一种枯草芽孢杆菌及其用途 【技术领域】
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其用途。背景技术 食物是人类生存和社会发展的第一物质基础， 而食品 ( 农产品 ) 安全是全世界共 同关注的问题， 其中， 食品防腐保鲜则是食品安全的一个关键。目前普遍使用的化学食品 防腐剂潜在的安全隐患不容忽视， 但经长期的研究， 发现一些合成防腐剂有诱癌性、 致畸性 和易引起食物中毒等问题。随着社会生活水平的不断提高和消费者对健康的日益关注， 人 们对防腐剂之类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求， 高效安全的天然食品防腐 保鲜剂的开发与应用是食品科学研究的发展趋势。 至今， 国内外已从动物、 植物和微生物等 各种生物资源开发溶菌酶、 乳酸链球菌素 (Nisin)、 纳他霉素 (Natamycin)、 ε- 聚赖氨酸、 茶多酚、 香精油、 大蒜素、 鱼精蛋白、 蜂胶、 壳聚糖等一系列可作为天然食品防腐保鲜剂的产 品； 但由于原料来源、 本身的产品性能、 制备工艺和价格等多种因素的限制， 目前仅乳酸链 球菌 (Lactococcus lactis) 菌株产生的乳酸链球菌素等少数微生物源品种获得了市场的 广泛认可， 得到了较大规模的使用。 乳酸链球菌素是由部分乳酸链球菌菌株产生的细菌素， 由 34 个氨基酸组成， 可抑制多种革兰氏阳性细菌的生长繁殖， 并对人体安全无毒。 但 nisin 在生产应用中存在其局限性， 如它的最适活性 pH 值为 3， 在碱性条件下溶解度很少， 稳定性 也差 ； 食品的化学组成和物理性质也可显著影响 Nisin 的活性， 如新鲜肉中含有的谷胱甘 肽能显著降低乳酸链球菌素的活性， 而且肉本身较高 pH 和磷脂等成分也降低了它的抗菌 效果 ； 此外， 国际上已发现李斯特菌等多种食品腐败革兰氏阳性细菌诱变后可对 nisin 具 有较大的抗性。因此， 开发新的高效安全的天然食品防腐保鲜剂是保证食品 ( 农产品 ) 安 全的一项重要的任务。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种枯草芽孢杆菌， 该枯草芽孢杆菌的发酵液具 有抗菌功能。
为了解决上述技术问题， 本发明提供一种枯草芽孢杆菌， 保藏名称为 ： Bacillus subtilisZJU15， 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心， 保藏地址 ： 中国武汉武汉大学 ； 保藏 日期 ： 2010 年 4 月 2 日， 保藏号 ： CCTCC No ： M2010074。
本发明还同时提供了上述枯草芽孢杆菌的用途 ： 用于抑制革兰氏阳性病原细菌、 食品污染霉菌或植物病原真菌水稻纹枯病菌。
本发明以 ZJU15 菌株 ( 枯草芽孢杆菌 CCTCC ： M2010074) 总 DNA 为模板， 使用通用上 游引物 (5’ -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ )， 通用下游引物 (5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ) 进行 PCR 扩增获得 1455bp 的 16s rDNA 部分序列 (SEQ ID NO ： 1)。通过 Blast 与 GenBank 收录的细菌 16s rDNA 基因序列比对， 发现 ZJU15 菌株与枯草芽孢杆菌的同源性为 99％。 用 MEGA4.0 作进化树 ( 图 1)， 鉴定菌株 (ZJU15) 与一株枯草芽孢杆菌 (AB301009) 的同源性达到 100％。 附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 图 1 是本发明的 ZJU15 的 16sDNA 构建系统进化树。具体实施方式
实施例 1、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)ZJU15 的获得
2007 年 6 月 9 日在浙大生物技术研究所采集水稻叶片， 用稀释平板法从中分离细 菌：
(1)、 制备稀释液 ： 称取水稻叶片 10g， 放入 100ml 无菌水中， 用高速组织捣碎机捣 碎。无菌操作吸取捣碎组织液 1.0ml 加入 9.0ml 无菌水中， 再用无菌水稀释为 10-1、 10-2， 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7 共七个浓度梯度。
