一种细尖狼蝎KV13阻断剂基因及制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂Lm8的基因及制备方法和应用，其方法为：首先是构建细尖狼蝎毒腺细胞cDNA文库；从细尖狼蝎毒腺cDNA文库中筛选细尖狼Kv1.3阻断剂基因Lm8的阳性克隆子；进行测序，序列分析其细尖狼蝎Kv1.3阻断剂Lm8的编码特征，确定该阻断剂Lm8的氨基酸序列；采用基因工程的方法构建细尖狼蝎Kv1.3阻断剂Lm8重组大肠杆菌。表达和纯化了高纯度的重组Lm8多肽；膜片钳证实了重组Lm8多肽对电压门控mKv1.3的高效阻断作用。细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽在制备治疗或预防自身免疫疾病的药物中的应用。

1、  一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因，其特征在于：细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因重组大肠杆菌Escherichia coli DH5a/Lm8/pSPORT1，CCTCC NO：M207131。

2、  一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因重组大肠杆菌，其特征在于：细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因重组大肠杆菌Escherichia coli Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1，CCTCC NO：M207132。

3、  一种分离的多肽，其基因序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4、  一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

5、  一种实现权利要求1所述的一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因的制备方法，它包括下列步骤：
A、构建细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库，包括其毒腺用于总RNA的分离；取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，通过Trizol方法制备的蝎毒腺总RNA；
B、通过A步骤制备的蝎毒腺总RNA量为3mg，采用PolyA Tract mRNA分离系统分离和纯化mRNA，紫外分光光度计测定其获得的蝎毒腺mRNA；
C、用5μgmRNA为起始量，进行cDNA的第一链和第二链合成；
D、继续双链cDNA与SalI衔接头的连接，NotI消化双链cDNA，去除双链cDNA分子中的过量SalI衔接头和酶切片段；
E、双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化，毒腺细胞cDNA文库的鉴定，从细尖狼蝎毒腺细胞cDNA文库中挑选100克隆子，测序，为一个新的细尖狼蝎钾离子通道毒素基因。

6、  一种实现权利要求2所述的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因重组大肠杆菌的制备方法，其步骤是：
A、根据细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因序列设计与合成PCR上游引物，8-FP:5-GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA-3和下游引物，8-RP:5-GCTCTCGAGTCAGATAGAACATTTACA-3，用PCR技术从细尖狼蝎毒腺cDNA库中扩增Kv1.3阻断剂基因的成熟肽编码片段，并通过表达载体转化到受体菌大肠杆菌DE3；
B、设计的PCR引物含小肠激酶酶切位点gatgacgatgacaag:DDDDK，将PCR扩增的Kv1.3阻断剂成熟肽编码片段经过限制性内切酶酶切；
C、回收纯化后与经BamHI和XhoI酶切的pGEX-6p-1质粒连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5a中；
D、PCR方法和双酶切法鉴定阳性克隆子，阳性克隆子测序确证Kv1.3阻断剂成熟肽编码片段克隆到表达载体中，提取重组测序正确的重组阳性克隆子质粒Lm8/pGEX-6p-1，转化到大肠杆菌DE3中获得重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1；
E、将重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1经0.1mM的IPTG诱导，表达了谷胱甘肽转移酶-Lm8融合蛋白，经谷胱甘肽亲和层析柱纯化得到了融合蛋白GST-Lm8，超虑离心脱盐后用小肠激酶28℃酶切过夜，酶切产物经过高效液相色谱HPLC将Lm8和GST分开，收集Lm8蛋白峰，低温冷冻冻干，获得了重组细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽Lm8。

7、  一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽在制备治疗或预防自身免疫疾病的药物中的应用。

