山药低分子提取物与制备方法 所属技术领域
本发明为2002年12月31日申请之申请案(美国申请号第10/335,278号)之部分接续申请，其在此全部作为参考文献。
背景技术
山药(Dioscorea)，亦名“山药(wild yam)”，为单子叶薯蓣科的一员，其分布于热带与亚热带区域。于世界上约存在有650个种，其中于中国发现有93个种及9种变异种，而于台湾发现有14个种与5种变异种。
山药系为传统中药中一种非常重要的药用植物，且其医药效果系已被研究多年。于1936年，Tsukamoto等人自植物的薯蓣科中分离出戴思均尼(diosgenin，其为一种山药的类脂醇植物皂质，而后并将之使用以作为医药类固醇的快速合成的原料。于1992年的Aradhana，Rao Ar.Kale RK.的研究中，其指出戴思均尼可促进大白鼠乳腺上皮细胞的生长。于Biochemical &Biophysical Research Communications 207(1)：398-404，Feb/1995中，J.L.Beneytout等人报导，当将戴思均尼添加至人类红白血病(HEL)细胞培养液中时，其具有诱导巨核细胞形态及生化改变的特性，且因此，戴思均尼可使用以作为HEL细胞的巨核细胞分化诱导剂。于Life Sciences59(11)：147-57，1996中，山药的类固醇提取物被认为具有作为抗氧化剂之显着活性，以改良血清脂质的含量。
脱氢异雄固酮(DHEA)具有与戴思均尼相似的化学结构，且被认定具有抗癌、抗氧化、抗糖尿病与调节骨质的效果。血清中DHEA的含量会随年龄增加而逐渐下降，且与老化有关系。由多种研究可知，山药中的戴思均尼提取物可在人体中被转换成DHEA，而可补充随老化所减少的DHEA。然而，此等研究仅于摄取存在于山药中戴思均尼的老人来进行，以研究戴思均尼是否可降低血清脂质的过度氧化作用、减少血清中的三酸甘油脂，以及增加胆固醇的高密度含量(HDL)量，同时，降低胆固醇的低密度含量(LDL)的过度氧化伤害。
有关DHEA在骨质调控上的效果，于Life Sciences 62(1)：59-68，1998中，Ben A.A.Scheven等人提出下列报导，DHEA及其硫酸盐衍生物(DHEA-S)本身无法在人类造骨细胞上展现直接且独立的显着效果，但当与骨细胞调节剂，1，25(OH)2D3，一起处理细胞时，其可增进特定碱性磷酸酶(ALP)活性，此碱性磷酸酶是成熟造骨细胞的特定标记。此研究显示，DHEA及DHEA-S在造骨细胞生长及分化上的效果可能系藉由1，25(OH)2D3所诱发的骨细胞改变的效果而受到调控。
依据本发明，发现一种特别的山药物种，其提取物及其进一步的提取级分具有细胞再生的活性。特定而言，已发现在没有任何骨细胞调节剂存在之下，该山药物种的提取物及其进一步的提取级分本身可刺激造骨祖原细胞的增生与分化，以补充骨中造骨祖原细胞、促进造骨细胞的成熟与造骨细胞的矿质化，藉此以达到骨胳修复、恢复与复原，进而避免及治疗骨质疏松症。再者，该山药物种的提取物不仅可在颗粒单核球群落刺激生长因子(GM-CSF)存在下刺激骨髓中造血干细胞的增生及分化，且有助于接受抗癌药剂治疗所造成的白血球与红血球缺乏的病患的恢复，因此，可与抗癌药剂一起使用，作为化疗助剂。
【发明内容】
本发明是提供一种在需要治疗的对象治疗骨质疏松症的方法，包含口服给予对象有效量的山药物种提取物，其能促进对象体内骨髓细胞的增生与分化，其中该山药物种特征是当采用SEQID NO：9引物对该山药物种的基因组DNA进行扩增时，其随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹谱包含14个DNA带，依序分别是428bp，452bp，537bp，602bp，723bp，817bp，934bp，1140bp，1242bp，1478bp，1641bp，1904bp，2151bp和2918bp，以及该提取物是由以下步骤的方法所制备：(a)利用含有醋酸的基于醇类的溶剂对该山药物种的块茎进行提取；(b)将步骤(a)所得的产物进行分离处理以取得水溶性级分；以及(c)移除步骤(b)所得的水溶性级分的溶剂。
本发明另提供一种山药物种的提取物，该特征是当采用SEQID NO：9引物对该山药物种的基因组DNA进行扩增时，其随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹谱包含14个DNA带，依序分别是428bp，452bp，537bp，602bp，723bp，817bp，934bp，1140bp，1242bp，1478bp，1641bp，1904bp，2151bp和2918bp，以及该提取物是由以下步骤的方法所制备：(a)利用含有醋酸的基于醇类的溶剂对该山药物种的块茎进行提取；(b)将步骤(a)所得的产物进行分离处理以取得水溶性级分；以及(c)移除步骤(b)所得的水溶性级分的溶剂。
【附图说明】
为了说明本发明的目的，在附图中显示现阶段较佳的具体实施例。不过，应了解本发明非限于所示的具体实施例。
图1是包含标示为图1A与图1B的柱状图。图1A显示该山药物种提取物(DioMs)与DHEA的功效，以及图1B显示各个进一步的提取级分(DioMPw，DioMPb与DioMPe)在C3H小鼠的造骨祖原细胞增生上的功效。
图2是包含标示为图2A与图2B的柱状图。图2A显示该山药物种提取物的功效，以及图2B显示各个进一步的提取级分对于小鼠的造骨祖原细胞分化为成熟造骨细胞上的功效，该功效是在活体外以碱性磷酸酶活性来测定。
