一种含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂及其制备方法.pdf

本发明提供一种含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂，其原料药为灵芝孢子和白术。本发明还提供该中药制剂的制备方法，分别净制灵芝孢子和白术，按照重量比分别称取净制后的灵芝孢子和白术；破壁粉碎灵芝孢子；将破壁粉碎后的灵芝孢子制粒并干燥，获得干燥的灵芝孢子颗粒；将灵芝孢子颗粒与白术混合，经过粗混合油提取、杂质及水分去除步骤后，获得的灵芝孢子白术混合油即为所述的中药制剂。本发明的中药制剂具有调节免疫功能，抑瘤抗癌，减少西医药毒副反应，缓解症状等作用，适于手术、放化疗前后及不宜接受手术或放化疗之气阴两虚证恶性肿瘤患者服用。该中药制剂的制备方法能够高效的提取灵芝孢子与白术混合油。

1.  一种含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂，其特征在于所述中药制剂的原料药为灵芝孢子和白术。

2.  根据权利要求1所述的中药制剂，其特征在于所述灵芝孢子与白术的重量比为1∶1。

3.  根据权利要求1或2所述的中药制剂，其特征在于配伍药物上可接受的辅料，制成药物上所说的各种口服剂型。

4.  一种权利要求1或2所述的中药制剂的制备方法，其具体步骤如下：
a：分别净制灵芝孢子和白术，按照重量比分别称取净制后的灵芝孢子和白术；
b：破壁粉碎步骤a所得的灵芝孢子；
c：将步骤b所得破壁粉碎后的灵芝孢子制粒并干燥，获得干燥的灵芝孢子颗粒；
d：将步骤c所述干燥的灵芝孢子颗粒与步骤a所得的白术混合，经过粗混合油提取、杂质及水分去除步骤后，获得的灵芝孢子白术混合油即为所述的中药制剂。

5.  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤d中所述提取粗混合油的方法为CO₂超临界萃取法。

6.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述CO₂超临界萃取法提取粗混合油的条件为：萃取温度为40～60℃，压力为18～26MPa，CO₂流量为0.4～0.6m³/h，萃取时间为3～5h。

7.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于将所述的灵芝孢子混合油以常规方式制成软胶囊。

8.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于将所述的灵芝孢子白术混合油采用β-环糊精进行包合，获得灵芝孢子白术混合油的包合物。

9.  根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的包合方法如下：取4～8份重量的β-环糊精与2～4份重量的水混匀，然后加入1份重量的灵芝孢子白术混合油，研磨20～40min后，低温存放后抽滤，采用0.1～0.3份重量的无水乙醇洗涤，然后真空干燥即得所述灵芝孢子白术混合油的包合物。

