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DHA和ARA在制备用于调节基因表达的组合物中的用途
发明背景
(1)发明领域
总的来说，本发明涉及用于调节受试者中的基因表达的方法。
(2)相关领域的描述
每个基因包含制备蛋白质或非编码核糖核酸(RNA)所需的信息。然而，为了在细胞中生产功能性RNA和蛋白质分子，基因必须进行表达。基因表达在2个主要阶段——转录和蛋白质合成中发生。在转录期间，基因进行拷贝以产生具有与基因基本上相同的序列的RNA分子(初级转录物)。大多数人基因分成外显子和内含子，并且只有外显子携带蛋白质合成所需的信息。大多数初级转录物因此通过剪接进行加工，以去除内含子序列且产生仅包含外显子的成熟转录物或信使RNA(mRNA)。
基因表达的第二个阶段——蛋白质合成也称为翻译。在这个阶段期间，在脱氧核糖核酸(DNA)和RNA的核苷酸序列与蛋白质中的氨基酸序列之间没有直接对应。事实上，需要3个核苷酸以指定1个氨基酸。
人基因组中的所有基因并非以相同方式进行表达。一些基因在所有细胞中所有时间表达。这些所谓的持家基因是非常基本的细胞功能所必需的。其他基因在特定细胞类型中或在特定发育阶段时表达。例如，编码肌肉蛋白质例如肌动蛋白和肌球蛋白的基因仅在肌细胞而不在脑细胞中表达。另外的其他基因可以通过在身体内循环的信号例如激素得到激活或抑制。
这种差别基因表达通过调节转录和翻译来达到。所有基因由控制其表达的DNA序列包围。称为转录因子的蛋白质与这些序列结合且可以使基因打开或关闭。基因表达因此受不同转录因子的可用性和活性的控制。
因为转录因子本身是蛋白质，所以它们也必须由基因生产，并且这些基因必须受其他转录因子的调节。以这种方式，所有基因和蛋白质可以连接成从发育开始时卵中存在的转录因子开始的调节层次。许多人类疾病已知起因于转录因子的不存在或功能失常，且因此引起基因表达的破坏。
如果基因不以正确的时间、场所和量表达，那么疾病可能发生。因此，提供可以调节或调谐某些基因在受试者中的表达且从而预防各种疾病和病症的发作或治疗各种疾病和病症的组合物将是有利的。
发明概述
简言之，本发明涉及用于调节受试者中的一种或多种基因表达的新方法，其中所述基因选自本文表4-9中在“基因符号”列下列出的那些基因，所述方法包括给受试者施用单独或彼此组合的DHA和ARA。受试者可以是婴儿或儿童。受试者可以是需要此种调节的受试者。在特定情况下，ARA和DHA可以以约1:10-约10:1的ARA:DHA重量比施用。
本发明还涉及用于上调受试者中的一种或多种基因表达的新方法，其中所述基因选自本文表4和6中在“基因符号”列下列出的那些基因，所述方法包括给受试者施用单独或彼此组合的DHA或ARA。
本发明另外涉及用于下调受试者中的一种或多种基因表达的新方法，其中所述基因选自本文表5和7中在“基因符号”列下列出的那些基因，所述方法包括给受试者施用单独或彼此组合的DHA或ARA。
本发明还涉及用于上调受试者中的一种或多种基因表达的新方法，其中所述基因选自TIMM8A、TIMM23、NF1、SFTPB、ACADSB、SOD、PDE3A、NSMAF、OSBP2、FTH1、SPTLC2、FOXP2、LUM、BRCA1、ADAM17、ADAM33、TOB1、XCL1、XCL2、RNASE2、RNASE3、SULT1C1、HSPCA、CD44、CD24、OSBPL9、FCER1G、FXD3、NRF1、STK3和KIR2DS1，所述方法包括给受试者施用单独或彼此组合的DHA或ARA。
在一个实施方案中，本发明进一步涉及用于调节受试者中的一种或多种基因表达的方法，其中所述基因选自TIMM8A、TIMM23、NF1、LUM、BRCA1、ADAM17、TOB1、RNASE2、RNASE3、NRF1、STK3、FZD3、ADAM8、PERP、COL4A6、PLA2G6、MSRA、CTSD、CTSB、LMX1B、BHMT、TNNC1、PDE3A、PPARD、NPY1R、LEP及其任何组合。
在一个实施方案中，本发明还涉及用于治疗或预防受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括通过给受试者施用有效量的单独或彼此组合的DHA或ARA来调节受试者中选自TOB1、NF1、FZD3、STK3、BRCA1、NRF1、PERP和COL4A6的基因。
本发明涉及用于治疗或预防受试者中的神经变性的方法，所述方法包括通过给受试者施用有效量的单独或彼此组合的DHA或ARA来调节受试者中选自PLA2G6、TIMM8A、ADAM17、TIMM23、MSRA、CTSD、CTSB、LMX1B和BHMT的基因。本发明还涉及用于改善受试者中的视力的方法，所述方法包括通过给受试者施用有效量的单独或彼此组合的DHA或ARA来调节受试者中的LUM基因。本发明进一步涉及用于治疗或预防受试者中的黄斑变性的方法，所述方法包括通过给受试者施用有效量的单独或彼此组合的DHA或ARA来调节受试者中的LUM基因。
在其他实施方案中，本发明涉及用于刺激受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括通过给受试者施用有效量的单独或彼此组合的DHA或ARA来调节受试者中选自RNASE2、RNASE3和ADAM8的基因。本发明涉及用于改善受试者中的肺功能的方法，所述方法包括通过给受试者施用有效量的单独或彼此组合的DHA或ARA来调节受试者中的ADAM33基因。本发明还涉及用于改善受试者中的心脏功能的方法，所述方法包括通过给受试者施用有效量的单独或彼此组合的DHA或ARA来调节受试者中选自TNNC1和PDE3A的基因。
再进一步地，本发明涉及用于治疗或预防受试者中的肥胖的方法，所述方法包括通过给受试者施用有效量的单独或彼此组合的DHA或ARA来调节受试者中选自PPARD、NPY1R和LEP的基因。
在发现由本发明实现的几个优点中，它提供了用于调节受试者中所选择的基因的有用方法。它还提供了通过简单地施用化合物来上调或下调某些基因的方法。它还提供了用于预防和/或治疗婴儿期、儿童期、青春期或成年期中的各种疾病和病症的方法。
为了更全面地理解本发明，现在参考与附图结合进行的下述描述。
图1举例说明了由L3/C比较产生的ingenuity网络分析。网络图解表示为结点(基因)和边(基因之间的生物关联)。
优选实施方案的详细描述
现在将详细参考本发明的实施方案，所述实施方案的一个或多个例子在下文阐述。每个实施例为了解释本发明而不是限制本发明而提供。事实上，对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的范围或精神的情况下在本发明中进行各种修饰和变化。例如，作为一个实施方案的部分举例说明或描述的特征可以在另一个实施方案上使用，以产生再进一步的实施方案。
因此，预期本发明包含在附加权利要求及其等同方案的范围内的此种修饰和变化。本发明的其他目的、特征和方面公开于下述详细描述中，或由于下述详细描述而是显而易见的。本领域技术人员应当理解的是本讨论仅是示例性实施方案的描述，并不意欲作为本发明的更广泛方面的限制。
如本文所使用的，术语“调节”意指对基因表达的正或负调节作用。
如本文所使用的，术语“上调”意指对基因表达的正调节作用。
术语“下调”意指对基因表达的负调节作用。
如本文所使用的，术语“表达”意指在基因中编码的遗传信息通过转录而转变成mRNA、转移RNA(tRNA)或核糖体RNA(rRNA)。
术语“婴儿”意指小于约1岁的出生后的人。
术语“儿童”意指约1岁-12岁的人。在一些实施方案中，儿童为约1-6岁。在其他实施方案中，儿童为约7-12岁。
术语“受试者”意指任何动物。示例性受试者可以是家养动物、农场或动物园动物、野生动物、非人动物或人。非人受试者可以包括狗、猫、马、猪、牛、鸡、火鸡等。人受试者可以是婴儿、儿童和/或成年人。
术语“需要”当用于描述受试者时意指所述受试者属于可从起因于ARA和DHA施用的基因调节获益的受试者种类。在一些情况下，受试者由于遗传因素而需要此种调节，并且在其他情况下受试者可以是由于营养因素、疾病、创伤或身体病症而需要此种调节。
如本文所使用的，术语“婴儿代乳品(formula)”意指通过代替人乳而满足婴儿的营养需求的组合物。在美国，婴儿代乳品的内含物由在21C.F.R.Sections 100、106和107下阐述的联邦条例规定。这些条例限定了在模拟人母乳的营养和其他性质的努力中的常量营养物、维生素、矿物质和其他成分水平。
依照本发明，本发明人已发现了通过给受试者施用二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)用于调节受试者中的一种或多种基因表达的新方法。经由本发明的方法，在一些实施方案中，某些基因是上调的，且在其他实施方案中，某些基因是下调的。在一些实施方案中，该方法包括给受试者施用约1:10-约10:1的ARA:DHA重量比的二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)。在一些实施方案中，可以使用约1:5-约5:1的比，且在其他实施方案中，可以使用约1:2-约2:1的比。
事实上，本发明人已显示单独或彼此组合的DHA或RNA的施用可以横过不同的生物学过程来调节基因的表达。它们也已显示单独或彼此组合的DHA或RNA调节涉及学习、记忆、语言发展、肺功能、铁贮存和运输、氧合作用、免疫功能、抗癌作用、肿瘤抑制、肥胖症、重量增长、肥胖、动脉粥样硬化以及许多其他生物学功能和病症的基因的表达。
DHA和ARA是先前已显示有助于婴儿的健康和生长的长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)。具体地，DHA和ARA已显示支持婴儿的脑、眼和神经的发育和维持。Birch，E.等人，A Randomized Controlled Trialof Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Supplementation of Formula inTerm Infants after Weaning at 6 Weeks of Age，Am.J.Clin.Nutr.75：570-580(2002)。Clandinin，M.等人，Formulas with DocosahexaenoicAcid(DHA)and Arachidonic Acid(ARA)Promote Better Growth andDevelopment Scores in Very-Low-Birth-Weight Infants(VLBW)，Pediatr.Res.51：187A-188A(2002)。DHA和ARA在母乳喂养的婴儿中一般通过母乳来获得。然而，在代乳品喂养的婴儿中，DHA和ARA必须补充到饮食内。
尽管已知DHA和ARA对于婴儿中脑、眼和神经的发育是有利的，但DHA和ARA先前并未显示对受试者中的基因表达调节具有任何作用-特别是在婴儿中。在本发明中单独或彼此组合的DHA或ARA对基因表达调节的作用是令人惊讶和未预料到的。
在本发明中，受试者可以是婴儿。此外，受试者可以需要调节一种或多种基因的表达。此种调节可以是一种或多种基因的上调或下调。受试者可以处于发展与特定基因增加或减少的表达相关的疾病或病症的危险中。受试者可以是由于遗传素因、生活方式、饮食或遗传综合征、疾病或病症而处于危险中。
在本发明中，DHA和ARA的施用方式并不关键，只要治疗有效量施用于受试者。在一些实施方案中，DHA和ARA经由片剂、丸剂、胶囊化、囊片(caplet)、粒状胶囊(gelcaps)、胶囊、油滴剂或囊剂而施用于受试者。在另一个实施方案中，将DHA和ARA加入食物或饮料产品且消费。食物或饮料产品可以是儿童的营养产品，例如随访代乳品、生长乳(growing up milk)或奶粉，或产品可以是婴儿的营养产品，例如婴儿代乳品。
当受试者是婴儿时，作为加入随后可以喂给婴儿的婴儿代乳品内的补料提供DHA和ARA是方便的。DHA和ARA可以分别或组合施用于受试者。
在一个实施方案中，用于在本发明中使用的婴儿代乳品是营养完全的，且包含合适类型和量的脂质、碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质。脂质或脂肪的量一般可以从约3到约7g/100kcal变化。蛋白质的量一般可以从约1到约5g/100kcal变化。碳水化合物的量一般可以从约8到约12g/100kcal变化。蛋白质来源可以是本领域使用的任何一种，例如脱脂乳、乳清蛋白质、酪蛋白、大豆蛋白质、水解蛋白质、氨基酸等。碳水化合物来源可以是本领域使用的任何一种，例如乳糖、葡萄糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精、蔗糖、淀粉、稻糖浆固体等。脂质来源可以是是本领域使用的任何一种，例如植物油，如棕榈油、低芥酸菜子油、玉米油、大豆油、棕榈油精(palmolein)、椰子油、中链三酸甘油酯油、高油酸向日葵油、高油酸红花油等。
方便地，可以使用商购可得的婴儿代乳品。例如，Enfalac、 Premature Formula、 with Iron、和(可从Mead Johnson &Company，Evansville，IN，美国获得)可能补充有合适水平的单独或彼此组合的DHA或ARA，并且可以在本发明方法的实践中使用。此外，包含有效水平的DHA和ARA的是商购可得的，并且可以在本发明中使用。
本发明的方法要求单独或彼此组合的DHA或ARA的施用。在这个实施方案中，ARA:DHA的重量比一般为约1:3-约9:1。在本发明的一个实施方案中，该比为约1:2-约4:1。在另外一个实施方案中，该比为约2:3-约2:1。在一个具体实施方案中，该比为约2:1。在本发明的另一个具体实施方案中，该比为约1:1.5。在其他实施方案中，该比为约1:1.3。在另外其他的实施方案中，该比为约1:1.9。在具体实施方案中，该比为约1.5:1。在进一步的实施方案中，该比为约1.47:1。
在本发明的某些实施方案中，DHA的水平为约0.0重量％-1.00重量％的脂肪酸。因此，在某些实施方案中，单独的ARA可以治疗或减少肥胖。
DHA的水平可以为约0.32重量％。在一些实施方案中，DHA的水平可以为约0.33重量％。在另一个实施方案中，DHA的水平可以为约0.64重量％。在另一个实施方案中，DHA的水平可以为约0.67重量％。在另外一个实施方案中，DHA的水平可以为约0.96重量％。在进一步的实施方案中，DHA的水平可以为约1.00重量％。
在本发明的实施方案中，ARA的水平为0.0重量％-0.67重量％的脂肪酸。因此，在某些实施方案中，单独的DHA可以调节受试者中的基因表达。在另一个实施方案中，ARA的水平可以为约0.67重量％。在另一个实施方案中，ARA的水平可以为约0.5重量％。在另外一个实施方案中，DHA的水平可以为约0.47重量％-0.48重量％。
在本发明的实施方案中，DHA的量一般为约3mg/kg体重/天-约150mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，该量为约6mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天。在另一个实施方案中，该量为约15mg/kg体重/天-约60mg/kg体重/天。
在本发明的实施方案中，ARA的量一般为约5mg/kg体重/天-约150mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，该量为约10mg/kg体重/天-约120mg/kg体重/天。在另一个实施方案中，该量从约15mg/kg体重/天-约90mg/kg体重/天变化。在另外一个实施方案中，该量从约20mg/kg体重/天到约60mg/kg体重/天变化。
用于在本发明中使用的婴儿代乳品中的DHA的量一般从约2mg/100千卡(kcal)到约100mg/100kcal变化。在另一个实施方案中，DHA的量从约5mg/100kcal到约75mg/100kcal变化。在另外一个实施方案中，DHA的量从约15mg/100kcal到约60mg/100kcal变化。
用于在本发明中使用的婴儿代乳品中的ARA的量一般从约4mg/100kcal到约100mg/100kcal变化。在另一个实施方案中，ARA的量从约10mg/100kcal到约67mg/100kcal变化。在另外一个实施方案中，ARA的量从约20mg/100kcal到约50mg/100kcal变化。在具体实施方案中，ARA的量从约25mg/100kcal到约40mg/100kcal变化。在具体实施方案中，ARA的量为约30mg/100kcal。
用于在本发明中使用的补充有包含单独或彼此组合的DHA或ARA的油的婴儿代乳品可以使用本领域已知的标准技术进行制备。例如，等量的通常存在于婴儿代乳品中的油，例如高油酸向日葵油可以用DHA或ARA替换。
ARA和DHA的来源可以是本领域已知的任何来源，例如海洋油(marine oil)、鱼油、单细胞油(single cell oil)、卵黄脂质、脑脂质等。DHA和ARA可以是天然形式的，前提是LCPUFA来源的剩余物不导致对婴儿的任何相当大的有害作用。可替代地，DHA和ARA可以以精炼形式使用。LCPUFA来源可以包含或不包含二十碳五烯酸(EPA)。在一些实施方案中，在本发明中使用的LCPUFA包含很少的EPA或不包含EPA。例如，在某些实施方案中，本文使用的婴儿代乳品包含小于约20mg/100kcal EPA；在一些实施方案中，小于约10mg/100kcal EPA；在其他实施方案中，小于约5mg/100kcal EPA；且在另外其他的实施方案中，基本上不包含EPA。
DHA和ARA的来源可以是如美国专利号5,374,657、5,550,156和5,397,591中教导的单细胞油，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考。
在本发明的实施方案中，单独或彼此组合的DHA或ARA可以从出生直至婴儿达到约1岁补充到婴儿的饮食中。在具体实施方案中，婴儿可以是早产婴儿。在本发明的另一个实施方案中，单独或彼此组合的DHA或ARA可以从出生直至受试者达到约2岁补充到受试者的饮食中。在其他实施方案中，单独或彼此组合的DHA或ARA可以在受试者终生补充到受试者的饮食中。因此，在具体实施方案中，受试者可以是儿童、青少年或成年人。
在实施方案中，本发明的受试者是1岁-6岁的儿童。在另一个实施方案中，本发明的受试者是7岁-12岁的儿童。在具体实施方案中，给1岁-12岁的儿童施用DHA在调节各种基因表达中是有效的，所述基因例如表4-9中列出的那些。在其他实施方案中，给1岁-12岁的儿童施用DHA和ARA在调节各种基因表达中是有效的，所述基因例如表4-9中列出的那些。
在本发明的某些实施方案中，单独或彼此组合的DHA或ARA在动物受试者中在调节某些基因表达方面是有效的。动物受试者可以是需要此种调节的受试者。动物受试者一般是哺乳动物，所述哺乳动物可以是家养、农场、动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。
本发明还涉及单独或彼此组合的DHA或ARA用于制备用于调节受试者中的一种或多种基因表达的药物中的用途，其中所述基因选自表4-7中在“基因符号”列下列出的那些基因。在这个实施方案中，单独或彼此组合的DHA或ARA可以用于制备用于调节任何人或动物新生儿中的基因表达的药物。例如，药物可以用于调节家养、农场、动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等中的基因表达。在一些实施方案中，动物需要此种基因表达的调节。