图3是柱状图，其显示该山药物种提取物在骨髓细胞的碱性磷酸酶活性上的活体外功效，该骨髓细胞是取自于患有由糖皮质激素所诱发的骨质疏松症的病患。
图4是包含标示为图4A与图4B的柱状图。图4A显示该山药物种提取物在小鼠的造骨祖原细胞分化为成熟造骨细胞的活体内功效(藉由碱性磷酸酶活性来测定)。图4B显示该提取物在健康小鼠的骨髓细胞中骨质矿质化的功效，其是藉由骨小节形成来测定。
图5是包含标示为图5A与图5B的柱状图。图5A显示该山药物种提取物对碱性磷酸酶活性的活体内功效，以及图5B显示在卵巢切除小鼠的骨髓细胞中该提取物对骨质矿质化的功效。
图6显示取自小鼠的骨髓细胞的细胞激素的RT-PCR结果，该小鼠是经口服供给根据本发明的山药物种提取物。
图7包含图7A-7E，其为相差显微图影像，显示在上皮生长因子(EGF)存在下，该山药物种提取物在初代培养的小鼠的骨髓细胞的形态改变上的影响。
图8显示该山药物种提取物对于白血球减少症小鼠的周边血液中白血球数量上的活体内功效，该白血球减少症是由环磷酰胺所引起。
图9为柱状图，显示该山药物种提取物对于由环磷酰胺所诱发的白血球减少症小鼠的周边血液中红血球数量上的活体内功效，该小鼠患有严重贫血。
图10为柱状图，显示该山药物种提取物对于由环磷酰胺所诱发的白血球减少症小鼠的周边血液中血红素含量上的活体内功效，该小鼠患有严重贫血。
图11为组合照片影像，显示针对14种山药物种，利用单一的随机扩增多态性DNA的引物SEQ ID NO：9的增幅产物的电泳图上的标志图谱；以及
图12为树干图，其为根据RAPD分析所决定该14种山药物种基因上的相似性的种系树(phylogenetic tree)。
【具体实施方式】
以下名词在此处可用于权利要求与说明书的更好的例示说明。
「引物」在此所指为核酸片段或序列，其与样本的核酸的一股的至少一段区段互补，其中引物目的在于沿着该线条支持与引导该样本核酸的一部分扩增。在RAPD的扩增中，单一随意的引物是用来扩增核酸的非标定区段，其位于相对的DNA股上引物序列之间的位置。
「测试组(test panel)」是定义为一群某特定生物对象的群组，其为基于相互之间的基因组相似性或对于另一群组(也就是，另一属，种及亚种)读基因相异性所选择者。
「RAPD」系指「随机扩增多态性DNA(randomly amplifiedpolymorphic DNA)」。「RAPD的扩增」是指如美国专利号第5,126,239号发明所揭露的方法，是一种单一引物导引的核酸扩增的方法，其使用随机的短引物以扩增核酸的非标定随机片段，该美国专利的揭露内容在此处并入做为参考文献。「RAPD方法」或「RAPD分析」是指一种侦测基因多态性的方法，其牵涉利用随机的短引物对于核酸的非标定随机片段进行扩增，在样本间互相比对「RAPD」扩增产物的图谱或指纹谱，以侦测多态性。「RAPD引物」是指长度约为8至约13个硷基的引物，具有随机序列，根据现有方法可用于RAPD扩增或RAPD分析。
根据本发明，提取物所来自的山药物种的特征是具有一个随机引物所得到的RAPD指纹谱，该引物如OPA-18，其寡核苷酸序列为AGGTGACCGT(SEQ ID NO：9)。RAPD指纹谱来自于RAPD分析，其为利用OPA-18引物，对测试组的多种山药物种进行基因组的扩增。当基因组DNA由聚合酶连锁反应(PCR)扩增后，每个山药物种皆可得到一组不连续的DNA片段，在电泳胶上会表现出不同大小的DNA带。如以下实施例10所说明以及图11所示，当基因组DNA由SEQ ID NO：9的OPA-18引物进行扩增时，可得到14个DNA带，依序分别是428bp，452bp，537bp，602bp，723bp，817bp，934bp，1140bp，1242bp，1478bp，1641bp，1904bp，2151bp和2918bp。
接着，测定一个相似性指标(similarity index)，其定义为在群集分析(cluster analysis)中，两物种间共同分享全部RAPD带的比例。相似性指标可由以下公式所决定：
F＝2nxy/nx+ny
其中nxy为山药物种x与y间共同具有的DNA带的数量，nx与ny分别为山药物种x与y的所有DNA带。根据RAPD指纹谱的结果与其它已知山药物种的比较(请见图12)，可以相信的是本发明所使用的山药物种(或亚种)，是不同于其它已知的山药物种，因此该山药物种是新的。
本发明是基于如发明中所鉴定的新山药物种提取物的生物活性的发现，特别是细胞再生的活性。由实验证实，依本发明方法所制备的山药物种提取物及其进一步的提取级分含有活性物质，该活性物质可促进小鼠的骨髓祖原细胞的增生与分化。更特定的说，该山药物种的提取物及其进一步的提取级分，可增进功能性造骨祖原细胞的增生，且大大地诱导造骨祖原细胞分化为造骨细胞，并促进造骨细胞的矿质化作用。再者，该山药物种的提取物可减轻由抗癌药剂所造成的副作用。更特定的说，该提取物可回复该以环磷酰胺(CY)处理小鼠的周边血液中白血球与红血球量。因此，该山药物种的提取物可用于预防及治疗骨质疏松症(该病症是老化过程中常见的疾病)，且可与抗癌药剂并用，以作为一种化疗助剂。
干细胞是指可自我更生与分化的细胞。干细胞在胚胎时期的数量最多，且会随着老化而逐渐减少。因此，可推测干细胞与老化间有重要的关联性。成体中干细胞会对透过微环境改变所传递的特定讯息产生专一性的反应，而产生新的干细胞或分化成特定细胞。当干细胞接受分化讯息时，干细胞会快速大量增生，最后进行分化。此等干细胞是用以维持成体体内细胞的平衡，且补充因自然因素或伤害所死亡之细胞数目。
