集乳。以12小时的间隔每天进行2次挤乳。将收集的乳贮存于-70℃。对于每个挤乳样品，分析E2his和E2his-CD154重组蛋白质在乳中的表达动力学(图3和4)。证明了重组蛋白质的分子大小相应于二聚和三聚同种型。所获得的在接种后第2-8天的E2his的平均表达为1.03g/L，其中每只动物的平均产量为5.22g。对于重组分子E2his-CD154，获得0.73g/L的平均表达，其中平均产量为3.04g/动物。
实施例5：从山羊乳中纯化E2his和E2his-CD154抗原。
分别将包含E2his和E2his-CD154重组疫苗抗原的每个挤乳日的样品相混合，并于4℃在15000g下离心30分钟。分离可溶相(乳清)并弃去脂肪相。将收集的乳清以1:4的比例稀释在乳分离缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM CaCl₂，pH：8.0)中。将混合物在冰上冷却30分钟，并于4℃在15000g下离心30分钟。上清液和沉淀物通过SDS-PAGE和Western印迹法进行分析。确定，此类重组蛋白质的大部分存在于可溶相中，而沉淀物主要包含酪蛋白。
包含目的重组抗原(E2his和E2his-CD154)的乳清级分通过在0.8μM和0.4μM膜(Millipore)中进行系列过滤而得到澄清，并且进一步施加到用Ni-NTA-Agarose基质(Qiagen，USA)填充的XK16纯化柱(Amersham，USA)中。进行使用100mM磷酸盐缓冲液，20mM咪唑，pH7.2(第一次洗涤)以及100mM磷酸盐缓冲液，50mM咪唑，pH7.2(第二次洗涤)的2个洗涤步骤。洗涤后，在100mM磷酸盐缓冲液，20mM咪唑，pH7.2中洗脱目的蛋白质。将相应于纯级分的峰逆10mM磷酸盐缓冲液，pH7.2进行透析(图5)。
从山羊乳中的E2his和E2his-CD154的纯化操作对于这两种疫苗抗原来说是相同的。以高于90％的纯度水平获得这两种蛋白质。以70％的回收率获得E2his，和在E2his-CD154的情况下，获得58％的回收率。纯化的蛋白质通过SDS-PAGE和Western印迹法进行分析，以便确定蛋白质聚集体形成。可以确定，在乳中产生的E2his的二聚同种型(同二聚体)被来自受CSFV感染的猪的多克隆血清有效地识别，这表明该分子的这种特异的构象增加分子抗原性(图6)。
实施例6：在巴斯德毕赤酵母甲醇营养酵母中的表达载体的构建。
巴斯德毕赤酵母表达载体pPS10用Nae I限制性核酸内切酶进行消化，以便在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)蔗糖转化酶(Suc2)的分泌信号的3′末端处掺入目的编码序列。将由PCR扩增的E2编码序列插入pPS10质粒的Nae I限制位点中。通过用Sma I-EcoRV限制性核酸内切酶进行酶促消化而从pMOS-E2his-CD154质粒中移出E2his-CD154编码序列，并插入pPS10的Nae I限制位点中。由此，获得pPS-E2his和pPS-E2his-CD154质粒，其中编码这两种分子的序列与酿酒酵母的Suc2的分泌信号向偶联，并且保持在巴斯德毕赤酵母醇氧化酶(AOX1)启动子的转录控制下。
重组质粒用Pvu II限制性核酸内切酶进行线性化，并且将它们电穿孔入巴斯德毕赤酵母MP36菌株的电感受态细胞中。由此，产生了用质粒pPS-E2his和pPS-E2his-CD154稳定转化的巴斯德毕赤酵母MP36菌株的几个克隆。这种菌株是组氨酸营养缺陷型突变体，因此重组酵母获得His⁺表型，从而允许其的选择。
还通过Southern印迹法来分析最初通过斑点印迹法鉴定的重组酵母，以便确定可以通过巴斯德毕赤酵母AOX1基因的替换而发生的整合模式，产生Mut^s-His表型(甲醇的低使用)。AOX1的基因替换通过在酵母基因组中和在质粒中存在的AOX1启动子区域和3′AOX1区域的重组而发生，结果消除了AOX1基因的编码区。具有Mut^s表型的重组酵母支持AOX2基因中的醇氧化酶产生，但它在甲醇中的生长率很低。此外，可以通过替换来获得整合模式，表型Mut⁺-His⁺。