(2) 培养 ： 取各浓度的稀释液 100ul 分别涂布于 LB 培养基平板 ( 蛋白胨 10g/L， NaCl10g/L， 酵母浸出物 5g/L， 琼脂 16g/L， 其余为水 ； pH7.0， 121℃灭菌 20 分钟 )， 凉干后倒 置恒温箱内 30℃培养。 (3) 取单菌落 ： 等平板上长出菌落后， 根据形态挑取单菌落于 10ml 灭菌的 LB 液体 培养基 ( 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 酵母浸出物 5g/L， 其余为水 ； pH7.0， 121℃灭菌 20 分 钟 ) 中， 摇床上 30℃恒温振荡培养 24 小时 ； 得细菌培养液。
(4) 采用甘油保藏法， 在灭菌的菌种管中， 加入 1.0ml 细菌培养液， 0.5ml 50％ ( 体 积浓度 ) 的甘油， 混匀后于 -70℃冰箱保存。
(5) 以单增李斯特菌 (Listeriae monocytogenes) 为指示菌， 进行拮抗菌的筛选 ： LB 固体培养基加热融化， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接指示菌培养液， 混匀， 制备平板。 在平板上接各分离菌株 ( 步骤 (4) 所得 )， 恒温箱内 30℃培养， 观察抑菌状况。结果从中筛 选出一株对李斯特菌具明显抑菌效果的菌株， 定名为 ZJU15。
菌落形态特征 ： 在 LB 培养基平板上培养初期菌落半透明脓状隆起， 边缘整齐， 表 面有皱摺 ； 培养后期菌落乳白色， 表面干燥， 周围粗糙。
将该菌株 ZJU15 进行了保藏， 保藏名称为 ： Bacillus subtilis ZJU15， 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心， 保藏地址 ： 中国武汉武汉大学 ； 保藏日期 ： 2010 年 4 月 2 日， 保藏 号： CCTCC No ： M2010074。
实施例 2、 枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 产生的抗菌物， 其制备过程具体如下 ：
1)、 枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 种子液制备 ： 取一环保存于 -70℃冰箱的枯草芽孢杆 菌菌株 ZJU15(Bacillus subtilis ZJU15CCTCC No ： M2010074) 菌种接种于 LB 液体培养基 中， 30℃下， 200rpm/min 振荡培养 12 小时， 作为种子培养液。
2)、 菌株抗菌代谢产物发酵 ： 将上述种子培养液以 5％ (V/V) 浓度接种于 LB 液体 培养液中， 在 30℃下， 200rpm/min 振荡培养 18 小时， 获得发酵液。
3)、 抗菌物的获得 ： 将发酵液以 6000 ～ 8000rpm/min 离心 10min， 在所得上清液中 按照每 100ml 上清液加入 11g 固体硫酸铵的比例添加硫酸铵， 从而使硫酸铵的饱和度约为 20％。4℃下放置 4 小时， 然后再以 12000rpm/min 离心 20min， 收集沉淀。所得沉淀用占上
清液 1/15 体积的灭菌蒸馏水悬浮， 获得抗菌物。
实施例 3、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 对细菌的抑菌作用 ：
采用琼脂扩散法 (Agar Diffiution Assay) 检测抗菌物的拮抗活性。将各指示菌 接种于相应的培养基平板 ( 见表 1)， 37℃培养 18-24 小时， 挑取 3-5 个菌落， 用灭菌生理盐 水制成浊度约为 0.5 麦氏比浊标准的悬液中。然后将相应的固体培养基 ( 见表 1) 加热融 化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培养液， 混匀， 制备平板。用孔 径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍稀释液 ( 抗菌物用相同体 积的蒸馏水逐步稀释 )， 37℃下培养过夜， 观察抑菌作用。抑菌活性的计算方式 ： 如果稀释 n n 2 倍具有最小抑菌圈， 那么抑菌活性大小为 2 ×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌浓度 的稀释倍数 (Apolonio， Carvalho et al.2008)， 重复两次。