骨髓中的干细胞分为两类，一为造血干细胞，该细胞会产生两种较特定化的干细胞种类，即，淋巴祖原细胞(其转变成T与B淋巴球)以及脊髓祖原细胞(其变成白血球、红血球与巨核细胞)；另一为基质细胞，该细胞为骨髓中构成支持结构的细胞来源。基质细胞于培养时，具有贴附于培养盘底部的特性，且可分化成造骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，且甚至于分化成肌母细胞。基质细胞为造血干细胞生长与分化时所需。
当老化发生时，干细胞的产生与数量会大量减少，导致多种老化的问题，其中骨质疏松症最为常见。骨质疏松症的发生包括骨骼生成作用与骨骼溶蚀作用(resorption)间之平衡的丧失。造骨细胞是衍生自造骨祖原细胞，且负责骨胳的生成，而骨胳的生成作用包括骨质的形成与骨骼的矿质化。造骨祖原细胞系源自于骨髓中的基质细胞。地塞米松(Dexamethasone)与抗坏血酸可促进造骨祖原细胞的增生与生长，且可使细胞分化为成熟的造骨细胞。在分化的过程中，会表现不同的造骨细胞特定标记。首先有胶原基质的沉积，于10至14天后，会表现碱性磷酸酶。碱性磷酸酶被广泛作为用以辨识造骨细胞活性的生化标记，虽目前相信其参与骨骼的矿质化过程，但其实际功能仍未知。于连续培养至第21天后，细胞会分泌骨钙(osteocalcein)，且最后矿质化以形成骨小节(bone nodules)。
于本发明中，发明人意外地发现，该山药物种提取物或其进一步的提取级分，可在没有任何骨细胞调节剂存在之下，增进造骨祖原细胞的增生与分化，因此，一种具有此活性提取物的组成物可用来治疗骨质疏松症。
于本发明中，该提取物是由该山药物种的块茎部位所制备，且是使用甲醇作为提取溶液而制得。制备方法涉及：(a)利用含有醋酸的基于醇类的溶剂对该山药物种的块茎进行提取，较佳是在1％醋酸存在下，其中该以基于醇类的溶剂为以甲醇、乙醇或其等的混合物的溶剂。
此外，所得到的提取物可进一步基于其极性来进行提取，以获得药学上的活性级分。于本发明较佳实施态样中，该提取物进一步进行分配层析法(partition chromatography)，其包含下列步骤：
(b)混合乙酸乙酯与水的溶剂以及步骤(a)所得的提取物，以将乙酸乙酯与存在于水相中的水提取物分离；
(c)将正丁醇溶剂加至水相中进行进一步的提取，以将丁醇提取物与残存于水相中的残存水提取物分离；以及
(d)将75％乙醇溶剂加至由步骤(c)所得的水相中，提取并进一步移除多糖，以获得纯化的水提取物。
为了确认该山药物种成分的生物活性，故于细胞上进行该山药块茎的提取物与其进一步的提取级分的生物活性分析，其中细胞是取自于正常小鼠与患有由糖皮质激素所诱发的骨质疏松症的病人。
参图1所示的实验结果，意外地发现，该山药物种提取物与其进一步的提取级分可在没有任何骨细胞调节剂的帮助下，增进造骨祖原细胞的增生。于相同的浓度下，DHEA对于造骨祖原细胞增生并无任何增进效果。于图2中，该结果显示，该山药物种提取物明显增加正常细胞中所表现的碱性磷酸酶的量，换言之，由本发明所制备的提取物可刺激造骨祖原细胞分化为成熟的造骨细胞。
发明人进一步确认，对于衍生自患有由糖皮质激素所诱发的骨质疏松症的病人身上的不正常骨髓细胞上的影响。糖皮质激素为多种发炎与自体免疫疾病的必要疗法。然而，长期糖皮质激素的使用是骨质疏松症最常见的医源性原因之一。糖皮质激素会透过对于造骨细胞的多种影响而增加骨骼的流失，也就是，造骨细胞谱系复制的抑制、新造骨细胞之发生的降低。由图3的结果可知，发明人发现，本发明的活性提取物增加此细胞中所表现的碱性磷酸酶的量，因此，造骨细胞的功能可藉由以该活性提取物治疗患有由糖皮质激素所诱发的骨质疏松症的病患而恢复。
再者，为了更进一步确认该山药物种提取物在活体内治疗骨质疏松症上的有效性，发明人在正常小鼠与被进行卵巢切除以诱发骨质疏松症的小鼠上进行实验，该等小鼠是以口服方式供给本发明的提取物。
于图4-5中，该结果证明，于活体内，该山药物种提取物增加衍生自正常小鼠与被进行卵巢切除以诱发骨质疏松症的小鼠的造骨细胞中碱性磷酸酶的表现量与矿质化作用。因此，该山药物种提取物不仅可调控造骨祖原细胞的增生与分化，且可控制骨胳的生成与改造(remodeling)，且因此，此活性提取物可预防及治疗骨质疏松症。
现在已知骨髓细胞的增生与分化可藉某些因子而控制，诸如，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、转化生长因子(TGF-β)、血清白细胞介素-4(IL-4)、表皮生长因子(EGF)、颗粒单核球群落刺激分子等(GM-CSF)。当改变培养环境中的因子时，干细胞会依此因子的专一性而分化成不同的细胞。例如，BMP-2、TGF-β、IL-4与EGF与骨髓基质细胞增生与分化成造骨细胞的谱系有正相关性。于此研究中，发明人进行实验以确认该山药物种提取物在BMP-2、TGF-β与IL-4的基因表现上的功效，以及该提取物及其进一步提取级分在EGF与GM-CSF存在下，对于骨髓干细胞的增生与分化的作用。
于图6中，数据证明，该山药物种提取物会增加BMP-2、TGF-β与IL-4的基因表现，特别是BMP-2与TGF-β。再者，由图7与表2显示的实验结果，发明人发现，该山药物种提取物在EGF的存在下，会刺激小鼠骨髓细胞的分化。该进一步提取级分，DioMPw，会增进小鼠骨髓细胞的增生。
