KGF-2的聚乙二醇修饰物及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种蛋白药物，具体地说是角化细胞生长因子-2(Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)的聚乙二醇修饰物，本发明还涉及其制备方法。
背景技术
角化细胞生长因子(KGF-2)是成纤维细胞生长因子家族的第7个成员(Fibroblast Growth Factor-7，FGF-7)，它为来源于胚胎上皮细胞的一种碱性蛋白，由208个氨基酸残基组成，主要在间充质细胞合成，通过与上皮细胞细胞膜上的受体作用，特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移。KGF-2在新生或成年间质成纤维细胞系、成年人的肾、胃肠道脏器等均有表达。KGF-2的作用主要表现抗肝肺组织纤维化、促进创伤性组织损伤、慢性组织损伤(糖尿病患者的持续性损伤)以及静脉溃疡(包括肠胃的慢性溃疡)的修复和愈合等；研究表明，KGF-2的生物学功能包括：促进表皮细胞的增生；促进发育过程；促进组织修复和伤口愈合；抗辐射，且显示与癌症的发生有密切关系。
为了研究KGF-2在体外对肿瘤细胞增殖作用和体内对肿瘤细胞生长的促进作用，使用不同的生长率和表达不同水平KGFR的肿瘤细胞系为材料，通过Alamar Blue染色和H-胸腺嘧啶掺入检测方法来考查KGF-2对体外肿瘤细胞的增殖情况的影响。构建了植入KGFR(+)肿瘤细胞的裸鼠模型，采用静脉或腹膜注射KGF-2，来考察KGF-2对体内肿瘤细胞生长的影响。结果表明，在体外给予0.01-1000ng/mL的KGF-2后，30种人肿瘤细胞系都没有显示出明显的增殖。体内试验结果也显示在一次或多次静脉注射给子KGF-21mg/kg后，对移植有人KGFR(+)肿瘤细胞的裸鼠体内肿瘤的生长没有明显的促进作用。实验证明KGF-2在体内外对KGFR(+)人上皮样肿瘤没有明显地促增殖作用，因而对于进行肿瘤放化疗引起粘膜炎等的病人来说，使用KGF-2是安全可靠的。
KGF-2的广泛的生物学活性表明其在医疗上有广泛的应用前景。但长期以来KGF-2表达量低一直是制约其产业发展的关键问题，另外，长期的研究及临床实践表明KGF-2与其他蛋白药物一样，也存在稳定性差、体内半衰期短以及存在免疫原性等缺陷。目前，国内外对KGF-2进行研究开发的单位主要有：美国人类基因组公司开发的RepiTermin(Recombinant Human Keratinocyte Growth Factor-2，rhKGF-2或简写为rhk2)已进入II期临床试验，开展的项目有静脉溃疡、因癌症治疗诱发的粘膜炎和溃疡性大肠炎。已上市的同类药品有德国杨森.西拉格公司的becaplermin凝胶剂(含0.01％的KGF-2)，商品名Regranex，具促进糖尿病慢性溃疡愈合的作用，售价昂贵，每支售价达33美元。美国Amgen公司的静脉注射液KepivanceTM(palifermin，译名帕利非明)，用于治疗口腔黏膜炎。上海新生源医药集团为国内首家进行KGF-2新药申报的单位，其申报的冻干重组人角质细胞生长因子-2及重组人角质细胞生长因子-2流体膜获得临床批件。
蛋白化学修饰技术是近年来快速发展的新兴技术。蛋白质的化学修饰是指通过以某些物质如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、葡聚糖、肝素等作为修饰剂与蛋白质(多肽)的活性基团发生反应，从而达到改善蛋白质性质的目的，如：解除异体蛋白质免疫原性、毒副作用以及增加活性、提高稳定性、增大溶解度、增强物理和热稳定性、延长体内半衰期等。
然而目前还未见关于KGF-2聚乙二醇修饰物的相关报道。
【发明内容】
本发明的目的在于提供KGF-2的聚乙二醇修饰物(聚乙二醇-KGF-2)，用于克服KGF-2稳定性差，半衰期短等不足。
本发明聚乙二醇-KGF-2，其结构通式如下：
修饰结构通式为：
其中m为甲氧基，n可选2-10，优选n＝3或4，R为KGF-2。聚乙二醇的修饰位点是KGF-2的N末端。优选聚乙二醇为直链结构，分子量范围优选为5～80kD，更优选为20～30kD。优选采用野生型KGF-2，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明聚乙二醇-KGF-2，与未修饰的KGF-2相比，其热稳定性、抗各种蛋白酶水解能力、体内半衰期均显著提高。
本发明还提供一种制备上述聚乙二醇-KGF-2的方法，其是将KGF-2与聚乙二醇进行加成反应，具体地说包括步骤：