结果如表 1， 由表 1 可知枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 产生的抗菌物能够有效抑制多种 食品污染和人体致病革兰氏阳性细菌如 Listeriae monocytogenes、 Micrococcus luteus、 Enterococcus feacalis、 Staphylococcus aureaus、 Streptococcus pyogenes 等， 但该抗 菌物对革兰氏阴性细菌没有抑制作用。
表 1、 ZJU15 菌株抗菌物对细菌的抑菌作用
注： a： ATCC 为美国标准菌种收藏所， GIMCC 为广东省微生物研究所菌种保藏中心， 临床分离菌株由浙江大学医学院第二附属医院检验科提供。b ： MH(Mueller-Hivton agar) 和 BA(Columbia Blood agar) 为 Oxoid 公司产品， TSBYE( 蛋白胨 17g/L， 多胨 3g/L， 酵母粉 6g/L， K2HPO4.3H2O， 2.5g/L， NaCl 5g/L)。
实施例 4、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 对真菌的抑菌作用 ：
采用琼脂扩散法 (Agar DiffiutionAssay) 检测抗菌物对各种病原真菌的抑菌作 用。 对念珠菌属 (Candida spp) 病原菌 ： 将念珠菌属病原菌接种于 MH 培养基平板， 37℃培养
18-24 小时， 挑取 3-5 个菌落， 用灭菌生理盐水制成浊度约为 0.5 麦氏比浊标准的悬液。然 后将 MH 固体培养基加热融化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培 养液， 混匀， 制备平板。 用孔径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍 稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水逐步稀释 )， 37℃下培养过夜， 观察抑菌作用。对于其 它真菌病原菌 ： 在 PDA 固体培养基 ( 土豆 200g/L， 葡萄糖 20g/L， 琼脂 18g， 其余为水， pH7.0， 121℃灭菌 20 分钟 ) 平板中心接种直径为 1. 0cm 的病原菌菌丝块， 30℃下培养 24 小时后， 在距菌落边缘约 2cm 处用孔径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍 稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水逐步稀释 )， 30℃下培养过夜， 观察抑菌作用。抑菌活 n 性的计算方式 ： 如果稀释 2 倍具有最小抑菌圈， 那么抑菌活性大小为 2n×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌浓度的稀释倍数 (Apolonio， Carvalho et al.2008)， 重复两次。
结果如表 2， 由表 2 可知枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 产生的抗菌物对引起柑橘采后 腐败的意大利青霉 (Penicillium digitatum)、 引起多种食品霉变的黄曲霉 (Aspergillus flavus) 和水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani) 等食品 / 植物病原真菌也具有明显的抑制 作用， 但对念珠菌属 (Candida spp) 病原菌没有抑制作用。
表 2、 ZJU15 菌株抗菌物对真菌的抑菌作用
实施例 5、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 的热稳定性 ：
分别取小量抗菌物， 分别在 37， 60， 80， 100℃下处理 30min， 高压 121℃ 20min， 冷却 至室温。以单增李斯特菌为指示菌， 采用琼脂扩散法 (AgarDiffiutionAssay) 检测各处理 液的抑菌活性 ： 将单增李斯特菌接种于 TSBYE 液体培养基中， 37℃下振荡培养至对数生长 期 ( 麦氏浊度标准≈ 0.5)。然后将 TSBYE 固体培养基加热融化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培养液， 混匀， 制备平板。 用孔径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水逐步稀释 )， 37℃培养 n 那么抑菌活性大 过夜， 观察抑菌作用。抑菌活性计算方法 ： 如果稀释 2 倍具有最小抑菌圈， n 小为 2 ×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌圈的稀释倍数。重复两次。结果表明枯草芽 孢杆菌菌株 ZJU15 的抗菌物在温度 37-121℃之间都能保持完全活性 ( 表 3)。
