小肠SP细胞在制备治疗肠损伤药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及小肠SP细胞的一种新用途，特别涉及小肠SP细胞在制备治疗肠损伤药物中的应用。
背景技术
小肠作为机体组织中最重要的吸收营养物质的场所，是机体中不可缺少的重要器官之一。目前虽然大部分小肠疾病均可通过各种有效的内外科方法得到有效的治疗，但许多难治性的小肠疾病的治疗存在着相当的困难，如短肠综合症以及盆腔肿瘤术后放疗照射引起的小肠放射性肠炎等。随着肠内肠外营养支持的迅速发展以及小肠移植科学的出现，这些难治性小肠疾病的治疗有了很大的进步。但事物的发展总是具有两面性，长期的营养支持费用太高，而且有些患者会出现相关并发症。小肠移植是目前难治性小肠疾病的终末治疗手段，因为小肠又是机体中最大的淋巴组织器官，所以小肠移植中存在的最大问题就是移植术后的免疫排斥反应，强烈的免疫排斥反应往往导致小肠移植的失败。因此寻找一种有效的治疗手段仍是目前胃肠科学领域的难点和热点。
成体干细胞治疗作为一种新兴的治疗手段为难治性小肠疾病的治疗带来了新希望。干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的种子细胞，人体所有的组织器官细胞均由干细胞分化发育而来，理论上人体所有的组织和器官的损伤也可以利用干细胞进行损伤修复治疗。干细胞按照机体发育的不同阶段分为不同类别，如胚胎干细胞，多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等，根据目前已经取得的研究结果，胚胎干细胞在技术上还难以取得突破，短时间内无法应用于临床，同时还面临取材限制及伦理挑战等诸多问题。可喜的是，成体干细胞因其最近在细胞可塑性上取得的一系列突破使得利用成体干细胞治疗各种组织器官损伤疾病成为了可能，同时成体干细胞来源方便，培养手段简易，同时不存在伦理方面的担心，因此研究利用成体干细胞治疗多种组织器官损伤性疾病是今后研究临床治疗的创新思路之一。
SP细胞(side-population)是一种较特殊的成体干细胞群体，该类细胞根据生命活力越强的细胞其mdr基因表达越丰富，排出Hoechst33342的能力越强，以及活细胞对PI染料拒染的原理使用流式细胞仪分选得到。在流式细胞仪上显示该细胞群体处于整个被分选的细胞群体的边缘，因此被命名为SP(side-population即边缘群)细胞。
【发明内容】
本发明的目的是提供小肠SP细胞的一种新用途。
本发明所提供的小肠SP细胞的新用途是小肠SP细胞在制备治疗肠损伤药物中的应用。
在实际应用中，所述小肠SP细胞可悬浮于生理盐水中作为治疗放射性肠炎损伤的药物；所述生理盐水为0.9％的氯化钠水溶液。
所述小肠SP细胞具体可为小肠黏膜SP细胞。
所述肠损伤可为肠炎损伤，如小肠肠炎损伤。
上述肠损伤可为放射性肠损伤。
本发明将小肠SP细胞移植给腹腔照射的受体小鼠，实验结果表明小肠SP细胞能够归巢到小肠隐窝修复损伤，还可延长受致死量照射动物模型的存活时间，明显改善放射性肠炎的慢性纤维化，对放射性小肠损伤取得了良好的修复效果。本发明为小肠损伤疾病的临床治疗提供了一种创新并且简便的方法和途径。本发明为将来寻找小肠黏膜干细胞特异性表面标志物打下了基础。
【附图说明】
图1为小肠SP细胞分选示意图
图2为小肠SP细胞的细胞周期分析
图3为小肠SP细胞表型分析
图4为显微共聚焦染色显示ROSA26小鼠来源的SP细胞注射C57BL/6小鼠后2个月分布在小肠的黏膜和隐窝位置。
图5A显微共聚焦染色显示ROSA26小鼠来源的SP细胞注射C57BL/6小鼠后2个月分布在小肠的隐窝-绒毛部位
图5B为LacZ染色显示ROSA26小鼠来源的SP细胞注射C57BL/6小鼠后2个月分布在小肠的隐窝-绒毛部位
图6为实验组和对照组受全腹腔照射后第1、2、3、4天的小肠HE切片照片
A、B、C、D分别为对照组受照射后第1、2、3、4天的小肠HE切片照片
A1、B1、C1、D1分别为实验组受照射后第1、2、3、4天的小肠HE切片照片