一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因，该基因的分离方法和生产这种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂。具体地说，本发明涉及一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因的分离；涉及一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆菌及其构建方法；还涉及一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂的制备方法，同时还涉及Kv1.3阻断剂在自身免疫疾病中的用途。
背景技术
蝎(scorpion)是我国的一种传统名贵中药，2000多年前就记载了蝎子的药用史。明朝《本草纲目》更详细记载蝎主治“诸风瘾疹、中风、半身不遂、口眼歪斜、语涩、手足抽挚，小儿惊痫风搐”等多种疾病，具有抗肿瘤，杀虫，抑菌和抗菌功效，其作用主要来源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一类由10-100个氨基酸组成的具有多种生物活性的小分子多肽，它们可以选择性、特异性的与细胞膜上的膜蛋白相互作用，从而改变细胞对离子的通透能力，调节细胞体积、pH、膜电位、兴奋性等多种细胞代谢过程和细胞分泌、激素作用和信号转导等多种生理过程。因此，蝎毒素具有重要的理论研究意义和应用开发价值。但是由于蝎毒成分复杂，结构相似，难以分离，许多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低，这些无疑都限制了蝎毒的研究和应用。很有必要采用现代分子生物学技术研究蝎毒单体成分的生理功能。
离子通道(ion channel)是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道，由于离子通道的功能、结构异常与许多疾病的发生和发展有关，因此离子通道的相关研究已成为了各国科学家们研究的重点之一。钾离子通道是细胞膜上重要的离子通道，是离子进出细胞的必经之路，对于细胞功能的调节具有十分重要的作用，而且由于其功能异常会引起多种神经精神疾病，因此钾离子通道的结构与功能研究也是目前分子神经生物学的前沿热点。近年来，电压门控的钾离子通道Kv1.3已成为了一个治疗众多疾病的有效靶标。对钾通道Kv1.3的研究表明，Kv1.3控制人类T淋巴细胞的活化，专一性的Kv1.3离子通道抑制剂将对T淋巴细胞的活化产生影响，这类抑制剂很可能成为新的免疫抑制因子，可用于防治移植排斥反应和治疗自身免疫疾病。
目前涉及蝎毒腺毒素基因的专利有7项：①东亚钳蝎毒素BmKAS在制药中的应用，该发明涉及东亚钳蝎毒素BmKAS在制备抗外周伤害药中的应用，以及东亚钳蝎毒素BmKAS在制备抗痛觉过敏药中的应用；②一种含有双价抗虫基因的重组杆状病毒，该发明涉及东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素基因BmKIT与一种昆虫几丁质酶基因(Chi)，获得含双价抗虫基因的重组杆状病毒AcNPV-BmKIT-Chi；③蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌及其构建方法，该发明涉及了一种蝎抗心律失常肽BmKIM基因重组大肠杆菌，用于大量生产可溶、具有抗心律失常活性的重组肽；④蝎抗心律失常肽及其制备方法和应用，该发明公开了一种蝎抗心律失常肽BmKIM及其制备方法和应用，本发明所得到的重组BmKIM多肽具有高效抗心律失常活性，且可溶性好，产量高；⑤一种人工合成的蝎氯离子通道神经毒素基因-rBmKCTa，该专利涉及到氯离子通道神经毒素BmKCT基因，采用基因工程所得的改良的重组蝎氯离子通道神经毒素对神经胶质细胞具有抑制作用，可用于制备通过抑制神经胶质细胞可以治疗的疾病的药物；⑥一种过渡型蝎毒素BmKabT的用途，本发明公开了的过渡型蝎毒素BmKabT的用途，它可以作为一个独特的钠通道调制剂，研究钠通道组成、结构和功能的探针，可调节和治疗钠通道相关疾病的调制剂和药品，可制备调节或治疗高血钾性麻痹、先天性肌强直及其它骨骼肌疾病、第三类长QT间隔症(LQT3)、原发性心室纤颤及其他心脏疾病的调制剂或药品；⑦一种重组蝎昆虫毒素及其可溶性表达和纯化方法，该发明涉及一种重组蝎昆虫毒素rBmKIT及其可溶性表达和纯化方法。
尽管①②③④⑤⑥⑦专利都是关于东亚钳蝎毒素的内容，专利涉及的蝎毒素基因BmKAS、BmKIT、BmKIM、BmKCT、BmKabT与本发明获得的来自于细尖狼蝎(Lychas mucronatus，Lm)Lm8基因是完全不同的毒素基因，并且①②③④⑤⑥⑦专利发明都没有涉及到钾离子通道阻断剂的功能。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因，该基因小，易于操作。
本发明的另一个目的还在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆菌的构建方法，方法简便，安全性高，生产成本低廉，纯化简单且产物纯度高。
