一种蚕茧丝胶层醇溶物及其制备方法.pdf

本发明公开了一种蚕茧丝胶层醇溶物的制备方法包括如下步骤：将洁净的茧壳、茧衣、废丝或生丝置于水中润湿后，在110～140℃、0.1～0.26MPa下脱胶处理1～5小时，获得蚕丝脱胶液；将上述蚕丝脱胶液过滤、浓缩后得到丝胶浓缩液，然后加入有机溶剂进行萃取，所述丝胶浓缩液和有机溶剂的体积比为1∶1～9；收集上层清液，下层沉淀物再用有机溶剂反复萃取；合并的上层清液浓缩后经喷雾干燥或真空冷冻干燥制成粉末，即为所述蚕茧丝胶层醇溶物。本发明获得的这种非丝胶组分具有抗氧化、抗酪氨酸酶和抑制α-葡萄糖苷酶的活性，在化妆品、抗衰老保健品和降血糖药物等方面有广泛的应用前景。

1.  一种蚕茧丝胶层醇溶物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将洁净的茧壳、茧衣、废丝或生丝置于水中润湿后，在110～140℃、0.1～0.26Mpa下脱胶处理1～5小时，获得蚕丝脱胶液；
(2)将上述蚕丝脱胶液过滤、浓缩后得到丝胶浓缩液，然后加入有机溶剂进行萃取，所述丝胶浓缩液和有机溶剂的体积比为1∶1～9；收集上层清液，下层沉淀物再用有机溶剂进行萃取，重复上述操作3～4次，合并上层清液；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮和四氢呋喃中的一种或几种；
(3)将步骤(2)得到的上层清液经旋转浓缩仪浓缩，获得浓缩液，再经喷雾干燥或真空冷冻干燥制成粉末，即为所述蚕茧丝胶层醇溶物。

2.  根据权利要求1所述的蚕茧丝胶层醇溶物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中脱胶处理为：在120℃、0.20Mpa下脱胶处理1～2小时。

