一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂.pdf

本发明涉及一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂，其低残留、杀虫谱广、高效、能降解、选择性强。本发明包括以下重量百分比的组分：碱性蛋白酶9％-16％，表面活性剂1％-2％，高渗剂1％-1.5％，增效剂1％-3％，助剂3％-5％，水68％-84％。上述表面活性剂为苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助剂为三聚磷酸钠，增效剂由氯化镁、亚硫酸钠、硝酸铵、蔗糖和5种原料中的2种或2种以上的原料组配而成，所含各种原料及其重量比为亚硫酸钠∶硝酸铵∶尿素＝25～52∶8～15∶25～35；还掺入微量的碱金属盐类MgCl2或K2O3等作为添加剂。

1、  一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂，其特征在于包括以下重量百分比的组分：
碱性蛋白酶            9％-16％
表面活性剂            1％-2％
高渗剂                1％-1.5％
增效剂                1％-3％
助剂                  3％-5％
水                    68％-84％

2、  根据权利要求1所述的一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂，其特征在于：表面活性剂为苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助剂为三聚磷酸钠，增效剂由氯化镁、亚硫酸钠、硝酸铵、蔗糖和5种原料中的2种或2种以上的原料组配而成，所含各种原料及其重量比为亚硫酸钠∶硝酸铵∶尿素＝25～52∶8～15∶25～35。

3、  根据权利要求1所述的一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂，其特征在于：碱性蛋白酶的制造方法为：
(1)菌种培养：采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；
(2)发酵培养基配制；
(3)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；
(4)粗提：发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；
(5)精制：粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。

4、  根据权利要求3所述的一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂，其特征在于：发酵过程中发酵培养基配方为葡萄糖1.2％、蔗糖0.6％、淀粉1.2％，豆饼粉3％，酵母粉0.3％，K2HPO4·3H2O0.2％，其中百分比为w/w；发酵时间为36h，温度为36℃，初始PH值8.0，摇瓶转速150r/min。消泡剂为0.3％-0.6％花生油。