本发明再有一个目的是提供一种用基因工程方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂的高效生物活性，细尖狼蝎Kv1.3阻断剂在制备治疗或预防自身免疫疾的病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明的构思为：①构建一个高质量细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库；②以上述①毒腺组织cDNA文库为基础，通过随机测序方法筛选到了一个克隆子8(编号)，序列分析为一种钾离子通道毒素基因，命名为Lm8，该菌已经保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2007年8月29日，保藏编号：CCTCC NO：M207131，分类命名：Escherichia coli DH5α/Lm8/pSPORT1；③构建了表达和生产重组蝎毒素Lm8的基因工程菌，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2007年8月29日，保藏编号：CCTCC NO：M207132，分类命名：Escherichia coli Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1；④采用基因工程的方法，获得了高纯度的重组蝎毒素Lm8，纯度达95％；⑤通过膜片钳方法，测定了④获得的重组蝎毒素Lm8对电压门控钾离子通道Kv1.3的高效阻断效用，其半效抑制剂量IC50为26.40±1.62nM。细尖狼蝎毒素Lm8在制备治疗或预防自身免疫疾病的药物中具有重要应用价值。
本发明的一个目的在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因。首先构建高质量细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库。包括其毒腺用于总RNA的分离；取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，通过Trizol方法制备的蝎毒腺总RNA；制备的蝎毒腺总RNA采用甲醛变性凝胶电泳检测其质量。
通过上述方法制备的蝎毒腺总RNA量为3mg，采用PolyATract mRNA分离系统(购自美国Promega)分离和纯化mRNA。紫外分光光度计测定其获得的蝎毒腺mRNA量约10μg；用5μgmRNA作为起始量，进行cDNA的第一链和第二链合成，继续双链cDNA与SalI衔接头的连接，NotI消化双链cDNA，去除双链cDNA分子中的过量SalI衔接头和酶切小片段，双链cDNA与pSPORT1载体(购自美国Invitrogen)的连接和转化，毒腺细胞cDNA文库的鉴定等步骤。结果获得了一个丰度为1.5*10⁶个克隆子/μgcDNA。采用该方法构建的蝎毒腺cDNA文库阳性插入率达到95％以上，细尖狼蝎的毒素基因覆盖率达到95％以上。
随机从构建好的细尖狼蝎毒腺细胞cDNA文库中挑选100克隆子，送公司测序。序列分析表明克隆子8为一个新的细尖狼蝎钾离子通道毒素基因，命名为Lm8。一种分离的多肽基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：ggaaggaaaatgaacaaagtttgctttgtcgtcgttcttgttctcttcgtggctctggctgcatatgtgtcacctatcgaaggtgtaccaacaggaggatgcccactttcggattcgctgtgtgccaaatattgcaagtcccacaaatttggcaaaaccggaagatgcaccggaccaaacaagatgaaatgtaaatgtctcgtgtaataaaatgtaagcgaataaagatttgtgaatgaaaaaaaaaaaaa(图1)。
本发明的另一个目的还在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。Lm8的前体组织形式编码65个氨基酸残基(SEQ ID NO：2)，由二个部分组成，即信号肽(25个残基)和成熟肽(40个残基)：MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEGVPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(SEQ ID NO：2)，信号肽序列为前25个氨基酸残基MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEG，其成熟肽是由40个氨基酸组成：VPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(图1)。
