生物膜治疗 发明领域 本 发 明 涉 及 用 于 预 防 或 改 变 诸 如 那 些 含 有 牙 龈 卟 啉 单 胞 菌 (Porphyromonas gingivalis) 的生物膜的细菌生物膜的形成和 / 或发展的组合物与方法。 特别是， 本发明涉 及使用或抑制对生物膜生长或在血红素限制下的生长重要的多肽来调节生物膜的形成和 / 或发展。本发明还涉及用于调节生物膜的形成和 / 或发展的组合物， 该调节包括通过调控 细菌的酶的调节。
发明背景
许多细菌治疗涉及浮游状态的细菌。 然而， 细菌病理学包括生物膜状态的细菌。 例 如， 牙龈卟啉单胞菌被认为是慢性牙周疾病的主要病因 (causative agent)。对在牙齿表 面作为多种微生物细菌生物膜的一部分而生长的牙龈卟啉单胞菌 (P.gingivalis) 的异常 调节的宿主免疫应答， 导致了与该疾病有关的组织损伤。 细菌生物膜在自然界中普遍存在， 并且定义为互相粘附和 / 或粘附至表面或界面的基质围绕 (matrix-enclosed) 的细菌群落 (1)。这些作为成熟的生物膜粘附至表面并在表面上生长的固定细菌细胞能够幸免于包括 存在抗微生物剂、 剪切力以及营养缺乏在内的不利环境。
疾病控制与预防中心 (Centers for Disease Control and Prevention) 估计 65％的人细菌感染与生物膜有关。生物膜通常通过保护细菌免受免疫系统、 降低抗生素效 力并将浮游细胞分散至远处以促使再感染， 使慢性感染的治疗复杂化 (2、 3)。 牙菌斑是细菌 生物膜的典型实例， 其中高多样性的物种形成在牙齿表面生长的异源多微生物生物膜。牙 齿的表面是独特的微生物生境， 因为牙齿表面是人体中唯一的坚硬、 永久、 不脱落的表面。 与上皮细胞的脱落限制了生物膜的发展的粘膜表面相反， 这使得坚固的细菌生物膜在漫长 的时间内累积。 因此， 发生在浮游与生物膜状态之间的牙龈卟啉单胞菌蛋白质组的变化， 对 我们理解慢性牙周疾病的发展是重要的。
牙龈卟啉单胞菌分为两个大的菌株组， 包括 W50 和 W83 在内的菌株被描述为在动 物模型中是侵入性的， 而包括 381 和 ATCC 33277 在内的菌株则被描述为非侵入性的 (4、 5)。 Griffen 等人 (6) 发现， W83/W50 样菌株比包括 381 样菌株在内的其他牙龈卟啉单胞菌菌株 与人牙周疾病更相关， 而 Cutler 等人 (7) 证明， 牙龈卟啉单胞菌的侵入性菌株比非侵入性 菌株对吞噬作用更具抵抗力。测序的牙龈卟啉单胞菌 W83 菌株与模式菌株 ATCC 33277 的 比较表明， 菌株 33277 缺乏 7％的基因或者是高度趋异的 (divergent)， 这表明菌株之间存 在明显的不同 (8)。有趣地是， 与容易形成生物膜的菌株 33277 相比， 牙龈卟啉单胞菌菌株 W50 在大部分条件下仅形成不好的生物膜 (9)。由于这个原因， 对牙龈卟啉单胞菌 W50 形成 生物膜只进行了相对很少的研究。
利用基于凝胶染色强度计算蛋白比率的 2D 凝胶电泳方法， 已进行了定量蛋白质 组学研究， 以测定诸如绿脓假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)、 大肠杆菌 (Escherichia coli) 以及变形链球菌 (Streptococcusmutans) 的人细菌病原体， 从浮游至生物膜状态的 蛋白质组的变化 (10-12)。替代方案是利用稳定同位素标记技术， 例如 ICAT、 iTRAQ 或具有 18 18 MS 定量的重水 (H2 O)(13)。H2 O 标记的基础是， 在蛋白质水解期间， 已证明诸如胰蛋白酶