表 3、 ZJU15 菌株抗菌物对温度的稳定性
处理 ( 温度 ) 抗菌活性 (AU/ml) 37℃ /30min 1600 60℃ /30min 1600 80℃ /30min 1600 100℃ /30min 1600 121℃ /20min 1600
实施例 6、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 对蛋白酶的稳定性
分别取 1.0ml 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 分别加入胰蛋白酶、 胃蛋白酶、 蛋白酶 K 和 蛋白酶 E 至终浓度为 1.0mg/ml， 37 ℃下放置 2h， 以加牛血清蛋白 (1mg/ml) 的抗菌物为对 照。以单增李斯特菌为指示菌， 采用琼脂扩散法 (Agar DiffiutionAssay) 检测各处理液的 抑菌活性 ： 将单增李斯特菌接种于 TSBYE 液体培养基中， 37℃下振荡培养至对数生长期 ( 麦 氏浊度标准≈ 0.5)。然后将 TSBYE 固体培养基加热融化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培养液， 混匀， 制备平板。 用孔径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水逐步稀释 )， 37℃培养过夜， n 观察抑菌作用。抑菌活性计算方法 ： 如果稀释 2 倍具有最小抑菌圈， 那么抑菌活性大小为 n 2 ×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌圈的稀释倍数。重复两次。结果表明枯草芽孢杆 菌菌株 ZJU15 的抗菌物能被蛋白酶 K 完全水解， 对蛋白酶 E 部分敏感， 但对胰蛋白酶和胃蛋 白酶不敏感 ( 表 4)。
表 4、 ZJU15 菌株抗菌物对酶的稳定性
处理 ( 蛋白酶 ) 抗菌活性 (AU/ml) 牛血清蛋白 ( 对照， 1mg/ml) 1600 蛋白酶 K(1mg/ml) 0 蛋白酶 E(1mg/ml) 800 胰蛋白酶 (1mg/ml) 1600 胃蛋白酶 (1mg/ml) 1600
实施例 7、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 的 pH 稳定性
分别取 1.0ml 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 于试管中用 0.1mol/L 氢氧化钠或 0.1mol/L 盐酸将样品溶液分别调 pH 值 2-12， 室温保持 24h 后， 再将各管的 pH 调回至约 pH 7.0， 再用 灭菌水定容到 1.2ml。 以单增李斯特菌为指示菌， 采用琼脂扩散法 (Agar DiffiutionAssay) 检测各处理液的抑菌活性 ： 将单增李斯特菌接种于 TSBYE 液体培养基中， 37 ℃下振荡培 养至对数生长期 ( 麦氏浊度标准≈ 0.5)。然后将 TSBYE 固体培养基加热融化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培养液， 混匀， 制备平板。用孔径为 5mm 的 打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水 逐步稀释 )， 37℃培养过夜， 观察抑菌作用。抑菌活性计算方法 ： 如果稀释 2n 倍具有最小抑 菌圈， 那么抑菌活性大小为 2n×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌圈的稀释倍数。重复 两次。结果表明枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 的抗菌物在 pH 值 2-10 之间保持完全活性， pH 11 活性降低了 50％， pH12 活性完全丧失 ( 表 5)。
表 5、 ZJU15 菌株抗菌物对酸碱的稳定性
处理 ( 酸碱 ) 抗菌活性 (AU/ml) pH2-10 1600 pH11 400 pH12 200