本发明的另一个目的在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆菌的构建方法(构建重组表达载体的示意图见图2)。包括设计与合成PCR上游引物(8-FP：5-GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA-3)和下游引物(8-RP：5-GCTCTCGAGTCAGATAGAACATTTACA-3)，用PCR技术从细尖狼蝎毒腺cDNA库中扩增Kv1.3阻断剂基因的成熟肽编码片段，并通过表达载体转化到受体菌大肠杆菌DE3(购自美国NOVAGEN)。其特征是，设计的PCR引物含小肠激酶酶切位点(gatgacgatgacaag：DDDDK)，将PCR扩增的Kv1.3阻断剂成熟肽编码片段经过限制性内切酶(BamHI和XhoI)酶切，回收纯化后与经BamHI和XhoI酶切的pGEX-6p-1(购自美国Novagen)质粒连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5a(购自中国典型培养物保藏中心)中，PCR方法和双酶切法鉴定阳性克隆子(图3和图4)。阳性克隆子进一步测序确证Kv1.3阻断剂成熟肽编码片段克隆到表达载体中。提取重组测序正确的重组阳性克隆子质粒Lm8/pGEX-6p-1，转化到大肠杆菌DE3中获得重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1，用于生产可溶的且有活性的重组细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽。
本发明的另一个目的在于提供一种生产细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽的基因工程方法。将重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1经0.1mM的IPTG诱导，高表达了谷胱甘肽转移酶-Lm8融合蛋白(GST-Lm8)(图5)，经谷胱甘肽亲和层析柱纯化得到了高纯度的融合蛋白GST-Lm8(图5)，超虑离心脱盐后用小肠激酶28℃酶切过夜(图5)，酶切产物经过高效液相色谱HPLC将Lm8和GST分开(图6)，手工收集Lm8蛋白峰，低温冷冻冻干(—40℃)，获得了高纯度和可溶性好的重组细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽Lm8，最终得率达到1mg/L。质谱分析重组细尖狼Kv1.3阻断剂多肽Lm8与预期分子量大小一致(图7)。根据本发明的生产方法，所得到的重组肽有以下特点：重组肽中不含有多余氨基酸残基，与由cDNA推测的成熟肽一致；所得到的重组肽是可溶的非包涵体状态，而且产量高，产量为1mg/L培养物。
本发明还有一个目的是提供一种用基因工程方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂对电压门控钾离子通道Kv1.3的高效抑制作用。包括稳定超表达人电压门控钾离子通道Kv1.3绿色荧光蛋白细胞系Cos7/mKv1.3的构建(图8)，采用全细胞膜片钳的方法，发现重组细尖狼蝎毒素多肽Lm8对表达于Cos7细胞系Kv1.3电流有明显的阻断作用，且具有剂量依赖性(图9)。通过浓度依赖曲线测定了重组细尖狼蝎毒素多肽Lm8对Kv1.3电流的半效抑制浓度IC50为26.40±1.62nM(图10)。采用本发明的方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂具有高效抑制电压门控的钾离子通道Kv1.3的作用，在制备治疗或预防自身免疫疾病(如哮喘、肌肉硬化症、红斑狼疮、硬皮病、类风湿性关节炎等)的药物中有重要的应用价值。
本发明是一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用。获得了一个全新的钾离子电压门控通道Kv1.3阻断剂基因。并且，构建了一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆菌，其方法简便，安全性高，生产成本低廉，纯化简单且产物纯度高。可以大规模基因工程生产Kv1.3阻断剂，用于防治自身免疫疾病。
附图说明
图1细尖狼蝎Lm8基因及其氨基酸。
cDNA序列下方为推断的对应氨基序列；信号肽氨基酸以单下划线标记；双下划线部分为PolyA加尾信号。
图2构建重组表达载体Lm8-pGEX-6p-1示意图。
抽提pGEX-6p-1质粒；PCR扩增Kv1.3阻断剂基因；BamHI和XhoI酶切pGEX-6p-1和Kv1.3阻断剂基因的PCR扩增产物；酶切的质粒和片段的连接，获得重组克隆子质粒Lm8-pGEX-6p-1。
图3PCR方法鉴定重组Lm8-pGEX-6p-1阳性克隆子。
M为DNA Marker；1为PCR阴性对照；2为PCR阳性对照；3-5为阳性转化子。
图4酶切方法鉴定重组Lm8-pGEX-6p-1阳性克隆子。
M为DNA Marker；1为Lm8基因片段的阳性对照；2为BamHI和XhoI双酶切重组质粒Lm8-pGEX-6p-1；3为BamHI单酶切重组质粒Lm8-pGEX-6p-1。
图5重组GST-Lm8、Lm8的表达与纯化的SDS-PAGE。
A：1为标准蛋白质分子量Marker；2为重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1未经IPTG诱导；3为重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1经IPTG诱导；4为重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-6p-1未经IPTG诱导；5为重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-6p-1经IPTG诱导。
B：1为标准蛋白质分子量Marker；2为经谷胱甘肽亲和层析柱纯化得到了高纯度的融合蛋白GST-Lm8；3为GST蛋白；4为HPLC纯化的Lm8蛋白；5为小肠激酶28℃酶切过夜产物。
图6HPLC分离GST和Lm8蛋白。
箭头指示纯化的Lm8蛋白。
