一种具有免疫抑制功能的寡核苷酸 技术领域:
本发明涉及一种对因细菌或病毒成分引起的异常增强的免疫反应具有抑制功能的寡核苷酸及其在预防和治疗与该种异常增强的免疫反应相关疾病中作为药物的用途。
背景技术:
David S.Pisetsky在1994年首先发现S-oligo(dG)20能抑制刀豆蛋白A(ConA)、大肠杆菌DNA、佛波酯(PMA)、钙离子载体A23187诱导的小鼠脾细胞产生IFN-γ。1998年,Arthur M.Krieg研究发现,腺病毒的一个DNA基序可以抑制CpG ODN引起的免疫激活。随后David S.Pisetsky在2000年研究发现小牛胸腺DNA和人胎盘DNA抑制大肠杆菌DNA诱导的小鼠脾细胞分泌IL-12,同时发现(dG)30、(dA)30、(dC)30、(dT)30可抑制大肠杆菌DNA、脂多糖(LPS)和CpG ODN诱导的IL-12产生。2003年,Dennis M.Klinman实验发现,哺乳动物端粒重复序列可抑制细菌DNA和CpG ODN诱导的免疫激活,这是首次在哺乳动物DNA中找到具有免疫抑制功能的序列。
Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是一个识别微生物(细菌或病毒成分)来源的病原体相关模型分子(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)的受体家族,表达TLRs的免疫细胞通过结合PAMP而被激活。近年的研究表明,TLRs的激活和败血症、扩张性心肌病、糖尿病系统性红斑狼疮、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎、动脉粥样硬化、哮喘、慢性阻碍性肺疾病和器官衰竭的发生有关(The WritingCommittee of the World Health Organization(WHO)Consultation on Human Influenza A/H5.Avian Influenza A(H5N1)Infection in Humans.N Engl J Med 2005;353:1374-85)。其他因素引起的免疫系统激活、细胞因子风暴等也给机体带来伤害性反应。
有文章报道,树突状细胞摄取凋亡细胞碎片及核酸可以激活TLRs,由此引发的IFN-α/β大量分泌将会导致系统性自身免疫性疾病,同时B细胞也可以通过TLR被激活而增殖,可能也会加剧上述疾病过程。
细菌毒素激活单核-巨噬细胞系统,进而引起的全身一系列炎症反应过程,造成脓毒症的临床表现。最新的研究资料表明,TLR9和脓毒血症密切相关,抑制TLR9的激活,可以减轻脓毒血症的致命性(PlitasG,et al.Toll-like receptor 9 inhibition reduces mortality in polymicrobial sepsis.J Exp Med.2008 Jun9;205(6):1277-83)。
现有研究发现,TLR9和系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)关系密切。活动期的SLE患者外周血B细胞TLR9的表达水平和SLE活动指数及血清总补体溶血活性具有显著意义的正相关,提示可以通过抑制TLR9的活性来治疗SLE(Nakano S,et al.Role of pathogenic auto-antibody production byToll-like receptor 9 of B cells in active systemic lupus erythematosus.Rheumatology(Oxford).2008 Feb;47(2):145-9)。
TLR9和糖尿病亦有密切关系,TLR9信号通路和自身免疫性糖尿病相关,TLR9拮抗剂(如氯喹)可以降低动物模型中糖尿病的发病率(Danny zipris,et al.TLR9-Signaling Pathways Are Involved in Kilham RatVirus-Induced Autoimmune Diabetes in the Biobreeding Diabetes-Resistant Rat.The Journal of Immunology,2007,178:693-701)。
其他因素引起的免疫系统激活、细胞因子风暴等也给机体带来伤害性反应,
发明内容:
目的:发明一种对因细菌或病毒成分引起的异常增强的免疫反应或Toll样受体(Toll like Receptor,TLR)异常激活具有抑制功能的寡核苷酸,从而达到治疗由细菌或病毒成分引起的异常增强的免疫反应或Toll样受体(Toll like Receptor,TLR)异常激活导致的疾病的目的。
技术方案及效果:
1、人工合成的一种寡核苷酸,其寡核苷酸序列上的特征是含有一个或多个如下所述的基本序列:5′-ACCCCCTCT-3’,包括但不限于SEQ NO.1或SEQ NO.2或SEQ NO.3序列所示的寡核苷酸,以上所述的寡核苷酸可被化学修饰,化学修饰的部位可以是磷酸骨架、核糖、碱基,修饰方式包括但不限于硫代修饰。
2、上述寡核苷酸用于制备用于治疗由细菌或病毒成分引起个体异常增强的免疫反应导致的疾病的制剂的用途
(1)CpG二核苷酸是细菌基因组特征性组成成分,本发明提供的寡核苷酸可以抑制由含有CpG二核苷酸的寡核苷酸CpG 2216引起的小鼠脾细胞抗病毒物质的产生;抑制含有CpG二核苷酸的寡核苷酸CpG2006、CpG 684、CpG C274引起的小鼠脾细胞增殖。
(2)本发明提供的寡核苷酸可以抑制灭活病毒HSV-1(单纯疱疹病毒)或灭活病毒PR8、FM1-Flu(两个流感病毒)引起的人外周血单个核细胞抗病毒物质的产生。
3、上述寡核苷酸用于制备用于预防或治疗个体中和Toll样受体(Toll like Receptor,TLR)异常激活相关地疾病的制剂的用途
(1)CpG 2216是TOLL样受体激动剂,可激活TOLL样受体9(Krug A,et al.,2001),进而引起人外周血单个核细胞产生抗病毒物质。本发明提供的寡核苷酸可以抑制A型CpG ODN(CpG 2216)引起的人外周血单个核细胞抗病毒物质的产生,且抑制作用随该寡核苷酸浓度的增加而增强。因此,本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体9激动剂CpG 2216对TOLL样受体9的激活作用。
(2)CpG 2006为TOLL样受体激动剂,可激活TOLL样受体9(Hartmann G,et al.,2000),进而引起人外周血单个核细胞增殖。本发明提供的寡核苷酸可以抑制B型CpG ODN(CpG 2006)引起的人外周血单个核细胞增殖,且抑制作用随该寡核苷酸浓度的增加而增强。因此,本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体9激动剂CpG 2006对TOLL样受体9的激活作用。
(3)CpG 684为TOLL样受体激动剂,可激活TOLL样受体9(Wang X,Bao M,et al.,2008),进而引起人外周血单个核细胞增殖。本发明提供的寡核苷酸可以抑制B型CpG ODN(CpG 684)引起的人外周血单个核细胞增殖,且抑制作用随该寡核苷酸浓度的增加而增强。因此,本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体9激动剂CpG 684对TOLL样受体9的激活作用。