一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂
一、技术领域：
本发明涉及一种微生物杀虫剂，尤其是涉及一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂，其为一种通过微生物发酵后提取得到的具有杀虫活性的碱性蛋白酶和以其为主要活性物质的高效微生物杀虫剂。
二、背景技术：
自九十年代以来，全球化学农药以每年2％左右的比例下降，而生物农药的产量每年以10％—20％的速度递增。由于长期施用化学农药，农田生态平衡遭到了严重破坏，害虫防治难度日益增大。其次，农产品的农药残留对人类造成了巨大威胁，并严重影响我国农产品的出口，而生物防治刚好能克服诸多弊端。目前，全世界生物农药产品已经超过100多种，其中生物技术产品有10余种。在生物农药中，90％以上是微生物杀虫剂。随着对滥用化学农药危害性的认识，以及对无公害绿色食品的需求和对环境保护意识的增强，人们清楚地认识到应用微生物杀虫剂不仅是单纯的治虫，而且有利于保护环境，有利用于生态平衡，有利于民族健康。微生物具有易培养、易进行大规模工业化生产等特点，因此从微生物的代谢产物中寻找高效低毒、易被分解的杀虫物质成为微生物杀虫剂研究的热点。由于生物农药中产品开发方面有明显优势，世界各国都争相投资，研究和开发新型生物农药。在自然界，存在着许多对害虫有致病作用的微生物，利用这种致病性来防治害虫是一种有效的生物防治方法。我们可以从这些病原微生物中筛选出施用方便、药效稳定、对人畜和环境安全的菌种，进行工业规模的生产开发，从而制成微生物杀虫剂。微生物杀虫剂是生物科学与工程技术结合发展的产物，随着现代生物工程的迅速发展，微生物杀虫剂将有很大的开发前景。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂，其低残留、杀虫谱广、高效、能降解、选择性强。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种活性物质为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的微生物杀虫剂，其特征在于包括以下重量百分比的组分：
碱性蛋白酶                        9％-16％
表面活性剂                        1％-2％
高渗剂                            1％-1.5％
增效剂                            1％-3％
助剂                              3％-5％
水                                68％-84％
上述表面活性剂为苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助剂为三聚磷酸钠，增效剂由氯化镁、亚硫酸钠、硝酸铵、蔗糖和5种原料中的2种或2种以上的原料组配而成，所含各种原料及其重量比为亚硫酸钠∶硝酸铵∶尿素＝25～52∶8～15∶25～35。
上述碱性蛋白酶的制造方法为：
(1)菌种培养：采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；
(2)发酵培养基配制；
(3)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；
(4)粗提：发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；
(5)精制：粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。
上述发酵过程中发酵培养基配方(w/w)为葡萄糖1.2％、蔗糖0.6％、淀粉1.2％，豆饼粉3％，酵母粉0.3％，K₂HPO₄·3H₂O0.2％；发酵时间为36h，温度为36℃，初始PH值8.0，摇瓶转速150r/min。消泡剂为0.3％-0.6％花生油。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
本发明涉及一种活性物质为BQ-An碱性蛋白酶的杀虫剂，其通过枯草芽孢杆菌BQ-An为出发菌株，进行微生物发酵，提取到具有杀虫活性的碱性蛋白酶，经过大量药效试验证明，该活性物质具有与环境相容、选择性强、防效高、无残留等特点，且杀虫谱广，对小龄幼虫防治效果显著。
四、附图说明：
图1为本发明发酵工艺图；
图2为本发明菌株筛选图。
五、具体实施方式：
本发明为一种农药。通过土壤中的微生物BQ-An发酵提取得到的具有杀虫活性的碱性蛋白酶，以其为主要活性物质的生产高效微生物杀虫剂，具有无毒、高效、低残留的特点，可有效防治小龄幼虫。
实施例：
1、样品采集：
按照多点取样(不同地点、不同土层深度)混合的方法，铲去表层土，采用简易打孔器，打取深度为3—15cm的土样，装入无菌牛皮纸袋或铝盒中，做好记录。采集的土样应没有大的颗粒，带回实验室阴干后立即进行分离培养。其中取样的土壤为任何普通的土壤，任何普通的土壤中均含有枯草芽孢杆菌，即取样不受客观条件的限制，具有重复性。
2、分离与纯化(参见图2)：
将采来的土样阴干、研磨后，称取5g，放入150ml盛有45ml生理盐水的三角瓶中，摇动3-5min，在80℃水浴中加热10 min，杀灭不产芽孢的细菌和其他菌类。采用土壤稀释分离法，吸取1mL的稀释液加入到含有9mL水的试管中，振荡混匀，制得10^-2土壤稀释液；按照上述方法分别制取10-3、10-4、10-5土壤稀释液。分别取10-3、10-4、10-5土壤稀释液0.05 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上。倒置在28℃的恒温培养箱中培养48h。挑取单菌落，镜检，采用划线分离的方法纯化。
初筛
(1)初筛培养基(％)(w/w)：脱脂奶粉6.0；酵母膏0.1；葡萄糖0.1；MgSO_4·7H₂O 0.01；KH₂PO₄0.05；K₂HPO₄0.1；琼脂2.0；pH7.0。
(2)用接种环将分离得到的菌株接种在弹性蛋白平板培养基上，并置于37℃培养2一3天，然后观察直径和透明圈大小，以透明圈直径与菌落直径的比值(HC值)作为初筛指标。将比值大的用稀释倒平板或划线法进行分离纯化，挑取单菌落接入斜面，于37℃培养24-32小时。
3、复筛(参见图2)：
(1)发酵培养基(％)(w/w)：酪蛋白3.0；葡萄糖4.0；玉米提取液2.0；K2HPO40.2；MgSO4·7H2O0.01；pH6.0。
(2)将初筛所得菌株分别接种到基础发酵培养基中，摇床振荡发酵24小时后，4℃、4000rpm离心30分钟，取上清液，用标准底物、分光光度计测定各菌株弹性蛋白酶的活力反复试验，选择一株活力最高的菌株作为发酵菌株。酶活测定参照工业部颁国家标准方法进行。
4、微生物发酵条件优化
1、发酵培养基优化
(1)碳源选择
在原发酵基本培养基上，保持碳源含量不变，分别采用葡萄糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖+蔗糖(1:1)、蔗糖+淀粉(1:1)、葡萄糖+淀粉(1:1)及葡萄糖+蔗糖+淀粉(2:1:2)等有机物作为碳源，以不加任何碳源作为对照。
(2)氮源选择
选择(1)试验中抑菌效果最好的碳源组成方式作为碳源，改变氮源的组成。供选择的氮源有：蛋白胨、酵母粉、豆饼粉、尿素、玉米浆、麦麸、(NH₄)₂SO₄，以不加任何氮源作对照。
(3)无机离子选择 按照已筛选好的最佳碳源、最佳氮源作为碳氮源，称取适量的无机盐，使得金属离子在培养基中的浓度为0.02mol/L，以不加任何无机离子为对照。供选择的无机盐有：硫酸锌、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铁、磷酸氢二钾及硫酸镁。
(4)最优培养基正交实验
从上述培养基基本成分研究中，确定最佳碳源和氮源及加入的无机盐种类。为进一步确定各培养基成分因子含量之间的相关性，选取碳源、氮源、生长因子(酵母膏)和无机盐等4个因素进行正交筛选试验。每个因素取3个水平，根据正交表L₉(3⁴)设计实验。
表1 培养基组分L₉(3⁴)正交实验因素水平表