图7重组Lm8蛋白的质谱分析。
图8稳定超表达人电压门控钾离子通道Kv1.3绿色荧光蛋白细胞系Cos7/mKv1.3。
图9重组Lm8蛋白对Kv1.3电流的浓度阻断效用。
图10重组Lm8蛋白对Kv1.3电流的浓度依赖曲线。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：蝎毒腺总RNA的提取(Trizol LS一步法：Trizo1LS购自美Invitrogen)
①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，加入10ml TRIZOLreagent混匀，室温(20-25℃，以下相同)放置5分钟；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室温放置2-3分钟，4℃下12000g离心15分钟；③取水相加1倍体积异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000g离心10分钟得RNA沉淀；④沉淀用5ml 75％乙醇洗涤，7500g离心5分钟；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC-treated water，55-60℃保温10分钟以彻底溶解RNA。整个过程参照TR1ZOL(Total RNA Isolation)ReagentKit推荐方法进行。
实施例2：mRNA的分离纯化
采用PolyA Tract mRNA分离系统(Promega，USA)分离和纯化mRNA，其工作原理是基于Oligo(dT)与mRNA 3’端poly(A)尾的互补配对特性，用生物素标记Oligo(dT)，通过它与mRNA 3’端poly(A)的退火形成杂交体，然后用标有亲合素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素Oligo(dT)/mRNA杂交体，最后用无RNA酶的ddH₂O将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。①样品的制备：将RNA加入到含有32μl β-巯基乙醇的800μl的GTC中。②探针的退火：取250pM浓度Oligo(dT)5μl，加蒸馏水至50μl；加入1.6ml预热(70℃)的dilution buffer(dilution buffer已加入32μl β—巯基乙醇)，与RNA混匀，70℃温育5分钟。③磁珠的活化：取1.2ml的磁珠SA-PMPS(购自美国Promega公司)于1.5ml的离心管中；用0.5×SSC(0.15摩尔/升的氯化钠和0.015摩尔/升的柠檬酸钠，pH7.0)重悬SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原体积0.5×SSC洗涤SA-PMPS3次。④mRNA的获取：将70℃温育的RNA与SA-PMPS混合，室温放置5分钟放磁架上吸附磁珠，弃上清液；2ml的0.5XSSC悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC；加入无RNA酶的ddH₂O至磁珠中，轻轻混匀，然后离心(12000g×3分钟)或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA。通过电泳和紫外测定mRNA的浓度和纯度。⑤mRNA的沉淀：将④获得的mRNA中加入糖原和2.5倍体积的无水乙醇，沉淀过夜，mRNA将用于cDNA的合成。
实施例3：第一链cDNA合成
①在1.5ml Ep管中加入2μl Not I Primer-adapter(美国INVITOGEN公司)和6μlmRNA(含3μg mRNA)，70℃温育10min，迅速放于冰上，离心后，加入下列成分：4μl 5X first strand buffer(美国INVITOGEN公司)；2μl 0.1MDTT；1μl 10mM dNTPs；1μl DEPC·H₂O。轻轻混匀后离心，37℃放至2min；②加入5μl逆转录酶，混匀后取2μl，加1μl[α-³²P]dCTP(4μCi)(示踪管)。与上述反应组分(样品管)同时37℃温育1h，然后放入冰上终止反应；③对于示踪管，依次加入43μl 20mM EDTA和5μl酵母tRNA，混匀后，分别取两份10μl点于两张滤膜上，1份用10％ TCA洗3次，每次5min，95％乙醇洗1次，空气干燥后，放入1.5ml闪烁液中(为1^#样品)；另1份空气干燥后，放入1.5ml闪烁液(为2^#样品)。另30μl示踪液，加1.5μl 7.5M NH₄OAc和90μl无水乙醇(-20℃)，混匀后立即14,000rpm离心20min，弃上清，加入0.5ml70％无水乙醇(-20℃)，14,000rpm离心2min，弃上清，37℃干燥10min让乙醇挥发，溶于10μl TEN溶液，加入10μl 2X加样缓冲液，取10μl用于碱性凝胶电泳。用[α-³²P]dCTP标记λDNA HindIII片段作分子量标记；④混匀后室温下放置15min，加入2μl 0.2M EDTA终止反应。取6μl反应液和6ml 2X碱性电泳缓冲液混匀，电泳5h后，用7％ TCA浸泡20min，直至溴酚兰变黄。然后用卫生纸吸干(8h左右)，进行放射自显影；⑤对于样品管，用于第二链的合成。

实施例4：第二链cDNA合成