(4)CpG C274是TOLL样受体激动剂,可激活TOLL样受体9(Marshall JD,et al.,2003),进而引起人外周血单个核细胞增殖。本发明提供的寡核苷酸可以抑制C型CpG ODN(CpG C274)引起的人外周血单个核细胞增殖,且抑制作用随该寡核苷酸浓度的增加而增强。因此,本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体9激动剂CpG C274对TOLL样受体9的激活作用。
(5)灭活病毒HSV-1是TOLL样受体激动剂,可激活TOLL样受体9(Barrat FJ,et al.,2005),进而引起人外周血单个核细胞产生抗病毒物质。本发明提供的寡核苷酸可以抑制灭活病毒HSV-1引起的人外周血单个核细胞抗病毒物质的产生。因此,本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体9激动剂灭活病毒HSV-1对TOLL样受体9的激活作用。
(6)灭活流感病毒PR8是TOLL样受体激动剂,可激活TOLL样受体7(Barrat FJ,et al.,2005),进而引起人外周血单个核细胞产生抗病毒物质。本发明提供的寡核苷酸可以抑制灭活病毒PR8引起的人外周血单个核细胞抗病毒物质的产生。因此,本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体7激动剂灭活病毒PR8-Flu对TOLL样受体7的激活作用。
本发明中的术语:
“化学修饰”:与自然的DNA相比,本发明中的寡核苷酸可以有各种化学修饰,修饰的部位可发生在核苷之间的磷酸二酯键,核糖单位或/和有机碱基(A、T、C、G)。在寡核苷酸的合成期间或合成后都可以进行修饰。在合成期间的化学修饰可以在寡核苷酸的内部或5`端进行修饰。合成后的寡核苷酸可以但不限于在活性基团(如5`或3`端的磷酸或羟基)进行化学修饰。和相同序列的自然形态的寡核苷酸相比,本发明中的寡核苷酸的化学修饰可以位于局部的磷酸二酯键或/和局部的核糖单位或/和局部的核苷碱基。本发明中的化学修饰包括寡核苷酸的骨架修饰。在这里,寡核苷酸的骨架修饰包括但不限于磷酸骨架修饰。磷酸骨架修饰可以是在核苷酸分子的一个稳定的磷酸骨架中,其中至少一个核苷酸间键合中的非桥性磷酸氧原子被硫原子取代。在本发明中的寡核苷酸中,核苷酸间键合中的非桥性磷酸氧原子可以部分或全部被硫原子取代。本发明中的寡核苷酸的骨架也可发生非离子DNA类似物,如烷基、芳香-碳磷酸盐化合物(带电荷的碳磷酸盐化合物氧原子被烷基、芳香基取代)修饰,再如磷酸二酯和烷基磷酸三酯中的氧原子部分被烷基化修饰。本发明的寡核苷酸可以是磷硫酰和磷酸二酯的嵌合体。在本发明的寡核苷酸中,化学修饰还包括碱基替代,如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代嘌呤替代。替代的嘌呤和嘧啶包括但不限于:腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、其它的自然的和非自然出现的碱基。在本发明的寡核苷酸中,化学修饰还包括碱基修饰。修饰的碱基在化学上不同于典型的自然中的碱基(如A、T、C、G。),但具有它们基本的化学结构。本发明中的寡核苷酸还可以用胞嘧啶衍生物或胸腺嘧啶核苷衍生物修饰。这里胞嘧啶衍生物是指胞嘧啶样核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧样核苷(不包括胸腺嘧啶)。另外,本发明中的寡核苷酸的修饰可以是在寡核苷酸的两个或一个末端连接连接一个二元醇,如四乙二醇或六乙二醇。
“微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病”:微生物入侵如果非常严重,有时可以在一个个体引起全身性炎症反应,导致微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病。如感染流感病毒A(H5N1)或SARS病毒的个体的血液中可出现高水平的下列物质:TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、化学因子干扰素诱导蛋白10、单核细胞趋化蛋白1、IL-8、IL-1-β。这种由于微生物感染而引起的血液中细胞因子水平显著升高,被称为细胞因子血症或细胞因子风暴。研究表明,感染禽流感病毒或SARS病毒的病人,除了需要抗病毒的药物外,还需要抑制免疫反应的药物。微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病可表现为脓毒病综合征(sepsis)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官衰竭(The Writing Committeeof the World Health Organization(WHO)Consultation on Human Influenza A/H5.Avian Influenza A(H5N1)Infection in Humans.N Engl J Med 2005;353:1374-85)。引起这类疾病的微生物包括病毒、细菌、寄生虫和真菌和海绵状脑病致病原。引起微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病的病毒包括:SARS病毒、流感病毒、禽流感病毒、HTV-1、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒属、埃可病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒、冠状病毒、疱疹性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、汉坦病毒、bunga病毒、静脉病毒、Nairo病毒、出血热病毒、呼肠病毒、orbiviurses、轮状病毒、乙肝病毒、细小病毒组、乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、类天花病毒、痘苗病毒、痘病毒、非洲猪霍乱病毒、海绵状脑病致病原、丁型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、口蹄疫病毒。引起微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病的细菌包括:幽门螺旋杆菌、Boreliaburgdorferi、嗜肺性军团病菌、分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、淋病双球菌、脑膜炎双球菌、单核细胞增多性李司忒(氏)菌、A组链球菌属、B组链球菌属、链球菌属、粪链球菌、牛链球菌、链球菌属(厌氧的链球菌)、肺炎链球菌、致病性Carnpylobacter链球菌、肠道球菌、流感(嗜血)杆菌、antracis杆菌、白喉棒状杆菌、棒状杆菌属、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜芽孢梭菌、破伤风杆菌、肠道细菌(属)aerogeytes、肺炎杆菌、Pasturellamultocida、类杆菌属、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、密螺旋体属、细弱密螺旋体、细螺旋体和放线菌属。引起微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病的真菌包括但不限于:隐球菌属新型细球菌、夹膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白色念珠菌。引起微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病的真菌包括但不限于恶性疟原虫、鼠弓形体。