下述实施例描述了本发明的各种实施方案。根据如本文公开的本发明的说明书或实践的考虑，本文权利要求范围内的其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。预期说明书连同实施例仅视为示例性的，而本发明的范围和精神由实施例后的权利要求指出。在实施例中，除非另有说明，所有百分比在重量基础上(w/w)给出。
实施例1
这个实施例描述了DHA和ARA补充在调节基因表达中的结果。
方法
动物
所有动物工作均在位于San Antonio，TX的Southwest Foundation forBiomedical Research(SFBR)进行。动物规程得到SFBR和CornellUniversity Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的批准。动物特性在表1中概括。
表1.狒狒新生儿特性
 

动物数目14性别10只雌性，4只雄性在分娩时的妊娠年龄(天数)181.8±6.2出生重量(g)860.3±150.812周时的重量(g)1519.1±280.7重量增长(g)658.8±190.4
14只怀孕狒狒在约妊娠182天时自发分娩。在出生24小时内将新生儿转移至保育室且随机化至3个饮食组之一。动物在封闭培养箱中饲养直至2周龄，且随后移至在受控访问保育室中的个别不锈钢笼。室温维持在76℉-82℉的温度，伴随12小时光/暗循环。它们喂养实验代乳品直至12周大。
饮食
为动物指定3次实验代乳品之一，使用表2中呈现的LCPUFA浓度。
表2.代乳品LCPUFA组合物
 CLL3DHA(％，w/w)00.42±0.021.13±0.04DHA(mg/100 kcal)021.3±1.062.8±1.9ARA(％，w/w)00.77±0.020.71±0.01ARA(mg/100 kcal)039.4±0.939.2±0.7
靶浓度如括号中所示进行设定，且饮食进行过量配制以引起分析和制备变异性和/或贮存期间可能的损失。对照(C)和L，中等DHA代乳品分别是商购可得的人婴儿代乳品Enfamil和Enfamil LIPIL。代乳品L3具有当量浓度的ARA且在DHA的3倍浓度靶向。
代乳品由Mead Johnson & Company(Evansville，IN)以即可饲喂形式提供。每份饮食密封在指定2种不同颜色代码的罐中以掩盖研究者。动物每天在07:00、10:00、13:00和16:00 4次提供1盎司代乳品，在前2晚期间伴随另外的饲养。在第3天和之后，新生儿总共提供4盎司；当它们消费全部量时，提供的量以每天2盎司增量进行增加。新生儿对于前7-10天进行人工饲养直至独立饲养确立。
生长
新生儿生长使用体重测量进行评估，每周记录2或3次。对于每只动物每周获得头围和顶臀长数据。器官重量在12周尸体剖检时进行记录。
采样和阵列杂交
12周大的狒狒新生儿在84.4±1.1天时实施麻醉和安乐死。根据厂商说明书将来自大脑皮质的中央前回的RNA置于RNALater中，且用于微阵列分析和微阵列结果的验证。
利用狒狒样品以人寡核苷酸阵列的微阵列研究先前已成功地进行。3个组中的大脑皮质总信使RNA使用Affymetrix Genechip^TM HG-U133Plus 2.0阵列进行分析。参见http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/hgu 133 plus.affx。HG-U133Plus2.0具有包括38,500种充分表征的人类基因、代表47,000个转录物和变体的>54,000个探针组。对于每只动物进行一次杂交(总共12个芯片)。RNA制备和阵列杂交在Genome Explorations，Memphis，TN<http://www.genome-explorations.com>进行处理。完成的原始数据集由Genome Explorations安全ftp服务器下载。
统计学
数据表示为平均值±SD。统计学分析使用方差分析(ANOVA)来进行，以就在12周时获得的测量来测试等价方法的假设，且Tukey氏校正用于控制多重比较。代乳品消耗量、体重、头围和顶臀长经过时间的变化用随机系数回归模型进行测试，以比较LCPUFA组(L，L3)与对照(C)。分析使用SAS for Windows 9.1(SAS Institute，Cary，NC)来进行，显著性在p<0.05时宣告。
微阵列数据分析
将原始数据(.CEL文件)上载到Iobion′s Gene Traffic MULTI 3.2(Iobion Informatics，La JoIIa，CA，USA)且通过使用有力的多阵列分析(RMA)法进行分析。一般而言，RMA进行对Affymetrix GeneChip阵列特异的3次操作：总体背景标准化、横过所有所选择的杂交的标准化、和“完美匹配的”寡核苷酸探针值的log2转化。使用Gene Traffic中的显著性分析工具箱的统计学分析用于对所有探针水平标准化数据执行Multiclass ANOVA。配对比较在C对L和C对L3之间进行，且达到P<0.05的所有探针组比较都包括在该分析中。差别表达的探针组的基因列表由这个输出产生以用于功能分析。
生物信息学分析
表达数据使用NIH DAVID<http://apps1.niaid.nih.gov/david>和NetAffx<http://www.affymetrix.com/analysis/index.affx>进行注解。基因基于Gene Ontology Consortium<http:/www.geneontology.org>，KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)途径数据库<http://www.genome.jp/kegg/pathway.html>和<BioCarta<http://www.biocarta.com/>分成功能分类和途径。
RNA分离和RT PCR
对9种基因进行实时聚合酶链反应(RT PCR)以证实阵列分析的结果。来自狒狒大脑皮质脑组织匀浆的30mg样品的总RNA使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)来提取。每种RNA制剂根据制造商的说明书用DNA酶I进行处理。总RNA的产量通过260nm UV吸收进行评估。RNA的量通过样品的260/280nm比且通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，以验证RNA完整性。
使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)将来自每个组(C、L、L3)的1微克总RNA逆转录成第一链cDNA。iScript逆转录酶是经修饰的MMLV衍生的逆转录酶，且iScript反应混合物包含寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))和随机引物。将产生的第一链cDNA贮存于-20℃直至使用。
使用SYBR绿和TaqMan测定法的定量实时PCR用于验证在L3/C比较中上调的所选择的基因的差别表达。所有引物是基因特异性且由人序列产生<www.ensembl.org>。PCR引物用PrimerQuest软件(IDT，Coralville，IA)进行设计且由Integrated DNA Technologies(IDT，Coralville，IA)定购。最初引物在30μl反应体积中通过聚合酶链反应用狒狒大脑皮质脑cDNA作为模板进行测试，其中使用Eppendorf梯度热循环仪(Eppendorf)，使用1μm每种引物、各0.25mm dNTPs、3μl10 x PCR缓冲液(Perkin-Elmer Life Sciences，Foster City，CA，USA)、1.5mM MgCl₂和1.5U Taq聚合酶(Ampli Taq II；Perkin-Elmer LifeSciences)。热循环条件为：于95℃最初变性5分钟，随后为于95℃变性30秒、于60℃退火1分钟和于72℃延伸1分钟的25-35个循环，以及于72℃最终延伸2分钟。PCR产物通过在用溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上电泳进行分离，并且获得合适大小的条带。对LUM、TIMM8A、UCP2、β-ACTIN、ADAM17和ATP8B1的PCR产物进行测序且保藏于GenBank(登记号分别为：DQ779570、DQ779571、DQ779572、DQ779573、DQ779574和DQ779575)。
用于基因(ATP8B1、ADAM17、NF1、FZD3、ZNF611、UCP2、EGFR和对照β-ACTIN)的最初标准化的引物用于SYBR绿实时PCR测定(Power SYBR Green PCR Master Mix，Applied Biosystems，Foster City，CA)。狒狒LUM、TIMM8A和β-ACTIN序列用于设计TaqMan测定(Assay by Design；<www.appliedbiosystems.com>)。所选择的基因符号、引物对和探针细节在表3中得到描述。

定量实时PCR反应用Applied Biosystems Prism 7300/7500实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)来完成。于50℃ UNG激活2分钟后，执行于95℃的最初变性10分钟，40个循环的循环条件由于95℃变性15秒、于60℃退火30秒和于72℃延伸1分钟组成。对于SYBR绿法，排除UNG激活步骤。所有反应一式三份地进行，且β-ACTIN用作参考基因。相对定量通过使用比较CT法(ABI RelativeQuantification Chemistry指导#4347824)来进行。
网络分析
环球网递送的生物信息学工具箱——Ingenuity途径分析(IPA 3.0)<http://www.ingenuity.com>用于鉴定由饮食处理影响的功能网络。IPA是由同行评审的科学出版物产生的知识数据库，所述知识数据库使得能够发现、显现和探查基因表达数据中的功能生物网络，且描绘对那些网络最显著的功能。如下所述由微阵列数据鉴定的1108个差别表达的探针组用于网络分析。将Affymetrix探针组ID′s上载到IPA内，且针对在IPA知识数据库中贮存的所有其他基因进行查询，以产生具有最高达35种基因的一组网络。每个Affymetrix探针组ID对其在IPA知识数据库中相应的基因标识符作图。代表与IPA知识数据库中的基因具有直接相互作用的基因的探针组称为“焦点”基因，这随后用作初始点用于产生功能网络。每个产生的网络根据数据集中差别调节的焦点基因的数目指定得分。这些得分衍生自指示焦点基因由于随机偶然性在网络中发现在一起的可能性的P的负对数。4或更高的得分具有99.9％的显著性置信水平。
结果和讨论
在分析的38,000种充分表征的基因中，显著性分析(P<0.05)鉴定在脑、脾、胸腺和肝的至少一种中的约1108个探针组(ps)表达水平中的变化。这代表在寡阵列(oligoarray)上总共>54,000个ps的2.05％。大多数ps显示<2倍的变化且一些基因在不同器官中不同地进行调节。
对于L/C比较，534个ps是上调的且574个ps是下调的，而对于L3/C比较，666个ps是上调的且442个ps是下调的。这举例说明了更多的基因在大脑皮质中响应于增加的代乳品ARA和DHA而超表达。
在调节的约1108种基因中，其约700种具有名称和已知功能。剩余基因仅由其许可板(license plate)(即，一些疾病描述的性质)已知。
表4举例说明了在脑中显示由DHA和ARA补充得到上调的具有已知生物学功能的基因。第一列显示Affymetrix探针ID号——在研究期间给予基因的编号。名称为“基因符号”的第二列描述基因的通常公认的名称。第三列显示基因的表达变化。正值指示上调，且负值指示下调。表达变化提供为“log2值”或对数底2值。为了本文讨论的目的，将这些值中的一些转变成线性百分比。
名称为“器官”的表4中的第五列列出了其中基因得到调节的器官的缩写。缩写如下：肝脏(L)、脑(B)和胸腺(T)。名称为“生物学功能”、“分子功能”、“细胞组分”和“途径”的第六、七、八和九列提供关于涉及那些功能的基因的任何已知信息。
表5到7包含了与表4中讨论的那些相同的种类。表5举例说明了在0.33％ DHA或1.00％ DHA时显示由DHA和ARA补充下调的具有已知生物学功能的基因。表6举例说明了在0.33％ DHA或1.00％ DHA时显示由DHA和ARA补充上调的没有已知生物学功能的基因。表7举例说明了在0.33％ DHA或1.00％ DHA时显示由DHA和ARA补充下调的没有已知生物学功能的基因。
表8举例说明了由于1.00％ DHA和0.67％ ARA补充上调或下调的脾基因。第一列显示Affymetrix探针ID号，第二列描述基因的通常公认的名称，且第三列显示基因的表达变化。第四、五和六列提供关于那些基因的任何已知信息。表9举例说明了由于0.33％ DHA和0.67％ ARA补充上调或下调的脾基因。列以与表8中的那些相同的方式组织。































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































因此，在出生后早期周时，当与未补充的对照组相比较时，在0.33％ DHA/0.67％ ARA(L)和1.00％ DHA/0.67％ ARA(L3)水平上的补充越过不同的生物学过程改变基因表达。1108种基因的表达在脑组织中由于DHA/ARA补充而改变，大多数基因显示小于2倍的变化。当使L组与C组比较时，534种基因是上调的，且574种基因是下调的。当使L3组与C组比较时，666种基因是上调的，且442种基因是下调的。
具有≥1.4倍的表达变化的探针组呈现于表10中。显示了关于L组(第三列)以及L3组(第四列)的表达变化。L/C比较对应于在目前水平上接近全世界的母乳平均值的DHA和ARA的包括，而L3组对应于接近全世界高水平的DHA补充。
表10.在基因表达中显示≥1.4倍的变化的探针组。
 Affymctrix探针ID号基因符号表达变化(倍数变化)：表达变化(倍数变化)：L/CL3/C231628_s_atSERPINB6-1.454.59231655_x_atSERPINB61.811552719_atH631.641564654_atCOL4A61.61208137_x_atZNF6111.58210800_atTIMM8A1.56233399_x_at---1.54226134_s_atMS121.54224105_x_at---1.52238895_atTEBP///PTGES31.521560276_atLOC2834031.51234788_x_atFLJ136111.51241867_atPARP61.50230867_atLOC1318731.50212179_atC6orf1111.49205745_x_atADAM171.49
 233808_atSTK31.48242273_at---1.48216051_x_at---1.481553844_a_atC10orf671.47214768_x_at---1.47215604_x_at---1.47215208_x_atRPL35A1.46242391_at---1.45224143_atTTTY81.45239199_at---1.45238269_atFBXL71.44231538_atC11orf11.44244310_at---1.44208844_atVDAC31.43221304_atUGT1A101.42235767_x_atPHAX1.42234652_at---1.411554583_a_atMGC505591.41216600_x_atALDOB1.41235425_atSGOL21.41242016_atLOC2844091.40216202_s_atSPTLC21.40234594_atC14orf851.40233868_x_atADAM331.40227149_atTNRC6C1.401553641_a_atTSGA13-1.40218575_atANAPC1-1.41234006_s_atRP4-622L5-1.41229023_atMGC5391-1.41203023_atHSPC111-1.41216300_x_atRARA-1.41221418_s_atTHRAP5-1.41244858_atTGIF-1.42210764_s_atCYR61-1.42223852_s_atMGC4796-1.42206681_x_atGP2-1.42222349_x_atRNF126P1-1.43230117_atLOC285878-1.44229118_atPRRG3-1.44219088s_atZNF576-1.44241399_atFAM19A2-1.44209364_atBAD-1.45202862_atFAH-1.47244128_x_atGLIS1-1.48
 205839_s_atBZRAP1-1.49211534_x_atPTPRN2-1.49221256_s_atHDHD3-1.4922301.8_atNOB1P-1.50204647_atHOMER3-1.50224451_x_atARHGAP9-1.54205440_s_atNPY1R-1.56237847_at----1.56238996_x_atALDOA-1.62203395_s_atHES1-1.63220551_atSLC17A6-3.21-1.87
如表11中所示，9种基因通过定量实时PCR进行测试，以证实阵列结果。全部在性质上与基因阵列结果一致。
表11.微阵列对QRT-PCR基因表达值(倍数变化)的比较
 基因名称微阵列QRT-PCR微阵列QRT-PCRL/CL/CL3/CL3/CLumicam(LUM)1.034.181.306.04线粒体内膜移位酶8同源物A(TIMM8A)1.041.331.571.76ATP酶，I类，8B型，成员1(ATP8B1)1.281.131.361.20ADAM金属肽酶结构域17(ADAM17)1.371.951.502.66神经纤维瘤蛋白1(NF1)1.032.071.202.16卷曲(frizzled)同源物3(FZD3)1.131.801.202.58锌指蛋白611(ZNF611)1.101.461.603.25解偶联蛋白2(UCP2)1.162.181.303.82表皮生长因子受体(EGFR)-1.08-1.201.171.40
由这些差别调节的基因的基因本体论(ontology)的功能表征将其归于不同的生物学过程，包括脂质及其他代谢、离子通道和转运、发育、视觉、G蛋白质和信号转导、转录调节、细胞周期、细胞增殖和凋亡。受DHA和ARA补充影响的基因个体发生(ontogeny)的几个种类在下文得到讨论。
脂质(脂肪酸和胆固醇)代谢
表12呈现了来自由饮食LCPUFA调节的涉及脂质代谢的基因的结果。
表12.在表达谱中的脂质和能量代谢基因调节。