3.  权利要求1所述的制备方法得到的蚕茧丝胶层醇溶物。

4.  权利要求1所述的制备方法得到的蚕茧丝胶层醇溶物在制备化妆品、保健食品或降血糖药物中的应用。

一种蚕茧丝胶层醇溶物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种蚕茧丝胶层的提取物，具体涉及一种蚕茧丝胶层醇溶物及其制备方法。
背景技术
蚕丝主要由占总量70％的丝素纤维和30％的被覆在丝素纤维周围的丝胶层组成。在丝胶层中：丝胶蛋白占茧层总量约25％，其余5％为非丝胶组分，如碳水化合物、腊质和色素等。丝素纤维和丝胶二种蛋白分别是由家蚕的后部和中部丝腺体细胞分泌的，而非丝胶组分源自饲养蚕的食物-桑叶，因食桑时咀噬、酶解等多种作用而被中肠消化与吸收，进入血液最后到达丝腺体与丝胶蛋白混合。蚕吐丝营茧时，这种胶状混合物被覆在丝素纤维外面起到保护和胶粘纤维的作用而使蚕茧更牢固、能抵抗包括紫外辐射在内的恶劣环境的影响，有利于蚕蛹的变态与发育。
然而，在缫丝、练染、精练等丝绸加工过程中正好相反，需要逐步去除层层胶粘在纤维周围的丝胶蛋白，由此产生大量含丝胶的工业废水；在丝棉和绢纺等加工过程中脱除的大部分丝胶层物质也与脱胶试剂一起而被废弃；在丝蛋白新功能材料的研究与开发中，必须完全去除丝胶层物质而产生的盐丝胶液也很难回收。过去，很多研究人员想从大量工业废弃液中回收丝胶的巨大努力大都成为泡影，这倒并不是丝胶不能回收，而是回收丝胶的工艺或设备非常复杂而造成成本偏高，难以实用化。当然，其中重要的因素也是因为找不到广泛应用丝胶蛋白的市场需求和高附加值的应用领域。因此，多年来人们的重点一直致力于丝胶蛋白的分离、纯化和低成本的回收，以及丝胶蛋白的各种生物活性和药理作用的研究，如生物药物(抗病毒、抗紫外辐射、抗肿瘤、促消化、促细胞增殖)或医学组织工程材料(再生皮肤、细胞培养基质)。
然而，人们恰恰忽视了上述占茧层总量约5％左右的非丝胶组分的存在。虽然，最近日本学者发现家蚕茧层中的非丝胶组分中有槲皮素及其3种葡萄糖苷、山萘酚及其2种葡萄糖苷(Kurioka et al，Biosci Biotechnol Biochem，2002，55，1396～1399)；后又发现了另外2种槲皮素葡萄糖苷(Tamura et al，Phytochemistry，2002，59，275～278)；最近还发现了以前从未发现过的2种C-脯氨酸槲皮素(Hirayama et al，Phytochemistry，2006，67，579～583)。上述物质的提取方法主要是用乙醇或甲醇水溶液直接浸提蚕丝、废丝，或者浸提经机械粉碎的蚕丝粉末，然后再用其它有机溶剂反复纯化得到。然而这种直接对蚕丝的抽提方法只能得到少量的槲皮素等样品，一般只能用于定性分析，而不具有实用性。而关于在茧层中大量提取非丝胶组分等活性物质，以及对其生物学活性进行单独研究与分析的报道很少。
发明内容
本发明的目的是提供一种蚕茧丝胶层醇溶物及其制备方法，并对其生物学活性进行研究。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种蚕茧丝胶层醇溶物的制备方法包括如下步骤：
(1)将洁净的茧壳、茧衣、废丝或生丝置于水中润湿后，在110～140℃、0.1～0.26Mpa下脱胶处理1～5小时，获得蚕丝脱胶液；
(2)将上述蚕丝脱胶液过滤、浓缩后得到丝胶浓缩液，然后加入有机溶剂进行萃取，所述丝胶浓缩液和有机溶剂的体积比为1∶1～9；收集上层清液，下层沉淀物再用有机溶剂进行萃取，重复上述操作3～4次，合并上层清液；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮和四氢呋喃中的一种或几种；
(3)将步骤(2)得到的上层清液经旋转浓缩仪浓缩，获得浓缩液，再经喷雾干燥或真空冷冻干燥制成粉末，即为所述蚕茧丝胶层醇溶物。
上文中，所述茧壳、茧衣、废丝或生丝等蚕丝原料可以是家蚕茧、柞蚕茧、蓖麻蚕茧和其它蚕茧。所述步骤(1)中的茧壳、茧衣、废丝或生丝置于水中润湿，优选将上述蚕丝原料置于温水中过夜浸渍处理；所述步骤(1)中的脱胶处理可以是普通自来水、弱碱性水；该脱胶处理是现有技术。所述步骤(2)中的重复萃取操作是为了将蚕丝脱胶液中的非丝胶组分充分洗脱下来。对于上述蚕丝脱胶液，经过萃取后剩下的沉淀物干燥或真空冷冻干燥制成的粉末即高纯的丝胶蛋白。
进一步的技术方案是，所述步骤(1)中脱胶处理为：在120℃、0.20Mpa下脱胶处理1～2小时。
本发明同时要求保护上述制备方法得到的蚕茧丝胶层醇溶物，以及该蚕茧丝胶层醇溶物在制备化妆品、保健食品或降血糖药物中的应用。
经测试，上述蚕茧丝胶层醇溶物主要由黄酮类化合物和降解的丝胶寡聚肽和游离氨基酸组成。通常，蚕茧丝胶层醇溶物含总黄酮类组份约为5～45％(以芦丁为标准计算的质量比)、氨基酸25～80％。该蚕茧丝胶层醇溶物消除DPPH自由基和酪氨酸酶的抑制活性远远高于其高纯丝胶蛋白；而且还具有较强力的抑制α-葡萄糖苷酶活性，而高纯丝胶蛋白几乎没有这种抑制活性。因此，该蚕茧丝胶层醇溶物可以制成治疗和预防糖尿病的各种剂型药物，如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂；也可以与高纯丝胶蛋白一起制备抗氧化、抗衰老的保健食品和高级化妆品。
由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明先在高温高压下进行脱胶处理获得蚕丝脱胶液，然后再用有机溶剂萃取其中的非丝胶组分，获得了大量的非丝胶组分，也为其生物学活性的研究打下了基础。
2.本发明获得的蚕茧丝胶层醇溶物具有较强的抗氧化作用和显著的酪氨酸酶抑制活性，其IC₅₀分别为170μg/mL和27μg/mL，还具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC₅₀为110μg/mL，因而可在制备化妆品、保健食品或降血糖药物中得到应用。
3.本发明的制备过程中，副产物(即经过萃取后剩下的沉淀物)经干燥或真空冷冻干燥可制成高纯的丝胶蛋白而完全利用，且有机溶剂也在旋转浓缩仪浓缩的时候一并回收，因而整个制备工艺绿色环保，几乎无污染。
4.本发明的制备方法简单且成本较低，具有良好的应用前景。
5.我国是蚕丝业大国，蚕茧缫丝废液和丝棉脱胶废液仍是目前没有利用的巨大资源。高附加值利用丝胶蛋白和提取非蛋白活性成分仍是我们的广泛利用丝胶蛋白的重大难题。所以，这项新技术不仅有显著的经济效益，还具有明显的社会效益，还能为培养出新功能蚕茧品种提供重要科学依据。
附图说明
图1是本发明实施例四中的各种家蚕品种的蚕茧丝胶层醇溶物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
为方便说明实施例中使用的不同蚕茧品种，在此进行统一说明，如下：
NC：普通蚕品种(清松×晧月)；
FC和MF分别为“荧苏×荧晓”荧光判性品种的雌、雄蚕茧；
YC：由黄白限性蚕品种“701×702”；
DZC：大造蚕茧。
实施例一
蚕茧丝胶层醇溶物的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先去除茧壳、茧衣、废丝的不净物或杂质，然后用水或电解水浸泡过夜，接着置于高温高压锅中于120℃处理2h，由此获得的蚕丝脱胶液，
(2)将上述蚕丝脱胶液过滤、去除水不溶物和残渣，再经旋转浓缩仪浓缩，获得丝胶浓缩液；加入等体积有机溶剂震动萃取2～10h；静止分层或离心(5000rpm×10min)分离后收集沉淀物，再加入有机溶剂萃取；重复上述操作3～4次，将吸附在丝胶蛋白上的非丝胶蛋白成分完全洗脱下来，合并上清液，所述有机溶剂为乙醇；
(3)将步骤(2)得到的上层清液经旋转浓缩仪浓缩，获得浓缩液，再经喷雾干燥或真空冷冻干燥制成粉末，即为所述蚕茧丝胶层醇溶物。
反复冲洗后获得的白色沉淀物同样干燥后制成高纯的丝胶蛋白粉末。
实施例二
氨基酸和总黄酮类含量测定
对实施例一获得的蚕茧丝胶层醇溶物进行氨基酸和总黄酮类含量分析：
1.氨基酸
家蚕茧层在120℃水中高温高压脱胶处理，某些丝胶肽肯定会降解或水解成小分子丝胶肽(寡聚肽)或游离氨基酸，所以，利用日立L-8800自动氨基酸分析对茧层溶物的氨基酸总量进行分析。称取一定量醇溶物6.0mol/L盐酸在110℃水解24h，当醇溶物水解液中的盐酸完全挥发去除后，用自动氨基酸分析仪测定氨基酸总量与组成。分别测定了5种蚕茧丝胶层醇溶物中氨基酸种类与组成，结果见表1：
表1.蚕茧丝胶层醇溶物的氨基酸组成与含量(％)