“TOLL样受体激动剂”:CpG ODN是Toll样受体(Toll like receptors)9的激动剂。Toll样受体是一个识别微生物来源分子结构(病原体相关分子模型)的受体家族。表达Toll样受体的免疫细胞通过结合这种病原体相关分子模型而被激活。在人类,Toll样受体家族共有11个成员。Toll样受体可以识别很多病原微生物来源的物质,这些物质都是TOLL样受体激动剂。如,TLR4可以识别细菌脂多糖(LPS);TLR2和TLR6的双体可以识别脂磷壁酸和双酰脂肽;TLR2和TLR1的双体可以识别三酰脂肽;TLR9可以识别合成的或来源于细菌和病毒含CpG寡核苷酸(CpG ODN);TLR5可以识别细菌鞭毛蛋白;TLR2和TLR6的双体还可以识别酵母多糖;TLR4可以识别呼吸道合胞病毒F蛋白;TLR3可以识别聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(poly IC),合成的或来源于病毒的双链RNA;TLR7和TLR8可以识别单链病毒RNA;TLR4可以识别原虫产物,如GPI锚定蛋白;TLR4还可以识别炎症组织的产物,如HSP60和纤维原片段(Foo Y.Liew,et al.Negative regulation of toll like receptor mediated immune responses Nature Reviews Immunology.Vol 5,June2005,446-458)。已经有研究证实,TLR9激动剂可以激活天然免疫反应和获得性免疫反应(Arthur M.Krieg.Therapeutic potential of Toll-like receptor 9activation.Nature Reviews Drug Discovery,Vol 5.June 2006,471-484)。在人类的免疫系统中,B细胞和浆细胞样树突细胞(pDCs)表达TLR9。含有CpG的寡核苷酸(CpGODN)是TLR9的激动剂(D.M.Klinman,Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides,428Nat.Rev.,Immunol.4(2004)249-258)。TLR9激动剂可以被胞吞到细胞间隙而激活TLR9。在浆细胞样树突状细胞中,TLR9激活可以启始一个快速的天然免疫反应,其特征是分泌大量的促炎因子如IL-6,肿瘤坏死因子-α(TNFα)、I型干扰素(IFN-a/β)和干扰素诱导的趋化因子。通过干扰素依赖和干扰素非依赖两条通路,此浆细胞样树突细胞可以继发激活天然免疫细胞如NK细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。通过TLR9的刺激,B细胞增强了对抗原刺激的敏感性,可以有效地分化成抗体分泌细胞。因此,TLR9的刺激有助于获得性免疫应答,特别是体液免疫应答。
“药物学上可接受的载体”:药物学上可接受的载体是指一种或多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质,此载体适合将本发明中的寡核苷酸应用于个体。该载体可以是有机的、无机的、天然的或合成的。该载体包括各种溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真菌剂、等渗的和延缓吸收的试剂、和其他的适合本发明中的寡核苷酸应用的载体。药物学上可接受的载体的选择决定于本发明中寡核苷酸应用方式。可注射用的载体包括水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖溶液、甘油等。对于固体混合物(如粉末、丸、片剂、胶囊形式)而言,常用的非毒性固体载体包括:具有药理学纯度的苷露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸镁等。另外,作为生物学上中性的载体,应用的药理学组分中可以含有非毒性的辅助物质,包括湿化或乳化剂、防腐剂、PH缓冲试剂,醋酸钠和单月桂酸酯等。
“治疗有效剂量”:本发明中的寡核苷酸每次应用到个体的剂量范围从1μg到100mg。为了达到理想的治疗效果,本领域技术熟练人员可以对应用的剂量作调整,如主治医师在可靠的医疗判断的基础上,做出的剂量调整,其剂量范围可以是前述范围的10倍到1000倍。
“药物组合物”:药物组合物指的是本发明中治疗有效剂量的寡核苷酸或其与药物学上可接受的载体组成的混合物。药物组合物分可以包含一个或多个本发明中的寡核苷酸。药物组合物可以但不限于是水溶液、盐溶液、颗粒、气溶胶、片剂、粉剂、糖衣片剂、胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬胶液、乳膏、滴剂和其它合适的物质。药物组合物的应用方式可以是:经肠外、经口、经直肠、经阴道、经腹膜内、经局部(粉剂、软膏剂、凝胶剂、滴剂、透辟贴剂)、含服或口腔和鼻腔喷雾等。在各种情况下,药物组合物必须是无菌和稳定的。本发明的注射剂药物组合物包括药学上可接受的水溶液、非水溶液、分散剂、悬浊剂、乳剂或粉剂,注射前用无菌的注射用水或分散剂溶解。本发明中的寡核苷酸可以用水相载体溶解,比如用pH 3.0到pH 8.0的等渗的缓冲液,pH值范围也可为pH 3.5-pH 7.4,pH 3.5-pH 6.0,pH 3.5-pH 5.0。缓冲液包括:柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液。口服的药物组合物可以和可食用的载体按配方制成粉剂、片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂或悬浊剂等。常规的非毒性固体载体作为固体组分可以是药物学级别的甘露醇、乳糖、淀粉和便脂酸镁等。口腔含化给药法的药学药学药物组合物可以是传统方式的片剂和锭剂。作为吸入法的药学药学药物组合物是喷雾剂,相关领域技术熟练人员可以选择使用压力囊、喷雾器或干粉。在一些情况下,为了延长本发明中寡核苷酸的作用效果,药物组合物可被处理于合适的持续释放系统后应用。发明中的寡核苷酸或药物组合物可以被处理成带有结晶的悬胶液或水分较少的非结晶物质,来稳定地延缓释放。注射用的本发明中寡核苷酸的延缓释放可以通过用疏水物质(如,可接受的油性载体)来溶解寡核苷酸来实现。用于注射形式的药物组合物,可以是脂质体包裹的寡核苷酸或乳粒,或可生物降解的半透性聚合物,如多乳酸化合物、多正酯类或聚酐。