 代谢基因符号Unigene IDL1L3脂质ATP8B1PDE3AELOVL5ACSL3HNF4ACLPSALDH3B2PLCE1Hs.569910Hs.386791Hs.520189Hs.471461Hs.116462Hs.1340Hs.87539Hs.200221.281.08-1.02-1.131.061.021.05-1.101.361.301.111.08-1.16-1.16-1.16-1.19脂肪酸氧化ACADSBACAD10GLYATADH5CPT2Hs.81934Hs.331141Hs.274336Hs.78989Hs.145384-1.10-1.081.011.031.101.381.101.301.22-1.22能量LEPHs.194236-1.011.17神经酰胺NSMAFLASS5Hs.372000Hs.270525-1.041.061.311.11鞘糖脂SPTLC2Hs.4356611.271.40类固醇OSBP2UGT2B15SULT2B1Hs.517546Hs.150207Hs.369331-1.171.041.041.351.21-1.38磷脂DGKEPLA2G6Hs.546318Hs.170479-1.10-1.091.17-1.20前列腺素和白三烯TEBPANXA3LTC4SHs.50425Hs.480042Hs.4561.021.26-1.331.52-1.04-1.24胆固醇DHCR24PRKAG2PRKAA1SOAT1FDFT1Hs.498727Hs.131133Hs.43322Hs.496383Hs.546253-1.18-1.071.09-1.091.011.171.09-1.02-1.12-1.13
涉及磷脂生物合成的基因(PLA2G6和DGKE)是差别表达的。PLA2G6在2个组中都是下调的。这种基因编码Ca不依赖性胞质磷脂酶A2组VI。这种基因中的改变最近已暗示为涉及铁积累的神经变性病症的共同特征，Morgan，N.V.等人，PLA2G6，Encoding a Phospholipase A2，is Mutated in Neurodegenerative Disorders with High Brian Iron，Nat.Genet.38(7)：752-54(2006)，以及在婴儿神经轴索营养不良中的潜在因子，所述婴儿神经轴索营养不良由铁在苍白球中积累引起且在10岁时导致死亡的神经变性病症。Khateeb，S.等人，PLA2G6 MutationUnderlies Infantile Neuroaxonal Dystrophy，Am.J.Hum.Genet.79(5)：942-48(2006)。PLA2是释放来自磷脂的sn-2位的脂肪酸的酶超家族；在苍白球中DHA和ARA是在这个部位上最丰富的酰基。因此，本发明已显示在下调PLA2G6中有用，从而预防或治疗神经变性病症。
引人注目的是，在与LCPUFA合成相关的延伸和去饱和酶中，仅有单个延伸酶是差别表达的。人ELOVL5转录物在L/C组中略微下调且在L3/C组中上调。这种酶也称为HELO1，催化多不饱和18和20碳脂肪酸的二碳延伸。Leonard，A.E.等人，Cloning of a Human cDNA Encodinga Novel Enzyme Involved in the Elongation of Long-Chain PolyunsaturatedFatty Acids，Biochem.J.350 Pt.3：765-70(2000)；Leonard，A.E.等人，Identification and Expression of Mammalian Long-Chain PUFA ElongationEnzymes，Lipids 37(8)：733-40(2002)。
本发明人还发现DGKE在L3/C比较中是上调的。涉及神经酰胺代谢(NSMAF，LASS5)、鞘糖脂代谢(SPTLC2)和类固醇代谢(OSBP2，UGT2B15)的基因在L3/C组中显示增加的表达，而NSMAF和OSBP2在L/C组中是下调的。
由DHA和ARA补充调节的更多的基因是丝氨酸棕榈酰转移酶，长链亚基2(SPTLC2)。丝氨酸棕榈酰-辅酶A转移酶(SPT)是鞘脂生物合成中的关键限速酶。鞘脂在细胞膜形成、信号转导和血浆脂蛋白代谢中起非常重要的作用。SPT视为Sptlc1和Sptlc2的2个亚单位的异二聚体。SPTLC2缺乏引起血浆神经酰胺水平中的显著减少。神经酰胺是众所周知的第二信使且在凋亡中起重要作用。升高细胞神经酰胺的策略用于针对停滞生长或促进凋亡的疗法。M.R.Hojjati等人，SerinePalmitoyl-CoA Transferase(SPT)Deficiency and Sphingolipid Levels inMice，Biochim Biophys Acta.1737(1)：44-51(2005)；Y.A.Hannun等人，Enzymes of Sphingolipid Metabolism：From Modular to IntegrativeSignaling，Biochemistry 40(16)：4893-903(2001)。
SPTLC2缺乏引起血浆SlP(鞘氨醇-1-磷酸)水平的显著减少。在人血浆中，65％的SlP与脂蛋白结合，其中HDL是主要载体。HDL中的SlP已显示与人内皮细胞上的SlP/Edg受体结合，并且由于这个原因被认为介导HDL对内皮细胞的许多抗炎作用。F.Okajima，PlasmaLipoproteins Behave as Carriers of Extracellular Sphingosine 1-Phosphate：Is this an Atherogenic Mediator or an Anti-Atherogenic Mediator？BiochimBiophy.Acta.1582：132-137(2002)；T.Kimura等人，High-DensityLipoprotein Stimulates Endothelial Cell Migration and Survival ThroughSphingosine 1-Phosphate and its Receptors.Arterioscler Thromb Vasc Biol.23：1283-1288(2003)。
SPTLC2缺乏还引起显著减少的血浆LysoSM(溶鞘磷脂(lysosphingomyelin))水平。LysoSM是在几种细胞内和细胞间事件中重要的推定的第二信使，且已牵涉于细胞生长、分化和凋亡的调节。它增加内皮细胞中的细胞内钙浓度和氧化氮生产，从而引起牛冠状动脉的内皮依赖性血管舒张。Y.Xu.Sphingosylphosphorylcholine andLysophosphatidylcholine：G Protein-Coupled Receptors andReceptor-Mediated Signal Transduction.Biochim Biophys Acta.1582：81-88(2002)；K.Mogami等人，Sphingosylphosphorylcholine InducesCytosolic Ca(2+)Elevation in Endothelial Cells in Situ and CausesEndothelium-Dependent Relaxation through Nitric Oxide Production inBovine Coronary Artery.FEBS Lett.457：375-380(1999)。
如表9中所示，SPTLC2在本研究中在L组和L3组中都是上调的。认为用DHA和ARA补充可以增加血浆LysoSM水平和血浆SlP水平。
ARA的研究最多的作用是作为关于类花生酸的前体，所述类花生酸包括前列腺素、白三烯和血栓烷。衍生自膜结合的ARA的基因之一在DHA/ARA组中都是下调的，所述基因催化半胱氨酰白三烯，白三烯C4合酶(LTC4S)的生物合成中的第一个步骤。LTC4S是有力的促炎和过敏介质。Welsch，D.J.等人，Molecular Cloning and Expression of HumanLeukotriene-C4 Synthase，Proc.Natl.Acad.Sci.91(21)：9745-49(1994)。因此，认为DHA和ARA补充由于其下调LTC4S可能具有抗炎作用。
在2个饲养组中都观察到关于PGES3(前列腺素E合酶3)的升高水平的mRNA。PGES3也称为TEBP(端粒酶结合蛋白p23)或失活的孕酮受体23-KD(p23)。起关于热激蛋白HSP90的辅陪伴分子作用的普遍存在的高度保守蛋白质，p23参与许多细胞调节蛋白质的折叠。Buchner，J.，Hsp 90 & Co.-A Holding for Folding，Trends Biochem.Sci.24(4)：136-41(1999)；Weaver，A.J.等人，Crystal Structure and Activityof Human p23，a Heat Shock Protein 90 Co-Chaperone，J.Bio.Chem.275(30)：23045-52(2000)。它已证实与人端粒酶逆转录酶(hTERT)结合且有助于端粒酶活性。Holt，S.E.等人，Functional Requiremetn of p23and Hsp90 in Telomerase Complexes，Genes Dev.13(7)：817-26(1999)。伴随增加的DHA观察到减少水平的膜联蛋白A3(ANXA3)，也称为脂皮质蛋白III。
在L3/C组中，涉及脂肪酸氧化(ACADSB、ACAD10和GLYAT)的基因超表达，且肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)下调。ACADs家族成员ACADSB和ACAD10在L3/C组中的上调与高DHA组中更大的能量生产一致。ACADs(酰基辅酶A脱氢酶)是线粒体基质黄素蛋白的家族，其催化酰基辅酶A衍生物的脱氢作用且涉及β氧化和支链氨基酸代谢。Rozen，R.等人，Isolation and Expression of a cDNA Encoding the Precursorfor a Novel Member(ACADSB)of the acyl-CoA Dehydrogenase GeneFamily，Genomics 24(2)：280-87(1994)；Ye，X.等人，Cloning andCharacterization of a Human cDNA ACAD10 Mapped to Chromosome12q24：1，Mol.Bio.Rep.31(3)：191-95(2004)。ACADSB缺乏引起分离的2-甲基丁酰甘氨酸尿症，异亮氨酸代谢中的缺陷。2-甲基丁酰甘氨酸(2-MBG)的分离的排泄，在L-异亮氨酸氧化的近端途径中近期鉴定的缺陷，由ACADSB缺乏引起。
线粒体特异性GLYAT(甘氨酸-N-酰基转移酶)也称为酰基辅酶A：甘氨酸N-酰基转移酶(ACGNAT)，使甘氨酸与酰基-辅酶A缀合且参与各种药物和异生素的解毒。Mawal，Y.R.& Qureshi，I.A.，Purificationto Homogeneity of Mitochondrial Acyl coa：glycine n-acyltransferase fromHuman Liver，Biochem.Biophys.Res.Commun，205(2)：1373-79(1994)；Mawal，Y.R.等人，Developmental Profile of Mitochondrial GlycineN-Acyltransferase in Human Liver，J.Pediatr.130(6)：1003-7(1997)。Mawal等人也暗示GLYAT的延缓发育可能损害儿童中的解毒过程。
涉及胆固醇生物合成的基因，DHCR24、PRKAG2、PRKAA1、SOAT1和FDFT1显示与LCPUFA水平显著关联。增加的DHA上调DHCR24和PRKAG2，且下调PRKAA1、SOAT1和FDFT1。DHCR24(24-脱氢胆固醇还原酶)，也称为选择性AD指示剂1(SELADIL1)，催化胆固醇生物合成期间的固醇中间物的Δ-24双键的还原。Waterham，H.R.等人，Mutations in the 3beta-Hydroxysterol Delta-Reductase Gene CauseDesmosterolosis，An Autosomal recessive Disorder of CholesterolBiosynthesis，Am.J.Hum.Genet.69(4)：985-94(2001)。SELADIN1可能激活脑中的雌激素受体且保护不受β-淀粉状蛋白介导的毒性。Peri，A.G.等人，Seladin-1 as a Target of Estrogen Receptor Activation in theBrain：A New Gene for a Rather Old Story？J.Endocrin.Invest.28(3)：285-93(2005)。在患有阿尔茨海默氏病的患者的脑区中观察到SELADIN1的减少的表达。Benvenuti，S.等人，Estrogen and SelectiveEstrogen Receptor Modulators Exert Neuroprotective Effects and Stimulatethe Expression of Selective Alzheimer＇s Disease Indicator-1，A RecentlyDiscovered AntiApoptotic Gene，in Human Neuroblast Long-Term CellCultures，J.Clin.Endocrin.Metab.90(3)：1775-82(2005)。PRKAG2(蛋白激酶，AMP激活的，γ2)是AMP激活的蛋白激酶(AMPK)家族的成员。AMPKs在钙信号传导、体重减轻、心脏中的能量代谢调节中执行多功能的作用。Evans，A.M.，AMP-Activated Protein Kinase andthe Regulation of Ca2+ Signalling in O2-Sensing Cells，J.Physiol.(2006)；Watt，MJ.等人，CNTF Reverses Obesity-Induced Insulin Resistance byActivating Skeletal Muscle AMPK，Nat.Med.12(5)：541-48(2006)；Dyck，J.R.等人，AMPK Alterations in Cardiac Physiology and Pathology：Enemy or Ally？J.Physiol.(2006)。
SOAT1(固醇O-酰基转移酶)或酰基-辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内蛋白质，其催化内质网中的胆固醇酯的形成，且涉及作为粥样硬化斑块的泡沫细胞的特征的脂质小滴。Miyazaki，A.等人，Inhibitors of Acyl-CoEnzyme A：Cholesterol Acyltransferase，Curr.DrugTargets Cardio.Haematol.Disorder，5(6)：463-69(2005)；Stein，O.& Stein，Y.，Lipid Transfer Protein(LTP)and Atherosclerosis，Pharm.Res.22(10)1578-88(2005)；Leon，C等人，Potential Role ofAcyl-Coenzyme A：Cholesterol Transferase(ACAT)Inhibitors asHypolipidemic and Antiatherosclerosis Drugs，Pharm.Res.22(10)1578-88(2005)。
在2个组中检测到对于ATP8B1和PDE3A增加的表达，在L3/C中相对更多，而涉及HNF4A(肝核因子-4α)、CLPS和ALDH3B2的转录物显示伴随增加的DHA而减少的表达。ATP8B1表达由实时PCR进行证实。
肝内胆汁郁积，或胆汁流的损害，是遗传和获得性肝病的重要表现，导致有毒胆汁酸的肝积累和进行性肝损害。胆汁酸增强饮食脂肪和脂溶性维生素的有效消化和吸收，且是用于固醇排泄的主要途径。ATP8B1的表达在小肠中高，并且ATP8B1基因中的突变已与肝内胆汁郁积关联。Bull，L.N.等人，A Gene Encoding a P-Type ATPase Mutated in Two Formsof Hereditary Cholestasis，Nat.Genet.18(3)：219-24(1998)；Mullenbach，R.等人，ATP8B1 Mutations in British Cases with Intrahepatic Cholestasisof Pregnancy，Gut.54(6)：829-34(2005)。ATP8B1可能起胆汁盐转运蛋白的作用。ATP8B1的敲除小鼠表型揭示胆汁盐稳态中的破坏，而无胆汁分泌的损害。钙吸收不良、镁缺乏和维生素D缺乏通常与胆汁郁积性肝病中的骨质疏松症和低血钙症相关。已提出ATP8B1基因经由甲状旁腺激素涉及基因钙调节。
PDE3A(磷酸二酯酶3A，cGMP抑制的)是在心肌和血小板中发现的120 kDa蛋白质。Liu，H.，Expression of Cyclic GMP-InhibitedPhosphodiesterases 3A and 3B(PDE3A and PDE3B)in Rat Tissues：Differential Subcellular Localization and Regulated Expression by CyclicAMP，Br.J.Pharm.125(7)：1501-10(1998)。Ding等人显示在衰弱的人心脏的左心室中显著减少的PDE3A表达。Ding，B.等人，Functional Role of Phosphodiesterase 3 in Cardiomyocyte Apoptosis：Implication in Heart Failure，Circulation 111(19)：108-14(2000)。遗传证据指出减数分裂在体内和体外的重新开始需要PDE3A活性。完全不育性在雌性PDE3A-/-小鼠中是显著的。PDE3A表达还是人中的阴茎勃起调节所需的。Kuthe，A.等人，Gene Expression of thePhosphodiesterase 3A and 5A in Human Corpus Cavernosvm Penis，Eur.Urol.38(1)：108-14(2000)。