图7为实验组小鼠在全腹腔照射后第1、2、3、4天LacZ染色的照片
图8为实验组小鼠在全腹腔照射后第4天，小肠SP细胞向小肠各种组织细胞分化的照片
图9为小鼠受致死量照射后的生存率图。
图10为ROSA26小鼠小肠SP细胞移植后6个月在C57BL/6小鼠小肠的分布
A显示ROSA26小鼠小肠SP细胞在注射六个月后主要分布在小肠隐窝潘氏细胞的位置上。
B显示ROSA26小鼠小肠SP细胞在注射六个月后也能分布在小肠绒毛-隐窝结构的多处位置上。
图11为放射模型中小肠SP细胞移植后六个月的观察结果
A为致死量照射(14Gy X射线)后第三天的对照组潘氏细胞特殊组织化学染色。
B为致死量照射(14Gy X射线)后第三天的实验组潘氏细胞特殊组织化学染色。
C为非致死剂量照射(10Gy X射线)后六个月的对照组潘氏细胞特殊组织化学染色。
D为非致死剂量照射(10Gy X射线)后六个月的实验组潘氏细胞特殊组织化学染色。
E为非致死剂量(10Gy X射线)后六个月的对照组Masson三色染色，显示显著的黏膜下胶原累积现象。
F为非致死剂量(10Gy X射线)后六个月的实验组Masson三色染色，显示SP细胞的输入有效减少了照射后出现的黏膜下胶原累及和黏膜萎缩等现象的出现。
【具体实施方式】
下述实验在分离类器官片段的基础上结合分离SP细胞的原理，将类器官片段制作成单细胞悬液并从中分离出SP细胞群，对它的生物学特性进行了分析，并将其移植给全腹腔照射模型小鼠的小肠黏膜下，证实培养的小肠黏膜样结构物质中含有小肠黏膜上皮的成熟细胞。分离出来的SP细胞高表达integrin β1(CD29)，处于细胞周期的静止期，符合干细胞的特性，SP细胞移植后能够归巢到损伤的小肠黏膜部位并分化成所有的小肠黏膜成熟细胞，可用于小肠黏膜损伤的治疗中。
实施例1、SP细胞移植修复放射性肠炎损伤
一、SP细胞的制备和表型分析
本发明在目前尚缺乏理想小肠黏膜干细胞表面标志物的情况下，结合前人的研究成果和发明人对小肠黏膜类器官片段的体外培养研究成果，在已证实了小肠黏膜类器官片段是已经初步富集化的干/祖细胞群体的基础上，以小肠黏膜的类器官片段为起始材料，分离其中的SP细胞，并进一步富集。具体方法如下：
1、小肠黏膜类器官片段的分离
小鼠小肠黏膜类器官片段的分离简述如下。从新出生1-2天的ROSA26小鼠(购于美国Jackson实验室)的腹腔中取出小肠，按长轴剖开，并剪成0.5公分的片段，使用低钙镁的1×HBSS(Gibco公司)清洗7-10遍以清洗小肠中的内容物。洗净后的片段再剪成小片(1-2mm2)并置含中性蛋白酶I(100mg/ml，Boehringer)和胶原酶XI(300U/ml，Sigma)的1×HBSS中，在室温和摇床上消化20分钟。使用含5％(体积百分含量)胎牛血清，2％(质量百分含量)山梨醇，1000U/ml青霉素，1000μg/ml链霉素的DMEM(Gibco公司，美国)30ml中止消化反应。收集消化后的上清液，并在250rpm的速度下离心3分钟得到类器官片段。这些类器官片段在含2％(质量百分含量)山梨醇的DMEM中重悬。
2、小肠SP细胞的制备和表型分析
将制备的类器官片段轻轻拍打摇晃成单细胞悬液。将已经分散开的细胞按照1×107个细胞/ml的细胞浓度重悬在1×HBSS中，并按照2.5mg/ml的浓度滴加Hoechst33342。细胞随后在37℃孵箱中孵育90分钟，离心后重悬在1×HBSS中并按照1mg/ml的浓度滴加PI染料，置冰上保存，直到上流式细胞仪检测。
流式细胞仪选择前射光和侧射光由100mW氩离子激光器在488nm波长激发。Hoechst33342和PI由100mW的氪离子激光器激发(范围351-364nm)。Hoechst荧光通过440/60nm滤波器测量，而PI荧光通过670/14nm滤波器测量。分选结果如图1所示，小鼠SP细胞群为Hoechst 33342和PI双阴性染色的细胞群。图1中A:为分选中去处细胞碎片及凋亡细胞区域选中的P1区域作为首选的分选区域；B：去处凋亡的细胞P2区域C：在P1区域和P2区域的基础上分选的P3区域作为选中的SP细胞群。其中黑色代表细胞碎片及死亡的细胞、红色代表凋亡的细胞、绿色代表成熟的细胞、黄色代表分选的SP细胞。