“活性物质”:活性物质包括非类固醇类的抗炎试剂、类固醇、非特异性免疫抑制剂、生物反应调节剂、化合物、小分子、核酸分子、TLR拮抗剂等。活性物质还指通过如下方式抑制免疫活性的试剂:拮抗趋化因子,诱导产生调节T细胞(CD4+CD25+T细胞),抑制补体系统,抑制基质金属蛋白酶,抑制NO合成酶,阻断协同刺激分子,抑制免疫细胞的信号转导。非类固醇类的抗炎试剂的包括但不限于:双氯芬酸、双氟尼酸、乙哚乙酸、氟吡洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、痛力克、萘普酮、甲氧萘丙酸、吡罗昔康、舒林酸、tohnetin、塞来考昔、罗非考昔。类固醇包括但不限于肾上腺皮质素、地塞米松、氢化可的松、甲基氢化泼尼松、去氢氢化可的松、泼尼松和氢羟强的松龙。非特异性免疫抑制剂是指用来抑制免疫介导的疾病的试剂,包括但不限于:环磷酰胺、环孢霉素A、氨甲喋呤、类固醇、FK506、他克莫司、霉酚酸和西罗莫司。生物反应调节剂包括:重组IL-1受体拮抗剂(Kineret or anakima)、可溶性p75、TNF-a受体gG1融合蛋白(etanercept or Enbrel)、抗TNF-a单克隆抗体(infliximab or RemicadeX),还包括干扰素β-1a、白细胞介素-10和TGFβ。
“递送载体”:本发明中的寡核苷酸可以用递送载体递送应用。递送载体包括但不限于:类固醇(如胆固醇)、络和物、乳化物、免疫刺激复合物(ISCOMs)、脂质(如阳离子脂质和阴离子脂质)、脂质体、活的细菌载体(如沙门氏菌、大肠杆菌、分枝杆菌志贺(氏)杆菌、乳酸杆菌)和活的病毒载体(如牛痘苗、腺病毒、单纯疱疹病毒)、病毒小体、病毒样颗粒、微球、核酸疫苗、高分子材料(如羧甲基纤维素、脱乙酰壳多糖)、环状多聚物。递送载体也可以通过特异性受体识别靶细胞的靶向性配体分子。
附图说明:
图1:寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01抑制人外周血单个核细胞(PBMC)在CpG 2216刺激下抗病毒物质的产生。
相同浓度(16μg/ml)的寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01或对照寡核苷酸ms19(16μg/ml)与CpG 2216(2μg/ml)共同作用于人外周血单个核细胞48小时,收取培养上清,观察此上清保护Vero E6抵抗10×TCID50VSV病毒攻击的作用。
图中横坐标表示培养液及各种寡核苷酸作用下人PBMC培养上清,纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01均可以抑制在CpG 2216刺激下人外周血单个核细胞抗病毒物质的产生,使Vero细胞在VSV病毒攻击下死亡数量增多。图2:寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG 684刺激下的增殖。
相同浓度(8μg/ml)的寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01或对照寡核苷酸ms19(8μg/ml)与CpG 684(1μg/ml)共同作用于人外周血单个核细胞48小时,掺入[3H]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。
图中横坐标表示作用于人PBMC的寡核苷酸种类,纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数),用cpm±SD表示各寡核苷酸作用下细胞的增殖情况。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01可以抑制在CpG 684刺激下人外周血单个核细胞的增殖。
图3:不同浓度的寡核苷酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG 2216刺激下抗病毒物质的产生。
不同浓度(16、8、4、2、1、0μg/ml)的寡核苷酸mt01与CpG 2216(2μg/ml)共同作用于人外周血单个核细胞48小时,收取培养上清,观察此上清保护Vero E6抵抗10×TCID50VSV病毒攻击的作用。
图中横坐标表示培养液及不同浓度寡核苷酸mt01作用下人PBMC培养上清,纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。寡核苷酸mt01可以抑制在CpG 2216刺激下人外周血单个核细胞抗病毒物质的产生,且抑制作用随mt01浓度的增加而增强。
图4:mt01抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒HSV-1刺激下抗病毒物质的产生。
寡核苷酸mt01(8μg/ml)或对照寡核苷酸ms19(8μg/ml)与灭活病毒HSV-1共同作用于人外周血单个核细胞48小时,收取培养上清,观察此上清保护Vero E6抵抗10×TCID50VSV病毒攻击的作用。
图中横坐标表示培养液及两种寡核苷酸作用下人PBMC培养上清,纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01可以抑制灭活病毒HSV-1刺激下人外周血单个核细胞抗病毒活性。
图5:mt01抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒PR8-Flu刺激下抗病毒物质的产生。
寡核苷酸mt01(8μg/ml)或对照寡核苷酸ms19(8μg/ml)与灭活病毒PR8-Flu共同作用于人外周血单个核细胞48小时,收取培养上清,观察此上清保护Vero E6抵抗10×TCID50VSV病毒攻击的作用。
图中横坐标表示培养液及两种寡核苷酸作用下人PBMC培养上清,纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01可以抑制灭活病毒PR8-Flu刺激下人外周血单个核细胞抗病毒活性。
图6:mt01抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒FM1刺激下抗病毒物质的产生。
寡核苷酸mt01(8μg/ml)或对照寡核苷酸ms19(8μg/ml)与灭活病毒FM1共同作用于人外周血单个核细胞48小时,收取培养上清,观察此上清保护Vero E6抵抗10×TCID50VSV病毒攻击的作用。
图中横坐标表示培养液及两种寡核苷酸作用下人PBMC培养上清,纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01可以抑制灭活病毒FM1刺激下人外周血单个核细胞抗病毒活性。
图7:寡核苷酸mt01抑制小鼠脾细胞在CpG 2216刺激下抗病毒物质的产生。
寡核苷酸mt01(8μg/ml)或对照寡核苷酸ms19(8μg/ml)与CpG 684(1μg/ml)共同作用于小鼠脾细胞48小时,收取培养上清,观察此上清保护L929细胞抵抗10×TCID 50 VSV病毒攻击的作用。
图中横坐标表示培养液及CpG 2216作用下人PBMC培养上清,纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01可以抑制在CpG 2216刺激下小鼠脾细胞抗病毒物质的产生。