至于GM-CSF，GM-CSF可作用于存在于造血祖原细胞上的特定对象复合物上，以刺激骨髓生成，因而，可促进骨髓中造血祖原细胞的增生与分化成单核球、中性白血球、巨噬细胞等。因此，据信，GM-CSF对回复进行化疗病人的巨噬细胞有医疗上的潜力。于此研究中，发明人发现，在GM-CSF的存在下，于该山药物种提取物及其进一步的提取级分的刺激下，可促进骨髓细胞的增生(见表3)。此外，结果显示，该山药物种进一步的提取级分可促进干细胞的分化。于相同的条件下，DHEA展现增进细胞分化的效果，但无法增进细胞增生。因此，此研究暗示，由本发明所制得的山药物种提取物及其进一步的提取级分可藉由骨髓细胞的增生与分化，协助GM-CSF回复因化疗而降低的巨噬细胞数目，因此，可使用作为一种化疗助剂。
发明人进一步确认该山药物种提取物在化疗上作为化疗助剂的活体内的应用。环磷酰胺(CY)系为一种用以治疗多数癌症的药物，然而，其破坏了骨髓的功能、降低血球细胞，例如，白血球、巨噬细胞与红血球，并造成多种其它不好的副作用。于本发明中，使用环磷酰胺以造成小鼠的白血球减少症，以建立用来决定本发明的活性提取物作为化疗助剂功能的动物的模型。所得结果显示，本发明的活性提取物可预防白血球数目的降低，并维持红血球数量与血红素含量在正常值，因此，可加速以环磷酰胺造成白血球减少症的小鼠的回复。因此，本发明的活性提取物可被用来作为化疗助剂，以减轻由抗癌药剂所引发的不好的副作用。
本发明所进行的实验明显证明，该山药物种提取物及其进一步的提取级分可于在不存在有任何骨细胞调节剂下，促进造骨祖原细胞的增生与分化。因此，本发明提供一种山药物种在治疗骨质疏松症上的应用。再者，根据本发明所制得的提取物可增加并回复因化疗所降低的巨噬细胞、白血球与红血球的数目，而可作为一种化疗助剂。
以下之实施例是用以说明本发明。该等实施例不欲用以限定本发明的范畴，且亦应以此方式解释。
制备步骤1：山药物种甲醇提取物的制备方法
将4kg的去皮山药块茎浸于1％醋酸溶液中过夜。所得到的固体部份于-70℃下冷冻并冷冻干燥。将所得的冷冻干燥部份浸泡于存在有1％醋酸的甲醇溶液中。于搅拌及调整甲醇浓度至40％体积后，使混合溶液静置过夜，而后离心分离。将所得到的溶解级分进行冷冻干燥，并命名为DioMs。
DioMs进一步进行分配层析法，其包含下列步骤：使用乙酸乙酯与水(1:1)的溶剂混合物提取DioMs，以将乙酸乙酯提取物(称为DioMPe)与水相中的水提取物分离；于水相中加入正丁醇溶剂，以进行进一步的提取，以将丁醇提取物(称为DioMPb)与残存于水相中的水提取物分离；以及，于水相中加入75％(v/v)乙醇溶剂，以提取并进一步移除多糖，而得纯化的水提取物(称为DioMPw)。
制备步骤2：含有山药物种甲醇提取物的小鼠饲料的制造方法
将一种市售的小鼠饲料(Purina Chow 5001)磨成粉末。将冷冻干燥的山药物种甲醇提取物加入磨碎的饲料中，以形成饲料混合物，其加入量是取代来自磨碎饲料的饲料量。使饲料混合物均匀地与蒸馏水混合，藉挤出成型模具重新成形，在适当的功率下，于微波炉中烘烤2分钟，而后至室温冷却并冷冻于-70℃。于进行冷冻干燥后，饲料混合物会形成与PurinaChow饲料非常相似的丸粒。所形成的丸粒储存于-20℃冰箱中。于喂食当天，将丸粒回温至室温，且于无菌工作台上以UV灯杀菌。制备具有不同浓度的甲醇提取物的饲料混合物。
制备步骤3：骨髓细胞的分离与培养
于无菌条件下，牺牲SPF级C3H/HeN小鼠，并将DMEM/F12的液态培养液注入大腿骨中，以冲出骨髓细胞。以53号无菌尼龙网过滤细胞。将含有N2的DMEM/F12培养液与所得的单细胞悬浮液混合，以调整至适当细胞浓度。
制备步骤4：自小鼠制备造骨祖原细胞
于无菌条件下，取得SPF级C3H/HeN小鼠大腿骨，并注入DMEM/F12。冲出骨髓细胞并以53号无菌尼龙网过滤。将含有15％FCS的DMEM/F12培养液与所得的单细胞悬浮液混合，以调整细胞浓度。
将细胞培养于含有DMEM/F12培养液的T形容器中6天，该培养液含有15％FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松。培养液每3天更换一次。细胞浓度为106细胞/cm2。于第6天，去除悬浮细胞及培养液。以1XPBS(已被回温至室温)冲洗黏附的细胞层，而后在37℃下，细胞层以0.01％EDTA处理5至10分钟。移除EDTA，并以含有FCS的培养液中止反应。收集所有细胞，并在1000rpm下离心5分钟。
实施例1：经山药物种甲醇提取物及其进一步提取级分处理的小鼠的造骨祖原细胞的增生反应
使用22G针头将制备步骤4所得的细胞打散，并悬浮于含有15％ FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的DMEM/F12培养液中，以形成4.5 x 104细胞/ml浓度。将225μl的细胞悬浮液加至96孔微盘的各孔中。于3个小时后，于各孔的细胞悬浮液中加入25μl甲醇提取物、各进一步提取级分与DHEA，并培养72个小时。而后，进行溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑氮(MTT)分析。于各孔中加入1mg/mlMTT溶液，并反应4个小时。将150μl/孔的MTT细胞溶解溶液(20％SDS-50％DMF)加至各孔中，并反应16个小时，而后，在O.D.570nm下量测各孔中所得细胞悬浮液的吸光值。