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其用途。背景技术 食物是人类生存和社会发展的第一物质基础， 而食品 ( 农产品 ) 安全是全世界共 同关注的问题， 其中， 食品防腐保鲜则是食品安全的一个关键。目前普遍使用的化学食品 防腐剂潜在的安全隐患不容忽视， 但经长期的研究， 发现一些合成防腐剂有诱癌性、 致畸性 和易引起食物中毒等问题。随着社会生活水平的不断提高和消费者对健康的日益关注， 人 们对防腐剂之类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求， 高效安全的天然食品防腐 保鲜剂的开发与应用是食品科学研究的发展趋势。 至今， 国内外已从动物、 植物和微生物等 各种生物资源开发溶菌酶、 乳酸链球菌素 (Nisin)、 纳他霉素 (Natamycin)、 ε- 聚赖氨酸、 茶多酚、 香精油、 大蒜素、 鱼精蛋白、 蜂胶、 壳聚糖等一系列可作为天然食品防腐保鲜剂的产 品； 但由于原料来源、 本身的产品性能、 制备工艺和价格等多种因素的限制， 目前仅乳酸链 球菌 (Lactococcus lactis) 菌株产生的乳酸链球菌素等少数微生物源品种获得了市场的 广泛认可， 得到了较大规模的使用。 乳酸链球菌素是由部分乳酸链球菌菌株产生的细菌素， 由 34 个氨基酸组成， 可抑制多种革兰氏阳性细菌的生长繁殖， 并对人体安全无毒。 但 nisin 在生产应用中存在其局限性， 如它的最适活性 pH 值为 3， 在碱性条件下溶解度很少， 稳定性 也差 ； 食品的化学组成和物理性质也可显著影响 Nisin 的活性， 如新鲜肉中含有的谷胱甘 肽能显著降低乳酸链球菌素的活性， 而且肉本身较高 pH 和磷脂等成分也降低了它的抗菌 效果 ； 此外， 国际上已发现李斯特菌等多种食品腐败革兰氏阳性细菌诱变后可对 nisin 具 有较大的抗性。因此， 开发新的高效安全的天然食品防腐保鲜剂是保证食品 ( 农产品 ) 安 全的一项重要的任务。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种枯草芽孢杆菌， 该枯草芽孢杆菌的发酵液具 有抗菌功能。
为了解决上述技术问题， 本发明提供一种枯草芽孢杆菌， 保藏名称为 ： Bacillus subtilisZJU15， 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心， 保藏地址 ： 中国武汉武汉大学 ； 保藏 日期 ： 2010 年 4 月 2 日， 保藏号 ： CCTCC No ： M2010074。
本发明还同时提供了上述枯草芽孢杆菌的用途 ： 用于抑制革兰氏阳性病原细菌、 食品污染霉菌或植物病原真菌水稻纹枯病菌。
本发明以 ZJU15 菌株 ( 枯草芽孢杆菌 CCTCC ： M2010074) 总 DNA 为模板， 使用通用上 游引物 (5’ -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ )， 通用下游引物 (5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ) 进行 PCR 扩增获得 1455bp 的 16s rDNA 部分序列 (SEQ ID NO ： 1)。通过 Blast 与 GenBank 收录的细菌 16s rDNA 基因序列比对， 发现 ZJU15 菌株与枯草芽孢杆菌的同源性为 99％。 用 MEGA4.0 作进化树 ( 图 1)， 鉴定菌株 (ZJU15) 与一株枯草芽孢杆菌 (AB301009) 的同源性达到 100％。 附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 图 1 是本发明的 ZJU15 的 16sDNA 构建系统进化树。具体实施方式
实施例 1、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)ZJU15 的获得
2007 年 6 月 9 日在浙大生物技术研究所采集水稻叶片， 用稀释平板法从中分离细 菌：
(1)、 制备稀释液 ： 称取水稻叶片 10g， 放入 100ml 无菌水中， 用高速组织捣碎机捣 碎。无菌操作吸取捣碎组织液 1.0ml 加入 9.0ml 无菌水中， 再用无菌水稀释为 10-1、 10-2， 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7 共七个浓度梯度。