在能量代谢中有作用的瘦蛋白(LEP)在L3/C组的脑组织中超表达。瘦蛋白是分泌的脂肪细胞激素，其在食物摄取和能量稳态调节中起关键作用。Zhang，Y.等人，Positional Cloning of the Mouse Obese Gene and ItsHuman Homologue，Nature 372(6549)：543-46(1995)；Halaas，J.L.等人，Weight-Reducing Effects of the Plasma Protein Encoded by theObese Gene，Science 269(5223)：543-46(1995)。瘦蛋白通过抑制下丘脑神经肽Y合成和分泌来部分抑制喂养和减少肥胖症。Stephens，T.W.等人，The Role of Neuropeptide Y in the Antiobesity Action of theObese Gene Product，Nature 377(6549)530-32(1995)；Schwartz，M.W.等人，Identification of Targets of Leptin Action in Rat Hypothalamus，J.Clin.Invest.98(5)：1101-06(1996)。在糖尿病小鼠中，LEP的施用减少饮食过多、高血糖症和生长素释放肽(Ghrelin)mRNA水平。在肥胖小鼠中检测到LEP减少的mRNA水平。
基于上述基因的调节，本发明人已显示DHA和ARA在改变脂质代谢中是有用的。更具体而言，DHA和ARA补充可以提供更大的能量生产、能量代谢的调节、食欲的抑制和体重减轻。因此，在实施方案中，本发明涉及通过给所述受试者施用治疗有效量的DHA和ARA用于改善受试者的身体组成的方法。
离子通道和转运
涉及离子通道和转运蛋白活性的转录物的表达水平由饮食LCPUFA加以改变。具有离子通道活性的解偶联蛋白2LOC131873(推定蛋白质)和ATP11C在2个组中都是上调的，但在L3/C中更是如此。具有离子通道活性的其他转录物包括VDAC3、FTH1、KCNK3、KCNH7和TRPM1在L3/C组中是超表达的，且在L/C中表达不足。GLRA2、TRPV2和HFE在L/C中是超表达的且在L3/C中被抑制。P2RX2、GRIA1和CACNA1S在2个组中都被抑制。
本发明中的重要观察之一是解偶联蛋白2(UCP2)，线粒体质子载体的超表达。数据显示UCP2在新生儿大脑皮质中与饮食LCPUFA相关的增加的表达；增加的表达在2个组都观察到，但在L3/C中更是如此。QRT-PCR证实阵列结果。已观察到起因于骨骼肌和白脂肪组织中的饮食n3-PUFA的线粒体解偶联蛋白的营养调节和诱导。Baillie，R.A.等人，Coordinate Induction of Peroxisomal Acyl-CoA Oxidase and UCP-3 byDietary Fish Oil：A Mechanism for Decreased Body Fat Deposition，Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids，60(5-6)：351-56(1999)；Hun，C.S.等人，Increased Uncoupling Protein2 mRNA in White AdiposeTissue，and Decrease in Leptin，Visceral Fat，Blood Glucose，andCholesterol in KK-Ay Mice Fed with Eicosapentaenoic andDocosahexaenoic Acids in Addition to Linolenic Acid，Biochem.Biophys.Res.Cornmun.259(1)：85-90(1999)。增加的UCP2表达在与神经变性、心血管和2型糖尿病相关的疾病中是有利的。Mattiasson，G.&Sullivan，P.G.，The Emerging Functions of UCP2 in Health，Disease，andTherapeutics，Antixoid.Redox Signal，8(1-2)1-38(2006)。乳中的饮食脂肪增加新生儿脑中的UCP2表达和功能，且保护神经元不受兴奋性神经毒性。Sullivan，P.G.等人，Mitochondrial Uncoupling Protein-2Protects the Immature Brain from Excitotoxic Nueronal Death，Ann.Neurol.53(6)：711-717(2003)。
VDAC3(电压依赖性阴离子通道3)属于在线粒体外膜和脑突触膜中发现的成孔蛋白质组。Blachly-Dyson，E.等人，Human Genes Encodingthe Voltage-Dependent Anion Channel(VDAC)of the Outer MitochondrialMembrane：Mapping and Identification of Two New Isoforms，Geomics 20(1)：62-67(1994)；Shafir，I.等人，Voltage-Dependent Anion ChannelProteins in Synaptosomes of the Torpedo Electric Organ：Immunolocalization，Purification，and Characterization，J.Bioenerg.Biomembr.30(5)：499-510(1998)。Massa等人观察到肌养蛋白缺陷型mdx小鼠在出生后发育期间的骨骼肌和脑中显著减少的VDAC3mRNA水平。Massa，R.等人，Intracellular Localization and IsoformExpression of the Voltage-Dependent Anion Channel(VDAC)in Normaland Dystrophic Skeletal Muscle，J.Muscle Res.Cell.Motil.21(5)：433-42(2000)。缺乏VDAC3的小鼠显示出不育。Sampson，M.J.等人，ImmotileSperm and Infertility in Mice Lacking Mitochondrial Voltage-DependentAnion Channel Type 3，J.Biol.Chem.276(42)：39206-12(2001)。具有电压门控阴离子通道孔蛋白活性的所有转录物(VDAC3、KCNK3和KCNH7)伴随增加的DHA而超表达。
本发明已显示FTH1(铁蛋白重链1)在婴儿期内由DHA和ARA补充得到上调。FTH1是主要铁贮存因子且是铁稳态所需的。它先前已显示在人脑中表达。Percy，M.E.等人，Iron Metabolism and HumanFerritin Heavy Chain cDNA from Adult Brain with an ElongatedUntranslated Region：New Findings and Insights，Analyst 123(1)：41-50(1998)。它已鉴定为NF-κB的抗氧化剂和保护活性的基本介质。FTH1的减少表达可能负责铁蛋白的异常积累且可能负责高铁蛋白血症(hyperferritenemia)的人类情况。发现铁蛋白的异常积累与常染色体显性缓慢进展的神经变性疾病相关，所述疾病的临床特征在于震颤、小脑性共济失调、帕金森综合症、锥体束征、行为障碍和认知减退。与对照组相比较，FTH1在L组中下调8％，但在L3组中上调37％。因此，认为FTH1在婴儿期内经由DHA和ARA补充的上调可以改善铁吸收和/或可以预防各种铁相关病症的发作。
编码小分子转运蛋白的基因是差别表达的，包括葡萄糖(SLC2A1、SLC5A4)、氯化物(SLC12A6)、钠(SLC13A3)、单胺(SLC18A2)及其他(SLC26A4、SLC17A6)的载体。这些转运蛋白可能帮助营养物和代谢物的交换。蛋白质的细胞色素P和B家族的成员也是差别表达的。编码VDP、RSAFD1、C1QG和OXA1L的转录物被增加的DHA显著抑制。
基于上述结果，本发明已显示DHA和ARA可以正面影响身体内重要的营养物和代谢物的转运和交换。这在从神经系统功能到肌肉收缩到胰岛素释放的生物学过程中可能是重要的。
G蛋白质和信号传导
编码G蛋白质活性的众多基因是差别调节的。那些中的大多数由高水平的DHA诱导。例如，GNA13、GNA14、PTHR2、RCP9和FZD3在2个DHA组中显示增加的表达。EDG7、SH3TC2、GNRHR、ADRA1A、BLR1、GPR101、GPR20和OR8G2在L/C中是下调的且在L3/C中是上调的。
DHA调节脑和视网膜中的G蛋白质信号传导。Salem，N.等人，Mechanisms of Action of Docosahexaenoic Acid in the Nervous System，Lipids 36(9)：945-59(2001)。G蛋白质是促进GTP与GDP交换且调节信号转导和膜运输的膜相关蛋白。Bomsel，M.，& Mostov，K.，Roleof Heterotrimeric G Proteins in Membrane Traffic，Mol.Biol.Cell.36(9)：945-59(2001)。GNA13缺乏损害小鼠中的血管发生，而GNA14激活NF-κB信号级联放大。Offermanns，S.等人，Vascular Systme Defects andImpaired Cell Chemokinesis as a Result of Galpha 13 Deficiency，Science275(5299)：533-36(1997)；Liu，A.M.& Wong，Y.H.，Activation ofNuclear Factor κB by Somatostatin Type 2 Receptor in Pancreatic AcinarAR42J Cells Involves Gα14 and Multiple Signaling Components：AMechanism Requiring Protein Kinase C，Calmodiulin-Dependent Kinase II，ERK，and c-Src，J.Biol.Chem.280(41)：34617-25(2005)。甲状旁腺激素受体2(PTHR2)由甲状旁腺激素激活且在CNS中相对丰富。Usdin，T.B.等人，New Members of the Parathyroid Hormone/ParathyroidHormone Receptor Family：the Parathyroid Hormone 2 Receptor andTuberoinfundibular Peptide of 39 Residues，Front Neroendocrin.21(4)：349-83(2000)；Harzenetter，M.D.等人，Regulation and Fucntino of theCGRP Receptor Complex in Human Granulopoiesis，Exp.Hematol.30(4)：306-12(2002)。RCP9也称为降钙素基因相关肽-受体组分蛋白质，可能在血细胞生成期间有作用。
由DHA和ARA补充调节的另一种基因包括FZD3(卷曲，果蝇(drosophilia)，同源物，3)。FZD3阵列结果通过SYBR绿实时PCR测定进行证实。G蛋白质涉及信号传导机制，其使用GDP交换GTP作为分子“开关”，以允许或抑制细胞内的生物化学反应。FZD家族的成员是关于分泌的涉及发育控制的WNT糖蛋白的受体。RT-PCR和定量TaqMan分析检测到广泛表达的FZD3，其中在CNS的边缘区域中的水平最高，和在睾丸、肾和子宫以及成神经细胞瘤细胞系中的水平显著。C.F.Sala等人，Identification，Gene Structure，and Expression of HumanFrizzled-3(FZD3)，Biochem.Biophys.Res.Commun.273(1)：27-34(2000)。Tissir和Goffinet显示在小鼠中在出生后CNS发育期间的FZD3表达。Tissir，F.& Goffinet，A.M.，Expression of Planar Cell Polaritygenes During Development of the Mouse CNS，Eur.J.Neurosci.23(3)：597-607(2006)。
卷曲3(FZD3)基因位于染色体8p21上，这个区域已牵涉于遗传连锁研究中的精神分裂症。在中国人群体中在FZD3基因座和精神分裂症之间已显示出强关联。Y.Zhang等人，Positive Association of theHuman Frizzled 3(FZD3)Gene Haplotype with Schizophrenia in ChineseHan Population.Am.J.Med.Genet.B.Neuropsychiatr.Genet.129(1)：16-9(2004)；J.Yang等人，Association Study of the Human FZD3 Locuswith Schizophrenia，Biol.Psychiatry 54(11)：1298-301(2003)。
卷曲3(FZD3)可以是候选肿瘤抑制基因，因为在人乳腺和卵巢癌中检测到在染色体8p21上的杂合性丢失。FZD3还被提议为牵涉于在胚胎发生期间的CNS神经发生的重要基因。H.Kirikoshi等人，MolecularCloning and Genomic Structure of Human Frizzled-3 at Chromosome 8p21Biochem.Biophys.Res.Commun.271(1)：8-14(2000)。如表4中所示，FZD3在L和L3组中在狒狒婴儿中已经由DHA和ARA补充得到上调。因此，认为DHA和ARA补充对精神分裂症的发生率或肿瘤抑制以及其他事物具有有利作用。
神经肽Y是在体内具有强促进食欲作用的36氨基酸肽。Tatemoto，K.，Neuropeptide Y：Complete Amino Acid Sequence of the Brain Peptide，Proc.Natl.Acad.Sci.79(18)：5485-89(1982)。NPY的2个重要亚型(Y1和Y2)已由药理学标准进行定义。NPY1R被提议对于喂养控制是独特的。Gehlert，D.R.，Multiple Receptors for the Pancreatic Polypeptide(PP-fold)Family：Physiological Implications，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.218(1)：7-22(1998)。Pedrazzini等人观察到在缺乏NPY1R基因的小鼠中在食物摄入方面中等但明显的减少。Pedrazzini，T.等人，Cardiovascular Response，Feeding Behavior and Locomotor Activity inMice Lacking the NPY Y1 Receptor，Nat.Med.4(6)：722-26(1998)。瘦蛋白通过抑制下丘脑神经肽Y合成和分泌来部分抑制喂养和减少肥胖症。
EDG7(内皮分化，溶血磷脂酸G蛋白质偶联受体，7)介导钙动员。Bandoh，K.等人，Molecular Cloning and Characterization of a NovelHuman G-Protein-Coupled Receptor，EDG7，for Lysophosphatidic Acid，J.Biol.Chem.274(39)：277776-85(1999)。SH3TC2基因中的突变引起影响运动和感觉神经元的神经变性病症的儿童期发作。Senderek，J.等人，Mutations in a Gene Encoding a Novel SH3/TPR Domain ProteinCause Autosomal Recessive Charcot-Marie-Tooth Type 4C Neuropathy，Am.J.Hum.Genet.73(5)：1106-19(2003)。
几种信号传导蛋白(NF1、WSB1、SOCS4、RIT1、CD8B1、OR2A9P和RERG)在2个组中都是上调的。还观察到在L3/C中上调且在L/C中下调的基因。例如，PDE4D、KRAS、ITGA2、PLCXD3、WNT8A、ARHGAP4、RAPGEF6、OR2F1/OR2F2、CCM1和SFRP2在L3/C中是上调的且在L/C中是下调的。几种基因(WNT10A、ADCY2、OGT、DDAH1和BCL9)在L/C中是上调的且在L3/C中是下调的。IQGAP3、GCGR、APLN、CYTL1、GRP、LPHN3、CNR1、VAV3和MCF2在2个组中都是下调的。
在大脑皮质中经由DHA和ARA补充上调的另一种基因是NF1。NF1表达水平由QRT-PCR加以证实。1型神经纤维瘤病(NF1)是特征特别在于“咖啡牛乳色”斑和皮肤的纤维瘤的病症，其发生率为全世界3000人中约1人。所有患者中的一半呈现骨表现，例如先天性(congenial)假关节。T.Kuorilehto等人，NF1 Gene Expression in Mouse FractureHealing and in Experimental Rat Pseudarthrosis，J Histochem.Cytochem.54(3)：363-370(2005)。
NF1基因表达和功能是正常骨折愈合所需的。同上。在NF1中具有种系突变的个体倾向于发展外周和中枢神经系统的良性和恶性肿瘤。Y.Zhu等人，Inactivation of NF1 in CNS Causes Increased Glial ProgenitorProliferation and Optic Glioma Formation.Development.132(24)：5577-88(2005)。神经纤维瘤蛋白表达的丧失已在多种NF1相关肿瘤中观察到，包括星形细胞瘤。D.H.Gutmann等人，Loss of Neurofibromatosis 1(NF1)Gene Expression in NF1-Associated Pilocytic Astrocytomas，Neuropathol.Appl.Neurobiol.26：361-367(2002)；L.Kluwe等人，Loss of NF1 AllelesDistinguish Sporadic from NF1-Associated Pilocytic Astrocytomas，J.Neuropathol.Exp.Neurol.60：917-920(2001)。
与对照组相比较，在L组中，NF1基因仅上调2％，但在L3组中，该基因上调27％。因此，认为在婴儿期内NF1经由DHA和ARA补充的上调可以预防各种肿瘤的随后发展。
WSB1是在鸡中在胚胎发育期间表达的包含SOCS框的WD-40蛋白质。Vasiliauskas，D.S.等人，SwiP-1：Novel SOCS Box ContainingWD-Protein Regulated by Signalling Centres and by Shh DuringDevelopment，Mech.Dev.82(1-2)：79-94(1999)。小GTP酶(RIT1、KRAS、RERG和RAPGEF6)的RAS和RAS相关基因家族通过增加的DHA得到上调。
n-3PUFA中的饮食缺乏诱导神经膜中的n-6DPA(22：5n-6)替代，和由G蛋白质介导的信号传导介导的功能的损害，例如视觉、学习和记忆以及嗅觉辨别。证据指出与DHA充分的动物相比较，这导致减少的视紫红质激活、和在视杆外段中的信号传导。