10.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于将所述包合物制成片剂或硬胶囊剂。

一种含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及制药领域，尤其涉及一种含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类的健康。近年来，恶性肿瘤发病率逐年升高，在我国甚至全世界范围内，肿瘤的发病率、死亡率均已为单瘤种疾病的首位。由于现代科学对恶性肿瘤的发生、发展机理认识不够，目前尚无可达到治愈恶性肿瘤目的之方法。
西医学治疗恶性肿瘤的主要方法是手术、放疗和化疗。
手术治疗用于局限性肿瘤，可以得到根治性治疗效果。手术根治切除辅以区域淋巴结清扫能将肿瘤比较完整切除，清除周围可能的病灶，术后标本可作病理检查以明确肿瘤类型，有否转移，切除是否彻底，对下一步治疗有一定参考意义。但一般情况下，恶性肿瘤患者在手术过程中或手术前就有微小转移灶，术后体内也还存在一定量肿瘤细胞。如肺腺癌长至1cm直径时就有约30％的远处转移，至2cm则有约60％的转移。因此，大部分病人仅靠手术不能防止肿瘤复发和远处转移。有些病人由于肿瘤在术前已有远处转移，即使作了超根治术，仍不能取得根治性疗效。还有部分病人在被确诊时，已失去了手术指征。此外，手术对患者生理功能亦有一定干扰，尤其对免疫功能的损伤，影响了手术效果与预后。
手术后的放疗和化疗都可以将一定数量的剩余癌细胞杀灭，减少肿瘤复发。(1)放疗是应用放射线杀灭癌细胞，适用于局限性放射敏感性肿瘤，一般用来处理肿瘤的原发灶，亚临床灶和淋巴结转移。但放疗对放射区正常组织也有损伤作用，产生全身和局部反应，并不适用于有远处转移的患者，加之，有些肿瘤对放射线不敏感，所以，放疗也有一定的局限性，需配合其他治疗方法。(2)近十余年来，化疗得到了较快的发展，尤其对白血病、恶性淋巴瘤等的治疗取得了较好效果，新的抗肿瘤化疗药品研发，联合化疗的较大进展，综合疗法的使用，均使肿瘤化疗的疗效有所提高。但化疗存在许多缺点。理论上，化疗对癌细胞的杀灭是对数级杀灭，不可能杀灭体内所有的癌细胞，一般体内含残留10⁶～10⁸左右癌细胞；而且多数抗肿瘤化疗药品缺乏理想的选择性，在抑制肿瘤细胞的同时也损伤了正常细胞，常引起肿瘤患者较严重的毒副反应，对造血系统、消化系统、神经系统、肝肾功能的损害，迫使患者中断治疗。
近代中医肿瘤学家认为，肿瘤的诊断、正规治疗(主要是手术、放化疗)时间的早晚对于肿瘤的预后有重大影响。在提倡尽早手术时，应注意到患者在接受手术前的整体状况，许多学者认为此阶段中医药的运用，应以调整患者气血阴阳，脏腑功能为原则，使患者恢复接近“阴平阳秘”状态，这是使手术、放化疗顺利完成的关键。一般采用益气养阴生津等方法，以达到明显减轻肿瘤患者放疗后的临床症状，保护造血系统功能、提高免疫功能、减轻组织损伤、减毒增效、抑制肿瘤的效果，使放疗得以顺利进行。近代多数中医学者认为化疗后患者不良反应的病机主要是气血损伤，热毒伤阴，脾胃失调等。目前对化疗反应的治疗原则为扶正培本，应用益气养血，滋补肝肾等方法。常可明显减轻肿瘤患者化疗后多种临床症状，防止化疗过程中白细胞和血小板下降，调整免疫功能，明显提高肿瘤患者化疗疗程的完成率，以其减毒增效抑瘤作用，提高患者生存质量，延长生存期。手术、放化疗以后的治疗以恢复机体功能为主，抑制、消除残留的癌细胞，以巩固疗效，防止复发转移。治疗主要针对常见症状，如低热、盗汗、乏力、食欲减退等症状进行整体调整。对于失去最佳手术或放化疗时机的肿瘤患者，可以根据病人的具体状况，以扶正固本为主，攻补兼施，以达到提高生存质量，延长生命的目的。
总之，西医采用的以手术、放疗、化疗为主的治疗方法是目前治疗恶性肿瘤的主要措施，但对相当数量患者的疗效不能令人满意。在给肿瘤患者应用西医药治疗时，使用立足于扶正培本的中医药治疗，有其抑瘤、减毒、增效、降低不良反应的明显优势。以中医药理论为指导，临床疗效为基础，针对恶性肿瘤发生、发展及西医治疗对机体损伤的病因病机，从整体功能调节角度，研制缓解患者症状，以达到治疗未病、有病早治、治病求本目的防治恶性肿瘤药物是既有必要、又有可能的。
发明内容
本发明的目的是提供一种含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂，该中药制剂具有调节免疫功能，抑瘤抗癌，减少西医药毒副反应，缓解症状等作用，适于手术、放化疗前后及不宜接受手术或放化疗之气阴两虚证恶性肿瘤患者服用。本发明同时提供该中药制剂的制备方法。
本发明提供一种含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂，所述中药制剂的原料药为灵芝孢子和白术。
所述的中药制剂，其原料药灵芝孢子与白术的重量比优选1∶1。
以上的原料药配伍药物上可接受的辅料，制成药物上所说的各种口服剂型。
本发明还提供该中药制剂的制备方法，其具体步骤如下：
a：分别净制灵芝孢子和白术，按照重量比分别称取净制后的灵芝孢子和白术；
b：破壁粉碎步骤a所得的灵芝孢子；
c：将步骤b所得破壁粉碎后的灵芝孢子制粒并干燥，获得干燥的灵芝孢子颗粒；
d：将步骤c所述干燥的灵芝孢子颗粒与步骤a所得的白术混合，经过粗混合油提取、杂质及水分去除步骤后，获得的灵芝孢子白术混合油即为所述的中药制剂。
上述制备方法中，步骤b中可以采用细胞破壁微粉机破壁粉碎灵芝孢子。细胞破壁微粉机使用的条件为选灵芝孢子的装量为1～3kg，每次破壁粉碎时间1～2h，优选条件为：装量2kg，每次破壁粉碎时间1.5h。
