一种从人类同种异体细胞提取细胞液的方法.pdf

本发明公开了一种从人类同种异体细胞提取细胞液的方法。本发明通过严格的流程选取人类同种异体组织细胞，经体外细胞培养，成为含有多种生物学活性成分的细胞。采用超低温萃取技术分离出细胞液，对细胞液中的细胞进行物理破壁处理后，将细胞的胞浆和细胞核中的核酸、多种短肽、多肽细胞因子、多种氨基酸、微量元素等释放到细胞液中，使细胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋白、细胞生长因子群、多型胶原成分等。可将其开发成具有细胞生物学活性功能的制剂，作用于人体后可提高机体细胞代谢功能、增强机体免疫力，并可改善皮肤弹性与光泽等功效。通过各项安全性检测未见毒副作用。

1.  一种从人类同种异体细胞提取细胞液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)选取健康产妇新鲜胎盘、脐带及其他同种异体组织；
(2)将原料剪碎放置于容器中，用去热原水将剪碎组织清洗，沥干；
(3)加入注射用水，开启匀浆机以8000～10000转/分的转速匀浆；
(4)将匀浆液分装到血袋中，封口，将分装得到血袋经平衡后，置于离心机内2500～3000转/分离心，取上清液；
(5)将上清液经50kD的中空纤维柱超滤，滤出液用50kD的中空纤维柱再次超滤，收获滤液，即为原液；
(6)除菌，灭活病毒。

一种从人类同种异体细胞提取细胞液的方法
技术领域
本发明涉及从人类同种异体细胞提取细胞液的制备方法，属于分子生物学、细胞生物学领域。
背景技术
人体由各个系统组成，系统由各种组织组成，组织则由各种细胞组成。有生命的机体内各个细胞时时刻刻都在进行着新陈代谢，并保持正常的自我稳态调节功能才能维持正常的内环境并抵抗来自外界的各种致病因子的侵袭而不产生疾病。而细胞进行新陈代谢并保持自我稳态需要消耗各种能源物质。如：核酸、氨基酸、微量元素、酶类、免疫蛋白、各种细胞生长因子、多型胶原成分等。
我们通过严格的流程选取人类同种异体组织细胞，通过严格的流程选取人类同种异体组织细胞，经体外细胞培养，成为含有多种生物学活性成分的细胞。采用超低温萃取技术分离出细胞液，对细胞液中的细胞进行物理破壁处理后，将细胞的胞浆和细胞核中的核酸、多种短肽、多肽细胞因子、多种氨基酸、微量元素等释放到细胞液中，使细胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋白、细胞生长因子群、多型胶原成分等。可将其开发成具有细胞生物学活性功能的制剂，作用于人体后可提高机体细胞代谢功能、增强机体免疫力，并可改善皮肤弹性与光泽等功效。通过各项安全性检测未见毒副作用。
核酸、氨基酸和微量元素等合成蛋白质的基本物质，可提高细胞质量，使酶系统保持像正常的催化功能；天然免疫蛋白可以抵御和修复机体自身和自然界对机体细胞的损伤；具有刺激细胞生长作用的细胞生长因子群(包括转化生长因子-β、表皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子等)，对机体细胞(含干细胞)的增殖与分化和新陈代谢、提高新生细胞所占比例、替代更新原有的因衰老或病理性等因素所造成组织细胞的衰退和老化等具有关键作用。由于机体细胞的新陈代谢被细胞因子群调控至最佳状态，机体细胞保持水分的能力也大大增强。多型胶原成分，可促进真皮层内纤维母细胞增殖、成纤维母细胞合成和分泌更多胶原蛋白，修复老化受损的胶原纤维与弹性纤维，还原肌肤弹性，使皮肤均匀紧致。在细胞因子群调控下，成纤维细胞的数量大大增加，进而成纤维细胞源源不断分泌自体胶原蛋白。这种自体成纤维细胞在真皮下合成和分泌的自体胶原蛋白能更好地与机体组织融合，使胶原蛋白重新支撑起皮肤，真皮层厚度和密度增加，进而消除皱纹，使老化的皮肤重新恢复弹性与光泽。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种从人类同种异体细胞提取细胞液的制备方法。
本发明的从人类同种异体细胞提取细胞液的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取健康产妇新鲜胎盘、脐带及其他同种异体组织；
凡患有肝炎、恶性肿瘤、免疫缺陷病、艾滋病、各种传染病、人工流产、死胎、各种畸形儿之胎盘及脐带等组织不得使用；肉眼检测外观不正常或有腐臭变质的胎盘、脐带等组织不得使用。
胎盘娩出后，立即由接生人员用无菌操作放入灭菌容器(食品级塑料袋)内，并立即冷藏(10℃以下)，在收集运输过程中也应冷藏。收集的胎盘学逐支用国家药品管理当局批准的试剂盒进行抗-HBs、抗-HBc等项检测。
