一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法.pdf

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法，属于微生物饲料添加剂技术领域。该添加剂使用鱼粉、豆粕粉、棉籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、大豆蛋白胨、酵母膏中的一种或几种作为氮源，葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖、玉米粉、麸皮中的一种或几种作为碳源进行发酵而成，活菌数达到1×109CFU/ml以上，进一步经浓缩干燥或直接吸附到载体上，喷雾干燥得到芽孢杆菌粉剂，活菌数达到1×1010CFU/g以上。利用本发明提供的深层液体发酵法生产的新型芽孢杆菌产品无毒副作用、无耐药性、无残留；耐受加工、耐受肠道生境、耐储存。

1、  一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
1)凝结芽孢杆菌的一级斜面培养：
将凝结芽孢杆菌接种于一级斜面培养基上，于30～40℃培养24～36小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；
所述的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：大豆蛋白胨5.0～15.0，酵母膏5.0～15.0，葡萄糖3.0～10.0，MgSO₄.7H₂O 0.5～1.5，K₂HPO₄ 1.0～4.0，MnSO₄ 20～70ppm，CaCO₃ 5.0～15.0，琼脂20～30，pH为7.0；
2)凝结芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量20～100ml/500ml，在35～45℃、180～300rpm/min条件下培养25～36小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；
所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：大豆蛋白胨5.0～15.0，酵母膏 5.0～15.0，葡萄糖 3.0～10.0，MgSO₄.7H₂O 0.5～1.5，K₂HPO₄ 1.0～4.0，MnSO₄ 20～70ppm，CaCO₃ 5.0～15.0，pH为7.0；
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液体积百分比0.5～5％，在培养基上于35～45℃、180～300rpm/min条件下培养25～36小时，得到凝结芽孢杆菌；
所述的培养基同于步骤2)中的培养基；
4)凝结芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：氮源2～50，碳源50～150，K₂HPO₄ 1.0～3.0，CaCO₃ 5.0～15.0；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至105～121℃，并保温20～40min，自然冷却5～15min，通冷却水冷却至35～45℃，接入步骤3)中所述种子液，接种量0.5～5％，罐压0.02～0.10MPa，搅拌转速180～300rpm，通风量1：0.2～1.0，发酵时间20～40h，直至菌数达到10亿CFU/ml。

2、  如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基氮源为鱼粉、豆粕粉、棉籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、大豆蛋白胨、酵母膏中的一种或几种。

3、  如权利要求2所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的鱼粉、豆粕粉、棉籽粕使用前需用40％甲醛蒸汽灭菌20～40分钟，粉碎至60～120目。

4、  如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的碳源为葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖、玉米粉、麸皮中的一种或几种。

5、  如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于进一步包括下述步骤：
将步骤4)中的凝结芽孢杆菌的发酵液采取离心、微滤浓缩、添加载体保护直接离心喷雾干燥工艺，发酵液经负压真空浓缩到原体积的20～60％后，加入预先混合好的载体中，控制混合液固形物含量在10％～50％，喷雾干燥，最终物料水分3～10％。

6、  如权利要求5所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于最终物料菌体得率为90％，制剂的活菌数≥1×10¹⁰CFU/g。

7、  如权利要求5所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的载体为有机载体和/或无机载体。

8、  如权利要求7所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述的有机载体包括玉米芯粉、脱脂米糠、玉米蛋白粉、变性淀粉、葡萄糖中的一种或几种的混合物。

9、  如权利要求7所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述的无机载体为石粉、沸石粉、硫酸铝钾中的一种或几种的混合物。

10、  一种如权利要求1至9任一项所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法所制得的饲料添加剂。