将KGF-2制成溶液，按照KGF-2∶PEG为1∶3～1∶12的摩尔比加入PEG化试剂，调节pH至6.0～7.0，反应2-24小时。反应可在0～37℃下进行。可用甘氨酸终止反应。反应结束后可通过凝胶过滤层析以及亲和层析进行纯化。
以下是优选的制备方法：
1)将KGF-2以5-50mM的醋酸钠缓冲液溶解，配制成浓度为0.1-1.0mg/ml的溶液；
2)按KGF-2∶PEG为1∶3-1∶12的摩尔比加入mPEG-丁醛，用冰乙酸调节pH到6.0-7.0，在0-37℃条件下反应2-24小时；
3)加入甘氨酸终止反应；
4)将步骤3所得的反应液过Sephedax G-25柱除盐，可采用5-50mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集含有角质细胞生长因子-2地聚乙二醇修饰物的洗脱液；
5)将步骤4所得的反应液上肝素-Sepharose CL-6B亲和层析柱(10cm×0.9cm)，5-50mM醋酸钠缓冲液+0.6M NaCl缓冲液及5-50mM醋酸钠缓冲液+1.2M NaCl缓冲液洗脱，收集含有角质细胞生长因子-2的聚乙二醇修饰物的洗脱液。
本发明采用聚乙二醇对角化细胞生长因子-2进行化学修饰，获得KGF-2的聚乙二醇修饰产物，修饰产物均一性好、分离纯化工艺简单、活性回收率高，同时，提高了稳定性、延长了体内半衰期、降低了免疫原性。
【附图说明】
图1是SDS-PAGE电泳法检测修饰产物的结果，其中M：低分子量蛋白质标准(由上至下116.0kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD)；A：mPEG-KGF-2；B：KGF-2。
图2是SDS-PAGE电泳法检测纯化后修饰产物的结果，其中M：低分子量蛋白质标准(116.0kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD)；I：KGF-2和mPEG-KGF-2混合物；II：KGF-2；9876III：mPEG-KGF-2。
图3显示的是本发明PEG-KGF-2与KGF-2在大鼠体内产生抗体的水平对比，其中，1、KGF-2，2、PEG-KGF-2；3、生理盐水对照。
图4显示的是本发明PEG-KGF-2与KGF-2的稳定性对比。
【具体实施方式】
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1聚乙二醇-KGF-2的制备
1、修饰反应：将溶解于醋酸钠缓冲液(5mM，pH＝6.00)中的KGF-2与mPEG-丁醛(20kD，直链)以摩尔比1∶3混合，放置于4℃，修饰6小时。
2、修饰反应产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过SephedaxG-25柱(20cm×1.5cm)除盐，具体方法是：采用5mM醋酸钠缓冲液平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，5mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上肝素-SepharoseCL-6B亲和层析柱(10cm×0.9cm)，具体方法是：用5mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，5mM醋酸钠缓冲液+0.6M NaCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min，洗脱杂蛋白，5mM醋酸钠缓冲液+1.2M NaCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集峰，即得纯品。
实施例2聚乙二醇-KGF-2的制备
1、修饰反应：将溶解于醋酸钠缓冲液(10mM，pH＝6.20)中的KGF-2与mPEG-丙醛以摩尔比1∶6混合，放置于8℃，修饰12小时。
2、修饰反应的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱(20cm×1.5cm)除盐，具体方法是：采用10mM醋酸钠缓冲液平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，10mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上肝素-SepharoseCL-6B亲和层析柱(10cm×0.9cm)，具体方法是：用10mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，10mM醋酸钠缓冲液+0.6M NaCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min，洗脱杂蛋白，10mM醋酸钠缓冲液+1.2M NaCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集峰，即得纯品。