步骤c所述制粒的优选条件如下：取破壁粉碎后灵芝孢子加入其20～30％重量的蒸馏水，混合均匀，制成软材，将该软材置于制粒机中，用10目不锈钢筛制粒，获得灵芝孢子颗粒；步骤c所述干燥的优选条件如下：将所述灵芝孢子颗粒置热风循环烘箱中，在小于等于60℃干燥。蒸馏水加入的量优选25％破壁粉碎后灵芝孢子重量。
为了高效提取灵芝孢子白术混合油，步骤d中提取粗混合油的方法优选CO₂超临界萃取法。提取条件如下：萃取温度为40～60℃，压力为18～26MPa，CO₂流量为0.4～0.6m³/h，萃取时间为3～5h。优选的提取条件为：萃取温度60℃，压力26MPa，CO₂流量为0.6m³/h，萃取时间5h。
将所述的灵芝孢子混合油以常规方式制成软胶囊剂。
将所述的灵芝孢子白术混合油采用β-环糊精进行包合，获得灵芝孢子白术混合油的包合物。
优选的包合方法如下：取4～8份重量的β-环糊精与2～4份重量的水混匀，然后加入1份重量的灵芝孢子白术混合油，研磨20～40min后，低温存放后抽滤，采用0.1～0.3份重量的无水乙醇洗涤，然后真空干燥即得所述灵芝孢子白术混合油的包合物。
将所述包合物制成片剂或硬胶囊剂。
本发明提供一种含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂，该中药制剂具有调节免疫功能，抑瘤抗癌，减少西医药毒副反应，缓解症状等作用，适于手术、放化疗前后及不宜接受手术或放化疗之气阴两虚证恶性肿瘤患者服用。灵芝孢子性味甘平，具有疗虚劳，益精气，扶正固本作用，是灵芝的生殖细胞，白术性温，味甘、苦，健脾和胃，燥湿安胎。全方药味少而性平和，二药共用，具益气养阴，扶正固本功效。应用于肿瘤患者，具有增强患者体质，补益虚弱状态，调整机体内环境稳定，抑制肿瘤细胞生长等作用。近年来对灵芝孢子、白术的化学组成与药效作用进行了较为深入的研究。灵芝孢子含有蛋白质、氨基酸类、多糖糖肽类、腺苷类、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类等化学物质。药理研究表明，灵芝孢子具有抗染色体突变，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、杀伤癌细胞，拮抗环磷酰胺引起的小鼠耐力下降、染色体畸变、血红蛋白与白细胞下降、染色体畸变、血红蛋白与白细胞下降、巨噬细胞吞噬力下降和SGPT升高等不良反应，抑制⁶⁰Co照射引起的白细胞减少不良反应、激活并提高特异性杀伤细胞(CTL)和非特异性杀伤细胞(NK、LAK)的抗肿瘤作用、增强单核-巨噬细胞吞噬功能，抗脂质过氧化反应等作用，显示出灵芝孢子在调节免疫功能、抗肿瘤方面的良好应用前景。白术挥发油对小鼠肉瘤S₁₈₀、、艾式腹水癌及淋巴肉瘤腹水型均有抑制作用，对小白鼠肉瘤S₁₈₀、抑制率为31％～49％；白术挥发油对组织培养人的食管癌细胞株有明显抑制作用。白术的抑瘤机理同降低癌细胞的增殖率、减低瘤组织的侵袭性，提高机体抗瘤反应能力及对瘤细胞的细胞毒作用等有关。根据中医药理论、实践经验及药理学研究结果，提示本方药具有调节免疫功能，抑瘤抗癌，减少西医药毒副反应，缓解症状等作用，适于手术、放化疗前后及不宜接受手术或放化疗之气阴两虚证恶性肿瘤患者服用。
本发明提供的该中药制剂的制备方法，能够高效的提取灵芝孢子与白术混合油。采用β-环糊精对所述的混合油进行包合，灵芝孢子与白术混合油被包合后化学成分没有变化，而制成包合物后溶解度明显增加，可以提高挥发油的生物利用度，降低挥发油的刺激性和副作用，掩盖其不良气味，大大提高了挥发油的稳定性，降低了挥发油在生产、储存过程中的挥散或氧化变质，可增加制剂的稳定性，提高了该产品的质量，并使挥发油液体药物固体粉末化，便于制成多种剂型，例如片剂、硬胶囊剂等，服用携带均很方便。
附图说明
图1表示含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂的制备过程；
图2表示各物质的紫外表征图，纵坐标表示吸光度，横坐标表示吸收波长，其中1-灵芝孢子白术混合油，2-灵芝孢子白术混合油与β-环糊精的物理混合物，3-包合物脱包后的物质，4-包合物，5-β-环糊精。
具体实施方式
实施例1含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂-灵芝孢子白术混合油的制备方法该中药制剂的制备过程如下(图1)：
a：分别净制灵芝孢子和白术，按照重量比分别称取净制后的灵芝孢子和白术；
所谓净制，即去除灵芝孢子或白术中的杂质。按照重量比1∶1分别称取净制后的灵芝孢子和白术。
b：破壁粉碎步骤a所得的灵芝孢子；
采用贝利细胞破壁微粉机(BFM-100A型，济南倍力粉技术工程有限公司)来破壁粉碎净制后的灵芝孢子，冷却介质为水，冷却介质压力大于0.65Mpa，冷却介质流量为3M³/分钟，冷却介质温度＜20℃，粉碎室温度＜50℃，主轴转速为970/分钟，摩擦棒为500根。
确定破壁粉碎过程中的加料量与时间：取灵芝孢子进行破壁粉碎，根据破壁粉碎设备的特性，在主轴转速、摩擦棒、冷却介质、时间(1h)各项参数固定的情况下，选择1～3kg不同加料量进行试验，考察指标为得粉率和破壁率。结果：加料量对得粉率影响不大；破壁率与加料量成反比，考虑到生产成本和效率，加料量2kg为宜(见表1)。加料确定为2kg后，又对破壁粉碎时间进行选择(见表2)，经三批验证均能符合试验结果(见表3)。
表1.灵芝孢子破壁加料量试验数据表