一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法，属于微生物饲料添加剂技术领域。
背景技术
作为抗生素的替代品，微生态制剂凭借其独特的调节肠道菌群的功能，正越来越受到饲料业界人士的关注，而其中的乳酸菌类制剂更是备受青睐，以双歧乳酸杆菌和嗜酸乳杆菌、粪链球菌所制成的各种动物(包括人体在内)的保健品在国内外极其盛行。但这些制剂中使用的都是营养体细胞，对热和干燥的抵抗能力均较弱，保存性差，不耐加工，且经过消化道胃酸和胆盐的作用后活菌数急剧下降，使产品的应用受到限制。微胶囊包被法可提高产品中活菌的数量，但通过此法得到的产品价格昂贵。因此，只有找到一种既有良好的生物学功能又具有很强抗性的细菌，才能从根本上解决抗逆性和成本的问题。凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，由于其独特的芽孢结构，兼具有乳酸菌的有益功能和芽孢杆菌的抗逆性强的特性、耐热、耐酸，此菌一方面可以改变目前市售各种乳酸菌保存性差，培养和加工条件苛刻等缺点，减少流通领域中由于保存性差带来的损失；另一方面由于省掉了微囊包被环节，大大降低了生产成本。将凝结芽孢杆菌用于饲料添加剂并进行工业化生产，可以提高动物体内的整肠和免疫力功能，更可以克服因一些抗生素药物饲料添加剂所带来的动物耐药性和二重感染等问题，起到某些抗生素药物所不能实现的保健效果。
目前，凝结芽孢杆菌产品的研究尚处于起步阶段，专利CN 1831113A公开的一种用于水质净化的凝结芽孢杆菌的制备方法中，进行了固体发酵，制备的凝结芽孢杆菌活菌数高，可达1×10¹¹，但是由于固体发酵法易于污染杂菌的缺点导致研究者开始转向采用液体发酵法；专利CN 1579200A中公开了一种采用液体发酵法制备凝结芽孢杆菌菌剂的方法，液体发酵工艺简单，成本低，但是活菌数下降快，储存期短，且体积大，携带运输不便，容易污染；专利CN1857326A采用在菌泥中添加载体进行气流干燥将活菌制剂进行固化的技术，避免了液体发酵的弊端，提高了保存期，但是该专利将液体进行固化的过程中只采用了淀粉作为载体，载体类型比较单一，限制了应用的范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型饲料添加剂——凝结芽孢杆菌饲料添加剂，本发明的另一目的是提供该凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，包括下述的步骤：
1)凝结芽孢杆菌的一级斜面培养：
将凝结芽孢杆菌接种于一级斜面培养基上，于30～40℃培养24～36小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；
所述的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：大豆蛋白胨5.0～15.0，酵母膏 5.0～15.0，葡萄糖 3.0～10.0，MgSO₄.7H₂O 0.5～1.5，K₂HPO₄ 1.0～4.0，MnSO₄ 20～70ppm，CaCO₃ 5.0～15.0，琼脂 20～30，pH为7.0；
2)凝结芽孢杆菌的二级液体培养：
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量20～100ml/500ml，在35～45℃、180～300rpm/min条件下培养25～36小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；
所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：大豆蛋白胨5.0～15.0，酵母膏 5.0～15.0，葡萄糖 3.0～10.0，MgSO₄.7H₂O 0.5～1.5，K₂HPO₄ 1.0～4.0，MnSO₄ 20～70ppm，CaCO₃ 5.0～15.0，pH为7.0；
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液体积百分比0.5～5％，在培养基上于35～45℃、180～300rpm/min条件下培养25～36小时，得到凝结芽孢杆菌；
所述的培养基同于步骤2)中的培养基；
4)凝结芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：氮源2～50，碳源50～150，K₂HPO₄ 1.0～3.0，CaCO₃ 5.0～15.0；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至105～121℃，并保温20～40min，自然冷却5～15min，通冷却水冷却至35～45℃，接入步骤3)中所述种子液，接种量0.5～5％，罐压0.02～0.10MPa，搅拌转速180～300rpm，通风量1：0.2～1.0，发酵时间20～40h，直至菌数达到10亿CFU/ml。
上述步骤中所述的发酵培养基氮源为鱼粉、豆粕粉、棉籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、大豆蛋白胨、酵母膏中的一种或几种。其中，所述的鱼粉、豆粕粉、棉籽粕在使用前，本发明优选用40％甲醛蒸汽灭菌20～40分钟，粉碎至60～120目。所述的碳源为葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖、玉米粉、麸皮中的一种或几种。
本发明所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，进一步包括下述步骤：将步骤4)中的凝结芽孢杆菌的发酵液采取离心、微滤浓缩、添加载体保护直接离心喷雾干燥工艺，发酵液经负压真空浓缩到原体积的20～60％后，加入预先混合好的载体中，控制混合液固形物含量在10％～50％，喷雾干燥，最终物料水分3～10％。最终物料菌体得率为90％，制剂的活菌数≥1×10¹⁰CFU/g。
其中，所述的载体为有机载体和/或无机载体。所述的有机载体包括玉米芯粉、脱脂米糠、玉米蛋白粉、变性淀粉、葡萄糖中的一种或几种的混合物。所述的无机载体为石粉、沸石粉、硫酸铝钾中的一种或几种的混合物。
本发明还包括由上述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法所制得的饲料添加剂。
本发明提供的饲料添加剂及其生产工艺与现有技术相比，有明显的优点：
1)采用新型高效耐酸的凝结芽孢杆菌，耐受加工与耐受肠道生境；
2)改固体发酵为液体发酵，避免固体发酵过程中杂菌污染严重的现象，但不增加生产成本；
3)采用的凝结芽孢杆菌抗逆性好，活菌数高，可以避免贮存和运输中的活菌急速下降问题；
4)该方法采用多种物质作为碳源、氮源以及载体的来源，大大扩大了实际应用范围；
5)本方法生产成本低廉，具有显著的经济效益、社会效益和生态效益；
6)该法制备的凝结芽孢杆菌活菌制剂可以促进动物生长，提高饲料转化率，以及降低动物腹泻率的发生。
本发明上述主题范围不仅仅局限于以下实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范畴。
具体实施方式
实施例1 制备新型芽孢杆菌液剂-Y1
1)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS 1.2407)一级斜面培养：