①冰上在样品管中依次加入下列成分；②轻轻混匀后，16℃温育2h；③加入2μl(10units)T4 DNA聚合酶，继续16℃反应5min；④转入冰上，加入10μl0.5M EDTA；⑤加入等体积(150μl)酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，彻底涡旋后，室温下14,000rpm离心5min。将水相(140μl)转入另一1.5ml Ep管；⑥加入70μl的7.5M NH₄OAc和0.5ML无水乙醇(-20℃)，涡旋后，室温下14,000rpm离心20min；⑦弃上清，加入0.5ml70％乙醇(-20℃)，同上离心2min。弃上清，37℃干燥10min。

实施例5：双链cDNA与Sal I衔接头的连接
①用25μl DEPC·ddH₂O溶解实施例4的cDNA样品，然后按下表依次加入；②轻轻混匀，16℃反应过夜(约20h)。③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提和NH₄Oac/乙醇沉淀后，37℃干燥10min。

实施例6：Not I消化双链cDNA
①将实施例5的样品溶于41μl，然后按下表依次加入；②混匀后，37℃温育2h；③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5M NH₄Oac/乙醇沉淀，37℃干燥10min。④溶于70μlTEN，取1μl用于定量，其余-20℃保存备用。

实施例7：去除双链cDNA分子中的过量Sal I衔接头和酶切小片段
用nucleon extraction and purification kit(Amersham，USA)去除过量Sal I衔接头和酶切小片段。①室温下悬浮树脂，然后取600μl加于离心柱中，2000rpm离心10s，去掉液体。在树脂中央加入40μl上述cDNA溶液。同上离心；②收集洗脱液用于连接反应。
实施例8：双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化
①在1.5ml Ep管中依次加入下列成分；②室温下反应16h；③在②反应液中依次加入下列成分：5.0μl yeast tRNA，12.5μl 7.5M NH4Oac，70μl无水乙醇(-20℃)。涡旋混匀后立即14000离心20min；④沉淀用70％乙醇(-20℃)洗涤，37℃干燥后溶于4μl；⑤取2μl电击转化50μl E.coli K12 MC1061。

实施例9：毒腺细胞cDNA文库的初步鉴定
用PCR方法鉴定文库的质量，正向引物：5’TCGACCCACGCGTCCG3’(按SalI衔接头序列设计)；反向引物：5’GAGCGGCCGCCCT153’(按NotI引物-衔接头的序列设计)。
实施例10：随机测序策略筛选cDNA文库
随机从构建好的细尖狼毒腺细胞cDNA文库中挑选100克隆子，送上海三博公司测序。序列录入软件为BioEdit v4.5.8(Tom Hall，1999)，同源性比较和信号肽切割位点预测软件分别为CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.，1997)和PC/GENE(Intelligenetics Inc.，Switzerland)。序列分析表明克隆子8为一个全新的毒素基因，命名为Lm8。其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：ggaaggaaaatgaacaaagtttgctttgtcgtcgttcttgttctcttcgtggctctggctgcatatgtgtcacctatcgaaggtgtaccaacaggaggatgcccactttcggattcgctgtgtgccaaatattgcaagtcccacaaatttggcaaaaccggaagatgcaccggaccaaacaagatgaaatgtaaatgtctcgtgtaataaaatgtaagcgaataaagatttgtgaatgaaaaaaaaaaaaa。该基因含有一个完整的开放阅读框，有两个加尾信号aataaa。Lm8的前体组织形式编码65个氨基酸残基，由二个部分组成，即信号肽(25个残基)和成熟肽(40个残基)：MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEGVPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(SEQ ID NO：2)。信号肽序列为前25个氨基酸残基MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEG，其成熟毒素是由40个氨基酸组成：VPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(图1)。
实施例11：设计引物及PCR扩增细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因