图8:不同浓度的寡核苷酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG 2006刺激下的增殖。
不同浓度(64、32、16、8、4、2、1、0μg/ml)的寡核苷酸mt01或对照寡核苷酸与CpG 2006(1μg/ml)共同作用于人外周血单个核细胞48小时,掺入[3H]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。
图中横坐标表示作用于人PBMC的不同浓度的寡核苷酸mt01,纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数),用cpm±SD表示寡核苷酸mt01作用下细胞的增殖情况。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01可以抑制在CpG 2006刺激下人外周血单个核细胞的增殖,且抑制作用随mt01浓度的增加而增强。
图9:不同浓度的寡核苷酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG C274刺激下的增殖。
不同浓度(64、32、16、8、4、2、1、0μg/ml)的寡核苷酸mt01或对照寡核苷酸ms19与CpG C274(1μg/ml)共同作用于人外周血单个核细胞48小时,掺入[3H]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。
图中横坐标表示作用于人PBMC的不同浓度的寡核苷酸mt01,纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数),用cpm±SD表示寡核苷酸mt01作用下细胞的增殖情况。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01可以抑制在CpG C274刺激下人外周血单个核细胞的增殖,且抑制作用随mt01浓度的增加而增强。
图10:不同浓度的寡核苷酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG 684刺激下的增殖。
不同浓度(64、32、16、8、4、2、1、0μg/ml)的寡核苷酸mt01或对照寡核苷酸ms19与CpG 684(1μg/ml)共同作用于人外周血单个核细胞48小时,掺入[3H]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。
图中横坐标表示作用于人PBMC的不同浓度的寡核苷酸mt01,纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数),用cpm±SD表示寡核苷酸mt01作用下细胞的增殖情况。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01可以抑制在CpG 684刺激下人外周血单个核细胞的增殖,且抑制作用随mt01浓度的增加而增强。
图11:寡核苷酸mt01抑制小鼠脾细胞在CpG 2006、CpG C274或CpG 684刺激下的增殖。
寡核苷酸mt01(8μg/ml)或对照寡核苷酸(8μg/ml)与CpG 2006(1μg/ml)、CpG C274(1μg/ml)或CpG 684(1μg/ml)共同作用于小鼠脾细胞48小时,掺入[3H]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。
图中横坐标表示作用于人PBMC的不同CpG ODN,纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数),用cpm±SD表示寡核苷酸mt01作用下细胞的增殖情况。与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01可以抑制在CpG2006、CpG C274或CpG 684刺激下小鼠脾细胞的增殖。
图12:寡核苷酸mt01与其突变序列mt01c、mt01d、mt01f抑制人外周血单个核细胞在CpG 2216刺激下抗病毒物质的产生。
相同浓度(8μg/ml)mt01、mt01c、mt01d、mt01f或对照寡核苷酸(8μg/ml)与CpG 2216(2μg/ml)共同作用于人外周血单个核细胞48小时,收取培养上清,观察此上清保护Vero E6抵抗10×TCID 50 VSV病毒攻击的作用。
图中横坐标表示培养液及各种寡核苷酸作用下人PBMC培养上清,纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。寡核苷酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f均能抑制人外周血单个核细胞在CpG 2216刺激下抗病毒物质的产生。
图13:寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b、mt01c、mt01d、mt01e、mt01f抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒FM1刺激下抗病毒物质的产生。
相同浓度(8μg/ml)mt01、mt01c、mt01d、mt01f或对照ODN与灭活病毒FM1共同作用于人外周血单个核细胞48小时,收取培养上清,观察此上清保护Vero E6抵抗10×TCID 50 VSV病毒攻击的作用。
图中横坐标表示培养液及各种寡核苷酸作用下人PBMC培养上清,纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。寡核苷酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f均能抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒FM1刺激下抗病毒物质的产生。
具体的实施方式:
表1实验中所用寡核苷酸序列(由大连宝生物工程有限公司合成,硫代修饰)
名称 序列 mt01 5′-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3’ mt01a 5′-ACCCCCTCT-3’ mt01b 5′-ACCCCCTCTACCCCCTCT-3’ mt01c 5′-ACCCCCACAACCCCCACAACCCCCACA-3’ mt01d 5′-AAAACCTCTAAAACCTCTAAAACCTCT-3’ mt01f 5′-CCCCCCTCTCCCCCCTCTCCCCCCTCT-3’ ms19 5′-GGGAGGGAGGGAGGGAGGGAGGGA-3’ CpG 2216 5′-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’ CpG 2006 5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’ CpG C274 5′-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’ CpG 684 5′-TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC-3’