表2.灵芝孢子破壁时间试验数据表

表3.三批灵芝孢子破壁验证试验数据表

因此，采用贝利细胞破壁微粉机进行破壁粉碎时，灵芝孢子的装量为2kg，每次破壁粉碎时间为1.5h。破壁后的芝孢子粉经扫描电镜检测，粒径≤5μm，破壁率≥95％，正态分布测定为90％≤5μm。
c：将步骤b所得破壁粉碎后的灵芝孢子制粒并干燥，获得干燥的灵芝孢子颗粒。
(1)制粒
软材加水量的考察：为了制粒方便，需要先将破壁粉碎后的灵芝孢子制成软材，考虑到破壁后的灵芝孢子表面能比较大，湿润剂选用水(蒸馏水)即可。用目测对加水量进行了考察，实验结果显示破壁粉碎后的灵芝孢子与水的重量比为1∶0.25制成的软材比较适宜(表4)。
表4.软材加水量的考察数据表

制粒筛目的选择：由于制粒的目的主要是为了防止在超临界萃取时灵芝孢子被萃取剂带走，只要成颗粒，对筛目的大小并不重要，因此我们在筛目选择时，用目测重点考察颗粒的成型率，控制细粉的比例，10目筛(不锈钢)颗粒成型率高，结果见表5。
表5.筛目的考察数据表

因此，优选制粒的方法如下：取破壁粉碎后灵芝孢子加入其25％重量的蒸馏水，混合均匀，制成软材，将该软材置于制粒机中，用10目不锈钢筛制粒，获得灵芝孢子颗粒。
(2)干燥
干燥温度的确定：考察干燥温度主要是看干燥速率和控制颗粒的水分，从生产成本及保证灵芝孢子的有效成分的活性角度，确定干燥的温度≤60℃，干燥4小时，水分≤5％。结果见表6。
表6.干燥温度的考察数据表

d：将步骤c所述干燥的灵芝孢子颗粒与步骤a所得的白术混合，经过粗混合油提取、杂质及水分去除步骤后，获得灵芝孢子白术混合油。
(1)取干燥的灵芝孢子颗粒与步骤a所得的白术混合。
(2)CO₂超临界萃取法提取粗灵芝孢子白术混合油(粗混合油)。
工艺条件正交试验：CO₂超临界流体萃取技术是一项较新的提取和分离技术，利用萃取剂在超临界状态的下特有的性质达到提取和分离的目的，具有无化学溶剂残留、避免萃取物在高温下裂解和保证生理活性物质的活性等优点。用CO₂超临界萃取工艺提取粗灵芝孢子白术混合油时，主要因素有萃取物的粒度、萃取压力、萃取温度、萃取时间、CO₂流量等因素，在预试的基础之上，以干燥的灵芝孢子颗粒1000g，粒度(10目)固定的情况下，我们对影响萃取效率的主要因素：萃取压力、萃取温度、萃取时间、CO₂流量采用L₉(3)⁴正交试验设计，以粗灵芝孢子白术混合油得率为指标，进行提取工艺条件的试验，结果见表7-8、表9-1和表9-2。
表7.提取工艺的因素水平表