本发明的结果已举例说明DHA和ARA补充通过允许其正确调节细胞过程可以正面影响G蛋白质的信号传导。G蛋白质信号传导中的功能失常可能导致疾病或病症例如精神分裂症、肿瘤或超重。因此，用DHA和ARA补充可以帮助预防或治疗精神分裂症或肿瘤，可以抑制食欲，且可以帮助骨折愈合。
发育
表13显示与发育相关的24种基因的差别表达。
表13.表达谱中的发育基因调节
 发育基因符号Unigene IDL1L3神经系统TIMM8ANRG1SEMA3DNUMBHES1SIM1GDF11SMA3///SMA5SH3GL3FGF5FGF14Hs.447877Hs.453951Hs.201340Hs.585653Hs.250666Hs.520293Hs.591023Hs.482414/484969/588240Hs.270055/458285Hs.37055Hs.5912061.041.021.101.01-1.30-1.16-1.18-1.08-1.161.081.011.571.211.141.10-1.63-1.161.091.061.04-1.20-1.10肌肉C6of97CALD1Hs.130239Hs.490203-1.031.091.341.14骨骼BAPX1Hs.1059411.051.08心脏GATA4Hs.243987-1.021.22表皮S100A7FGF7SCELHs.112408Hs.122006Hs.115166-1.061.14-1.011.271.02-1.13外胚层/中胚层SMURF1TCF21Hs.189329Hs.780611.15-1.121.32-1.18配子发生OTEXTCP11CDV1SPAG6Hs.196956Hs.435371Hs.528382Hs.5276981.09-1.02-1.001-1.031.241.08-1.10-1.22
11种转录物的产物在神经系统发育中起作用。TIMM8A、NRG1、SEMA3D和NUMB基因的表达在L/C和L3/C组中都是上调的。HES1和SIM1在2个组中都是下调的。GDF11、SMA3/SMA5、SH3GL3在L/C中是下调的且在L3/C中是上调的。生长因子FGF5和FGF14的mRNA水平显示在L/C中增加的丰度和在L3/C中减少的丰度。
TIMM8A也称为耳聋/张力障碍肽1(DDP1)，是线粒体膜间间隙中组构的充分保守的蛋白质。它属于在线粒体膜间间隙中组构的进化上保守的蛋白质家族。这些蛋白质介导疏水膜蛋白质输入和交叉进入线粒体内膜内。它是线粒体内膜8的酵母移位酶同源物。
TIMM8A基因中的功能丧失引起Mohr-Tranebjaerg综合征，导致耳聋、盲、张力障碍和心理缺陷的进行性神经变性病症。TIMM8A基因中的功能丧失还可以导致Jensen综合征，导致伴随痴呆的视听(optocoacoustic)神经萎缩的病症。L.Tranebjaerg等人，A De NovoMissense Mutation in a Critical Domain of the X-linked DDP Gene Causesthe Typical Deafness-Dystonia-Optic Atrophy Syndrome.Eur J Hum Genet.8(6)：464-67(2000)；S.Hofmann等人，The C66W Mutation in theDeafness Dystonia Peptide 1(DDP1)Affects the Formation of FunctionalDDP1-TIM13 Complexes in the Mitochondrial Intermembrane Space，J.Biol.Chem.277(26)：23287-93(2002)；L.Tranebjaerg等人，NeuronalCell Death in the Visual Cortex is a Prominent Feature of the X-linkedRecessive Mitochondrial Deafness-Dystonia Syndrome Caused byMutations in the TIMM8a Gene，Ophthalmic Genet.22(4)：207-23(2001)。
在本研究中，TIMM8A在大脑皮质中是上调的。具体地，与对照组相比较，它在L组中上调4％和在L3组中上调57％。TaqMan测定证实阵列结果。因此，认为在婴儿期内T1MM8A基因经由DHA和ARA补充的上调可以预防Mohr-Tranebjaerg综合征、Jensen综合征及其他神经变性病症的随后发作。
TIMM23也称为TIM23，是线粒体内膜蛋白质且是细胞生存力所必需的。Lohret TA等人，Tim23，a Protein Import Component of theMitochondrial Inner Membrane，is Required for Normal Activity of theMultiple Conductance Channel，MCC，J.Cell.Biol.21；137(2)：377-86(1997)。TIM23 mRNA含量/细胞在妊娠后期明显增加，并且乳腺功能在这个阶段被激活且可以触发乳生成。Sun Y等人，HormonalRegulation of Mitochondrial Tim23 Gene Expression in the MouseMammary Gland，Mol.Cell.Endocrinol.172(1-2)：177-84(2001)。引起严重的多效性线粒体功能障碍的人TIMM23复合物损害的生物合成可能涉及神经变性疾病Mohr-Tranebjaerg综合征。Rothbauer，U.等人，Role of the Deafness Dystonia Peptide 1(DDP 1)in Import of HumanTim23 into the Inner Membrane of Mitochondria，J.Biol.Chem.276(40)：37327-34(2001)。
因此，因为TIMM23在婴儿狒狒胸腺组织中是上调的且TIMM23涉及Mohr-Tranebjaerg综合征，所以认为DHA和ARA补充可以预防和/或治疗Mohr-Tranebjaerg综合征。
NRG1是CNS的发育和功能所必需的，促进神经元迁移和轴突导向。Bernstein，H.G.等人，Localization of Neuregulin-1 Alpha(Heregulin-Alpha)and One of its Receptors，ErbB-4 Tyrosine Kinase，inDeveloping and Adult Human Brain，Brain Res.Bull.69(5)：546-59(2006)。NUMB负调节缺刻(notch)信号传导且在视网膜神经发生中起作用，从而影响视网膜前体的增殖和分化以及有丝分裂后神经元的成熟。Dooley，C.M.等人，Involvement of Numb in Vertebrate RetinalDevelopment：Evidence for Multiple Roles of Numb in NeuralDifferentiation in the Central-Nervous-System，J.Neuro.54(2)：313-325(2003)。HES1(毛发/分裂增强子，果蝇，同源物，1)，碱性螺旋-环-螺旋蛋白是下调的。随着神经发生进展，观察到减少的HES1表达；在持续表达的情况下，神经元细胞的分化在CNS中被阻断。Ishibashi，M.等人，Persistent Expression of Helix-Loop-Helix Factor Hes-1 PreventsMammalian Neural Differentiation in the Central-Nervous-System，Embo.J.13(8)：1799-1805(1994)。
因此，在实施方案中，本发明涉及用于调节受试者发育的方法，其包括给所述受试者施用治疗有效量的DHA和ARA。这些LCPUFAs经由其调节发育相关基因的能力可能在预防各种神经变性病症中有效。
视觉
在视觉中有作用的9种转录物是差别表达的(表14)。
表14.表达谱中的视觉基因调节
 基因产物Unigene IDLL3腔蛋白聚糖(LUM)Hs.4064751.031.30光受体间基质蛋白聚糖1(IMPG1)Hs.590893-1.031.18棘皮动物微管相关蛋白样2protein like 2(EML2)Hs.241781.071.15TIMP金属肽酶抑制剂3(TIMP3)Hs.2973241.281.05Tetratricopetide重复结构域(TTC8)Hs.3030551.101.01IMP(肌苷酸)脱氢酶1(IMPDH1)Hs.534808-1.20-1.12Tubby样蛋白质2(TULP2)Hs.1046361.07-1.15视网膜和前神经褶同源异形框(homebox)(RAX)Hs.278957-1.10-1.24G蛋白信号传导调节剂16(RGS16)Hs.4132971.01-1.26
编码LUM、EML2、TIMP3和TTC8的基因在2个补充组中都是超表达的。TaqMan测定显示为在微阵列数据中显示的5倍的LUM上调。IMPG1在L3/C中是上调的且在L/C中是下调的。RGS16和TULP2在L/C中是上调的且在L3/C中是下调的。RAX和IMPDH1在2个补充组中都是下调的。
腔蛋白聚糖(LUM)，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)家族成员是在哺乳动物结缔组织中广泛分布的细胞外基质糖蛋白。E.C.Carlson等人，Keratocan，a Cornea-specific Keratan Sulfate Proteoglycan，Is Regulated by Lumican，J.Biol.Chem.280(27)：25541-47(2005)。它大量存在于角膜基质以及心脏、主动脉、骨骼肌、皮肤和椎间盘的间质胶原基质中。S.Chakravarti & T.Magnuson，Localization of MouseLumican(Keratan Sulfate Proteoglycan)to Distal Chromosome 10，Mamm.Genome.6(5)：367-68(1995)。腔蛋白聚糖在小鼠中在新生儿发育期间帮助确立角膜基质的基质组构。缺乏腔蛋白聚糖的那些显示几种角膜相关缺陷。Beecher，N.等人，NeoNatal Development of the CornealStroma in Wild-Type and Lumican-Null Mice，Invet.Opthalmol.Vis.Sci.42(8)：1750-1756(2006)。它对于小鼠中的角膜透明度是重要的。TIMP3基因中的突变导致常染色体显性病症，Sorsby氏眼底营养不良，视网膜的年龄相关性黄斑变性。Li，Z.等人，TIMP3 Mutation in Sorsby＇sFundus Dystrophy：Molecular Insights，Expert Rev.Mol.Med.7(24)1-15(2005)。已提出关于Sorsby氏眼底营养不良中的视网膜变性的可能机制可起源于营养。Clarke，M.等人，Clinical Features of a Novel TlMP-3Mutation Causing Sorsby＇s Fundus Dystrophy：Implications for DiseaseMechanism，Br.J.Opthamol.85(12)：1429-1431(2001)。
腔蛋白聚糖无效小鼠显示出改变的胶原原纤维组构和角膜透明度的丧失。Carlson等人，J.Biol.Chem.280(27)：25541-47。腔蛋白聚糖还显著抑制同系基因小鼠中的皮下肿瘤形成且诱导和/或增强这些细胞的凋亡。Z.Naito，The Role of Small Leucine-rich Proteoglycan(SLRP)Family in Pathological Lesions and Cancer Cell Growth.J.Nippon.Med.Sch.72(3)：137-45(2005)。在乳腺癌中，腔蛋白聚糖减少的mRNA表达水平与快速的疾病进展和差存活率相关。同上。腔蛋白聚糖在乳腺、胰和结肠直肠癌中已牵涉为凋亡基因。S.Troup等人，ReducedExpression of the Small Leucine-rich Proteoglycans，Lumican，and DecorinIs Associated with Poor Outcome in Node-negative Invasive Breast Cancer，Clin.Cancer Res.9(1)：207-14(2003)；Y.P.Lu等人，Lumican Expressionin Alpha Cells of Islets in Pancreas and Pancreatic Cancer Cells，J.Pathol.196(3)：324-30(2002)；Y.P.Lu等人，Expression of Lumican in HumanColorectal Cancer Cells，Pathol.Int.52(8)：519-26(2002)。
LUM在L和L3组中在脑组织中都是上调的。因此，DHA和ARA补充在上调LUM表达中具有有利作用，并且认为此种上调可以减缓疾病进展且在患有乳腺、胰或结肠直肠癌的个体中提供更高的存活率。认为DHA和ARA补充还帮助抑制肿瘤。
IMPG1是参与视网膜粘附和光受体存活的蛋白聚糖。Kuehn，M.H.& Hageman，G.S.，Expression and Characterization of the IPM 150 Gene(IMPG 1)Product，A Novel Human Photoreceptor Cell-AssociatedChondroitin-Sulfate Proteoglycan，Matrix Bio.18(5)：509-518(1999)。婴儿代乳品中较高的DHA量增加IMPG1的表达。RAX转录物的表达在2个补充组中都是减少的。增加的RAX表达在脊椎动物眼发育期间在视网膜祖细胞中可见，且在分化的神经元中是下调的。Mathers，P.H.&Jamrich，M.，Regulation of Eye Formation by the Rx and Pax6 HomeoboxGenes，Cell.Mol.Life Sci.57(2)：186-194(2000)；Furukawa，T.等人，Rax，Hesl and Notch 1 Promote the Formation of Muller Glia byPostnatal Retinal Progenitor Cells，Neuron.26(2)：383-394(2000)。众所周知DHA促进脑中的神经突增生；这可以是关于本研究中RAX下调的可能原因。
基于上述结果，DHA和ARA补充调节帮助保持或发展视觉健康的基因。补充可能预防或治疗视觉疾病或病症的发展，或者可能改善视觉组分的发育。
对膜/膜级分的整合
其为生物膜的整合部分或在膜级分内的转录物在本发明中是差别表达的。例如，EVER1、PERP、Cep192、SSFA2、LPAL2、TMEM20、TM6SF1在2个组中都是上调的。ORMDL3、SEZ6L、HYDIN、TA-LRRP、尸KD1L1在L3/C中是上调的且在L/C中是下调的。MFAP3L在L/C中是上调的且在L3/C中是下调的。GP2和SYNGR2的转录物在2个组中都是下调的。
许多转录物由代乳品中增加的DHA得到上调。LCPUFA补充可以通过影响膜组成和透性、与膜蛋白质相互作用、膜结合的受体功能、光受体信号转导和/或转运而影响生物膜功能。Liefert，W.R.等人，Membrane Fluidity Changes are Associated with the Antiarrhythmic Effectsof Docosahexaenoic Acid in Adult Rat Cardiomyocytes，J.Nutr.Biochem.11(1)：38-44(2000)；Stillwetl，W.& Wassall，S.R.，DocosahexaenoicAcid：Membrane Properties of a Unite Fatty Acid，Chem.Phys.Lipids 126(1)：1-27(2003)；SanGiovanni，J.P.& Chew，E.Y.，The Role of Omega-3Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids in Health and Disease of theRetina，Prog.Retinal Eye Res.24(1)：87-138(2005)。EVER1或跨膜通道样6(TMC6)基因中的突变引起疣状表皮发育不良，一类皮肤病症。Ramoz，N.等人，Mutations in Two Adjacent Novel genes are Associatedwith Epidermodysplasia Verruciformis，Nat.Genet.32(4)：579-81(2002)。HYDIN是新基因，并且其功能由于突变几乎完全丧失引起小鼠中的先天性脑积水。Davy，B.E.& Robinson，M.L.，Congenital Hydrocephalus in Hy3Mice is Caused by a Frameshift Mutation in Hydin，a Large Novel Gene，Hum.Mol.Gen.12(10)：1163-1170(2003)。GP2的确切功能未知，但它已与胰中的分泌颗粒相关。Yu，S.等人，Effects of GP2 Expression onSecretion and Endocytosis in Pancreatic AR4-2J Cells，Biochem.& Biophys.Res.Comm.322(1)：320-325(2004)。
PERP(与PMP22相关的p53效应子)经由DHA和ARA补充在脑中表达。PERP是推定的跨膜受体和肿瘤抑制基因。由于在复层上皮中受损的粘附和显著的发疱，PERP敲除小鼠在出生后死亡。PERP的丢失通过损害p53和p63途径的肿瘤抑制活性可能与外胚层发育不良综合征或增强的癌症自发性危险相关。在正常斑马鱼发育期间，PERP是脊索和皮肤细胞存活所需的。
因此，DHA和ARA补充可能通过影响下述而影响膜/膜功能：(1)膜组成和透性、(2)与膜蛋白质相互作用、(3)膜结合的受体功能、(4)光受体信号转导、和/或(5)转运。
程序性细胞死亡/凋亡