实施例3聚乙二醇-KGF-2的制备
1、修饰反应：将溶解于醋酸钠缓冲液(15mM，pH＝6.40)中的KGF-2与mPEG-丁醛以摩尔比1∶9混合，放置于25℃，修饰18小时。
2、修饰反应的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱(20cm×1.5cm)除盐，具体方法是：采用15mM醋酸钠缓冲液平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，15mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上肝素-SepharoseCL-6B亲和层析柱(10cm×0.9cm)，具体方法是：用15mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，15mM醋酸钠缓冲液+0.6M NaCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min，洗脱杂蛋白，15mM醋酸钠缓冲液+1.2M NaCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集峰，即得纯品。
实施例4聚乙二醇-KGF-2的制备
1、修饰反应：将溶解于醋酸钠缓冲液(20mM，pH＝6.60)中的KGF-2与mPEG-丁醛以摩尔比1∶12混合，放置于25℃，修饰24小时。
2、修饰反应的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱(20cm×1.5cm)除盐，具体方法是：采用20mM醋酸钠缓冲液平衡柱至基线平稳后，1ml/min流速上样，20mM醋酸钠缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；过Sephedax G-25柱除盐后，上肝素-SepharoseCL-6B亲和层析柱(10cm×0.9cm)，具体方法是：用20mM醋酸钠缓冲液洗柱至基线平稳后，将除盐后收集到的蛋白上样，20mM醋酸钠缓冲液+0.6M NaCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min，洗脱杂蛋白，20mM醋酸钠缓冲液+1.2M NaCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min，收集峰，即得纯品。
实施例5SDS-PAGE电泳法对产物的检测
将收集的各洗脱峰，采用SDS-PAGE电泳法检测，分离胶12％，浓缩胶5％。电泳结束后，将胶体放入装有50ml固定液的培养皿中(甲醇16ml，甲醛20μl，重蒸水24ml)，在摇动下固定10-30分钟；取出胶体，水洗两次，每次5分钟；再放入0.02％的硫代硫酸钠溶液中，1分钟；水洗两次，每次20秒；放入装有30ml左右的0.1％的硝酸银溶液中，在摇动下染色10-30分钟；取出胶体，水洗一次，加入小体积的硫代显影液(无水碳酸钠1.5g，2％硫代硫酸钠200μl，甲醛25μl)，再转入30-50ml的硫代显影液中，缓慢摇动至足够的显影强度。
按实施例方法mPEG 20kd修饰剂定点修饰KGF-2，并按上述方法对产物进行SDS-PAGE电泳，结果如图1和2所示，图1是修饰后未经分离纯化的电泳结果，图2的C泳道是经分离纯化后的结果，图1和2在55kD(SDS-PAGE分析得到的修饰产物表观分子量比理论值高，这是因为PEG分子伸展在蛋白表面，使蛋白泳动速率降低，所以以蛋白质标准作为对照，SDS-PAGE分析得到的表观分子质量比理论值高)处出均现清晰条带，说明通过本发明方法获得了聚乙二醇-KGF-2。
实施例6
1、活性检测
采用用含10％的高糖DMEM培养基在96孔培养板内培养大鼠肾小管上皮细胞NRK52E细胞，每孔约1×104个细胞，37℃培养24h后换含0.4％血清的培养基，再24h后，每孔加入100μl纯化后的mPEG-KGF-2和KGF-2，同时设立阴性对照、空白对照。采用MTT法测定NRK52E细胞的增殖情况。结果表明，KGF-2经化学修饰后其活性保存率达到60％左右，远远高于其他文献报道的修饰蛋白的活性存活率：