按照SEQID NO：1所提供的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因(Lm8基因)序列设计PCR正向和反向引物：8-FP(8-FP：5-GCGGGATCCGATGACGATGACAAGGTACCAACAGGAGGATGC-3)和8-RP(8-RP：5-GCCCTCGAGTTACACGAGACATTTACA-3)，以从蝎毒腺细胞cDNA库中筛选所获得的Lm8基因(SEQ ID NO：1)克隆子为模板，进行PCR反应，大量扩增细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因的成熟肽区序列。PCR反应条件：1μl Taq聚合酶(1U)、0.5μl四种(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)脱氧单核苷酸等比混合液(10mmol/L)、16.5μl无菌双蒸水、2.5μl 10倍PCR缓冲液、1.5μl氯化镁(25mmol/L)、A1(10μmol/L)和A2(10μmol/L)引物以及Lm8基因模板各1μl，总体积为25μl。PCR反应过程：94℃预变性300秒、94℃变性60秒、55℃复性60秒、72℃延伸60秒、循环35次、72℃最后延伸300秒。
实施例12：Lm8和pGEX-6p-1的双酶切与连接
将实施例1中所得PCR产物经过酚:氯仿:异戊醇(25：24：1)抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用50μl灭菌水溶解沉淀。用限制性内切酶BamHI和XhoI(Takara公司产品)对回收的PCR产物和表达载体pGEX-6p-1质粒进行酶切。酶切反应：BamHI(14U/μl)和XhoI(20U/μl)各1μl，10倍缓冲液2.5μl，，PCR产物或pGEX-6p-1质粒50-100ng，加无菌水至总体积为25μl。37℃水浴5小时，酶切产物经酚:氯仿:异戊醇抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用T₄DNA连接酶将PCR产物与表达载体pGEX-6p-1连接。连接反应：T₄DNA连接酶(1U/μl)1μl，PCR产物与表达载体pGEX-6p-1的摩尔比为3∶1，并且DNA总量为0.1μg，5倍连接酶反应缓冲液4μl，加无菌水至总体积为20μl，16℃放置24小时。
实施例13：大肠杆菌DH5a和ROSSETTA(DE3)感受态细胞的制备
DH5α感受态细胞的制备：在划线平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml LB培养液，37℃，250rpm摇床中培养过夜；以1％量转接于5ml LB培养基中，生长至OD₆₀₀到0.4～0.6，取菌液1ml于预冷的1.5ml Eppendorf管中，冰浴5～10分钟，4℃ 12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，倒置1分钟，再冰浴10分钟；沉淀重悬于1ml预冷的0.1M CaCl₂中，冰浴20～40分钟(可省略)，4℃ 12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，将菌体重悬于150μl预冷的CaCl₂中，冰浴2～7小时，4℃冰箱保存，如放置在-70℃则可保存6个月。
Rossetta(DE3)感受态细胞的制备同于DH5α感受态细胞的制备。
实施例14：连接产物的转化和阳性克隆的鉴定
将实施例12中的20μl连接反应液加到100μl的DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒(不能摇动)，再冰浴2分钟；加等体积2×LB培养液，37℃摇床(120rpm)温育1小时；摇匀菌液，取200μl涂布于LB/AP⁺琼脂平板上，待菌液吸干后倒置于37℃培养12～16小时，观察结果。
LB/AP⁺琼脂平板上挑取单菌落10个，于500μl含氨苄的LB液体培养基中37℃振摇4小时，取2μl菌液作为模板，以实施例11中的正反向引物进行PCR。PCR筛选的阳性克隆子进一步使用限制性酶切反应鉴定。两者都为阳性结果的克隆子送上海三博公司进行测序分析。测序引物是针对pGEX-6p-1质粒的通用测序引物pGEX5’primer。
实施例15：重组表达质粒Lm8/pGEX-6p-1提取和基因工程菌Rossetta(DE3)(Lm8/pGEX-6p-1)的制备
将实施例14中测序确证的阳性克隆子按照碱裂解法提取重组表达质粒Lm8/pGEX-6p-1(方法见《分子克隆》第二版)。按照实施例14中的转化方法将提取的Lm8/pGEX-6p-1质粒转入实施例13制备的大肠杆菌感受态Rossetta(DE3)细胞中。平板为LB/AP⁺琼脂平板。挑取单克隆子获得基因工程菌Rossetta(DE3)(Lm8/pGEX-6p-1)，保存于中国典型培养物保藏中心。重组大肠杆菌Escherichiacoli Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1，CCTCC NO：M207132。
实施例16：重组GST-Lm8的表达和亲和层析
在含氨苄青霉素的LB液体培养基中以1:100的比例接种克隆子(重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1)，37℃培养至OD₆₀₀ 0.8时加入IPTG(终浓度为0.1mM)对培养物进行诱导，然后将培养物在28℃培养4小时以进行目的基因的表达(见图5)。浓缩诱导后的培养物50倍，超声波破细胞(80HZ，30秒/次，至培养物变清亮为止)，12000rpm离心15分钟，所得上清加入到GST亲和层析胶中充分混合后26℃作用1小时使融合蛋白GST-Lm8与GST亲和层析胶充分结合。用含50mM的EDTA的Tris-Cl缓冲溶液(1.0mM，pH8.0)反复冲洗GST亲和层析胶去除杂蛋白。然后用10mM的GSH溶液按照50ml/L培养物洗脱融合蛋白GST-Lm8。