对分离出来的SP细胞进行有关细胞生物学特性的检测，包括细胞周期测定以及细胞表型分析。
细胞周期分析：SP细胞分离出来后离心，以1×PBS按照1×106个/ml的细胞数量重悬，加入低渗的PI染料(1mM Tris，0.1mM EDTA，0.1％ triton-X100，3.4mM枸橼酸钠盐，0.05mg propidium iodide)。这些细胞在进行流式细胞仪分析前15分钟一直放在冰上。DNA含量分析使用488nm直射光和455nm散射光进行激发，并使用CellQuestA v3.2软件(Becton-Dickenson公司)进行分析，并使用ModFit LT v2.0软件进行绘图(Verity Software House公司)。
用直接免疫荧光法检测上述SP细胞的表型，细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的大鼠抗小鼠CD29、CD44、CD105、CD34、CD45、Sca-1、CD106、CD117和H-AD(小鼠MHC分子)抗体(上述抗体均购自BD公司，美国)标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(Becton Dickinson)。具体方法如下：在试管中分别加入上述抗体，再加入含有1×106个上述SP细胞的50ul细胞悬液，轻微振荡后混匀，暗处冰浴反应15分钟后，再轻微振荡后加入1ml洗液。300转/分离心5分钟，弃上清。重悬在4度的1×PBS中，等待上机，上机前加PI。
细胞周期分析结果显示近92％的细胞在G1期，少于10％在S期，只有1％的细胞在G2/M期(图2)。细胞周期分析显示高达92％的细胞群体集中在G0/G1期，这个结果与目前国际上报道的所有类型的干细胞群体的细胞周期特征是完全一致的。细胞表型分析的结果显示，以前文献报道的在小肠隐窝位置高表达的细胞表面蛋白Intergin β1(CD29)在SP细胞中的表达高达76％左右，而其他文献报道的间充质干细胞、血液干细胞的特征性细胞表型如CD105、CD106、Sca-1、CD34等在SP细胞中均不表达。也不表达CD44、CD45、CD117和H-AD。
二、小肠SP细胞移植后在受体小肠中的分布
按照如下方法建立C57BL/6小鼠全腹腔照射模型：C57BL/6小鼠放在独立的透明树脂盒，使用铅板遮盖住头、喉和下肢等其他部位，仅暴露腹部。全腹腔照射(吸收剂量10Gy)是使用X射线放射源(照射速率，1Gy/分钟)。执行照射的技术方案：
1、使用Varian直线加速器(美国)
2、6MV-X射线
3、剂量分解250Gy/min
4、SSD(射源与照射物距离)100cm。
实验组：照射后12小时，15只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠的小肠黏膜下注射ROSA26小鼠SP细胞，具体方法如下：小鼠麻醉后取仰卧位，使用75％的酒精消毒后，取腹部正中切口0.5cm，逐层进腹。将屈式韧带下至回盲部的所有小肠托出体外。显微镜下使用显微注射针取小肠中段其中任意一点的位置一次性将悬浮于200ul生理盐水中的2×105个细胞注射在小肠粘膜下疏松结缔组织内。
对照组：照射后12小时，15只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠小肠黏膜下注射同体积的生理盐水。