(2) 培养 ： 取各浓度的稀释液 100ul 分别涂布于 LB 培养基平板 ( 蛋白胨 10g/L， NaCl10g/L， 酵母浸出物 5g/L， 琼脂 16g/L， 其余为水 ； pH7.0， 121℃灭菌 20 分钟 )， 凉干后倒 置恒温箱内 30℃培养。 (3) 取单菌落 ： 等平板上长出菌落后， 根据形态挑取单菌落于 10ml 灭菌的 LB 液体 培养基 ( 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 酵母浸出物 5g/L， 其余为水 ； pH7.0， 121℃灭菌 20 分 钟 ) 中， 摇床上 30℃恒温振荡培养 24 小时 ； 得细菌培养液。
(4) 采用甘油保藏法， 在灭菌的菌种管中， 加入 1.0ml 细菌培养液， 0.5ml 50％ ( 体 积浓度 ) 的甘油， 混匀后于 -70℃冰箱保存。
(5) 以单增李斯特菌 (Listeriae monocytogenes) 为指示菌， 进行拮抗菌的筛选 ： LB 固体培养基加热融化， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接指示菌培养液， 混匀， 制备平板。 在平板上接各分离菌株 ( 步骤 (4) 所得 )， 恒温箱内 30℃培养， 观察抑菌状况。结果从中筛 选出一株对李斯特菌具明显抑菌效果的菌株， 定名为 ZJU15。
菌落形态特征 ： 在 LB 培养基平板上培养初期菌落半透明脓状隆起， 边缘整齐， 表 面有皱摺 ； 培养后期菌落乳白色， 表面干燥， 周围粗糙。
将该菌株 ZJU15 进行了保藏， 保藏名称为 ： Bacillus subtilis ZJU15， 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心， 保藏地址 ： 中国武汉武汉大学 ； 保藏日期 ： 2010 年 4 月 2 日， 保藏 号： CCTCC No ： M2010074。
实施例 2、 枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 产生的抗菌物， 其制备过程具体如下 ：
1)、 枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 种子液制备 ： 取一环保存于 -70℃冰箱的枯草芽孢杆 菌菌株 ZJU15(Bacillus subtilis ZJU15CCTCC No ： M2010074) 菌种接种于 LB 液体培养基 中， 30℃下， 200rpm/min 振荡培养 12 小时， 作为种子培养液。
2)、 菌株抗菌代谢产物发酵 ： 将上述种子培养液以 5％ (V/V) 浓度接种于 LB 液体 培养液中， 在 30℃下， 200rpm/min 振荡培养 18 小时， 获得发酵液。
3)、 抗菌物的获得 ： 将发酵液以 6000 ～ 8000rpm/min 离心 10min， 在所得上清液中 按照每 100ml 上清液加入 11g 固体硫酸铵的比例添加硫酸铵， 从而使硫酸铵的饱和度约为 20％。4℃下放置 4 小时， 然后再以 12000rpm/min 离心 20min， 收集沉淀。所得沉淀用占上
清液 1/15 体积的灭菌蒸馏水悬浮， 获得抗菌物。
实施例 3、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 对细菌的抑菌作用 ：
采用琼脂扩散法 (Agar Diffiution Assay) 检测抗菌物的拮抗活性。将各指示菌 接种于相应的培养基平板 ( 见表 1)， 37℃培养 18-24 小时， 挑取 3-5 个菌落， 用灭菌生理盐 水制成浊度约为 0.5 麦氏比浊标准的悬液中。然后将相应的固体培养基 ( 见表 1) 加热融 化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培养液， 混匀， 制备平板。用孔 径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍稀释液 ( 抗菌物用相同体 积的蒸馏水逐步稀释 )， 37℃下培养过夜， 观察抑菌作用。抑菌活性的计算方式 ： 如果稀释 n n 2 倍具有最小抑菌圈， 那么抑菌活性大小为 2 ×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌浓度 的稀释倍数 (Apolonio， Carvalho et al.2008)， 重复两次。