编码E2his和E2his-CD154变体的序列保持在AOX1启动子(其可通过甲醇诱导)调控下。巴斯德毕赤酵母分泌低水平的蛋白质，并且其培养基不需要蛋白质补充物，因此，可以预期，分泌的异源蛋白质构成了培养基中的总蛋白质的大部分(直至超过80％)。重组蛋白质的生产在5L的发酵罐中进行。表达的诱导通过在5天期间向培养物中加入甲醇来进行，并在发酵培养基中获得重组蛋白质。E2his以0.143mg/mL的水平分泌到重组酵母培养基中。在E2his-CD154的情况下，获得0.122mg/mL的表达水平。
实施例7：从巴斯德毕赤酵母培养基中纯化E2his和E2his-CD154抗原。
将发酵产物于4℃在10000g下离心30分钟，以便从液相中分离出生物量。培养基在0.8μM和0.2μM膜(Millipore)中进行过滤，并将它施加到用Ni-NTA-Agarose基质(Qiagen，USA)填充的XK16纯化柱(Amersham，USA)中。进行使用100mM磷酸盐缓冲液，30mM咪唑，pH7.2的洗涤，并且目的蛋白质用100mM磷酸盐缓冲液，200mM咪唑，pH7.2进行洗脱。将纯的级分逆10mM磷酸盐缓冲液进行透析。用于从经遗传转化的巴斯德毕赤酵母的发酵上清液中纯化E2his和E2his-CD154的操作程序对于这两种疫苗抗原来说是相同的。以高于95％的纯度水平获得这两种蛋白质。以83％的回收率获得E2his，和在E2his-CD154的情况下，获得78％的回收率。
实施例8：在用可分泌的E2his变体进行疫苗接种的猪中的保护试验。
在这个测定法中使用24只健康猪，其体重为大约20kg、具有对于CSFV而言阴性的血清学并且属于未疫苗接种和不含CSF的兽群。将猪分成每组8只动物的组，并且将它们饲养在无限制地获得水和食物的3个分开的实验房间(A、B和C)中。
组A和组B的动物用包含E2his抗原的疫苗组合物以30μg(组A)和50μg(组B)/动物的单剂量进行免疫接种，以及组C用安慰剂进行免疫接种。将抗原配制在油包水乳状液中，并且通过在颈中经肌内途径注射2ml来进行接种。由比例为1:1(V/V)的佐剂和磷酸盐盐水溶液构成的安慰剂以相同条件进行接种。在免疫接种后的第3周，通过肌内注射用10⁵LD₅₀的同源的CSFV“Margarita”毒株对所有动物进行攻击。
考虑到没有观察到正常临床参数改变这一事实，用E2his疫苗组合物进行接种不产生不利反应。在免疫接种第2周后在经疫苗接种的组中获得高于1/50的中和抗体滴度(被视为具有保护性)。在第3周后，滴度增至1/1600-1/6400(图7)。在经疫苗接种的组(A和B)之间没有观察到免疫应答的差异。已接种疫苗的猪不发展出发热或该病的临床症状，并且在攻击后的时期中从淋巴细胞中没有制得病毒分离物。然而，安慰剂组发展出该病的所有临床症状，包括发热、出血和非化脓性脑炎。在这个组中，从攻击后第4天直到处死当天获得病毒分离。在此，证实了，采用所建议的疫苗接种方案用E2his组合物(以30μg的剂量进行施用)进行疫苗接种的断奶猪保持受到保护而不出现临床症状和CSFV感染。
实施例9：在用可分泌的E2his抗原进行疫苗接种的怀孕母猪中的垂直保护试验。
取在血清学上对于CSFV而言阴性的、来自无CSF疾病或疫苗接种史(3年前)的兽群的10只母猪。在断奶后，通过激素处理来诱导发情周期，并且在3天后对所有母猪进行授精。授精与免疫接种同时进行。在5只母猪的一个组中，通过在颈中通过肌内途径注射2mL来施加实施例7(组B)中提及的疫苗组合物。取其余5只母猪作为阴性对照组，并且用由比例为1:1(V/V)的2mL佐剂和盐水溶液构成的安慰剂进行注射。疫苗接种组在21天后接受加强免疫。通过测量临床三联征(温度、心脏脉搏和呼吸频率)来研究怀孕母猪，并且每周进行抽血以用于抗CSFV的中和抗体的血液学和检测。2个月后，通过肌内注射用10⁵LD₅₀的同源CSFV“Margarita”毒株攻击怀孕母猪。在攻击后第3和5天时从外周血淋巴细胞中分离病毒，以便检测CSFV的存在。攻击后2周，处死母猪，并取出胎儿以用于病毒学、形态学和病理解剖学分析。在该实验期间，母猪可无限制地获取水和食物。