注：A：葡萄糖+蔗糖+淀粉；B：豆饼粉；C：酵母膏；D：磷酸氢二钾
发酵培养基PH的选择：
用4 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将培养基pH值调节为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0，最适温度下，150 r/min摇床培养38h，取发酵液测酶活。
3、发酵时间的选择：
将菌株发酵时间分别设成6、12、18、24、30、36、42、48h，调节pH为7.0，36℃下150r/min摇床培养，取发酵液测酶活。
4、发酵温度的选择：
将菌株发酵温度设成21、24、27、30、33、36、40℃，150r/min摇床培养，取发酵液测酶活。
5、摇床转速的选择：
将摇瓶的转速分别设为120、150、175、200、230r/min，调节最适pH，最适温度下，培养36 h，取发酵液测定酶活。
6、消泡剂的选择：
于已知最适条件下摇瓶发酵。在发酵液中加入不同的花生油作为消泡剂，进行酶的产生试验。
结果筛选得到最佳发酵培养基配方(w/w)为葡萄糖1.2％+蔗糖0.6％+淀粉1.2％，豆饼粉3％，酵母粉0.3％，K2HPO4·3H2O0.2％；最佳发酵时间36h，最佳温度36℃，初始最佳PH值8.0，摇瓶转速150r/min。消泡剂以0.3％-0.6％花生油为宜。
5、微生物发酵产物的提取和纯化工艺为：(参见图1)
1、发酵液的预处理
(1)发酵液的预处理：
取发酵完毕的发酵液100ml，加入絮凝剂NaAlO₂，室温搅拌8min后静置待分层。絮凝剂NaAlO₂的用量以质量百分比0.1％—0.15％为适宜。
(2)、发酵液的提取
a离心：
将预处理后的发酵液的上清液装入离心管，在4℃条件下8000r/min离心8min；
b脱色：
向洗脱液中加入1％的活性炭，用水浴加热至90℃，保温搅拌30分钟，趁热过滤，取滤液低温干燥可得粗蛋白酶。
c盐析：
将上述所得粗蛋白酶溶解，调pH为7.8，在冰浴条件下边搅拌边加入60％(w/w)的饱和硫酸铵溶液中，然后继续搅拌1h放置于4℃条件下4000r/min离心30min，收集沉淀，溶于0.2mol/L、pH7.4的硼酸缓冲液中，再用0.05mol/L的硼酸缓冲液透析。
d超滤：
将透析所得酶液置于超滤容器中在4℃的环境中，在氮气压力0.5个大气压力下，用截留分子量为10万的膜超滤5h，收集截留的液体。
e SephadexG一75凝胶柱层析：
在低温4℃的环境下，选择SephadexG一75作为填充介质。称取一定量的SephadexG一75在沸水中充分溶胀，冷却，装柱。将DEAE-Sephadex A50收集到的活性峰浓缩后上样。用0.1mol/LpH7.4的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min，用核酸/蛋白检测仪检测，收集碱性蛋白酶活性组分。然后冷冻干燥浓缩于4℃保存。
本发明活性物质为碱性蛋白酶的微生物杀虫剂的制备过程：
用芽孢杆菌BQ-An作生产菌株，选择用最佳培养基进行发酵，对发酵也浓缩提取活性物质碱性蛋白酶后，加入表面活性剂、增效剂、助剂、填料等，搅拌后即可包装。
微生物杀虫剂主要组分比例为(w/w)：
碱性蛋白酶                   9％-16％
表面活性剂                   1％-2％
高渗剂                       1％-1.5％
增效剂                       1％-3％
助剂                         3％-5％
水                           68％-84％
表面活性剂为苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助剂为三聚磷酸钠，高渗剂为OP-80，增效剂由氯化镁、亚硫酸钠、硝酸铵、蔗糖和5种原料中的2种或2种以上的原料组配而成。所含各种原料及其重量比为亚硫酸钠∶硝酸铵∶尿素＝25～52∶8～15∶25～35。
本发明活性物质为碱性蛋白酶的微生物杀虫剂室内药效试验：
1、分析方法；
药膜法测定杀虫剂对小龄幼虫的触杀毒力：
将杀虫剂等比稀释成5个梯级浓度(×10⁹、×10⁸、×10⁷、×10⁶、×10⁵)。在闪烁瓶(直径×高＝25mm×55mm)中加入0.5 ml药液，每处理重复3次，以不加杀虫剂为对照。加好药液后闪烁瓶平放在水平桌面上滚动，使闪烁瓶内侧形成均匀的药膜。每瓶接5头幼虫，瓶子横放，让试虫在药膜上爬行3 h，然后转入有孕穗期连根(用脱脂棉包住并加水保湿)小麦茎(高约10cm)的矿泉水瓶中(倒放)，再接入食料。用海绵塞封住矿泉水瓶瓶口。最后将试虫置于25℃、光周期14:10 h(L:D)的光照培养箱中，2d后检查死虫数。
杀虫剂毒力的评判
在确定杀虫剂的处理标准浓度后，对药剂处理后的药剂致死率加以校正，可直接查Abbort校正值表得到。用DPS软件对数据进行处理，计算毒力回归方程式、相关系数及LC₅₀。