2.黄酮类化合物
准确称取120℃干燥恒重的芦丁20.00mg，用98％微热乙醇定容至100mL，搖匀得浓度为0.2mg/mL的标准应用液。分别移取0.2mg/mL芦丁标准应用液0、2、4、6、8、10mL于50mL容量瓶中，编号分别为0、1、2、3、4、5，加入5％NaNO₂溶液2mL，摇匀，静止6min后，加入10％AlCl₃溶液2mL，搖匀，加入1mol/L NaOH溶液10mL，60％乙醇定容至刻度，摇匀，放置10～15min，用1cm比色皿，以空白试剂作参比，于波长499nm处测其吸光度，得到芦丁标准溶液的工作曲线。用最小二乘法进行回归，得到芦丁吸光度值A与标准量的关系曲线，绘制芦丁标准量-吸光度A的标准曲线，分析得回归方程y＝25.6x+0.0272，其线性范围为1～10μg/mL，相关系数R＝0.99927。
样品溶液测定：称取样液6.0mL于50mL容量瓶中，各加入5％NaNO₂溶液2mL，摇匀，静止6min，加入10％AlCl₃溶液2mL，搖匀，放置6min，加入1mol/L NaOH溶液10mL，60％乙醇定容至刻度，搖匀，放置10～15min，同时作试剂空白，以试剂空白作对照，于499nm波长处测定吸光度，用线性方程计算出各种蚕茧丝胶层醇溶物的总黄酮含量在7～43％范围内。测定值如表2所示：
表2  茧层中非丝胶蛋白组分