具有凋亡活性的转录物是差别表达的。本研究中的9种转录物中的7种伴随增加的DHA而上调，包括CARD6、TIA1、BNIP1、FAF1、GULP1、CASP9和FLJ13491。程序性细胞死亡(PCD)在免疫和神经系统发育期间起重要作用。Kuida，K.等人，Decreased Apoptosis in the Brain andPremature Letharlity in CPP32-Deficient Mice，Nature 384(6607)：368-372(1996)。Jacobson等人提出PCD是在发育期间消除不需要的细胞中的重要事件。由于作为减少的凋亡活性的结果其CNS中非常过量的细胞沉积，具有CASP3的靶向缺失的小鼠在围产期死亡。Jacobson，M.D.等人，Programmed Cell Death in Animal Development，Cell 88(3)：347-354(1997)。CARD6(胱天蛋白酶召募结构域蛋白质6)在2个组中都是上调的。它是激活NF-κB且参与导致凋亡的信号传导事件的微管相互作用蛋白质。Dufner，A.S.等人，Caspase Recruitment Domain Protein6 is a Microtubule-interacting Protein that Positively Modulates NF-KBActivation，Proc.Natl.Acad.Sci 103(4)：988-93(2006)。在本发明中TIA1在L3/C中是上调的且在L/C中是下调的。TIA1是具有促凋亡活性的RNA结合蛋白家族的成员，并且它使环加氧酶-2(COX2)的翻译沉默。Narayanan等人提出DHA间接增加下调COX2表达的基因表达。Narayanan，B.A.等人，Docosahexaenoic Acid Regulated Genes andTranscription Factors Inducing Apoptosis in Human Colon Cancer Cells，Int.J.Oncol.19(6)：1255-62(2001)。COX2酶催化关于前列腺素生产的限速步骤，这影响许多过程包括炎症。Dixon，D.A.等人，Regulation ofCyclooxygenase-2 Expression by the Translational Silencer TIA-1，J.Exp.Med.198(3)：475-481(2003)。TIA1在L/C中的下调可能是由于主要的COX2底物ARA的影响，而不是竞争抑制剂DHA的影响。GULP1通过吞噬作用帮助有效去除凋亡细胞。Su，H.P.等人，Interaction ofCED-6/GULP，an Adapter Protein Involved in Englufment of ApoptoticCells with CED-1 and CD91 /Low Density Lipoprotein Receptor-RelatedProtein(LRP)，J.Bio.Chem.277(14)：11772-11779(2002)。CASP9激活胱天蛋白酶激活级联且是线粒体凋亡途径的重要组分。Brady等人，Regulation of Caspase 9 Through Phosphorylation by Protein Kinase C Zetain Response to Hyperosmotic Stress，Mol.Cell Bio.25(23)：10543-55(2005)。
上面讨论的结果指出这些基因的调节可能作为程序性细胞死亡或凋亡的部分来帮助消除不需要的细胞。这个结果在健康的免疫和神经系统的发育中是重要的。由DHA和ARA补充引起的调节还可以用于预防或治疗受试者中的炎症。
细胞骨架和细胞粘附
在本发明中，饮食LCPUFAs调节涉及细胞骨架和细胞粘附的许多转录物的表达。事实上，涉及细胞骨架的27个ps的表达被改变。编码肌球蛋白同工型MYO1A、MYO5A和MYO1E的基因得到改变。MYO1A和MYO5A伴随增加的DHA量而上调，而MYO1E显示减少的表达。肌球蛋白-1同工型是在膜动力学、细胞骨架结构和信号转导中起基本作用的膜结合分子发动机。Sokac等人，Regulation and Expression of MetazoanUnconventional Myosins，in International Review of Cytology—A Surveyof Cell Biology，Vo.200：197-304(2000)。
胶原IV和IX型的表达通过饮食LCPUFA得到改变。COL4A6和COL9A3显示增加的表达，而COL4A2和COL9A2显示伴随增加的DHA而减少的表达。IV型胶原是基膜的主要组分。轻度形式的Alport肾病与COL4A6基因中的缺失相关，并且眼异常在受Alport综合征折磨的人中是常见的。Mothes等人，Alport Syndrome Associated with DiffuseLeiomyomatosis：COL4A5-COL4A6 Delection Associated with a MildForm of Alport Nephrophathy，Nephrol.Dial.Transplant，17(1)：70-74(2002)；Colville等人，Ocular Manifestation of Autosomal RecessiveAlport Syndrome，Ophtalmic Gen.18(3)：119-128(1997)。COL4A6在上皮基膜中的丢失在癌症侵入的早期阶段中发生。COL4A6的表达在结肠直肠癌中是下调的。食道的平滑肌瘤(Leiomyomata)也与COL4A6基因中的缺失相关。
WASL也称为神经WASP(WASP)，在2个组中都是上调的。肌动蛋白细胞骨架调节对于脑发育和功能是至关重要的。WASL是肌动蛋白调节蛋白质且介导线足形成。Miki等人，Induction of FilopodiumFormation by a WASP Subcellular Localization and Function，Nature 391(6662)：93-96(1998)；Wu等人，Focal Adhesion Kinase Regulationof N-WASP Subcellular Localization and Function，J.Bio.Chem.279(10)：9565-76(2004)；Suetsugu等人，Regulation of Actin Cytoskeleton bymDab1 through N-WASP and Ubiquitination of mDabi，Biochem.J.384：1-8(2004)。HIP1(亨廷顿相互作用蛋白1)和HOOK2(钩同源物2)在2个组中都是下调的。
涉及细胞粘附的15种转录物的表达水平由于饮食LCPUFA而改变。例如，BTBD9、CD44、ARMC4、CD58、LOC389722和PCDHB13在2个组中显示增加的表达。糖蛋白CD44是涉及细胞-细胞和细胞-基质相互作用的细胞表面粘附分子，而PCDHB13是跨膜糖蛋白的原钙粘着蛋白(protocadherin)β家族的成员。Wu等人，A Striking Organization ofa Large Family of Human Neural Cadherin-like Cell Adhesion Genes，Cell97(5)779-790(1999)。NLGN3和CYR61在2个组中都是下调的。
细胞骨架和细胞粘附的正确功能对于活生物的正常功能发挥是重要的。细胞粘附蛋白质使实体组织的组分保持在一起。它们对于游走细胞如白细胞的功能也是重要的。某些癌症涉及关于粘附蛋白的基因中的突变，这导致异常的细胞与细胞相互作用和肿瘤生长。细胞粘附蛋白还使突触保持在一起，这可能影响学习和记忆。在阿尔茨海默氏病中，存在突触细胞粘附的异常调节。结果已显示DHA和ARA可以调节涉及正确的细胞骨架和细胞粘附的基因。因此，本发明的方法涉及用DHA和ARA补充受试者，以治疗或预防癌症或阿尔茨海默氏病、改善记忆、或允许白细胞的移动。
肽酶
具有肽酶活性的几种转录物是差别表达的。SERPINB6在L3/C中轻微上调且在L/C中下调。值得注意的是，ADAM蛋白质家族(ADAM17、ADAM33、ADAM8和ADAMTS16)在2个补充组中是上调的，且ADAMTS15是下调的。ADAM蛋白质是由于其携带的2个基序而命名的膜锚定糖蛋白：粘附结构域(解联蛋白)和降解结构域(金属蛋白酶)。这些蛋白质涉及几种生物学过程，包括细胞-细胞相互作用、心脏发育、神经发生和肌肉发育。ADAM17是其他蛋白质的蛋白水解加工所需的且已报道参与淀粉状蛋白前体蛋白的切割。ADAM17的丢失在与心脏、皮肤、肺和肠相关的异常中得到报道。实时PCR证实ADAM17的阵列结果。
ADAM17也称为肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)。ADAM17通过切割淀粉状蛋白β(Aβ)序列内的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)而发挥神经保护作用，且因此通过预防有毒的淀粉样蛋白β肽的形成而在阿尔茨海默氏病过程中起关键作用。Buxbaum JD等人，Evidence that TumorNecrosis Factor Alpha Converting Enzyme is Involved in RegulatedAlpha-Secretase Cleavage of the Alzheimer Amyloid Protein Precursor，J.Biol.Chem.273：27765-27767(1998)；Endres K等人，Shedding of theAmyloid Precursor Protein-Like Protein APLP2 byDisintegrin-Metalloproteinases，FEBS J.272(22)：5808-5820(2005)。此外，阿司匹林经由ADAM17诱导血小板受体脱落。Aktas B等人，AspirinInduces Platelet Receptor Shedding via ADAM 17(TACE)，J.Biol.Chem.280(48)：39716-22(2005)。
ADAM17的缺乏导致小鼠中的发育异常，包括上皮结构例如皮肤和肠，以及肺的形态发生中的缺陷。Peschon JJ等人，An Essential Role forEctodomain Shedding in Mammalian Development，Science 282(5392)：1281-4(1998)；Zhao J等人，Pulmonary Hypoplasia in Mice Lacking TumorNecrosis Factor-Alpha Converting Enzyme Indicates an Indispensable Rolefor Cell Surface Protein Shedding During Embryonic Lung BranchingMorphogenesis.Dev.Biol.232(1)：204-18(2001)。因此，认为DHA和ARA对ADAM17的上调作用可以预防上皮结构和心脏发育中的异常，并且可以预防或治疗阿尔茨海默氏病。
ADAM17介导严重急性呼吸综合征-冠状病毒(SARS-CoV)受体、血管紧张肽转变酶-2(ACE2)的调节的胞外域脱落。Lambert，D.W.等人，Tumor Necrosis Factor-Alpha Convertase(ADAM17)MediatesRegulated Ectodomain Shedding of the Severe-Acute RespiratorySyndrome-Coronavirus(SARS-CoV)Receptor，Angiotensin-ConvertingEnzyme-2(ACE2).J.Biol.Chem.280(34)：30113-9(2005)。还已显示缺乏ADAM17和ADAM19的小鼠具有心脏发育中加剧的缺陷。Horiuchi K等人，Evaluation of the Contributions of ADAMs 9，12，15，17，and 19 to Heart Development and Ectodomain.Shedding ofNeuregulins Betai and Beta2，Dev.Biol.283(2)：459-71(2005)。在缺乏功能性ADAM17的小鼠中观察到的心脏异常是增厚且畸形的半月瓣(主动脉和肺动脉瓣)和房室瓣。Jackson，L.F.等人，DefectiveValvulogenesis in HB-EGF and TACE-Null Mice is Associated withAberrant BMP Signaling，EMBO J.22(11)：2704-16(2003)。
ADAM33是‘解联蛋白和金属蛋白酶结构域’蛋白质家族的成员，且通过定位克隆近期已牵涉于哮喘和支气管高反应性。Van Eerdewegh，P.等人，Association of the ADAM33 Gene with Asthma and BronchialHyperresponsiveness，Nature 418：426-30(2002)。
ADAM33存在于平滑肌束中和胚胎支气管周围，强烈暗示它可能在平滑肌发育和功能中起重要作用。Haitchi HM等人，ADAM33 Expressionin Asthmatic Airways and Human Embryonic Lungs，Am.J.Respir.Crit.Care Med.171(9)：958-65(2005)。在分化和未分化的胚胎间充质细胞中的ADAM33蛋白质暗示它可能涉及呼吸道壁“塑型”且可能另外涉及贯穿一生的确定肺功能。同上；Holgate，ST等人，ADAM33：a NewlyIdentified Protease Involved in Airway Remodeling，Pulm.Pharmacol.Ther.19(1)：3-11(2006)。在鼠模型中，ADAM33mRNA表达在胚胎肺发育期间增加且保持到成年期。同上。平滑肌和成纤维细胞中的高水平表达暗示ADAM33在哮喘中的呼吸道重塑中起作用。Lee，JY等人，ADisintegrin and Metalloproteinase 33 Protein in Asthmatics：Relevance toAirflow Limitation，Am.J.Respir.Crit.Care Med.(Dec 30，2005)。
因为ADAM33在新生儿狒狒的L组和L3组中都是上调的，所以本发明人认为DHA和ARA补充帮助呼吸道壁“塑型”以及平滑肌发育和功能。
ADAM8(解联蛋白和金属蛋白酶结构域8)经由DHA和ARA补充在肝中表达。ADAM8也称为CD156，在单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中高度表达。它在哮喘疾病中起重要作用。近来，发现ADAM8显著抑制在小鼠中实验上诱导的哮喘。因此，ADAM8还可以在变应性疾病中起作用。ADAM8在调节单核细胞粘附和移动中起作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活还可以导致增加的ADAM8表达。
CTSB(组织蛋白酶B)也称为淀粉状蛋白前体蛋白分泌酶(APPS)是上调的。它涉及淀粉状蛋白前体蛋白的蛋白水解加工。Felbor等人报道CTSB的缺乏在小鼠中导致脑萎缩和神经细胞的丢失。Felbor等人，Neuronal Loss and Brain Atrophy in Mice Lacking Cathepsis V and L，Proc.Natl.Acad.Sci.99(12)7883-7888(2002)。CTSC(组织蛋白酶C)在L/C组中是下调的且在L3/C组中是上调的。CTSC基因中的功能突变的丧失与牙齿和皮肤异常相关。Toomes等人，Loss-of-Function Mutations inthe Cathepsin C Gene Result in Periodontal Disease and PalmoplantarKeratosis，Nat.Genet.23(4)：421-424(1999)。
组织蛋白酶B(CTSB)显示由于DHA和ARA补充而在脑中表达。组织蛋白酶B也称为淀粉状蛋白前体蛋白分泌酶(APPS)，并且涉及淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的蛋白水解加工。APP的不完全蛋白水解加工已暗示为阿尔茨海默氏病中的病因因素。CTSB在胎盘和蜕膜巨噬细胞中的定位暗示这些细胞在介导绒毛血管发生(angiogensis)和蜕膜凋亡中的生理功能。CTSB缺陷小鼠显示在早熟的胰内胰蛋白酶原激活中的减少。已报道CTSB和CTSL的组合缺乏导致神经元丢失和脑萎缩，从而暗示CTSB和CTSL是CNS的成熟和完整性所必需的。
NAALAD2是上调的，而PAPLN、RNF130、TMPRSS2、PGC、CPZ、FURIN是下调的。CPZ与WNT蛋白质相互作用且可以调节胚胎发育；然而，它在成体组织中的表达较不丰富。TPP2和SPPL2B显示在L/C中增加的表达和在L3/C中减少的表达。PAPPA、GZMA、SERPINA1、QPCTL转录物在L/C中是下调的且在L3/C中是上调的。几种假设蛋白质(FLJ10504、FLJ30679、FLJ90661、FLJ25179、DKFZp686L1818)是差别表达的。
基于上述结果，本发明人已显示DHA和ARA补充在调节肽酶基因中是有效的。因此，DHA和ARA在预防或治疗皮肤、心脏、肺和/或肠中的异常中有用。作为本发明方法的部分，DHA和ARA可能在帮助肺和/或CNS的成熟和完整性中特别有用。DHA和ARA还可能在预防或治疗哮喘或变应性疾病中有用。
细胞周期、细胞生长和细胞增殖
在细胞周期调节、生长和增殖中有作用的15种转录物是差别表达的。涉及细胞周期调节的4种转录物SESN3、RAD1、GAS1和PARD6B在2个组中都是上调的。
SESN3(sestrin 3)经由DHA和ARA补充而在脑中表达。Sestrins是其表达由p53调节的半胱氨酸亚磺酰还原酶。Budanov等人显示sestrins是帮助重建抗氧化剂性质的过氧化物氧还蛋白再生所需的。Budanov等人，Regeneration of Peroxiredoxins by p53-RegulatedSestrins，Homologs of Bacterial AhpD，Sci.304(5670)：596-600(2004)。SESN3的确切功能仍是未知的。
细胞生长因子INHBC和OGN在2个组中得到诱导。FGFR1OP是细胞增殖的正调节剂且显示增加的表达。KAZALD1、CDC20和CDKN2C是下调的。
生长停滞特异性基因1(GAS1)表达是出生后小脑发育确实需要的。与野生型小鼠相比较，缺乏GAS1的小鼠具有显著减少的小脑大小。Liu等人提出GAS1以细胞自主方式在细胞周期停滞和增殖中执行双重作用。Liu等人，Growth Arrest Specific Gene 1 is a Positive Growth Regulatorfor the Cerebellum，Dev.Biol.236(1)：30-45(2001)。PARD6B在轴突生成(axonogenesis)中有作用。Brajenovic等人，ComprehensiveProteomic Analysis of Human Par Protein Complexes Reveals anInterconnected Protein Network，J.Bio.Chem.279(13)：12804-11(2004)。