实施例1含不同基序(ACCCCCTCT)个数的寡核苷酸对CpG ODN刺激的人外周血单个核细胞产生抗病毒活性的抑制作用的比较
材料:96孔细胞培养板(Costar公司),Ficoll试剂(TBD公司)、热灭活的胎牛血清(Hyclone)、IMDM培养液(美国Gibco)、青霉素(华北制药股份有限公司)、链霉素(大连美罗大药厂)、台酚兰、结晶紫、结晶紫脱色液、人外周血浓缩白细胞(吉林省血液中心)、Vero E6细胞(非洲绿猴肾细胞系,美国Type CultureCollection)、寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b、ms19、CpG 2216序列见表1。
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离人外周血单个核细胞。台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
Vero E6细胞用含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)的IMDM培养液在37℃、5%CO2的细胞孵箱内培养。采用Vero E6细胞病变法检测经处理的人外周血单个核细胞培养上清的抗病毒活性。方法介绍如下:人外周血单个核细胞以5×105个/孔的密度接种到U型底96孔板,在存在相同浓度(16μg/ml)的3种寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b或对照寡核苷酸ms19的情况下,将人外周血单个核细胞与CpG 2216(2μg/ml)共同培养48小时,收集上清。将Vero E6细胞(2×104/孔)接种到平底96孔板,培养12小时后加入100μl上述收集的上清培养18小时,再加入10×TCID50(TCID50,半数组织感染剂量)的VSV病毒继续培养48小时。培养结束后,用0.5%的结晶紫37℃染色15分钟,弃结晶紫染色液,流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液,拍干平板,每孔加入结晶紫脱色液100μ1,摇床上脱色1h,用酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔,结果经统计学检测。
如图1所示,与对照组相比,寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b可以抑制由CpG 2216刺激下的人外周血单个核细胞产生抗病毒物质,从而降低了CpG 2216刺激的人外周血单个核细胞培养上清对VSV病毒攻击的Vero E6细胞的保护作用(p<0.01)。
结论:寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细菌基因组免疫刺激序列CpG 2216刺激下的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)分泌免疫活性物质(包括抗病毒物质如IFN等)。
实施例2含不同基序(ACCCCCTCT)个数的寡核苷酸对CpG ODN诱导人外周血单个核细胞(PBMCs)增殖的抑制作用的比较
材料:3H-胸腺嘧啶(New England Nuclear,Boston,MA),其余材料同实施例1中材料。
用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离人外周血单个核细胞。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
用3H-胸腺嘧啶掺入法检测人外周血单个核细胞的增殖情况。方法介绍如下:人外周血单个核细胞以5×105/孔的密度接种到U型底96孔板,在存在相同浓度(16μg/ml)的3条寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b或对照寡核苷酸ms19的情况下,将人外周血单个核细胞与CpG 684(1μg/ml)共孵育48小时,之后加入3H-胸腺嘧啶(0.5μCi/孔)培养16小时。在玻璃纤维滤器上收获细胞,用闪烁计数器检测结果。每组均设3复孔,结果经统计学检测。。
如图1所示,与对照组相比,寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b可以抑制由CpG 2006刺激下的人外周血单个核细胞增生,从而降低了CpG 2006刺激的人外周血单个核细胞的增生作用(p<0.01)。
结论:寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细菌基因组免疫刺激序列CpG 2006刺激下的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)增殖。
实施例3不同浓度的寡核苷酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG 2216刺激下抗病毒物质的产生
材料:同实施例1中材料。
用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离单个核细胞。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
Vero E6细胞用含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)的IMDM培养液在37℃、5%CO2的细胞孵箱内培养。采用Vero E6细胞病变法检测经处理人外周血单个核细胞培养上清的抗病毒活性。
方法介绍如下:在存在不同浓度mt01(16、8、4、2、1、0.5、0μg/ml)的情况下,将人外周血单个核细胞与CpG2216(2μg/ml)共同培养48小时,收集上清。将Vero E6cells(2×104/孔)接种到平底型96孔板,培养12小时后加入100μl上述收集的上清继续培养18小时,再加入10×TCID50(TCID50,半数组织感染剂量)的VSV病毒培养48小时。培养结束后,用0.5%的结晶紫37℃染色15分钟,弃结晶紫染色液,流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液,拍干平板,每孔加入结晶紫脱色液100μl,摇床上脱色1h,用酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔,结果经统计学检测。
如图3所示,与对照组相比,mt01对由CpG 2216刺激下的人外周血单个核细胞抗病毒作用的抑制能力随浓度的加大而增强(p<0.01)。
寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细菌基因组免疫刺激序列CpG 2216刺激下的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)分泌免疫活性物质(包括抗病毒物质如IFN等),抑制能力随寡核苷酸mt01浓度的加大而增强。