如图1所示，于山药物种甲醇提取物的刺激下，造骨祖原细胞的增生能力受到增进，其中0.01与0.1μg/ml的浓度展现显着的增进功效。于相同的浓度下，DHEA对于造骨祖原细胞的增生作用并无任何促进效果。提取级分，DioMPe与DioMPb，在10-400μg/ml下，可促进细胞增生，其中DioMPe展现绝佳效果。
实施例2：山药物种甲醇提取物及其不同提取级分在活体外的小鼠成熟造骨细胞分化上的作用，其作用藉由碱性磷酸酶活性(ALP)来决定
由制备步骤4所收集的造骨祖原细胞培养于T形容器中6天。使用22G针头打散细胞，并将细胞浓度调至5 x 103细胞/cm2。而后将细胞培养于6孔盘中，其中于各孔中加入4.5ml的细胞培养液，且于隔天加入0.5ml甲醇提取物及其各提取级分。培养14天后，进行碱性磷酸酶活性分析(描述于后)。
吸出培养液，细胞层以PBS清洗多次。将0.5％Triton X-100的PBS加至各孔中。所得细胞悬浮液分别于-70℃与37℃下进行冰冻及解冻制程。此处理进行两次，以获得测试样本。将50μl的测试样本由各孔移至ELISA盘中。将50μl的AMP-受质缓冲液(含有2-胺基-2-甲基-1-丙醇(AMP，0.5M)的蒸馏水，pH10；2mM氯化镁与9mM p-磷酸硝基苯基酯)加至ELISA盘中，使其在室温下与测试样本反应10-20分钟。随即在410nm波长下，以ELISA读值机测得吸收值之后，定量各孔的蛋白质浓度。所测得的碱性磷酸酶活性以单位/μg表示。
如图2所示，于培养骨髓前驱细胞14天后，可发现作为成熟造骨细胞特定表现标记的碱性磷酸酶的表现。山药物种甲醇提取物及其各进一步提取级分可明显地增加碱性磷酸酶的表现量，其中0.1μg/ml的甲醇提取物、0.1μg/ml的DioMPb、0.01-0.1μg/ml的DioMPe与0.1μg/ml的DioMPw显示有最强的增进效果。
实施例3：山药物种甲醇提取物在骨髓细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性上的作用，该骨髓细胞是衍生自于患有由糖皮质激素所诱发的骨质疏松症的病患
将得自台北荣民总医院的病人骨髓细胞培养于含有15％ FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的DMEM/F12培养中7天。而后进行碱性磷酸酶活性分析。
如图3所示，有发现碱性磷酸酶的表现。与控制组及阳性对照组(1nM雌激素，其为已知的骨质疏松症的治疗方法)相较，山药物种甲醇提取物增加碱性磷酸酶的表现量，其中10μg/ml的甲醇提取物显示最强的增进功效。
实施例4：山药物种甲醇提取物在碱性磷酸酶(ALP)活性与骨髓细胞的矿质化作用上的活体内效果
制备用于口服供给的不同浓度的甲醇提取物(0、40、200与1000mg/kg)。于口服供给不同剂量的甲醇提取物5天后，牺牲小鼠，以取得骨髓细胞。
(1)碱性磷酸酶活性分析
所得的骨髓细胞以2 x 105细胞/孔的浓度培养于96孔微盘中，于其中加入含有15％FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的250μl的α-MEM培养液，于37℃与含有5％CO2的培养箱中培养2天。吸出125μl/孔的培养液，并以125μl/孔含有15％ FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的新鲜培养液取代。于培养4天后，进行碱性磷酸酶活性分析。
如图4(A)所示，发现有碱性磷酸酶的表现。于图4(A)中，山药物种甲醇提取物会增加碱性磷酸酶的表现量，其中，与控制组相较，1000mg/kg的甲醇提取物可达3倍的增进效果。
(2)骨小节形成分析
此测试是用以分析骨质的矿质化作用。自口服喂食不同浓度甲醇提取物(0，40，200，and1000mg/kg)的小鼠所得的骨髓细胞，植种于24孔盘中，浓度为1 x 106细胞/孔，并培养于含有15％FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的α-MEM培养液中，在37℃之5％ CO2培养箱中培养24个小时。吸出500μl/孔之培养液，并以含有15％ FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的500μl/孔新鲜培养液取代。细胞进一步培养15天，以分析骨质的矿质化，培养液每4天更换一次。进行骨小节形成分析，如后所述。
吸出培养液，细胞在37℃与含有5％CO2的培养箱中，与500μl/孔福尔马林反应30分钟而被固定。移除福尔马林并以无菌水清洗细胞3次，于各孔中加入200μl可与钙反应的2％茜素红(Alizarine Red)S溶液，细胞再于37℃含有5％CO2的培养箱中培养10分钟。然后，移出茜素溶液，细胞以绝对酒精清洗三次。骨质的矿质化区域藉由Meta Image测得。
如图4(B)所示，当与控制组组相较，山药物种甲醇提取物可促进骨质的矿质化，其中1000mg/kg浓度的甲醇提取物展现高达3.5倍的最强增进效果。
实施例5：于卵巢切除小鼠动物模型中，山药物种甲醇提取物在碱性磷酸酶(ALP)活性与骨髓细胞的矿质化作用的效果
于无菌条件下，一组SPF级的C57BL/6j小鼠接受外科手术，以去除卵巢来诱发骨质疏松症的发生，而另一组则仅接受手术但不移除卵巢，以作为控制组(称为经假手术之小鼠).