结果如表 1， 由表 1 可知枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 产生的抗菌物能够有效抑制多种 食品污染和人体致病革兰氏阳性细菌如 Listeriae monocytogenes、 Micrococcus luteus、 Enterococcus feacalis、 Staphylococcus aureaus、 Streptococcus pyogenes 等， 但该抗 菌物对革兰氏阴性细菌没有抑制作用。
表 1、 ZJU15 菌株抗菌物对细菌的抑菌作用
注： a： ATCC 为美国标准菌种收藏所， GIMCC 为广东省微生物研究所菌种保藏中心， 临床分离菌株由浙江大学医学院第二附属医院检验科提供。b ： MH(Mueller-Hivton agar) 和 BA(Columbia Blood agar) 为 Oxoid 公司产品， TSBYE( 蛋白胨 17g/L， 多胨 3g/L， 酵母粉 6g/L， K2HPO4.3H2O， 2.5g/L， NaCl 5g/L)。
实施例 4、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 对真菌的抑菌作用 ：
采用琼脂扩散法 (Agar DiffiutionAssay) 检测抗菌物对各种病原真菌的抑菌作 用。 对念珠菌属 (Candida spp) 病原菌 ： 将念珠菌属病原菌接种于 MH 培养基平板， 37℃培养
18-24 小时， 挑取 3-5 个菌落， 用灭菌生理盐水制成浊度约为 0.5 麦氏比浊标准的悬液。然 后将 MH 固体培养基加热融化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培 养液， 混匀， 制备平板。 用孔径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍 稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水逐步稀释 )， 37℃下培养过夜， 观察抑菌作用。对于其 它真菌病原菌 ： 在 PDA 固体培养基 ( 土豆 200g/L， 葡萄糖 20g/L， 琼脂 18g， 其余为水， pH7.0， 121℃灭菌 20 分钟 ) 平板中心接种直径为 1. 0cm 的病原菌菌丝块， 30℃下培养 24 小时后， 在距菌落边缘约 2cm 处用孔径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍 稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水逐步稀释 )， 30℃下培养过夜， 观察抑菌作用。抑菌活 n 性的计算方式 ： 如果稀释 2 倍具有最小抑菌圈， 那么抑菌活性大小为 2n×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌浓度的稀释倍数 (Apolonio， Carvalho et al.2008)， 重复两次。
结果如表 2， 由表 2 可知枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 产生的抗菌物对引起柑橘采后 腐败的意大利青霉 (Penicillium digitatum)、 引起多种食品霉变的黄曲霉 (Aspergillus flavus) 和水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani) 等食品 / 植物病原真菌也具有明显的抑制 作用， 但对念珠菌属 (Candida spp) 病原菌没有抑制作用。
表 2、 ZJU15 菌株抗菌物对真菌的抑菌作用
实施例 5、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 的热稳定性 ：
分别取小量抗菌物， 分别在 37， 60， 80， 100℃下处理 30min， 高压 121℃ 20min， 冷却 至室温。以单增李斯特菌为指示菌， 采用琼脂扩散法 (AgarDiffiutionAssay) 检测各处理 液的抑菌活性 ： 将单增李斯特菌接种于 TSBYE 液体培养基中， 37℃下振荡培养至对数生长 期 ( 麦氏浊度标准≈ 0.5)。然后将 TSBYE 固体培养基加热融化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培养液， 混匀， 制备平板。 用孔径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水逐步稀释 )， 37℃培养 n 那么抑菌活性大 过夜， 观察抑菌作用。抑菌活性计算方法 ： 如果稀释 2 倍具有最小抑菌圈， n 小为 2 ×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌圈的稀释倍数。重复两次。结果表明枯草芽 孢杆菌菌株 ZJU15 的抗菌物在温度 37-121℃之间都能保持完全活性 ( 表 3)。