INHBC是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员，且涉及细胞生长和分化。骨甘氨酸(osteoglycin)(OGN)也称为Mimecan和骨诱导因子(osteoinducive foctor)(OIF)。Mimecan是小的富含亮氨酸的蛋白聚糖基因家族的成员，并且是角膜及其他结缔组织的主要组分。它在骨形成、角膜发育和角膜基质中的胶原原纤维生成调节中有作用。CDC20调节后期促进复合物。
本发明人在本发明中已显示DHA和ARA可以调节与细胞周期、细胞生长和细胞增殖相关的基因。同样，本发明的方法包括用治疗有效量的DHA和ARA补充受试者的饮食，以增强细胞生长和增殖且一般而言改善细胞周期。
对应激的应答
MSRA、SOD2、GSTA3和GSR基因是差别表达的。MSRA(肽甲硫氨酸亚砜(sufoxide)还原酶)在2个补充组中都是上调的。SOD2在L/C中是下调的且在L3/C中是上调的。GSR在L/C中是上调的且在L3/C中是下调的。GSTA3在2个组中都是下调的。
经由活性氧种类对蛋白质的氧化性损伤与氧化应激、衰老和年龄相关性疾病相关。MSRA在视网膜色素上皮细胞、神经元中且遍及神经系统表达。MSRA基因在小鼠中的敲除导致在常氧和高氧(100％氧)条件下缩短的寿命。MSRA还参与蛋白质的调节。MSRA通过减少活性氧种类的作用在神经变性疾病如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病中起重要作用。MSRA的超表达保护人成纤维细胞不受H₂O₂介导的氧化应激。
活性氧种类(ROS)可以使甲硫氨酸(Met)氧化成甲硫氨酸亚砜(MetO)。氧化的产物——甲硫氨酸亚砜可以通过肽甲硫氨酸亚砜还原酶而酶促还原回甲硫氨酸。MSRA在升高的氧化应激条件下在神经系统中占优势地超表达显著延长果蝇的寿命。甲硫氨酸亚砜还原酶是哺乳动物中的抗氧化剂防御和寿命的调节剂。
SOD2属于铁/锰超氧化物歧化酶家族。它编码线粒体蛋白质且帮助消除在线粒体内产生的活性氧种类。在本研究中，增加的DHA量减少谷胱甘肽相关蛋白质GSR和GSTA3的表达。
本发明中的数据已显示DHA和ARA补充在调节与应激应答相关的基团中是有效的。基于这些结果，DHA和ARA补充在预防或治疗氧化应激、年龄相关性病症和神经变性疾病中是有用的。此外，DHA和ARA补充可能帮助视网膜、神经元和神经系统的正确发育和完整性。治疗有效量的DHA和ARA的补充还可能延长受试者的寿命。
激酶和磷酸酶
蛋白质的磷酸化和去磷酸化控制许多细胞过程。具有激酶活性的几种蛋白质在本发明中由于DHA和ARA补充而改变。值得注意的是，包括STK3、STK6、HINT3、TLK1、DRF1、GUCY2C和NEK1的转录物伴随增加的DHA而显著上调。许多MAP激酶在L3/C组中是下调的，包括MAP4K1、MAPK12、MAP3K2和MAP3K3。显示显著减少的表达的其他转录物是CKM、LMTK2、NEK11、TNK1、BRD4和MGC4796。
具有去磷酸化活性的转录物包括ACPL2、KIAA1240、PPP2R3A、PPP1R12B，.PTPRG、PPP3CA和ACPP在L3/C组中是上调的。MTMR2、PPP1R7、PTPRN2和HDHD3伴随增加的DHA而显著下调。
转录因子
几种转录因子经由饮食LCPUFA而差别表达。锌指蛋白、同源异形框蛋白质和RNA Pol II转录因子在其中。几种锌指蛋白在L3/C中超表达，这包括ZNF611、ZNF584、ZNF81、ZNF273、ZNF547、MYNN、ZBTB11、PRDM7、JJAZ1、ZNF582、MLLT10、ZNF567、ZNF44、ZNF286、ZFX、NAB1、ZNF198、ZNF347和ZNF207，而PCGF2、ZBTB9、ZNF297、WHSCIL1、SALL4、ZNF589、ZFY、ZNF146、ZNF419和ZNF479在L3/C组中被抑制。锌指蛋白在真核生物中显示出各种生物学功能，包括转录的激活、蛋白质折叠、凋亡的调节和脂质结合。同源异形框转录因子TGIF2、PHTF1、OTP和HHEX在L3/C中被诱导，而PHOX2A、IRX1和MITF被抑制。RNA Pol II转录因子(BRCA1、TFCP2、CHD2、THRAP3、SMARCD2和NFE2L2)显示在L3/C中增加的表达。然而，关于UTF1、POU2F2、ELL、POLR2C、THRAP5、TGIF和GLIS1的转录物在L3/C中显示减少的表达。SOX7和SOX12，高速泳动族(HMG)框蛋白质也是差别表达的。ZNF611阵列表达结果经由实时PCR进行证实。
BRCA1是肿瘤抑制基因。BRCA1是第一种鉴定和克隆的乳腺和卵巢癌易感性基因。Miki Y.等人，A Strong Candidate for the Breast andOvarian Cancer Susceptibility Gene BRCA1，Science 266(5182)：66-71(1994)。遗传性和散发性乳腺和卵巢肿瘤通常具有减少的BRCA1表达。Wilcox CB等人，High-Resolution Methylation Analysis of the BRCA1Promoter in Ovarian Tumors，Cancer Genet.Cytogenet.159(2)：114-22(2005)。BRCA1可能有助于其肿瘤抑制活性，包括在细胞周期检查点、转录、蛋白质遍在蛋白化、凋亡、DNA修复和染色体分离的调节中的作用。Venkitaraman AR.Cancer Susceptibility and the Functions of BRCA1and BRCA2，Cell 108：171-182(2002)；Rosen EM等人，BRCA1 Genein Breast Cancer，J.Cell.Physiol.196：19-41(2003)；Lou Z等人，BRCA1Participates in DNA Decatenation，Nat.Struct.Mol.Biol.12：589-93(2005)；Zhang，J.& Powell，S.N.，The Role of the BRCA1 TumorSuppressor in DNA Double-Strand Break Repair.Mol.Cancer Res.3(10)：531-9(2005)。
新出现的描述是BRCA1通过保护细胞不受双链断裂(DSB)在维持基因组完整性中起重要作用，所述双链断裂在DNA复制期间或DNA损伤后出现。Zhang & Powell，2005。BRCA1突变携带者具有显著增加的胰、子宫内膜和子宫颈癌以及在小于65岁的男性中前列腺癌的危险。Thompson，D.& Easton，D.F.，Cancer Incidence in BRCA1 MutationCarriers，J.Natl.Cancer Inst.94：1358-1365(2002)。
BRCA1在L组和L3组中都是上调的，且因此认为DHA和ARA补充降低胰、子宫内膜、子宫颈和前列腺癌的危险且可以抑制肿瘤。
受体活性
执行受体活性的转录物是差别表达的。尽管增加的DHA水平与CD40、ITGB7、IL20RA、CD14、DOK3、MR1、BZRAP1、RARA、CD3D、IL1R1、MCP和HOMER3转录物减少的表达相关，对于FCGR2B、IL31RA、MRC2、SCUBE3、CR2、NCR2、CRLF2、SLAMF1、EGFR和KIR3DL2检测到增加的表达。有趣的是，视黄酸受体α(RARA)活性在2个组中都是减少的。EGFR表达水平经由QRT-PCR进行证实。
泛蛋白循环
在遍在蛋白化过程中有作用的25个探针组是差别表达的。有趣的是，F框蛋白质家族的5个成员(FBXL7、FBXL4、FBXL17、FBXW4和FBXW8)在L3/C组显示增加的表达。F-框蛋白质参与各种细胞过程例如信号转导、发育、转录的调节和细胞周期的转换。它们包含蛋白质-蛋白质相互作用结构域且参与磷酸化依赖性遍在蛋白化。与后期促进复合物相关的蛋白质(CDC23和ANAPC1)在L3/C组中是下调的。
其他
涉及下述的转录物都是差别表达的：1)钙离子结合(MGC33630、UMODL1、FLJ25818、S100Z、MGC12458、ITSN2和PRRG3)，2)锌离子结合(FGD5、ZFYVE28、尸DLIM4、ZCCHC6、ZNF518和INSM2)，3)ATP结合(MMAA和C6orf102)，4)GTP结合(DOCK5、DOCK6、DOCK10、MFN1和GTP)，5)核酸结合(IFIH1、C13orf10、DDX58、TNRC6C、RSN、ZCCHC5、DJ467N11.1、MGC24039和LOC124245)，6)DNA结合(KIAA1305、HP1-BP74、H2AFY、C17orf31、HIST1H2BD和HIST1H1E)，7)蛋白质结合(ABTB1、MGC50721、RANBP9、STXBP4、BTBD5和KLHL14)和8)蛋白质折叠(HSPB3、DNAJB12、FKBP11和TBCC)。同样，在RNA加工事件中起作用的几种转录物是差别表达的。例如，SFRS2IP、LOC81691、EXOSC2、SFPQ、SNRPN和SFRS5显示伴随增加的DHA而增加的表达，而NOL5A、RBM19、NCBP2和PHF5A显示伴随增加的DHA而减少的表达。与免疫应答相关的转录物也是差别表达的。例如HLA-DPB1、MX2和IGHG1伴随增加的DHA而超表达，而PLUNC表达不足。
称为FOXP2的基因(Forkhead框P2)在补充有DHA和ARA的狒狒的大脑皮质中是上调的。与对照组相比较，在L组中，该基因下调8％，但在L3组中该基因上调38％。FOXP2是在神经学发育中起重要作用的推定的转录因子。FOXP2中的突变可以引起严重的言语和语言缺陷。在鸣禽中的近期研究显示在歌曲可塑性期间，FOXP2在对歌曲学习重要的纹状体区域中是上调的。该基因还牵涉于言语发展。因此，本发明人认为FOXP2经由DHA和ARA补充的上调帮助神经学和言语发展。
经由DHA和ARA补充上调的其他基因包括XLC1和2。它们是趋化因子，C基序，配体1和2。趋化因子是一群小的(约8-14kD)，主要基本结构相关的分子，其通过与7跨膜G蛋白质偶联受体亚群相互作用调节各种类型白细胞的细胞运输。趋化因子还在发育、稳态和免疫系统的功能中起基本作用，并且它们对中枢神经系统的细胞以及涉及血管发生或血管发生抑制(angiostasis)的内皮细胞有作用。它们视为免疫应答的介质。因此，本发明人认为XLC1或2经由DHA和ARA补充的上调改善免疫系统的功能。
经由DHA和ARA补充上调的另一种基因是RNASE3。RNASE3也称为嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，是“A”家族的核糖核酸酶。它定位于嗜酸性粒细胞的颗粒基质，并且具有神经毒性、蠕虫毒性(helminthotoxic)和对细菌的防御应答以及核糖核酸裂解(ribonucleolytic)活性。它已牵涉于与细胞免疫的结合。因此，认为RNASE3经由DHA和ARA补充的上调改善免疫系统的功能。
NRF1是作用于编码线粒体转录和复制机器的呼吸亚单位和组分的核基因的转录因子。众所周知NRF1调节各种组织中的线粒体DNA转录和复制。NRF1基因的敲除在小鼠中导致约在植入时的胚胎死亡。May-PanloupP.等人，Increase of Mitochondrial DNA Content andTranscripts in Early Bovine Embryogenesis Associated with Upregulationof mtTFA and NRF1 Transcription Factors，Reprod.Biol.Endocrinol.3：65(2005)。
已显示NRF1表达在糖尿病和前驱糖尿病胰岛素抵抗力个体的骨骼肌中是下调的。Patti，M.E.等人，Coordinated Reduction of Genes ofOxidative Metabolism in Humans with Insulin Resistance and Diabetes：Potential Role of PGCl and NRFl，Proc.Natl.Acad.Sci.100(14)：8466-71(2003)。已显示NRF1具有针对氧化应激的保护功能，且具有肝中NRF1的体细胞灭活的小鼠发展出肝癌。Parola，M.& Novo，E.，Nrf1 GeneExpression in the Liver：a Single Gene Linking Oxidative Stress to NAFLD，NASH and Hepatic Tumours，J.Hepatol.43(6)：1096-7(2005)。
EPA和DHA的摄取增加NRF1的表达。Flachs P等人，Polyunsaturated Fatty Acids of Marine Origin Upregulate MitochondrialBiogenesis and Induce Beta-Oxidation in White Fat，Diabetologia.48(11)：2365-75(2005)。还已提出NRF1在急性脑损伤后在神经元存活中起重要作用。Hertel M等人，Upregulation and Activation of the Nrf-1Transcription Factor in the Lesioned Hippocampus，Eur.J.Neurosci.15(10)：1707-11(2002)。
NRF1的超表达增加细胞内谷胱甘肽水平。γ谷氨酰半胱氨酰甘氨酸或谷胱甘肽(GSH)在细胞中通过维持细胞内氧化还原平衡以及消除异生素和自由基来执行重要的保护功能。Myhrstad MC等人，TCF11/NRF1Overexpression Increases the Intracellular Glutathione Level and CanTransactivate the Gamma-Glutamylcysteine Synthetase(GCS)HeavySubunit Promoter，Biochim.Biophys.Acta.1517(2)：212-9(2001)。
认为在本发明中NRF1经由DHA和ARA补充的上调可以是用于改善脑发育、健康和功能的方法。
STK3是还称为哺乳动物不育20-样2(Mammalian Sterile 20-Like 2)(MST2)或对应激响应的激酶(Kinase Responsive to Stress)1(KRS1)的基因。它是促分裂原活化蛋白激酶的生发中心激酶组II(GCK II)家族的成员。Dan I.等人，The Ste20 Group Kinases as Regulators of MAPKinase Cascades，Trends Cell.Biol.11：220-30(2001)。新出现的证据暗示促凋亡激酶MST2在新肿瘤抑制途径中发挥作用。O＇Neill EE等人，Mammalian Sterile 20-Like Kinases in Tumor Suppression：An EmergingPathway，Cancer Res.65(13)：5485-7(2005)。MST2的超表达诱导凋亡。O＇Neill E，等人，Role of the Kinase MST2 in Suppression ofApoptosis by the Proto-Oncogene Product Raf-1，Science 306：2267-2270(2004)。在本研究中STK3在L和L3代乳品组中都是上调的。因此，认为DHA和ARA补充经由上调STK3在肿瘤抑制中是有效的。
RNASE3也称为嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)。它是由嗜酸性粒细胞颗粒的基质中释放的核糖核酸酶A家族中高度碱性的蛋白质。RNASE3具有抗病毒、抗细菌、神经毒性、蠕虫毒性和核糖核酸裂解活性。Rosenberg，H.F.，Recombinant Human Eosinophil Cationic Protein：Ribonuclease Activity is not Essential for Cytotoxicity，J.Biol.Chem.270(14)：7876-81(1995)；Kreuze，J.F.等人，Viral Class 1 RNase III Involvedin Suppression of RNA Silencing，J.Virol.79(11)：7227-38(2005)。RNA沉默是针对病毒进行防御、控制转座因子且参与沉默染色质形成的真核细胞监督机制。RNA沉默还涉及在发育过程期间基因表达的转录后调节。RNASE3增强RNA沉默的抑制。Kreuze等人，2005。还已显示在5种人胰类型RNASES中，只有人RNASE3擅长与细胞表面结合且对几种癌细胞系具有生长抑制作用。Maeda T等人，RNase 3(ECP)is anExtraordinarily Stable Protein Among Human Pancreatic-Type RNases，J.Biochem.132(5)：737-42(2002)。
RNASE2也称为嗜酸性粒细胞衍生神经毒素(EDN)。已证实在嗜酸性粒细胞衍生神经毒素和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白之间存在显著相似性。Hamann KJ等人，Structure and Chromosome Localization of theHuman Eosinophil-Derived Neurotoxin and Eosinophil Cationic ProteinGenes：Evidence for Intronless Coding Sequences in the Ribonuclease GeneSsuperfamily，Genomics 7(4)：535-46(1990)。EDN在体外灭活逆转录病毒。Rosenberg，H.F.，Domachowske，J.B.，Eosinophils，EosinophilRibonucleases，and their Role in Host Defense Against Respiratory VirusPathogens，J.Leukoc.Biol.70(5)：691-8(2001)。EDN具有抗病毒、抗细菌、细胞毒性、神经毒性、蠕虫毒性、树突细胞趋化活性、和核糖核酸裂解活性。同上；Yang D等人，Eosinophil-Derived Neurotoxin(EDN)，an Antimicrobial Protein with Chemotactic Activities forDendritic Cells，Blood 102(9)：3396-403(2003)。EDN还已显示在同种异体混合淋巴细胞反应的上清液中部分负责HIV-1抑制活性。Rugeles MT等人Ribonuclease is Partly Responsible for the HIV-1Inhibitory Effect Activated by HLA Alloantigen Recognition，AIDS 17：481-486(2003)。
RNASE2和RNASE3在1.00％ DHA或0.33％ DHA和0.67％ ARA补充的存在下在狒狒胸腺中都是上调的。因此，本发明已显示DHA和ARA补充经由上调RNASE2和RNASE3可以有效提供抗病毒、抗细菌、神经毒性、蠕虫毒性和核糖核酸裂解性质、细胞毒性和树突细胞趋化活性。