HBV标志物阴性胎盘，再进行抗-HCV、抗-HIV-1/HIV-2和梅毒检测，阴性者为合格胎盘。
检出合格的胎盘应于-20℃冻存，并在胎盘娩出后6个月内投入生产。
(2)将原料剪碎放置于容器中，用去热原水将剪碎组织清洗，沥干；
(3)加入注射用水，开启匀浆机以8000～10000转/分的转速匀浆；
(4)将匀浆液分装到血袋中，封口，将分装得到血袋经平衡后，置于离心机内2500～3000转/分离心，取上清液；
(5)将上清液经50kD的中空纤维柱超滤，滤出液用50kD的中空纤维柱再次超滤，收获滤液，即为原液；
(6)除菌，灭活病毒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过严格的流程选取人类同种异体组织细胞，经体外细胞培养，成为含有多种生物学活性成分的细胞。采用超低温萃取技术分离出细胞液，对细胞液中的细胞进行物理破壁处理后，将细胞的胞浆和细胞核中的核酸、多种短肽、多肽细胞因子、多种氨基酸、微量元素等释放到细胞液中，使细胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋白、细胞生长因子群、多型胶原成分等。可将其开发成具有细胞生物学活性功能的制剂，作用于人体后可提高机体细胞代谢功能、增强机体免疫力，并可改善皮肤弹性与光泽等功效。通过各项安全性检测未见毒副作用。
具体实施方式
实施例1
1.从事细胞提取液生产人员：应具备医学或生物学知识，且上岗前手过严格操作培训。
2.生产环境：分离室洁净度要求为整体万级，局部百级。
3.生产设备：高速匀浆机、离心机、水浴箱、干燥箱、封盖机(置于车间内)、超净台、血液分离夹、高频电耦封口机、澄明度检测台、电子称、PH计、冰箱、冰柜、真空泵、超净工作台。
4.生产用具：量筒、烧杯、镊子(大，中，小号)，剪刀两把、止血钳、不锈钢托盘、微量移液器(1000ul，100ul，10ul)、30KD超滤管、酒精灯、封口膜、打火机、西林瓶、瓶塞、瓶盖、酒精喷壶500ml、废液缸、普通天平。
5.易耗品：75％酒精、针式过滤器、无菌副压抽滤瓶、注射器(50ml、20ml)、去离子水、注射用水、微量移液器吸嘴(1000ul、200ul、10ul)、45ml无菌无热原离心管、200ml血袋、医用纱布、鲎试剂及检测用水、病毒检测试剂(HBs、抗-HCV、抗-HIV1/2、梅毒检测试剂)、棉签、84消毒液、生理盐水、无菌无热原不锈钢盆。生产用源符合饮用水标准；纯化水及注射用水符合现行《中国药典》标准。
6.原材料的购买、运输、接收、储存及质量控制：
符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。
6.1 选取健康产妇新鲜胎盘、脐带及其他同种异体组织。凡患有肝炎、恶性肿瘤、免疫缺陷病、艾滋病、各种传染病、人工流产、死胎、各种畸形儿之胎盘及脐带等组织不得使用；肉眼检测外观不正常或有腐臭变质的胎盘、脐带等组织不得使用。
6.2 胎盘娩出后，立即由接生人员用无菌操作放入灭菌容器(食品级塑料袋)内，并立即冷藏(10℃以下)，在收集运输过程中也应冷藏。收集的胎盘学逐支用国家药品管理当局批准的试剂盒进行抗-HBs、抗-HBc等项检测。
6.3 HBV标志物阴性胎盘，再进行抗-HCV、抗-HIV-1/HIV-2和梅毒检测，阴性者为合格胎盘。
6.4 检出合格的胎盘应于-20℃冻存，并在胎盘娩出后6个月内投入生产。
7.制备流程
按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。
7.1 将生产设备放置于车间的适当位置，检查所有生产设备的运行情况，填写报告；
7.2 器械和设备的清洁及无热原处理：
7.3 将2000ml烧杯1个、500m14个按清洗操作规程洗净后用锡箔纸封口放置于干燥箱内250℃加热1小时，待冷却后取出并置于超净台内紫外消毒备用。
将高速匀浆机转子、剪刀用1％的84消毒液浸泡1小时后，用无热原水清洗5遍并置于超净台内紫外消毒备用。
7.4 将高速匀浆机用75％酒精擦拭消毒置于超净台内消毒。
7.5 将用200倍稀释的84消毒液浸泡12小时的超滤管(30kd)用去离子水清洗5遍，再用注射用水清洗5遍，置于超净台内沥干备用。
7.6 西林瓶及瓶塞、瓶盖的处理按照相应清洗操作规程严格执行。
7.7 将微量移液器吸嘴(1000ul、200ul、10ul)、棉签、医用纱布1包、镊子(大，中，小各两把)，剪刀两把、止血钳10把、不锈钢托盘3个高压灭菌121℃，30分钟，烘干备用。
7.8 开启车间紫外灯消毒1小时。
7.9 将原料放置于4℃解冻12小时，使用无热原锡箔纸称取对应重量的原料，用剪刀剪碎组织至每块大小为2 x 2 x 2cm³，将剪碎组织放置于500ml烧杯中。用去热原水将剪碎组织清洗3次，每次用水量为剪碎组织的3倍，洗后沥干。