实施例17：重组GST-Lm8蛋白的浓缩脱盐和小肠激酶酶切
将实施例16中洗脱的融合蛋白GST-Lm8通过15ml的10KDa超虑管(Millipore，Centricon，USA)离心浓缩脱盐，离心速度为3500rpm/min，温度为4℃。然后浓缩脱盐的GST-Lm8融合蛋白进行小肠激酶(Biowisdom，China)消化。小肠激酶酶切反应体系如下：小肠激酶10U，10倍缓冲液100μl，GST-Lm8融合蛋白10mg，加无菌水至总体积为1000μl。37℃水浴12小时。酶切消化的蛋白结果可以在Tricine-SDS-PAGE电泳中检测(见图6)。
实施例18：HPLC分离rLm8蛋白和质谱分析rLm8蛋白
将实施例17中消化的GST-Lm8融合蛋白通过HPLC(美国安吉伦公司产品)，把Lm8蛋白和GST蛋白分离。HPLC的参数设置为：分离柱子C18 column(EliteHPLC，China，10×250mm，5μm)，流速5ml/min，液相为含有0.1％TFA的CH3CN(10％ to 80％)洗脱液，紫外检测设置在230nm处。手工收集Lm8蛋白峰，并且冷冻干燥(—40℃)。通过Tris-Tricine缓冲液的SDS-PAGE蛋白质电泳检测收集液中的重组Lm8蛋白，并用Bradford方法测定含量。高纯度的rLm8蛋白通过MALDI-TOF-MS(Voyager-DESTR，Applied Biosystems)测定其分子量为4241.05(见图7)，与理论推导一致，表明成功的获得了高纯度的与天然Lm8蛋白完全一致的重组蛋白质。
实施例19：稳定超表达mKv1.3的绿色荧光蛋白的Cos7细胞系
鼠的电压门控钾离子通道Kv1.3克隆到真核绿色荧光表达载体pIRES2-EGFP中，构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-mKv1.3。测序确证正确的阳性克隆子用来大量提取pIRES2-EGFP-mKv1.3质粒。
质粒pIRES2-EGFP-mKv1.3转染Cos7细胞使用购自广州太阳马公司的转染试验盒。转染的最适DNA浓度约为5-30μg/mL。为了获得最好的转染效率，细胞密度应该为60-70％。对于24孔板，最理想条件是在转染前18-24h，每孔接种8×10⁴-2.0×10⁵个细胞。0.6μg DNA质粒稀释于30μL不含血清和抗菌素的DMEM中，轻轻混匀；1-2μL梭华-SofastTM稀释于30μLDMEM中，轻轻混匀；30μL梭华-SofastTM稀释液滴加到DNA稀释液中，一边滴加一边混匀；室温孵育15-20min；60μL梭华-SofastTM/DNA复合物加到每孔中并轻轻摇动使均匀混合；放置37℃ CO₂孵育箱孵育24-48h后，观察并分析报告基因转染效率。然后吸出培养液和沉淀物，用PBS将单层细胞再洗一次，每孔加入2mL预加温(37℃)的完全培养基。在非选择性培养基上培养72h后，使所转移基因得到充分表达，再用胰蛋白酶消化细胞，以1：10的浓度转接，加非选择性培养基培养24h后，再换含有适当浓度G418(800μg/mL)的选择性培养基，这种培养基在2-3周内每2-4d须更换1次，以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。筛选得到的稳定转染细胞系可以通过绿色荧光蛋白表达得以鉴定(见图8)。将强烈表达绿色荧光蛋白的Cos7细胞集落传代培养，用于下一步膜片钳试验。
实施例20：重组Lm8蛋白对mKv1.3电流的高效阻断作用
采用微电极拉制器(PP-83，日本光电)双步拉制玻璃电极，再进行抛光处理，选择尖端整齐，开口直径约为0.5-2μm的电极。用全细胞膜片钳的方法对重组肽Lm8的活性进行检测。吸取实施例19中细胞放置于样品池中，用细胞外液洗三遍，再加入细胞外液，以备测量。膜片钳试验采用EPC-10放大器记录，Pulse/Pulsefit(HEKA elektronik，Germany)软件操作。膜片钳操作的外液(mM)：NaCl 125，KCl5，MgSO₄ 1.2，CaCl₂ 1.0，Na₂HPO₄ 1.6，NaH₂PO₄ 0.4，Glucose 10.5和HEPES 32.5，用1mM NaOH调至pH 7.4。内液(mM)：KF 145，MgCl₂ 2，EGTA 10and HEPES 10，用1mM KOH调至pH 7.2。钳制电压为-80mV，测试电压为-80mV——+50mV，步增长为10mv，刺激频率0.5Hz，25℃进行。电压刺激细胞并记录mKv1.3电流，通过给药系统加入重组细尖狼Lm8多肽，再记录mKv1.3电流的变化。结果表明，重组细尖狼Lm8多肽对mKv1.3电流有高效的阻断作用(见图9)，其半效抑制剂量为26.40±1.62nM(见图10)。
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用
<130>一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用
<160>2
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>251
<212>DNA
<213>Lychas mucronatus
<400>1

<210>2
<211>65
<212>PRT
<213>Lychas mucronatus
<400>2