环糊精葡基转移酶的新用途.pdf

本发明公开了环糊精葡基转移酶(CGTase)的降血糖用途，可用于制备控制血糖药物和防治糖尿病的药物。

1、  环糊精葡基转移酶在制备控制血糖药物中的应用。

2、  环糊精葡基转移酶在制备防治糖尿病的药物中的应用。

环糊精葡基转移酶的新用途
技术领域
本发明涉及一种环糊精葡基转移酶(CGTase)的新用途，特别是一种药用用途。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus)是一种近年来世界范围内较为流行和具有高死亡率的内分泌—代谢疾病。它是一种慢性非传染性疾病，并且患病率逐年升高，死亡率呈现出持续上升的趋势，其特点为由于胰岛素的绝对或相对不足和靶细胞对胰岛素的敏感性降低，引起碳水化合物、蛋白质、脂肪、电解质和水的代谢紊乱。目前临床上以血糖升高至一定水平作为糖尿病的诊断标准，而通常采用药物来控制血糖在一定范围以防治糖尿病，现阶段的各类口服或注射的降血糖药物的作用机理主要是影响胰岛素分泌或是减少葡萄糖的吸收、促进葡萄糖酵解。
环糊精葡基转移酶(CGTase，EC2.4.1.19)是一种重要的胞外酶，可以水解淀粉生成环糊精和寡糖。现有报道示很多细菌可以产生环糊精葡基转移酶，如芽孢杆菌属、短杆菌属、梭状芽孢杆菌、棒状杆菌属、克氏杆菌属和微球菌属等(CN00819858.6)。由于CGTas的产生受染色体上一段基因控制，该酶基因可从30多种细菌中分离获得，故利用基因工程也可以制得重组的CGTase，如本发明人曾对来源于嗜碱性芽孢杆菌N-227菌株染色体上一段编码环糊精葡基转移酶基因进行克隆分析、诱导表达并转化到大肠杆菌中[王荫榆，王媛，张红发，任大明，郭本恒.来源嗜碱性芽孢杆菌N-227β-环糊精葡基转移酶基因分析及在大肠杆菌种的诱导表达.工业微生物，2007，37(3)：1-4]，发酵后通过分离纯化得到重组的CGTase[王媛，王荫榆，郭本恒，张红发.表达环糊精葡基转移酶基因的重组大肠杆菌发酵条件的研究.工业微生物，2007，37(3)：10-14；王媛，王荫榆，张红发，郭本恒.β-环糊精葡基转移酶的分离纯化及酶学性质的研究.工业微生物，2007，37(6)]。CGTase现已广泛用于食品、洗涤用品等行业，如用于面包生产、酿酒以及洗衣粉的添加剂，但目前CGTase尚无药用报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供环糊精葡基转移酶(CGTase)的一种新的用途，特别是药用用途。
本发明人根据文献通过四氧嘧啶来诱发小鼠糖尿病以作为试验动物模型(郑建仙，功能性食品[M].北京，中国轻工业出版社，1999.486-487)。本实验结果表明，将环糊精葡基转移酶采用腹腔注射对试验小鼠给药时，可以明显降低高血糖小鼠的血糖值，与对照值相比具有显著性差异；样品注射组的小鼠在经过10天的给药治疗后多饮、多食、多尿和体重减轻的“三多一少”症状有所缓解，体重有所增加。
可见，糊精葡基转移酶有望于制备成控制血糖或防治糖尿病的药物。其中，控制血糖是指将高血糖降低至正常范围，并进一步将血糖保持在正常范围不反弹。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
试验实施例1糊精葡基转移酶的降血糖作用
1.实验方法
1.1  实验材料
1.1.1  动物
昆明种小白鼠，雌雄各半，雄性小鼠22～30g，雌性小鼠18～25g，由中科院上海动物实验中心提供。
1.1.2  受试样品
环糊精葡基转移酶纯品(上海宝丰生化有限公司产品)，用生理盐水溶解后配制成一定浓度的溶液，过滤后注射给药。
1.1.3  其他药品
胰岛素注射液，100IU/mL，丹麦诺和诺德公司，避光4℃保存，用时生理盐水稀释；
四氧嘧啶(Alloxan)，sigma公司产品。冰上配制，用冰的生理盐水溶解、稀释。
1.1.4  主要仪器
血糖测定仪：罗氏血糖仪，Roche活力型血糖试纸，罗氏诊断产品(上海)有限公司。
1.2  实验方法
1.2.1  腹腔注射给药对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖和体重的影响
取小白鼠80只，雌雄各半，分笼饲养2～3天，正常饲养2～3天，选取10只作为注射空白对照组，试验前24h禁食不禁水，腹腔注射2w/w％的四氧嘧啶溶液，给药剂量为150mg/kg。72h后经尾静脉取血测定空腹血糖值(测血糖前禁食12h)，并记录为零时血糖值。血糖值高于13mmol/L的小鼠随机分成6组：空白对照组和模型对照组注射生理盐水；环糊精葡基转移酶注射组分3组，剂量分别为1.0mg/kg，10mg/kg和40mg/kg；阳性胰岛素对照组6U/kg。连续注射10天，第1、4、7、10天注射1h后测定空腹血糖值，每次测定血糖值前称量小鼠重量。
1.3  统计学分析
测量值以平均值±标准方差(X±SD)表示，采用One-Way ANOVA统计分析。
2.结果
2.1.1  腹腔注射给药对糖尿病小鼠血糖、体重的影响
注射样品第1、4、7、10次给药后测定空腹血糖值，采用分析结果见表1。
表1  注射样品对DM小鼠血糖(mmol/L)的影响

注：与零时值差异：^*p<0.05，^**p<0.01；与模型对照组差异：^#p<0.05，^##p<0.01。
结果表明，与正常组相比，模型组及样品组给药前血糖均明显升高，说明模型成立；腹腔注射不同剂量组的血糖值自第七次注射后出现差异，在第10次注射给药后1h测得的空腹血糖值明显降低，与给药前相比具有显著性差异，降低百分率分别为51.2％、53.2％、44.3％；与模型对照组相比也存在显著差异；给药环糊精葡基转移酶血糖降低幅度超过胰岛素组。腹腔注射结果说明环糊精葡基转移酶腹腔注射给药效果明显。
通过治疗，测定各组的小鼠体重数据见表2，空白组小鼠随着时间的增加体重明显增加，与初始体重存在显著性差异；高血糖模型组在注射四氧嘧啶之后，体重下降明显，在治疗的过程中只注射生理盐水，其体重值基本保持稳定趋势；样品治疗组不同剂量在给药期间体重均有所增加，但同一时间点与空白对照组相比增加不明显，具有显著性差异，这可能是因为建立高血糖模型时机体中的组织器官发生变化在短期内没有恢复到正常水平。
表2  注射样品对DM小鼠体重(g)的影响

注：a代表与空白对照组有显著性差异；b代表与初始体重有显著性差异；c代表与注射Alloxan后体重有显著性差异。
2.1.2  小鼠情况观察
小白鼠注射四氧嘧啶后，与空白对照组相比，毛色变得灰暗，精神状况变差，略有焦躁不安，体重变轻，同时伴有多饮、多食、多尿的典型症状。注射酶样品和胰岛素组的小鼠较高血糖模型组的小鼠相比，精神逐渐转好，体重略微增加，尿量相对减少，毛色也逐渐恢复。