7.10 在沥干后的组织中加入1.5倍于组织的注射用水，开启匀浆机以8000～10000转/分的转速匀浆2分钟。
7.11 将匀浆液用50ml注射器分装到200ml血袋中，高频电耦封口机封口。
(以上操作均在超净台内无菌操作)
7.12 将分装得到的200ml血袋经平衡后，置于离心机内2500～3000转/分离心30分钟，并于血液分离夹上操作并取上清液；将上清液经50kD的中空纤维柱超滤，滤出液用50kD的中空纤维柱再次超滤，收获滤液，即为原液。
7.13 将超滤管置入45ml离心管内，于超净台内将收集的离心上清液加入超滤管中，每管不超过5ml离心，3000转/分离心15分钟；
7.14 取出超滤液置于45ml无热原离心管内，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌2次；
(以上细胞液提取工作均置于冰袋之上进行低温操作)
7.15 进行60℃水浴加温10小时灭活病毒10小时。
8.体外细胞培养：
8.1 体外培养环境
工作环境要求清洁、空气干燥和无烟尘。
8.1.1 无菌：培养室的空气等彻底消毒，所有操作均要严格实行无菌操作，各种物品拿入操作台前应消毒，用洒精擦表面，用前于紫外线照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免和瓶口接触，操作时禁止讲话。
8.1.2 温度：组织培养的最适温度为35-37℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生不良影响，使之在24小时死亡，温度在43℃以上，细胞大多被杀灭，而低温对细胞影响较小，细胞置于25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢，放在4℃数小时之后，再置37℃培养，细胞仍能继续生长。
8.1.3 气体：所需的气体主要有O₂和CO₂。O₂参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。CO₂既是细胞代谢产物也是细胞所需成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。
8.1.4 pH值：多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4，偏离此范围对细胞可产生有害的影响。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐缓冲对。
8.1.5.培养器皿的处理：大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物。玻璃器皿须用清洁液浸泡1至7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次，烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。
8.2 传代细胞的静置培养
每天要仔细观察细胞的生长情况来决定是否要换液或传代。用倒置显微镜对活细胞形态、胞浆和胞膜进行观察。生长状态良好的细胞透明度大，细胞内颗粒少，看不见空泡，胞膜清晰，折光性强。培养上清液清晰透明，看不见悬浮的细胞和碎片。细胞机能不良时，胞质中常出现空泡，脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则，甚至失去原有的特点。只有状态良好的细胞才能用来做实验。一般在细胞接种或传代后，每天或至多间隔1-2天，应观察细胞形态、细胞生长、培养液PH值和污染与否等，随时掌握细胞动态变化，以便于做换液或传代处理。如发现异常情况，及时采取措施。正常情况下，培养液呈桃红色，用一般温箱培养时，随细胞生长时间的延长，二氧化碳积累增多，由于培养基内有pH指示剂的存在，其颜色可间接反映细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色则可能是培养时间过长，营养不足，死亡细胞过多；呈紫红色则可能是细胞生长状态不好或已死亡。
8.3 培养细胞的保存和复苏
8.3.1 影响冻存细胞活性的因素
8.3.1.1 细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜(DMSO)和甘油，常用的浓度为5％-10％(90％小牛血清)。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。