在注射后2个月后，用LacZ染色(整体组织染色)和显微共聚焦检测ROSA26小鼠SP细胞在小肠的分布情况。其中，LacZ染色(整体组织染色)方法如下：实验组和对照组小鼠使用Avertin麻醉后，按照中线切开暴露腹部、胸部。管腔插入心脏的左心室，使用预冷的4℃的固定液灌注固定10分钟。照射过的整个小肠和皮肤、肝脏、胰腺、脾脏被切除，并使用PBS清洗三遍，小肠按它的长轴切开，并将管腔面暴露朝上。在4℃的环境下组织固定30分钟后使用预热的X-gal缓冲液15分钟内清洗3遍，并在染液中37℃环境下孵育4-5小时。然后将小肠卷曲成盘状，从小肠的远端开始卷曲最后在近端结束。即远端在小肠卷的内侧中心，近端在小肠卷的外侧。小肠卷和皮肤包埋在石蜡中，并按照长轴切成15微米厚的切片。阳性细胞为蓝绿色染色。显微共聚焦的检测方法如下：实验组和对照组的小鼠的麻醉和内灌流方式同上。灌流结束后，迅速切下小肠、肝脏、照射部位的皮肤、胰腺、脾脏等组织器官。其中小肠依然卷曲成盘状。迅速在冰冻剂包裹下放在冰冻机上待结冻后进行切片。50微米厚的冰冻切片制作后在室温下使用丙酮固定10分钟，用流水轻轻冲洗切片表面。使用同种血清孵育20分钟后，切片使用抗β-gal抗体(BD公司，美国)进行染色，使用Hoechst33342(Sigma公司)进行核染色。染色结束后保存在4℃黑暗环境下尽早进行检测，检测前避免光线直接照射。显微共聚焦检测时先行建立阴性对照和阳性对照，建立参照系后进行实验组的检测。
实验结果显示：将ROSA26小鼠SP细胞移植到C57BL/6小鼠小肠黏膜下后，它们在损伤信号的诱导下能迅速移行到小肠黏膜的隐窝并分化成小肠绒毛的四种成熟细胞。图4显示ROSA26小鼠来源的SP细胞注射C57BL/6小鼠后2个月分布在小肠的黏膜和隐窝位置。图中红色为抗β-gal染色(表示供者细胞中的LacZ基因)细胞，兰色表示细胞核。
图5A显微共聚焦染色显示ROSA26小鼠来源的SP细胞注射C57BL/6小鼠后2个月分布在小肠的隐窝-绒毛部位，图中红色为抗β-gal染色(表示供者细胞中的LacZ基因)细胞，兰色表示细胞核。
图5B为LacZ染色显示ROSA26小鼠来源的SP细胞注射C57BL/6小鼠后2个月分布在小肠的隐窝-绒毛部位。图5B中箭头所指为LacZ来源的细胞分布的区域。
三、SP细胞修复和减轻受致死量X射线照射引起的放射性小肠损伤
小肠是对放射线高度敏感的器官之一。本实验在动物模型受到致死量照射的条件下，通过黏膜下注射移植SP细胞，研究不同照射剂量分组之间的变化。实验结果显示：SP细胞是能修复放射损伤肠组织的干细胞群体。具体实验方法和实验结果如下：
按照上述步骤二的方法建立C57BL/6小鼠全腹腔照射模型，除照射的总吸收剂量为14Gy(致死剂量)外，其它处理方法同前。共照射29只C57/BL6小鼠，其中实验组15只，对照组14只。
实验组：照射后12小时，每只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠的小肠黏膜下注射ROSA26小鼠SP细胞，具体方法如下：小鼠麻醉后取仰卧位，使用75％的酒精消毒后，取腹部正中切口0.5cm，逐层进腹。将屈式韧带下至回盲部的所有小肠托出体外。显微镜下使用显微注射针取小肠中段其中任意一点的位置一次性将悬浮于200ul生理盐水中的2×105个细胞注射在小肠粘膜下疏松结缔组织内。
对照组：照射后12小时，每只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠小肠黏膜下注射同体积的生理盐水。
照射后第1、2、3、4天实验组和对照组各取一只小鼠的小肠进行LacZ染色后制作切片和HE染色。小肠HE染色结果表明照射后第一天，实验组和对照组之间没有观察到明显变化(图6A，A1)。照射后第二天，实验组小肠隐窝生长良好(图6B1)，与实验组比较，对照组隐窝的发育和生长较差(图6B)。照射后第三天，实验组小肠虽然后出现特征性的“鸟眼样”损伤细胞，但同时以“实心团状或小腺体样”，细胞排列紧密，胞浆嗜碱性、多分裂象为特征的发育良好的隐窝数量仍然较多(图6C1)。对照组小肠中隐窝数量明显减少，残存的隐窝基本呈“鸟眼样”状态(图6C)。照射后第四天，实验组小肠呈蓬勃生长的状态，小肠黏膜面绒毛覆盖完整严密，隐窝部位无“鸟眼样细胞”或“透明样细胞”出现(图6D1)。对照组小肠黏膜面绒毛基本消失，黏膜下残存的隐窝基本呈透明样，无生长良好的隐窝存在(图6D)。