该疫苗对于所有怀孕母猪是无害的，并且在免疫接种后的时期中不存在流产或临床改变。经疫苗接种的动物发展出滴度为1:50-1:51200的抗CSFV的特异性中和抗体。疫苗接种组的母猪在攻击后仍是完全健康的。这些动物无一呈现发热、白细胞减少症、血小板增多症或任何其他CSF临床征象。
通过形态测量法和病理解剖学进行的分析允许确定，来自已接种疫苗的母猪的胎儿具有正常大小并且不呈现组织病理学损害。没有从在攻击后提取的母猪血液样品中获得的白细胞中分离出CSFV。也没有从处死的胎儿的血液或器官中分离出CSFV。
安慰剂组的母猪在攻击后具有发热和白细胞减少症。这些母猪之一在攻击后第8天流产，并且在攻击后第9天被处死。在来自攻击后2周时处死的母猪的胎儿中和在流产出的胎儿中观察到病理学征象，如小尺寸、木乃伊化、脾肿大、肾和膀胱中的几个瘀斑以及非化脓性脑炎。在来自这个组的胎儿的所有器官和血液中分离出了CSFV。用E2his疫苗组合物对猪进行疫苗接种防止了CSFV从母猪传播给后代。
实施例10：在用E2his-CD154疫苗组合物进行接种疫苗的猪中的早期保护试验。
取每组6只猪的4个组(在与实施例8中相同的条件下)，并且以下述量的抗原来施加疫苗组合物：50μgE2his-CD154(组D)、80μgE2his-CD154(组E)、50μgE2his(组F)。组G作为安慰剂组。将抗原配制在“油包水”乳状液中，并且通过IM注射来接种2mL，安慰剂组用不含蛋白质的佐剂进行接种。疫苗以单剂量进行施加。在免疫接种后第8天时通过用10⁵LD₅₀CSFV“Margarita”毒株进行IM接种来攻击动物。在实验期间每天记录临床征象，并且每周进行抽血以用于血液学和中和抗体的分析。此外，获取在疫苗接种后第1、3、5和7天时的血液样品，以通过淋巴组织增生和“血清中的抗病毒活性”测定法来评估细胞免疫应答。
在疫苗接种后，观察到正常的临床征象，并且在接种部位处没有观察到不利反应。在用E2-CD154抗原进行疫苗接种的动物(组D和E)中，在淋巴组织增生测定法中检测到淋巴细胞对于植物凝集素促分裂原的应答与对于CSFV的应答一样均增加。这种应答被针对CD4结构域的Mab阻断，这表明该免疫应答由T辅助淋巴细胞介导。在该测定法期间，来自组F和G(安慰剂)的动物的淋巴细胞样品不响应于用促分裂原和用CSFV的刺激(图8)。
在组D和E中在用E2-CD154抗原进行疫苗接种后第3、5和7天时，在样品中观察到高干扰素α滴度。然而，在该实验时间期间，在用E2his抗原(组F)进行疫苗接种的动物中和在安慰剂组(G)中没有检测到干扰素。在PK-15细胞中进行针对传染性胃肠炎病毒的“抗病毒活性测定法”。在组D和E中，获得1：512的抗病毒活性滴度；然而，在来自用E2his进行免疫接种的猪的样品中和在安慰剂组中没有检测到抗病毒保护作用(图9)。由这些实验确定，与CD154分子偶联的E2抗原增强针对CSFV的细胞免疫应答，这与CD154的免疫刺激活性相关。
实施例11：在用单剂量的包含E2his和E2his-CD154的疫苗组合物进行疫苗接种的猪中，中和抗体动力学的比较。
取每组6只猪的3个组，其体重为大约20kg，在血清学上对于CSFV而言是阴性的，来自无CSF疾病或疫苗接种史(3年前)的兽群。每日无限制地给动物供应水和食物。
在组H中，每只动物用50μgE2his-CD154进行疫苗接种；在组I中，用50μgE2his进行疫苗接种；和组J作为安慰剂组。将抗原配制在“油包水”乳状液中，并且通过IM注射来接种2mL，安慰剂组用不含蛋白质的佐剂进行接种。施加单剂量，并且在免疫接种后5周期间通过过氧化物酶联中和测定法(NPLA)来测量中和抗体的水平。