8.3.1.2 细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成，因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1℃的速度，降至-20℃冻结。均可获得满意效果。
8.3.1.3 保存温度：液氮罐，可达到-196℃，此时所有的物理化学活动均降至最低限度，以保证细胞长期保存。
8.3.1.4 复苏：急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃～43℃的水浴中，30秒至一分钟内融化。
8.3.2.冻存与复苏方法：
8.3.2.1 细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2～5 x 106/ml。
8.3.2.2 分装于2ml冻存管中，装量1ml，封口，作好标记，用几层纱布扎好。
8.3.2.3 冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程，以1℃/min的速度降温，一般挂在液氮上空8小时后，投入液氮贮存罐中长期保存。
8.3.2.4 为使冻存的细胞复苏，将冻存管置于37℃～43℃水浴中，充分摇动使其急速融化，30秒至1分钟内完成。
8.3.2.5 细胞悬液低速离心，去除上清中的保护添加剂，加入原来使用的生长液，置37℃培养。
8.4.试剂
8.4.1 将1640溶于新蒸的三次蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，过滤除菌即可。
8.4.2 小牛血清用前56℃X30分钟灭活(破坏补体)分装置-20℃保存备用。
8.4.3 青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解，分装冻存于-20℃，使用前融化，每100ml生长液中加1ml，即使用终浓度为含P.S 100μg/ml。(注：P.S不能冻融多次，应少量分装，一次用完)。
8.4.4 使用NaHCO₃液调整pH值，常用浓度为5～6％，配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌，分装4℃保存。
8.4.5 胰蛋白酶：在pH 8.0，温度37℃时作用力最强。
8.4.6 EDTA液
8.4.7 细胞冻存液：小牛血清90℅与二甲基亚砜(DMSO)10℅混合；-20℃冰箱保存备用。或小牛血清30℅，1640培养液60℅，DMSO10℅混合；-20℃冰箱保存备用。
10.检测：
按2000年版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行.
10.1 无菌实验：按2002年版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行；
10.2 内毒素检测：按2002年版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》进行。滴度应低于1：500；细胞内毒素含量应不高于5EU/ml；
10.3 病毒检测：各项指标为阴性；
10.4 热原质试验：按2002年版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行；
10.5 异常毒性试验：按2002年版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行.
10.6 指纹图谱检测：SDA-PAGE法分析应出现3条主要带；66kd 23kd10kd
10.7 蛋白检测：应在1g/L左右；
10.8 pH：为6.7～7.3；
10.9 多肽含量：用BCA法测定，应不低于1.0mg/ml；
10.10 核酸含量：应不低于800μg/ml
10.11 颜色：应为无色或微黄澄明液体，不应有异物、浑浊或沉淀。
11.分批
按2002年版规程通则《生物制品分批规程》进行。
12.分装
按2002年版规程通则《生物制品分装规程》进行。
12.1 将经检测合格原液调整至相应浓度后，使用0.22um过滤器连续过滤2次并将滤液置于45ml离心管；
12.2 使用1000ul微量移液器，吸取滤液分装至西林瓶，每瓶2.2ml，加盖胶塞及铝塑；
(以上分装过程须在超净台内进行)
12.3 将加盖胶塞及铝塑盖的西林瓶置于封盖机上封口。
13.规格：每支装量2ml。多肽含量应不少于2mg/支。
14.入库：经澄明度检测合格后，贴好标签放置于2℃-8℃的条件下保存，做好相关记录。
15.保存、运输及有效期：2.8℃避光保存及运输，自胎盘投料之日起有效期为2年。