表 3、 ZJU15 菌株抗菌物对温度的稳定性
处理 ( 温度 ) 抗菌活性 (AU/ml) 37℃ /30min 1600 60℃ /30min 1600 80℃ /30min 1600 100℃ /30min 1600 121℃ /20min 1600
实施例 6、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 对蛋白酶的稳定性
分别取 1.0ml 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 分别加入胰蛋白酶、 胃蛋白酶、 蛋白酶 K 和 蛋白酶 E 至终浓度为 1.0mg/ml， 37 ℃下放置 2h， 以加牛血清蛋白 (1mg/ml) 的抗菌物为对 照。以单增李斯特菌为指示菌， 采用琼脂扩散法 (Agar DiffiutionAssay) 检测各处理液的 抑菌活性 ： 将单增李斯特菌接种于 TSBYE 液体培养基中， 37℃下振荡培养至对数生长期 ( 麦 氏浊度标准≈ 0.5)。然后将 TSBYE 固体培养基加热融化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培养液， 混匀， 制备平板。 用孔径为 5mm 的打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水逐步稀释 )， 37℃培养过夜， n 观察抑菌作用。抑菌活性计算方法 ： 如果稀释 2 倍具有最小抑菌圈， 那么抑菌活性大小为 n 2 ×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌圈的稀释倍数。重复两次。结果表明枯草芽孢杆 菌菌株 ZJU15 的抗菌物能被蛋白酶 K 完全水解， 对蛋白酶 E 部分敏感， 但对胰蛋白酶和胃蛋 白酶不敏感 ( 表 4)。
表 4、 ZJU15 菌株抗菌物对酶的稳定性
处理 ( 蛋白酶 ) 抗菌活性 (AU/ml) 牛血清蛋白 ( 对照， 1mg/ml) 1600 蛋白酶 K(1mg/ml) 0 蛋白酶 E(1mg/ml) 800 胰蛋白酶 (1mg/ml) 1600 胃蛋白酶 (1mg/ml) 1600
实施例 7、 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 的 pH 稳定性
分别取 1.0ml 抗菌物 ( 实施例 2 所得 ) 于试管中用 0.1mol/L 氢氧化钠或 0.1mol/L 盐酸将样品溶液分别调 pH 值 2-12， 室温保持 24h 后， 再将各管的 pH 调回至约 pH 7.0， 再用 灭菌水定容到 1.2ml。 以单增李斯特菌为指示菌， 采用琼脂扩散法 (Agar DiffiutionAssay) 检测各处理液的抑菌活性 ： 将单增李斯特菌接种于 TSBYE 液体培养基中， 37 ℃下振荡培 养至对数生长期 ( 麦氏浊度标准≈ 0.5)。然后将 TSBYE 固体培养基加热融化后， 冷却到 45-50℃时按 1％ (V/V) 接对数生长期的指示菌培养液， 混匀， 制备平板。用孔径为 5mm 的 打孔器打孔， 每孔加 10μl ZJU15 菌株抗菌物的二倍稀释液 ( 抗菌物用相同体积的蒸馏水 逐步稀释 )， 37℃培养过夜， 观察抑菌作用。抑菌活性计算方法 ： 如果稀释 2n 倍具有最小抑 菌圈， 那么抑菌活性大小为 2n×1000μL/10μL， n 是指具有最小抑菌圈的稀释倍数。重复 两次。结果表明枯草芽孢杆菌菌株 ZJU15 的抗菌物在 pH 值 2-10 之间保持完全活性， pH 11 活性降低了 50％， pH12 活性完全丧失 ( 表 5)。
表 5、 ZJU15 菌株抗菌物对酸碱的稳定性
处理 ( 酸碱 ) 抗菌活性 (AU/ml) pH2-10 1600 pH11 400 pH12 200
最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然， 本发 明不限于以上实施例， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。9CN 101935628 A
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