实施例4mt01抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒HSV-1、灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FM1刺激下抗病毒物质的产生。
材料:HSV病毒(单纯疱疹病毒,本室自行保存)、PR8-Flu(流感病毒PR8毒株,本室自行保存)、FM1(流感病毒亚甲型鼠肺适应株,本室自行保存),其余实验材料同实施例1中材料。
用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离单个核细胞。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
Vero细胞培养扩增HSV-1,鸡胚扩增PR8-Flu,鸡胚扩增FM1。分别测定50%组织细胞感染量(TCID50)。70℃水浴10min灭活HSV-1,56℃水浴30min灭活PR8-Flu,56℃水浴30min灭活FM1。将处理后的HSV-1、PR8-Flu、FM1分别加入Vero细胞培养体系中,稳定传代3次,未见细胞被病毒感染,即判定病毒完全灭活。
Vero E6细胞用含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和l00IU/ml链霉素)的IMDM培养液在37℃、5%CO2的细胞孵箱内培养。采用Vero E6细胞病变法检测经前述三种灭活病毒处理的人外周血单个核细胞培养上清的抗病毒活性。
方法介绍如下:在存在mt01(8μg/ml)或对照寡核苷酸ms19的情况下,将人外周血单个核细胞与灭活病毒HSV-1、灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FM1分别培养48小时,收集上清。将Vero E6 cells(2×104/孔)接种到平底型96孔板,培养12小时,加入100μl上述收集的上清继续培养18小时,再加入10×TCID50(TCID50,半数组织感染剂量)的VSV病毒培养48小时。培养结束后,用0.5%的结晶紫37℃染色15分钟,弃结晶紫染色液,流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液,拍干平板,每孔加入结晶紫脱色液100μl,摇床上脱色1h,用酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔,结果经统计学检测。
如图4、图5、图6所示,与对照组相比,mt01可以抑制由灭活病毒HSV-1、灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FM1刺激下的人外周血单个核细胞产生抗病毒物质,从而降低了灭活病毒HSV-1、灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FM1刺激的人外周血单个核细胞培养上清对VSV病毒攻击的Vero E6细胞的保护作用(p<0.01)。
结论:寡核苷酸mt01可以抑制由病毒成分(灭活病毒HSV-1、灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FM1)刺激下的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)分泌免疫活性物质(包括抗病毒物质如IFN等),同时,由于灭活病毒HSV-1是Toll样受体9激动剂,灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FM1是Toll样受体7激动剂,所以寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体7、9介导的免疫激活。
实施例5寡核苷酸mt01抑制小鼠脾细胞在CpG 2216刺激下抗病毒物质的产生。
材料:L929细胞(小鼠成纤维细胞株,美国Type Culture Collection)、BALB/c鼠(吉林大学基础医学院动物室),其余材料同实施例1。
常规分离小鼠脾细胞。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
L929细胞用含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)的IMDM培养液在37℃、5%CO2的细胞孵箱内培养。采用L929细胞病变法检测经处理人外周血单个核细胞培养上清的抗病毒活性。
方法介绍如下:在存在mt01(16μg/ml)或对照寡核苷酸ms19的情况下,将小鼠脾细胞与CpG2216(2μg/ml)共同培养48小时,收集上清。将L929细胞(2×104/孔)接种到平底型96孔板,培养12小时,加入100μl上述收集的上清培养18小时,再加入10×TCID 50(TCID 50,半数组织感染剂量)的VSV病毒继续培养48小时。培养结束后,用0.5%的结晶紫37℃染色15分钟,弃结晶紫染色液,流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液,拍干平板,每孔加入结晶紫脱色液100μl,摇床上脱色1h,用酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔,结果经统计学检测。
如图7所示,mt01可以抑制由CpG 2216刺激下的小鼠脾细胞产生抗病毒物质,从而降低了CpG 2216刺激的小鼠脾细胞培养上清对VSV病毒攻击的Vero E6细胞的保护作用(p<0.01)。
结论:寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细菌基因组免疫刺激序列CpG 2216刺激下的小鼠免疫细胞(小鼠脾细胞)分泌免疫活性物质(包括抗病毒物质如IFN等)。
实施例6不同浓度的寡核苷酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG 2006、CpG C274或CpG 684刺激下的增殖。
材料:同实施例2。
用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离人外周血单个核细胞。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
用3H-胸腺嘧啶掺入法检测人外周血单个核细胞的增殖情况。方法介绍如下:人外周血单个核细胞以5×105/孔的密度接种到U型底96孔板,在存在mt01(8μg/ml)或对照寡核苷酸ms19的情况下,与CpG 2006(1μg/ml)、CpG C274(1μg/ml)或CpG 684(1μg/ml)共孵育48小时,之后加入3H-胸腺嘧啶(0.5μCi/孔)培养16小时。在玻璃纤维滤器上收获细胞,用闪烁计数器检测结果。每组均设3复孔,结果经统计学检测。
如图8、图9、图10所示,与对照组相比,寡核苷酸mt01可以抑制由CpG 2006、CpG C274或CpG 684刺激下的人外周血单个核细胞增殖(p<0.01)。
结论:寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细菌基因组免疫刺激序列CpG 2006、CpG C274或CpG 684刺激下的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)增殖。