制备用于口服供给不同浓度的甲醇提取物(0、40、200与1000mg/kg)。于口服供给不同剂量的甲醇提取物42天后，牺牲小鼠，以取得骨髓细胞。(1)碱性磷酸酶活性分析
得自口服供给不同浓度甲醇提取物(0、40、200与1000mg/kg)的小鼠的骨髓细胞，与得自经假手术的小鼠的骨髓细胞，以2 x 105细胞/孔的浓度培养于96孔微盘中，于其中加入250μl含有15％FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的α-MEM培养液，并培养于37℃含有5％CO2的培养箱中2天。吸出125μl/孔的培养液，并以125μl/孔含有15％FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的新鲜培养液取代。于培养4天后，进行碱性磷酸酶活性分析。
如图5(A)所示，发现有碱性磷酸酶的表现。于图5(A)中，其显示山药物种甲醇提取物可增加碱性磷酸酶的表现量，其中，1000mg/kg的甲醇提取物显示最强的增进功效。
(2)骨小节形成分析
得自口服供给不同浓度甲醇提取物(0、40、200与1000mg/kg)的小鼠骨髓细胞，与得自经假手术的小鼠的骨髓细胞，以1 x 106细胞/孔之浓度植种于24孔盘中，并以含有15％FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的α-MEM培养液培养，且于37℃含有5％CO2的培养箱中培养24个小时。吸出500μl/孔的培养液，并以500μl/孔含有15％FCS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠与10nM地塞米松的新鲜培养液取代。细胞系进一步培养15天，以分析骨质的矿质化，培养液每4天更换一次。之后进行骨小节形成分析。
如图5(B)所示，当与控制组相较，山药物种甲醇提取物可促进骨质的矿质化，其中1000mg/kg浓度的甲醇提取物展现最强的增进功效。
实施例6：山药物种甲醇提取物对骨髓细胞的基因表现的影响
使用UltraspecTM RNA分离试剂盒(Biotex laboratories Inc，U.S.A.)提取由实施例4所得到的骨髓细胞的所有RNA。5μg所有RNA与2.5μg寡dT在70℃下加热10分钟、冷却至室温10分钟，而后加入4μl 10mM dNTP、0.5μl rRNasin、1μl(10单位)AMV(鸟类骨髓胚细胞过多病病毒)逆转录酶与其缓冲液，最后反应体积为26.5μl。前述反应溶液于42℃下反应60分钟，然后在90℃下反应5分钟，得到cDNA。2.5μl的反应所得cDNA加入0.5μl 10mM dNTP、0.5μl聚合酶(2单位)及其缓冲液、1μl的10μM标地引物，反应混合物的终体积为25μl。进行合适循环次数的PCR，各循环由下列步骤所构成：94℃下45秒的变性作用、于适当配对(annealing)温度下的45秒配对反应、以及72℃的1分钟延长反应。反应产物以2％琼脂凝胶藉电泳而具像化。PCR引物的序列显示于第1表。实验结果显示于图6。
如图6所示，BMP-2、TGF-β与IL-4的基因表现增加，特别是BMP-2与TGF-β。
表1.使用于RT-PCR中之引物的序列
a细胞激素的大小由采用的引物进行聚合酶连锁反应后所决定，参考值为1000bp DNA梯状分子量标准
实施例7：于上皮生长因子(EGF)存在下，山药物种甲醇提取物在C3H小鼠的骨髓细胞形态变化上的影响
得自制备步骤3的1 x 104细胞/孔的小鼠骨髓细胞植种，在含有DMEM/F12培养液的96孔微盘中，该DMEM/F12培养液含有N2与10ng/mlEGF，并在37℃含有5％CO2的培养箱中培养24个小时。该提取物与DHEA分别加至不同孔中。含有单纯培养液的孔(于其中并无加入甲醇提取物与DHEA)是用以作为阳性对照组，其亦进行相同的培养程序。此外，除了使用50ng/ml EGF外，其它与控制组相同的程序皆重复，以作为阳性控制组。增生反应系是MTT分析来量测。依据MTT分析法，各孔加入1mg/ml MTT溶液，且于反应4个小时后，加入150μl/孔的MTT细胞溶解溶液(20％SDS-50％DMF)。所得混合物再反应16个小时。于O.D.570nm下测吸收值。
如图7所示，在骨髓祖原细胞以EGF诱导进行增生的情况下，发现山药物种甲醇提取物可进一步明显刺激骨髓祖原细胞的分化。可知，当所使用的甲醇提取物的浓度为10μg/ml时，可获得较理想之最适结果。于表2中进一步显示，当使用10μg/ml的DioMPw进行刺激时，细胞会表现明显增进的增生效果。如表2所示，与控制组相较，于使用100μg/ml的DioMPw的情况下，细胞的增生速率可高达1.9倍。
表2
群组浓度增生作用指标a形态变化b控制1.00+DHEA0.0001μg/ml0.001μg/ml0.01μg/ml0.1μg/ml1μg/ml0.990.640.650.670.70+++++++DioMPw10ng/ml100ng/ml1μg/ml10μg/ml100μg/ml1.091.131.171.34*1.90*-----
a.数据系以Student’s t-test来分析，*表示P<0.05
b.形态变化是以显微镜来观察
实施例8：于GM-CSF存在下，以山药物种甲醇提取物及其进一步提取级分处理的小鼠骨髓细胞的增生反应