表9-1以灵芝孢子白术混合油量为指标的正交安排表

注：表中提供了9个试验方案。如第6号试验是A₂B₃C₁D₂，即萃取压力22MPa，萃取温度60℃萃取时间3h，CO₂流量0.5m³/h，依此类推。
表9-2正交试验数据分析结果


以粗灵芝孢子白术混合油量为指标，极差分析结果A＞B＞C＞D即影响因素排列顺序为：萃取压力＞萃取温度＞萃取时间＞CO₂流量，各因素与水平之间的最佳组合为A₃B₃C₃D₃。以D项作为误差项，进一步进行方差分析，结果见表8。
表8.以灵芝孢子白术混合油量为指标的方差分析表

查F检验临界值结果F_0.05(2，2)＝19.00，各因素P＞0.05对实验结果的影响均不显著。
C0₂超临界萃取工艺验证试验：为了验证上述结果，选用A₃B₃C₃D₃条件进行提取试验，看看是否选定条件与原来的试验结果一致，进行验证试验，结果见表10。
表10.提取验证试验结果

因此，验证试验中粗灵芝孢子白术混合油得率与正交结果相符，因此以A₃B₃C₃D₃即萃取压力26MPa，萃取温度60℃，萃取时间5h，CO₂流量0.6m³/h确定为最佳萃取工艺条件。
(3)将获得的粗灵芝孢子白术混合油进行板框压滤或高速离心，去除其中的杂质，水分，得透亮且金黄色灵芝孢子白术混合油，即为所述的中药制剂。
该灵芝孢子白术混合油可以直接灌瓶，供病人口服。
实施例2说明含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂——软胶囊剂的制备方法
按照实施例1的方法获得灵芝孢子白术混合油，以明胶、甘油和水为原料制备软胶囊囊壳，经软胶囊灌装机制成软胶囊剂。
实施例3含灵芝孢子油的抗肿瘤中药制剂-片剂的制备方法
灵芝孢子白术混合油的包合物(简称为包合物)：包合剂-β-环糊精，被包合剂-按照实施例1的方法获得的灵芝孢子白术混合油。其制备方法如下：
(1)实验仪器与试剂
TM-40胶体磨，天津市鑫普机械制造有限公司；UV-2102PC型紫外分光光度计，优尼柯(上海)仪器有限公司；DZF-1B型真空干燥箱，上海跃进医疗器械厂；CQX25-06型超声波清洗器，上海必能信超声有限公司；磁力搅拌器，上海司乐仪器厂；HH-S数显恒温水浴锅，常州市国立试验设备研究所；AB104-N型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。β-环糊精，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20060731；其它试剂均为分析纯。
(2)包合方法的选择
以包合物收率、包合物含油率、油利用率为指标，在相同的物料比例下对饱和水溶液法、超声法、研磨法进行比较。
饱和水溶液法：取β-环糊精16g，在60℃下配成饱和溶液，在恒温条件下，缓缓加入灵芝孢子白术混合油2mL，搅拌一定时间，4℃下存放24h，抽滤，以少量水及乙醇洗涤3次，40℃真空干燥，即得β-环糊精包合物。
超声法：取β-环糊精16g，加入3倍量水，混合均匀，缓缓加入灵芝孢子白术混合油2mL，超声一定时间，其余同上。(f＝40KHz)
研磨法：取β-环糊精16g，加入3倍量水，混合均匀，倒入研钵中，缓缓加入灵芝孢子白术混合油2mL，碾磨一定时间，其余同上。
根据实验结果(表11)，优选研磨法对灵芝孢子白术混合油进行β-环糊精包合。
表11 3种不同包合方法的结果比较

(3)研磨法包合条件的选择
正交试验设计：通过文献资料和预实验考察可知，研磨法包合的主要因素有：灵芝孢子白术混合油与β-环糊精的物料比例(A)、加水量(B)、包合时间(C)、醇用量(D)等四个因素，因此采用L₉(3⁴)正交设计表，以包合物收率、包合物油利用率、包合物含油率为评价指标，并采用综合评分法，包合物收率、包合物油利用率、包合物含油率三者权重系数分别为0.2、0.4、0.4，分析优选最佳工艺条件(因素水平划分见表12，正交实验安排及结果见表13-1和表13-2)。
表12因素水平表

表13-1灵芝孢子白术混合油β-环糊精包合正交试验表