实施例三
抗氧化活性试验
用96孔板，在孔穴中加入样品或乙醇溶液80μL(对照组)，再加入0.4mM(即0.4mMol/L)1，1-二苯基1，2-苦味酰基自由基(DPPH)乙醇溶液80μL，充分混合后静止反应30min，然后在分光光度计上用550nm波长测定其吸光度。以乙醇为100％空白样，计算丝胶样品的抗氧化活性(清除率％)。以未加蚕茧丝胶层醇溶物的标准反应吸光度去除空白后的值为100％，记录加入各种醇溶物的吸光度值和计算抑制半值IC₅₀。表3和表4分别表示蚕茧丝胶层醇溶物和高纯丝胶蛋白的DPPH活性的抑制半值，从表中可见，蚕茧丝胶层醇溶物的抗氧化活性显著高于其丝胶蛋白。
表3  蚕茧丝胶层醇溶物的DPPH清除活性抑制半值(IR％±SD)


表4  高纯丝胶蛋白的DPPH清除活性抑制半值(IR％±SD)

实施例四
酪氨酸酶抑制活性试验
预先将DOPA底物缓冲液、酶液和样品液(也可称抑制液)置于30℃水浴中恒温，在恒温的试管中先加入底物缓冲液2.8mL，然后加入抑制液0.1mL(当测定无抑制物的标准酶反应时应加入0.1mL磷酸缓冲液)，充分混合后，当加入酪氨酸酶液0.1mL(约含酶活性5U)，就准确计时开始，反应总时间5min，然后立即用2.5mL移液器转入比色皿中，在475nm的紫外分光光度计上读取吸光度值。在每组样品测定前应先用2.8mL底物缓冲液和0.1mL抑制液作为校正液将两光路校正至0，然后在每组样品测定前更换参比池的校正液。每个样品重复测定3次，计算标准差±SD。
以没有加入抑制液的标准酶反应的吸光度值为100％，计算每个样品的抑制率。计算公式如下：
抑制率＝[(标准酶反应吸光度值-样品反应吸光度值)/标准酶反应吸光度值]×100％
表5和表6分别为蚕茧丝胶层醇溶物和高纯丝胶蛋白对酪氨酸酶活性的抑制半值，从表中可见，蚕茧丝胶层醇溶物对酪氨酸酶的抑制活性明显高于高纯的丝胶蛋白。
表5  蚕茧丝胶层醇溶物对酪氨酸酶活性的抑制半值(IR％±SD)

表6  高纯丝胶蛋白对酪氨酸酶活性的抑制半值(IR％±SD)

实施例五
α-葡萄糖苷酶抑制活性试验
各种蚕茧丝胶层醇溶物配制成浓度为10mg/mL水溶液，当测定抑制活性时这些样品液浓度再按抑制率大小而适当稀释。
α-糖苷酶抑制剂活性测定：100mg鼠肠丙酮粉(Sigma公司出品)加入1mL 0.9％生理盐水中，超声处理(1min×3)溶解。溶解液离心(3000rpm×30min)后，取出上清液用蒸溜水稀释4倍后置于4℃保存备用。试验混合液由100mM磷酸缓冲液(pH 6.0，0.7mL)、500m M麦芽糖溶液(0.1mL)和200mg/mL样品液(0.1mL)组成。将上述试验混合液置于37℃水浴中预保温5min，加入0.1mL鼠肠酶初提液后就开始酶解反应，37℃反应60min后加入2.0M磷酸-Tris-NaOH缓冲液(pH 7.4)1.0mL终止反应。反应混合物中产生的葡萄糖含量按葡萄糖试剂盒的操作说明书步骤进行测定。实验中每个样品应重复3次，然后计算其标准差(±SD)，结果如图1所示，为5种蚕茧丝胶层醇溶物的α-葡萄糖苷酶活性半抑制值，其IC₅₀值为110～450μg/mL。