得自制备步骤3的1 x 104细胞/孔的细胞系植种于96孔微盘各孔中，细胞以有N2与4ng/ml mGM-CSF的DMEM/F12培养液培养。具有不同浓度的山药物种甲醇提取物分别被加至各不同孔的培养细胞中。含有甲醇提取物的不同孔中的培养细胞，在37℃含有5％CO2的培养箱中培养14天。以含有N2与20ng/ml mGM-CSF的DMEM/F12培养液培养的细胞作为阳性对照。进行MTT分析。于此分析中，1mg/ml MTT溶液被加至各孔中，与被培养的细胞反应4个小时。加入150μl/孔的MTT细胞溶解溶液(20％SDS-50％DMF)。所得的混合物反应16个小时。于O.D.570nm下测定吸收值。.
如表3所示，于0.001μg/ml至1000μg/ml浓度的山药物种甲醇提取物的刺激下，由甲醇提取物进一步提取所得之级分皆发现具有增进细胞增生的能力。于其中，DioMPb与DioMPe被发现，其对增生的增进具有最佳效果。此外，已发现，在1-10μg/ml浓度的山药物种甲醇提取物的刺激下，20周大成鼠的骨髓细胞具有分化能力。于甲醇提取物的提取级分(其为利用水与乙酸乙酯的溶剂混合物提取，且75％醇类提取级分来自于进一步由75％醇类提取的水萃物)中，发现可加速20周大成鼠骨髓细胞的分化作用。然而，相反地，在相同的条件下，DHEA仅具有促进细胞增生的效果。因此，山药物种提取物在干细胞的再生与分化上皆具有优越的效果，而可辅助GM-CSF回复因化疗而减少的巨噬细胞的数目，因此可作为化疗助剂。
表3
群组浓度增生作用指标a形态变化b控制1.00+DioMs0.0001μg/ml1.08+0.001μg/ml1.19*+0.01μg/ml1.68*+0.1μg/ml1.95*+1.0μg/ml1.78*++10μg/ml1.82*+++100μg/ml1.49*+1000μg/ml1.39*+DioMPe0.01μg/ml0.98+0.1μg/ml1.11++1μg/ml1.35*++10μg/ml2.64*+++
100μg/ml0.83-c300μg/ml0.97-DioMPb0.01μg/ml1.07+0.1μg/ml1.23+1μg/ml1.34+10μg/ml1.41+100μg/ml1.90*+300μg/ml2.02*+DioMPw0.0001μg/ml1.06+0.001μg/ml1.08+0.01μg/ml1.12++0.1μg/ml1.18++1μg/ml1.31*+++10μg/ml1.56*+DHEA0.0001μg/ml0.99+0.001μg/ml1.15+0.01μg/ml1.04+0.1μg/ml1.13+1μg/ml1.11+++10μg/ml1.19*+
a.数据是以Student’s t-test来分析，*表示P<0.05
b.形态变化是以显微镜来观察
c.于高浓度DioMPe下，发现骨髓细胞死亡
实施例9：甲醇提取物对由环磷酰胺诱发的白血球减少症小鼠的周边血液中的白血球与红血球数目与血红素含量上的影响
制备用于口服供给不同浓度的甲醇提取物(0、20、100与500mg/kg)。在第0及第5天，小鼠以腹腔注射方式注射200与100mg/kg的环磷酰胺(CY)，以造成白血球减少症，且定期采血，以造成贫血现象。于第1天至小鼠牺牲当天，小鼠经由口服供给不同剂量的甲醇提取物。于第0、4、8与12天，自眼窝采样周边血液。
于第0、4、8与12天所得的血液(0.1ml)中加入25μl EDTA溶液(72mg/ml)，以避免血液凝集，血液以Turk’s溶液(具有0.01％结晶紫的2％醋酸)稀释10倍或20倍。以显微镜计算白血球数目。
于第8天所得的血液(0.1ml)中加入25μl EDTA溶液(72mg/ml)，以避免血液凝集，血液以生理食盐水稀释2000倍。计算红血球数目。血红素(Hbg)含量是以Worthington RE et al.，Experimental Hematology，15：85-92，1987所述的方法决定。
由图8-10所示的结果可知，本发明的活性提取物可减少周边血液中白血球数目的下降，并加速白血球的回复，且维持红血球及Hbg含量至正常值。
实施例10：利用RAPD分析确认山药物种的特征
1.DNA提取
本发明的制备或使用的提取物，来自于如上所述采集于台湾阳明山的山药物种。不知名的山药物种(显示为两组分别标码为100号或102号)与其它13种已知且生长于台湾的山药物种进行比较，其物种包括DioscoreaalataL.cv.(不同栽培法)台南1号(标码为1号)，Dioscorea esculenta(标码为3号)，Dioscorea bulbifera(编码为4号)，Dioscorea alata L.cv.8702(编号为5号)，Dioscorea alata L.cv.Sanzhi A(编号为6号)，Dioscorea alata L.cv.Sanzhi B(编号为7号)，Dioscorea alata L.cv.Dayeshoufeng(编号为9号)，Dioscorea alata L.cv.台南2号(编码为10号)，Dioscorea alata L.cv.Jifa(编码为67号)，Dioscorea alata L.cv.Zhanger 2号(编码为64号)，Dioscoreaalata L.cv.Dashan 3号(编码为13号)，Dioscorea alata L.cv.Danshan 2号(编码为12号)，及Dioscorea alata L.cv.Taidong(编码为11号)。