在用E2-CD154和E2his进行疫苗接种的组(H和I)中，从免疫接种第2周开始检测中和抗体，测得滴度超过1:50(被视为具有保护性)。在试验期间在来自安慰剂组的动物中未检测到抗体。在免疫接种后第2周时，来自组H(E2-CD154抗原)的动物的中和抗体滴度高于来自用E2his抗原进行免疫接种的组。那些结果暗示，在组H的动物中具有更高的体液应答的刺激(图10)。
可以得出结论，当与E2his疫苗组合物相比较时，以50μg剂量水平的E2his-CD154疫苗组合物是安全的、具有免疫原性的并且在已接种疫苗的猪中诱导早期体液应答。
实施例12：在用包含可分泌E2his-CD154的疫苗组合物进行接种疫苗的怀孕母猪中的垂直保护试验。
选择具有与在实施例8中所使用的那些相同的健康条件和来源的10只母猪。断奶后，通过激素处理来诱导发情周期，并且在3天后对所有母猪进行授精。同时地，5只母猪的一个组通过IM途径在颈中注射2mL来用E2his-CD154疫苗组合物进行免疫接种(80μg/动物；在实施例10中对于组E所使用的组合物)。其余5只猪的一个组用佐剂(作为安慰剂)来进行免疫接种。通过测量临床三联征(温度、心脏脉搏和呼吸频率)来研究怀孕母猪，并且每周进行抽血以用于抗CSFV的中和抗体的血液学和检测。在怀孕2个月时，用10⁵LD₅₀的CSFV“Margar ita”毒株来攻击动物。通过在攻击后第3和5天时抽血液来分析病毒血症。2周后，处死母猪，并取出胎儿以用于病毒学、形态学和病理解剖学分析。在该实验期间，母猪可无限制地获取水和食物。
在免疫接种后没有观察到流产情况或其他CSF临床征象。因此，以单次免疫接种的E2his-CD154疫苗组合物在怀孕母猪中是安全的。经疫苗接种的动物形成1:50-1:16000的针对CSFV的特异性中和抗体滴度。
在攻击后，在经疫苗接种的母猪的组中没有观察到发热、白细胞减少症或血小板增多症。在这个组中，通过形态测量法和病理解剖学分析测定，胎儿具有正常大小并且没有组织病理学损害。在攻击后获取的血液样品中，从经疫苗接种的母猪的白细胞中未分离出CSFV，也没有从处死的胎儿的血液或器官中分离出CSFV。
安慰剂组的母猪在攻击后具有发热、白细胞减少症和食欲缺乏。来自这个组的胎儿具有减少的大小，并且显示出与CSF相符的组织病理学损害，如脾肿大、肾和膀胱中的瘀斑、肠中的坏死灶、在内脏器官中的几处出血和非化脓性脑炎。从来自这个组的胎儿的所有器官和血液中分离出CSFV。用以所评估的时间表施加的E2his-CD154疫苗组合物对怀孕母猪进行接种疫苗，阻止了CSFV从母猪传播给后代。
序列表
<110>CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY
<120>对典型性猪瘟病毒的嵌合疫苗抗原
<130>PPC-E2
<140>
<141>
<150>CU2006-0052
<151>2006-02-28
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>363
<212>PRT
<213>典型性猪瘟病毒
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(363)
<223>363aa的多肽序列，其相应于CSFV的E2蛋白质的细胞外区段
<400>1


<210>2
<211>210
<212>PRT
<213>欧洲野猪
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(210)
<223>210aa的猪CD154的细胞外结构域，
其是通过将欧洲野猪的CD154基因(AB040443)作为序列原型而获得的
<400>2