LacZ染色结果如图7所示，第1天，黏膜下注射的SP细胞散状分布在小肠黏膜下固有层内，小肠的隐窝以及小肠的绒毛上没有分布(图7A)。第2天，注射的SP细胞开始归巢(homing)到小肠隐窝位置，小肠黏膜下固有层内仍有散状分布(图7B)。第3天，注射的SP细胞基本均归巢到小肠隐窝位置并开始向绒毛分化(图7C)。第4天，注射的SP细胞在隐窝以及小肠绒毛上均有分布和分化(图7D)。图7中，A、B、C、D分别为实验组在照射后第1、2、3、4天的LacZ染色的照片，绿色表示ROSA26小鼠SP细胞。
对实验组照射后第4天的小肠进行LacZ染色，按照文献(易家农，主编，组织学和组织学技术[M].长沙:湖南医学院，1986年版)的方法进行杯状细胞、潘氏细胞、内分泌细胞的特殊组织化学染色，结果表明实验组照射后第4天，供者来源的细胞(ROSA26小鼠SP细胞)能够分化成小肠黏膜的成熟上皮细胞，如吸收细胞、内分泌细胞、杯状细胞及潘氏细胞(图8)。图8中，A、B、C为试验组小肠的LacZ染色，A1、B1、C1分别为与A、B、C对应的杯状细胞、潘氏细胞、内分泌细胞的特殊组织化学染色。绿色为LacZ染色阳性，兰色为杯状细胞染色阳性，红色为潘氏细胞染色阳性，红棕色为内分泌细胞染色阳性。
四、小肠SP细胞移植显著提高照射损伤动物模型的生存率
对步骤三中的实验组和对照组小鼠从接受照射当天开始进行存活观察，结果如图9所示，表明实验组有3只小鼠术后存活超过30天；对照组在一周内全部死亡。
五、小肠SP细胞移植后在受体内的长期存活，SP细胞移植减轻小肠纤维化损伤
选用C57BL/6小鼠共8只，按照上述步骤二的方法建立C57BL/6小鼠全腹腔照射模型(总吸收剂量10Gy)。
实验组：照射后12小时，4只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠的小肠黏膜下注射ROSA26小鼠SP细胞，具体方法如下：小鼠麻醉后取仰卧位，使用75％的酒精消毒后，取腹部正中切口0.5cm，逐层进腹。将屈式韧带下至回盲部的所有小肠托出体外。显微镜下使用显微注射针取小肠中段其中任意一点的位置一次性将悬浮于200ul生理盐水中的2×105个细胞注射在小肠粘膜下疏松结缔组织内。
对照组：照射后12小时，4只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠小肠黏膜下注射同体积的生理盐水。
在照射后6个月取小肠进行LacZ染色，HE染色，按照文献(易家农，主编，组织学和组织学技术[M].长沙：湖南医学院，1986年版)的方法进行杯状细胞、潘氏细胞的特殊组织化学染色，使用福建迈新公司的Masson三色试剂盒进行Masson三色特殊细胞染色。其中，Masson三色特殊细胞染色的结果判定如下：胶原纤维、黏液、软骨、神经细胞呈兰色，肌肉、弹力纤维呈红色。神经轴索呈粉红色。纤维素呈紫红色。红细胞呈橘红色。
结果表明ROSA26小鼠SP细胞在小鼠接受10Gy照射后6个月的肠管中依然能够存在，且通过染色结果发现其能够分布在小肠的绒毛-隐窝位置(图10B)，但是主要分布在小肠隐窝的基底部相当于潘氏细胞的位置上(图10A)。
潘氏细胞特殊染色表明：实验组小肠的潘氏细胞正常存在，而对照组小肠中潘氏细胞的特征性嗜酸性颗粒出现丢失的现象。即使在实验组小肠中肠管增粗部位的潘氏细胞亦出现特征性嗜酸性颗粒丢失现象(图11C、D)。在步骤三的致死量照射组中，实验组和对照组在照射后第三天的潘氏细胞特殊染色出现了同样的现象(图11A、B)。该现象提示放射性肠损伤中潘氏细胞的颗粒丢失现象与放射后肠管增粗及纤维化可能存在某种联系。
结果表明实验组小肠绝大部分肠段黏膜下层的胶原纤维、肌纤维、弹力纤维的密度和分布与正常小肠组织基本一致，显示已经基本恢复正常。对照组小肠的黏膜下层的胶原纤维的密度、厚度显著增加，肌纤维的密度和厚度有所增加，弹力纤维的厚度增加不明显。在实验组小肠少量增厚的肠段中其对应的黏膜下的胶原纤维的密度和厚度与对照组一样显著增加，同样肌纤维的厚度和密度也同时显著增加(图11E、F)。
综上所述，在小肠受到一定剂量照射后及时移植小肠SP细胞能够有效避免和减少小肠的潘氏细胞的丢失颗粒的异常现象，从而避免和减轻放射后小肠纤维化现象的出现。