苍集上述山药物种的新鲜叶子0.2g，置于液态氮中磨碎。磨碎的组织加入9001的2％CTAB提取溶液(含有1.4M氯化钠，100mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐pH为8，20mM乙二胺四乙酸与0.2％-硫氢乙醇)并置于1.5ml微量离心管中，在65℃水浴30分钟。该样本离心后，将上清液移至干净的微量离心管，加入6001氯仿/异戊醇(24:1)，混合至呈现乳化的状态。该样本再次离心，将上清液移至干净的微量离心管，加入40的10％CTAB溶液(含有0.7M氯化钠)与4001氯仿/异戊醇(24:1)。离心后将4001上清液移至干净的微量离心管，与4001 CTAB溶液混合后置于冰上15-20分钟以沉淀DNA。沉淀后的DNA样本由4001高盐TE缓冲液(含有10ml三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐pH为8；1mM乙二胺四乙酸；1M氯化钠)与8001的95％乙醇清洗。DNA样本再离心，沉淀物以4001乙醇清洗，最后加入蒸馏的去离子水并储存在-20℃。
2.RAPD反应
RAPD分析采用随机RAPD引物，在此例中为SEQ ID NO：9的OPA-18(AGGTGACCGT，Operon Technologies，USA)，其被用来在此RAPD分析中扩增山药物种的基因组DNA。PCR的最终反应液体积为251，其包括10倍缓冲液，2.5mM各dNTP(dATP，dCTP，dGTP与dTTP)，0.2M引物(Operon)，5单位的Tag DNA聚合酶(TaKaRa Biomedicals)，以及5ng样本DNA。样本最适循环次数为41，其包括94℃下1分钟的变性作用，36℃下1分钟的配对反应，72℃下2分钟的延长作用，以及72℃下10分钟的一次最终延长循环。PCR结束后，取出10ml反应液置于2％琼脂凝胶，含有0.5g/ml溴化乙锭进行电泳。
3.结果分析
在电泳胶上，第一道(位于最左边)和最后一道(位于最右边)皆是DNA分子重量标志(M)，例如，X174DNA/HaeIII标志(Promega Co.，USA)，提供不同分子大小的参考，如500bp，1000bp，1500bp，2000bp，2500bp，3000bp，3500bp与4000bp，其它位置则加入不同山药物种的cDNA样本。从各种山药扩增的DNA产物图谱由荧光显影装置显现，并由一影像撷取装置，AlpaImager 1220，拍摄显影照片。因为在RAPD指纹谱上每种山药物种产生属于自己的DNA带，由此可区分出本发明的山药物种不同于其它山药物种。如图11所示，当该山药物种的基因组DNA由SEQ ID NO：9的OPA-18引物扩增时，可看到包含14条DNA带，依序是482bp，452bp，537bp，602bp，723bp，817bp，934bp，1140bp，1242bp，1478bp，1641bp，1904bp，2151bp与2918bp，可用来区分此未知的山药物种(在图上显示为标码100或102)。
群集分析或配对分析(pair analysis)是采用Gel-Compar软件，对于两种山药物种间计算相似性指标(similarity index)。分析的参数来自于RAPD指纹谱。接着，以UPGMA(unweighted pair-grouping mean arithmeticalanalysis)估算相似性指标：
F＝2nxy/nx+ny
其中nxy为山药物种x与y间共同具有的DNA带的数量，nx与ny分别为山药物种x与y的所有DNA带(Nei，M.and W.H.Li.1979，Mathematical Model for studying genetic variation in terms of restrictionendonucleases，Proc.Natl.Acad.Soc.U.S.A.76：5269-5273)。
参考图12，根据试验的14种山药物种的相似性指标，可绘制出种系树。如图12所示，该未知山药物种与Dioscorea alata L.cv.Sanzhi A或Dioscorea alata L.cv.Zhanger No.2的相似性指标约有88.9％。此外，该山药物种与Dioscorea bulbifera或Dioscorea esculenta有37.5％的相似性。再者，该未知山药物种与Dioscorea Dioscorea alata L.cv.Tainung No.1，Dioscorea alata L.cv.8702，Dioscorea alata L.cv.Sanzhi B，Dioscorea alataL.cv.Dayeshoufeng，Dioscorea alata L.cv.Tainung No.2，Dioscorea alata L.cv.Dashan No.3或Dioscorea alata L.cv.Dashan No.2具有大于75％的相似性。
基于以上的群集分析或配对分析的结果，可以知道的是此未知山药物种不同于其它已知的物种，但是与Dioscorea alata亚种较为近似。因此，此未知山药物种命名为Dioscorea alata L.Cv.Phyto。
在此所列举之专利或文献仅为参考文献。
所属领域的技术人员当知道可在不偏离广义的本发明概念下修饰上述具体实施例。应了解本发明不局限于所揭示的特定具体实施例，而意欲涵盖如权利要求所界定的本发明的精神及范围内的修饰。