实施例7寡核苷酸mt01抑制小鼠脾细胞在CpG 2006、CpG C274、CpG 684刺激下的增殖。
材料:L929细胞(小鼠成纤维细胞株,关国Type Culture Collection)、BALB/c鼠(吉林大学基础医学院动物室),其余材料同实施例2。
常规分离小鼠脾细胞。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
用3H-胸腺嘧啶掺入法检测人外周血单个核细胞的增殖情况。方法介绍如下:小鼠脾细胞以5×105/孔的密度接种到U型底96孔板,在存在mt01或对照寡核苷酸ms19的情况下,与CpG 2006(1μg/ml)、CpGC274(1μg/ml)、CpG 684(1μg/ml)或CpG 2395(1μg/ml)共孵育48小时,之后加入3H-胸腺嘧啶(0.5μCi/孔),培养16小时。在玻璃纤维滤器上收获细胞,用闪烁计数器检测结果。每组均设3复孔,结果经统计学检测。
如图11所示,与对照组相比,寡核苷酸mt01可以抑制由CpG 2006、CpG C274或CpG 684刺激下的小鼠脾细胞增殖(p<0.01)。
结论:寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细菌基因组免疫刺激序列CpG 2006、CpG C274或CpG 684刺激下的小鼠免疫细胞增殖(小鼠脾细胞)增殖。
实施例8寡核苷酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f抑制人外周血单个核细胞在CpG 2216刺激下抗病毒物质的产生。
材料:寡核苷酸mt01c、mt01d、mt01f序列见表1,其中,将mt01a序列中的两个碱基突变后串联重复3次而获得mt01c;将mt01a序列中的三个碱基突变后串联重复3次而获得mt01d;将mt01a序列中的一个碱基突变后串联重复3次而获得mt01f。其余材料同实施例1。
用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离单个核细胞。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
Vero E6细胞用含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)的IMDM培养液在37℃、5% CO2的细胞孵箱内培养。采用Vero E6细胞病变法检测经处理人外周血单个核细胞培养上清的抗病毒活性。方法介绍如下:在存在相同浓度(8μg/ml)的mt01、mt01c、mt01d、mt01f或对照寡核苷酸ms19的情况下,将人外周血单个核细胞与CpG2216(2μg/ml)共同培养48小时,收集上清。将Vero E6 cells(2×104/孔)接种到平底型96孔板,培养12小时后加入100μl上述收集的上清继续培养18小时,再加入10×TCID50(TCID50,半数组织感染剂量)的VSV病毒培养48小时。培养结束后,用0.5%的结晶紫37℃染色15分钟,弃结晶紫染色液,流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液,拍干平板,每孔加入结晶紫脱色液100μl,摇床上脱色1h,用酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔,结果经统计学检测。
如图12所示,与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f均可以抑制由CpG 2216刺激下的人外周血单个核细胞产生抗病毒物质,从而降低了CpG 2216刺激的人外周血单个核细胞培养上清对VSV病毒攻击的Vero E6细胞的保护作用(p<0.01)。
结论:将基本序列mt01a进行1-3个碱基序列突变,突变后的寡核苷酸仍然具有抑制人外周血单个核细胞在CpG 2216刺激下抗病毒物质产生的作用。
实施例9寡核苷酸mt01与其突变序列mt01c、mt01d、mt01f抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒FM1刺激下抗病毒物质的产生。
材料:同实施例4.
用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离单个核细胞。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。
鸡胚扩增FM1后测定50%组织细胞感染量(TCID50)。FM1。将56℃水浴30min灭活后的FM1加入Vero细胞培养体系中,稳定传代3次,未见细胞被病毒感染,即判定病毒完全灭活。
Vero E6细胞用含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)的IMDM培养液在37℃、5%CO2的细胞孵箱内培养。采用Vero E6细胞病变法检测经前述三种灭活病毒处理的人外周血单个核细胞培养上清的抗病毒活性。
方法介绍如下:在存在mt01(8μg/ml)或对照寡核苷酸ms19的情况下,将人外周血单个核细胞与灭活病毒FM1培养48小时,收集上清。将Vero E6 cells(2×104/孔)接种到平底型96孔板,培养12小时,加入100μl上述收集的上清继续培养18小时,再加入10×TCID 50的VSV病毒培养48小时。培养结束后,用0.5%的结晶紫37℃染色15分钟,弃结晶紫染色液,流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液,拍干平板,每孔加入结晶紫脱色液100μl,摇床上脱色1h,用酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔,结果经统计学检测。
如图13所示,与对照寡核苷酸ms19相比,寡核苷酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f均可以抑制由灭活病毒FM1刺激下的人外周血单个核细胞产生抗病毒物质,从而降低了灭活病毒FM1刺激的人外周血单个核细胞培养上清对VSV病毒攻击的Vero E6细胞的保护作用(p<0.01)。
结论:将基本序列mt01a进行1-3个碱基序列突变,突变后的寡核苷酸仍然具有抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒FM 1刺激下抗病毒物质产生的作用。
【序列表】
<110>长春华普生物技术有限公司
<120>一种具有免疫抑制功能的寡核苷酸
<160>3
<210>1
<211>9
<212>DNA
<213>人工合成的
<400>1
ACCCCCTCT 9
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成的
<400>2
ACCCCCTCTA CCCCCTCT 18
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成的
<400>3
ACCCCCTCTA CCCCCTCTAC CCCCTCT 27