表1KGF-2和PEG-KGF-2的促分裂活性
2、免疫原性实验
实验方法：
1)动物选择
选择1-2个月大，体重为18-21g的普通实验用雄性小白鼠15只，随机分成3组：KGF-2组，修饰型组和空白对照组，每组5只，用染料涂抹在动物的各条腿上，做出明确的标记。
2)抗原乳剂的制备
分别将KGF-2和修饰产物稀释至0.10mmol/ml制备抗原溶液，然后将2ml完全佐剂和2ml抗原溶液分别吸入两个10ml注射器内，在两个注射器之间套上一段消毒的医用无毒塑料管，然后缓缓推动针芯，使管内溶液通过塑料管进入对侧注射器内。每次推动针芯，必须把管内容物全部推出，另一侧也同样操作，使管内液体往返混合，直至形成油包水乳剂为止。每种抗原溶液都制备一种油包水乳剂，同时用PBS溶液与佐剂混合制备油包水乳剂，作为空白对照组。
3)免疫动物
用2)制备的三种油包水乳剂分别注射三组小鼠。本实验采用皮下注射法：初次免疫，在小白鼠的腹部一侧分3点皮下注射，每点注射0.2ml；初次免疫后2周进行二次免疫，在腹部的另一侧分3点皮下注射，每点注射0.2ml。
4)取血及分离血清
二次免疫后1周，通过眼球取血，每只小白鼠可取1ml左右的血。然后于4℃、8000rpm离心5分钟，取上清液，即得抗血清。将抗血清置-20℃冰箱保存。
5)间接ELISA法测定抗体滴度标准曲线制备
取KGF-2、PEG-KGF-2均用样品稀释液稀释到0.025umol/mL，将上述蛋白分别包被96孔板，每孔加样100uL，4℃过夜，用洗涤液PBST洗板3次，将抗体依次按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000的滴度稀释，取各稀释抗体100uL分别加到野生型、突变体和修饰产物包被孔中，37℃孵育1小时，洗板三次，甩干，将羊抗兔IgG-HRP用稀释液按滴度1∶2000稀释，每孔加100uL该二抗，37℃孵育1小时，洗板三次，甩干，每孔加入100uL底物显色液，37℃孵育20分钟，每孔加终止液100uL。酶标仪测定每孔样品的OD值，波长设定为492nm。以抗体浓度为横坐标、OD值为纵坐标，作标准曲线。
6)小鼠血清中抗体水平测定
同5)方法检测出各血清样品的OD值，根据标准曲线计算出相应的抗体浓度，并进行比较分析。
实验结果
按上述方法测定修饰前后KGF-2的体内免疫原性变化情况，结果如图3所示，说明KGF-2经化学修饰后，体内免疫原性明显降低。
3、稳定性实验
取大鼠血液，4℃8000rpm离心，取上清制得大鼠血清，分别取等物质量KGF-2和mPEG-KGF-2(浓度均为0.10mmol/ml)0.6mL与大鼠血清2.4mL混匀，37保温，分别于2、4、8、24、48h取样，-20℃保存，以空白大鼠血清作为对照，采用MTT法测定各样品生物活性。
结果如图4所示，修饰产物保温96小时后，活性保存率分别为70.8％，而KGF-2活性保存率仅为25.1％，前者在大鼠血清中热稳定性明显高于后者。
【序列表】
<110>温州医学院
<120>KGF-2的聚乙二醇修饰物及其制备方法
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>171
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser
20 25 30
Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe
35 40 45
Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr
50 55 60
Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu
65 70 75 80
Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala
85 90 95
Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp
100 105 110
Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala
115 120 125
Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr
145 150 155 160
Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
165 170