将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上，于30℃培养24小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L)：大豆蛋白胨：5.0，酵母膏：15.0，葡萄糖：3.0，MgSO₄·7H₂O：0.5，K₂HPO₄：1.0，MnSO₄：20ppm，CaCO₃：5.0，琼脂20；pH：7.0；
2)凝结芽孢杆菌二级液体培养
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中，装液量20ml/500ml，在35℃、180rpm/min条件下培养25小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：大豆蛋白胨：5.0，酵母膏：5.0，葡萄糖：3.0，MgSO₄·7H₂O：0.5，K₂HPO₄：1.0，MnSO₄：20ppm，CaCO₃：5.0；pH：7.0；
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液0.5％(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于35℃、180rpm/min条件下培养25小时，得到凝结芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；
4)凝结芽孢杆菌液体发酵培养
所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：豆粕2.0，葡萄糖50.0，K₂HPO₄ 1.0，CaCO₃：5.0；豆粕先经40％甲醛蒸汽灭菌20min，粉碎到60目后使用，发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至105℃，并保温20min，灭菌时间到后自然冷却5min，通冷却水冷却至35℃，无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子，接种量0.5％，发酵pH自然，罐压0.02MPa，搅拌转速180rpm，通风量1：0.2，发酵时间20h。直至菌数达到10亿CFU/mL。
实施例2 制备新型芽孢杆菌液剂-Y2
1)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS 1.2407)一级斜面培养：
将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上，于40℃培养36小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L)：大豆蛋白胨：15.0，酵母膏：5.0，葡萄糖：10.0，MgSO₄·7H₂O：1.5，K₂HPO₄：4.0，MnSO₄：70ppm，CaCO₃：15.0，琼脂30，pH：7.0；
2)凝结芽孢杆菌二级液体培养
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中，装液量100ml/500ml，在45℃、300rpm/min条件下培养36小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：大豆蛋白胨：15.0，酵母膏：15.0，葡萄糖：10.0，MgSO₄·7H₂O：1.5，K₂HPO₄：1.0，MnSO₄：70ppm，CaCO₃：15.0，pH：7.0；
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液5％(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于45℃、300rpm/min条件下培养36小时，得到凝结芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；
4)凝结芽孢杆菌液体发酵培养
所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：豆粕50.0，葡萄糖150.0，K₂HPO₄ 4.0，CaCO₃：5.0；豆粕先经40％甲醛蒸汽灭菌40min，粉碎到60目后使用，发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至121℃，并保温40min，灭菌时间到后自然冷却15min，通冷却水冷却至45℃，无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子，接种量5％，发酵pH自然，罐压0.10MPa，搅拌转速300rpm，通风量1：1，发酵时间40h。直至菌数达到10亿。
实施例3 制备新型芽孢杆菌液剂-Y3
1)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS 1.2407)一级斜面培养：
将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上，于36℃培养30小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L)：大豆蛋白胨：10.0，酵母膏：10.0，葡萄糖：5.0，MgSO₄·7H₂O：1.0，K₂HPO₄：0.4，MnSO₄：40ppm，CaCO₃：10.0，琼脂25，pH：7.0；
2)凝结芽孢杆菌二级液体培养
将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中，装液量700ml/500ml，在36℃、200rpm/min条件下培养30小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：10.0，酵母膏：10.0，葡萄糖：5.0，MgSO₄·7H₂O：1.0，K₂HPO₄：0.4，MnSO₄：40ppm，CaCO₃：10.0，pH：7.0；
3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液3％(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于36℃、200rpm/min条件下培养30小时，得到凝结芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；
4)凝结芽孢杆菌液体发酵
所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：棉籽粕50.0，淀粉150.0，K₂HPO₄ 2.0，CaCO₃：10.0；棉籽粕先经40％甲醛蒸汽灭菌25min，粉碎到60目后使用，发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至115℃，并保温25min，灭菌时间到后自然冷却10min，通冷却水冷却至36℃，无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子，接种量3％，发酵pH自然，罐压0.04MPa，搅拌转速250rpm，通风量1：0.6，发酵时间36h。直至菌数达到10亿。
实施例4～20 制备新型芽孢杆菌液剂-Y4～Y20
表1 制备新型芽孢杆菌液剂Y4～Y20