TNNC1也称为肌钙蛋白C，心脏(TNC)，在本发明中显示在肝中表达。横纹肌中的收缩由钙离子敏感性、多蛋白复合物肌钙蛋白和纤维状(fribrous)蛋白原肌球蛋白(tropomysoin)调节。TNNC1基因的第一种突变在患有肥厚型心肌病的患者中得到鉴定。这种突变与钙敏感性中的减少相关。氨基酸置换TNNC1(G159D)位于由Ca²⁺组成型占据的蛋白质结构域中。这可以改变对于Ca²⁺的亲和力，且由此改变肌钙蛋白复合物调节心肌收缩性的能力。特发性扩张型心肌病(DCM)是年轻人中心力衰竭和心脏移植的最常见原因。该状况的特征在于不明的左心室扩张、损害的收缩功能和由心肌纤维化支配的非特异性组织学异常。患者可能经历严重的疾病并发症，包括心律失常、血栓栓塞事件和猝死。已提出在肌钙蛋白复合物中的DCM突变可能诱导力量产生中的显著减少，从而导致损害的收缩功能和心脏扩张。此外，突变携带者的心肌可能更易受环境影响例如病毒和毒性试剂，这是可能的。
因此，认为经由DHA和ARA补充增加的TNNC1表达可以预防或治疗心脏的功能失常、疾病或病症，例如心律失常、血栓栓塞事件和甚至心力衰竭。
ASB1(含锚蛋白重复序列和socs框的蛋白质)已显示由于DHA和ARA补充而在肝中表达。ASB1属于细胞因子信号传导(SOCS)框蛋白质超家族的抑制剂。锚蛋白重复与蛋白质-蛋白质相互作用中的作用一致。已显示缺乏ASB1基因的小鼠显示精子发生的减少，伴随生精小管更不完全的填充。然而，ASB1的超表达无明显效应。随后认为根据本发明方法的DHA和ARA补充可能调节ASB1的表达，并且帮助生殖系统的正确发育和活性。
组织蛋白酶D(CTSD)是在本发明中已显示在肝中表达的溶酶体天冬氨酸蛋白酶。它在蛋白质降解以及由氧化应激、细胞因子和衰老诱导的凋亡过程中起重要作用。减少的CTSD活性已在先天性绵羊神经元蜡样脂褐质症(CONCL)中发现，所述疾病是一类神经变性疾病。CONCL由CTSD基因中的点突变引起，并且特征在于小的脑尺寸、显著的神经元丢失、反应性星形细胞增多和巨噬细胞的浸润。CTSD切割β分泌酶位点附近的β淀粉状蛋白前体蛋白。已显示CTSD可能在加工亨廷顿氏病中的突变型亨廷顿蛋白(mHtt)中起重要作用。在转基因小鼠模型中在视网膜色素上皮(RPE)中失活形式的CTSD显示RPE萎缩、光受体外节(POS)缩短和丢失以及加速的碎片积累。已显示在肾细胞癌症样品中减少的CTSD表达水平与关于发展转移性疾病增加的可能性相关。CTSD缺乏引起中枢神经系统中的大量神经元死亡，并且可能是关于溶酶体贮积、中风和年龄相关性神经变性疾病包括阿尔茨海默氏病的原因。因此，本发明的方法通过DHA和ARA补充在调节CTSD表达和预防或治疗神经变性和/或转移性疾病中有用。
LMX1B(LIM同源异形框转录因子1，β)在DHA和ARA补充后在胸腺中表达。LMX1B中功能突变的丧失引起指甲髌骨综合征(NPS)。NPS是影响四肢、肾、眼的发育和神经功能的常染色体显性病症。Lmx1b可能在发育中的脊髓中的神经元移动中具有独特作用。NPS患者中减少的疼痛应答可能是由于传入的感觉神经元无法移动。Lmx1b是小鼠中枢神经系统中的5-羟色胺神经元发育所需的。Dreyer等人显示LMX1B在关节和腱形成期间表达。Dreyer等人，Lmx1b Expression During Joint andTendon Formation：Localization and Evaluation of Potential DownstreamTargets，Gene Exp.Patterns 4(4)：397-405(2004)。LMX1B调节对于足细胞分化和功能重要的多种足细胞基因的表达。
根据本发明的方法用DHA和ARA补充已显示调节LMX1B表达，并且从而预防或治疗常染色体病症。此外，DHA和ARA补充经由LMX1B调节帮助四肢、肾、眼、神经系统和脊髓的正确发育。
BHMT(甜菜碱-同型半胱氨酸转甲基酶)在DHA和ARA补充后在肝中表达。BHMT是肝中重要的锌金属酶。BHMT的表达主要局限于肝，并且它的表达在肝硬化和肝癌的情况下减少。BHMT在猴眼晶状体的核区域中丰富表达，并且是发育调节的。因为BHMTs丰富地存在于眼晶状体中，所以它可以视为酶晶体蛋白。高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)视为许多重要疾病的危险因素，所述疾病如肾衰竭、心血管病症、中风、神经变性疾病(包括阿尔茨海默氏病)和神经管缺陷。BHMT催化从甜菜碱到同型半胱氨酸的甲基转移，以形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸，且帮助减少同型半胱氨酸的水平。因此，本发明在调节BHMT在肝中的表达，且从而促进健康的肝功能中有用。
PPARD(过氧化物酶体增殖物激活受体-Δ)在DHA和ARA补充后在肝中表达。C18不饱和脂肪酸已知激活人和小鼠PPARD。综合征X或代谢综合征是肥胖相关病症的集合。PPARs是转录因子且涉及响应脂肪酸的基因的调节。观察到PPARD敲除小鼠在代谢上较不活跃且是葡萄糖耐受不良的，而受体激活改善胰岛素敏感性。这暗示PPARD改善高血糖症且可能暗示治疗II型糖尿病的治疗方法。PPARD通过抑制在心脏成肌细胞(cardiomyoblasts)中氧化应激诱导的凋亡的发作而在心血管病症中发挥有利作用。PPARD的配体激活可以诱导角质形成细胞的终末分化。Burdick等人综述了关于PPARD的文献，且根据几项近期研究报道PPARD的配体激活可以诱导骨骼肌中的脂肪酸分解代谢，并且与改善的胰岛素敏感性、减弱的重量增长和升高的HDL水平相关。Burdick等人，The Role of Peroxisome Proliferator-ActivatedReceptor-Beta/Delta in Epithelial Cell Growth and Differentiation，CellSignal 18(1)：9-20(2006)。这暗示PPARD可以用作靶用于治疗肥胖、血脂异常(dyslipidemias)和2型糖尿病。在妊娠的前3个月和第三个3个月中观察到增加的PPARD表达，从而指出在胎盘功能中的重要作用。
因此，根据本发明方法的DHA和ARA补充可以调节PPARD表达，改善胰岛素敏感性、改善葡萄糖耐受不良、改善高血糖症，且治疗肥胖、血脂异常和2型糖尿病。
受DHA和ARA补充影响的其他基因分别在表15和16中列出。
表15.受DHA和ARA补充影响的大脑皮质基因¹。
 基因生物活性L组(与对照组相比较的调节％)L3组(与对照组相比较的调节％)TIMM8A酵母线粒体内膜移位酶8同源物457NF1神经纤维瘤病，1型227ADAM17解联蛋白和金属蛋白酶结构域173750BRCA1乳腺癌1基因435LUM腔蛋白聚糖330FOXP2Forkhead框P2-838SPTLC2丝氨酸棕榈酰转移酶，LC亚基22640FTH1铁蛋白重链1-837OSBP2氧化固醇结合蛋白2-1635NSMAF神经鞘磷脂酶激活相关因子-431PDE3A磷酸二酯酶，3A cgmp-抑制的830SOD超氧化物歧化酶2-729ACADSB酰基-辅酶A脱氢酶，短/支链-1138SFTPB表面活性剂，肺结合蛋白B335
¹正值指示上调；负值指示下调。
表16.受DHA和ARA补充影响的胸腺基因。
 基因生物活性L组(与对照组相比较的调节％)L3组(与对照组相比较的调节％)TOB1ERBB2的转导物，130110XCL1和XCL2趋化因子，C基序，配体1和24032RNASE3核糖核酸酶A家族36043SULT1C1磺基转移酶家族1C，成员13535HSPCA热激，90KD蛋白质1，α-225CD44CD44抗原3730CD24CD24抗原4328OSBPL9氧化固醇结合蛋白样蛋白质9320FCER1GIgE的Fc片段，受体亚单位14423KIR2DS1杀伤细胞免疫球蛋白样受体，2个结构域，短细胞质尾部，13010
最后，无已知基因本体论功能的406种转录物是差别表达的。这些转录物中的几种在最差别表达的之中，在它们中，H63、LOC283403、FL J13611、PARP6、C6orf111、C10orf67、TTTY8、C11orf1和PHAX是上调的，而关于CHRDL2、TSGA13、RP4-622L5、MGC5391、RNF126P1、FAM19A2和NOB1P的转录物被显著抑制。
Ingenuity网络分析
本发明人使用Ingenuity Systems网络分析研究了基因集合中的关联。在本文数据中1108个差别表达的探针组中，387个探针组(34.93％)在Ingenuity Pathway Analysis(IPA)知识数据库中找到，且标记为“焦点”基因。基于这些焦点基因，IPA产生显示于表17中的41个生物网络。








在这41个网络中，24个具有>8的得分且具有35个基因的最高的2个网络具有49的得分。由IPA鉴定的最高网络与神经系统发育和功能、细胞生长和增殖相关(图1)。表皮生长因子受体(EGFR)是在网络中发现的最突出的相互作用配偶体。EGFR与TIMP3、NRG1、ADAM17、EDG7和FGF7相互作用；全部是超表达的且涉及神经或视觉发育。EGFR信号传导牵涉于表皮、神经和眼发育的早期事件。EGFR信号传导的丧失在果蝇中导致减少的脑大小以及幼虫眼和视叶的丢失。EGFR表达在小鼠中是出生后前脑和星形胶质细胞发育所需的。使用IPA工具箱对这个网络进行的功能途径分析鉴定了涉及缺刻信号传导途径的3种基因——ADAM17、NUMB和HES1，所述缺刻信号传导途径调节神经系统和眼发育。ADAM17和NUMB是超表达的，而HES1在2个组中被抑制。这个分析暗示LCPUFAs影响其影响集中于EGFR的许多过程。它进一步举例说明根据本发明方法的DHA和ARA补充可以改善细胞生长和增殖以及神经系统、表皮和眼发育和功能。因此，本发明的方法涉及经由治疗有效量的DHA和ARA补充来改善这些领域中的至少一种。
已知LCPUFA与营养物敏感性转录因子直接相互作用，所述转录因子例如过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)、肝X受体、肝核因子-4α、固醇调节结合蛋白、类视黄醇X受体和NF-κB。摄食后，LCPUFA可以在数分钟内引发转录应答。关于LCPUFA补充动物的微阵列研究已鉴定了由LCPUFA调节的几种组织特异性途径，特别涉及肝、脂肪和脑组织转录组。使用鼠11 K Affymetrix寡阵列，Berger等人显示脂解基因增加的肝表达和脂肪生成基因减少的表达。Berger等人，Unraveling LipidMetabolism with Microarrays：Effects of Arachidonate andDocosaheaenoate Acid on Murine Hepatic and Hippocampal GeneExpression，Genome Bio.3(7)：preprint0004(2002)；Berger等人，Dietary Effects of Arachidonate-Rich Fungal Oil and Fish Oil on MurineHepatic and Hippocampal Gene Expression，Lipids Health Dis..1(2)：2(2002)。
然而，在海马脑区域中，涉及认知和学习调节的基因HTR4增加的表达以及TTR和SIAT8E减少的表达，以及与食欲控制相关的基因POMC得到鉴定。由Kitajka等人公开的关于谈到LCPUFA补充的脑基因转录组的第一篇文献证实给大鼠喂养鱼油(DHA 26.9％)增加涉及脂质代谢(SPTLC2、FPS)，能量代谢(ATP合酶亚单位d、ATP合酶H⁺、细胞色素、IDH3G)，细胞骨架(肌动蛋白相关蛋白质2、TUBA1)，信号转导(钙调蛋白、SH3P4、RAB6B小GTP酶)，受体，离子通道和神经传递(血管升压素V1b受体、促生长素抑制素)，突触可塑性(突触核蛋白)和调节蛋白质(蛋白磷酸酶)的基因表达。Kitijka等人，The Roleof n-3 Polyunsaturated Fatty Acids in Brain：Modulation of Rat Brain GeneExpression by Dietary n-3 Fatty Acids，Proc.Natl.Acad.Sci.99(5)：2619-24(2002)。
在相同研究中，鱼油补充还显著减少磷脂酶D和运甲状腺素蛋白的表达。在相关工作中，Kitajka等人使用具有3,200个点的大鼠cDNA微阵列发现类似于先前报道那些的结果。Kitajka等人，Effects of DietaryOmega-3 Polyunsaturated Fatty Acids on Brain Gene Expression，Proc.N.Acad.Sci.101(30)：10931-10936(2004)。Barcelo-Coblijn等人首先报道由于富含鱼油(DHA 11.2％)的饮食大鼠脑中基因表达中适度的年龄诱导的改变。Barcelo-Coblijn等人，Modification by DocosahexaenoicAcid of Age-Induced Alterations in Gene Expression and MolecularComposition of Rat Brain Phospholipids，Proc.Natl.Acad.Sci.100(20)：11321-26(2003)。在该研究中，2个月大的大鼠显示增加的SNCA和TTR表达，然而，2岁大的大鼠没有显示明显变化。同上。
另外，Puskas等人证实在2岁大的大鼠中来自鱼油(5％ EPA和27％ DHA；总脂肪含量：8％)的ω-3脂肪酸施用4周诱导运甲状腺素蛋白和线粒体肌酸激酶的表达，以及海马脑区域中的基因HSP86、ApoC-I和Makorin RING锌指蛋白2减少的表达。Puskas等人，Short-TermAdministration of Omega 3 Fatty Acids from Fish Oil Results in IncreasedTransthyretin Transcription in Old Rat Hippocamus，Proc.Natl.Acad.Sci100(4)：1580-85(2003)。最后，Flachs等人显示在脂肪组织中关于线粒体蛋白质的基因增加的表达。Flachs等人，Polyunsaturated FattyAcids of Marine Origin Upregulate Mitochondrial Biogenesis and InduceBeta-Oxidation in White Fat，Diabetologia 48(11)：2365-2375(2005)。
与先前的脑转录组分析相比较，使用高密度Affymetrix寡阵列(>54,000个ps.)的本研究揭示了由在模拟母乳范围的LCPUFA差别调节的基因。本文数据指出在母乳范围内的LCPUFA补充将诱导在众多生物学过程中的基因表达中的总体变化。
结论
DHA和ARA对婴儿狒狒的影响是显著和广泛的。几种新的差别表达的转录物在由饮食LCPUFA调节的12周龄的狒狒大脑皮质中得到鉴定。大多数探针组显示在基因转录中微妙的变化。在大脑皮质中，在2个组中都观察到线粒体质子载体UCP2(解偶联蛋白2)增加的表达，但在L3/C中更多。牵涉于儿童期神经变性的PLA2G6是差别表达的。COX2基因翻译的沉默基因TIA1在L3/C中是上调的。对于涉及神经发育的基因TIMM8A、NRG1、SEMA3D和NUMB观察到增加的表达。在视觉中具有作用的LUM、EML2、TIMP3和TTC8基因是超表达的。肝核因子-4α(HNF4A)显示伴随增加的DHA而减少的表达。RARA在2个组中都被抑制。
涉及归因于神经发育和功能的35种基因的网络使用Ingenuity网络分析得到鉴定，强调EGFR是网络中最突出的相互作用配偶体。在这个网络中，EGFR与涉及神经或视觉的基因TIMP3、NRG1、ADAMM、EDG7和FGF7相互作用。尽管很微妙，但在缺刻信号传导途径中先前未显示与脂肪酸相互作用的NUMB的上调和HES1的下调，支持LCPUFA特别是DHA在神经发育中的牵涉。有趣的是，没有已知的去饱和酶和仅有一种延长酶(elongase)，LCPUFA生物合成酶在大脑皮质中是差别表达的。
在肝基因表达的研究中，脂肪酸去饱和酶SCD和FADS1是显著下调的。多功能蛋白TOB1在肝中显著超表达。TOB1是受DHA和ARA补充影响的基因。它是ERBB2，1的转导物，并且与对照组相比较，在L组中在肝和胸腺中上调30％且在L3组中上调110％。TOB1是涉及海马依赖性学习和记忆的新多功能抗增殖蛋白质。Jin等人，The NegativeCell Cycle Regulator，Tob(Transducer of Erb-2)，is a MultifunctionalProtein Involved in Hippocampus-Dependent Learning and Memory，Neurosc.131(3)：647-59(2005)。该基因也已与淋巴细胞中的静止调节、肿瘤抑制和骨关节炎减少的发生率相关。Yusuf和Fruman，Regulation of Quiescence in Lymphocytes，Trends Immunol.24(7)：380-86(2003)；Yoshida等人，Mice Lacking a Transcriptional Corepressor Tobare Predisposed to Cancer，Genes Dev.17(10)：1201-06(2003)；Gebauer.等人，Repression of Anti-Proliferative Factor Tob1 in OsteoarthriticCartilige，Arthritis Res.Ther.7(2)：R274-R284(2005)。因此，因为该基因表明与学习、记忆、肿瘤抑制和骨关节炎有关，所以认为TOB1经由DHA和ARA补充的上调预防和/或治疗这些功能或病症中的每一种。
这些数据代表灵长类动物中的首次全面的转录组分析，并且已鉴定了大脑皮质基因中广泛的变化，所述基因由DHA中的增加调节、由饮食方式诱导。重要的是，本文使用的DHA范围在关于婴儿的天然食物——人和灵长类动物母乳的限制内，且指出CNS基因表达响应LCPUFA浓度。
本发明人已确定DHA和ARA增加的水平诱导在不同的生物学过程中的基因表达中总体变化的调节。例如，在本发明的实施方案中，DHA和ARA补充在下述方面有效：增加血浆神经酰胺和LysoSM水平，肿瘤抑制，预防铁相关病症，改善神经学发育例如语言、学习和记忆，介导免疫应答，增加肺功能和发育且预防心脏、皮肤、肠和肺异常。本发明人还认为本发明的实施方案在下述方面有效：预防或治疗各种神经变性病症，各种癌症，例如乳腺、胰、结肠直肠、卵巢、子宫内膜和前列腺，以及骨关节炎、精神分裂症和阿尔茨海默氏病。
此外，在涉及脂质机器例如吸收、转运和代谢的基因的转录和/或翻译水平上的调节，可以导致更低的血浆甘油三酯水平、脂肪细胞中更低的脂质积累、甘油三酯增加的利用和水解、和脂肪细胞和肌肉中增加的脂肪酸氧化。这些作用可以配合减少婴儿和儿童中的肥胖症、重量增长以及肥胖和动脉粥样硬化的发生。
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