的内肽酶将两个 18O 原子并入所得的肽的 C- 末端 (14、 15)。除了用于测定相对蛋白丰度以 18 外 (16-19)， 蛋白质组学中的 O 标记还用于鉴定蛋白 C- 末端、 鉴定酶促移除聚糖后的 N- 连 接的糖基化、 简化 MS/MS 的数据解释以及最近用于证实磷酸化位点 (20-23)。 用于测量相对 16 18 16 蛋白丰度的 O/ O 蛋白水解标记方法包括将一个样品在 H2 O 中消化， 并将另一样品在 H218O 中消化。然后在通过 LC MS/MS 进行分析前， 将该消化物合并。可以通过测量 MS 模式中肽 离子对 (ion pair) 的相对信号强度， 定量从 LC 柱中洗脱的肽。将两个 18O 并入胰蛋白酶消 化的肽的 C- 末端， 导致 +4m/z 的质量漂移 (mass shift)， 从而允许鉴定同位素对。
由于蛋白质组的复杂性， 初步分级 (prefractionation) 步骤对于增加肽和蛋白 质鉴定的数目是有利的。大部分初步分级步骤包括溶液中 (in-solution) 消化后肽水平上 的 2D LC 方法 (24、 25)。然而， 由于在蛋白溶液的初始脱水步骤期间潜在的样品损失， 也成 16 18 功地进行了蛋白水平上的 SDS PAGE 初步分级和其后的凝胶消化中的 O/ O 标记 (26-29)。 16 O/18O 蛋白水解标记是高度特异性并且多用途的方法， 但是只进行了很少的大规模验证研 究 (30)。Qian 等人 (18) 进行了极好的验证研究， 他们标记了 1 ∶ 1 的比率的两个相似等 份的血清蛋白， 并且从 891 个肽中获得了 1.02±0.23 的平均比率。Lane 等人 (26) 最近的 研究还证明， 使用反向标记策略测定对照与细胞色素 P450 诱导剂处理的移植了人肿瘤的 小鼠之间 17 个细胞色素 P450 蛋白相对丰度的 16O/18O 方法的可行性。 发明概述
本发明使用了某种系统， 其中以连续培养的方式使牙龈卟啉单胞菌 W50 生长， 并 且在恒化器容器的垂直表面上， 随延长的时间段发展了成熟的生物膜。最终的生物膜与疾 病发展条件下所见的生物膜类似， 因而允许生物膜细胞与浮游细胞之间的直接比较。在牙 龈卟啉单胞菌细胞外膜 (cell envelope) 组分的 SDS-PAGE 初步分级后， 进行使用反向标记 16 18 策略的 O/ O 蛋白水解标记， 然后与离线 LC MALDI TOF-MS/MS 耦合以进行鉴定与定量。 在 所鉴定的 116 种蛋白中， 在两个独立的连续培养研究中一致地发现了 81 种。发现具有多种 功能的 47 种蛋白的丰度在生物膜细胞中一致地增加或减少， 这为生物膜控制策略提供了 潜在的靶标。在这 47 种蛋白中， 本发明人选择了认为是治疗和 / 或预防牙龈卟啉单胞菌感 染的特别有用的靶标的 24 种蛋白。这些蛋白列于下文的表 4 中。
因此， 本发明提供了调节细菌形成的生物膜的分离、 纯化或重组的细菌多肽。 优选 地， 该细菌是厌氧的。在一实施方案中， 该细菌是依赖富马酸还原酶 (Frd) 的， 例如卟啉单 胞菌属 (Porphyromonas) 的那些细菌。优选的细菌是牙龈卟啉单胞菌。
用于牙龈卟啉单胞菌的本发明的多肽的氨基酸序列选自表 4 所列的序列。本发 明扩展至与该序列相同至少 80％的序列， 优选与该序列相同 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％。
本发明的另一方面涉及预防或治疗个体的牙龈卟啉单胞菌感染的方法， 该方法包 括向该个体施用包含调节生物膜的形成的多肽的抑制剂的药物组合物， 特别是源自细菌生 物膜的形成或与细菌生物膜的形成有关的牙龈卟啉单胞菌感染。 还提供了预防或治疗个体 的牙周疾病的方法， 该方法包括向该个体施用包含调节生物膜的形成的多肽的抑制剂的药 物组合物， 特别是源自细菌生物膜的形成或与细菌生物膜的形成有关的牙周疾病。从对该 多肽活性的抑制降低或抑制了生物膜的形成和 / 或发展的意义上而言， 该多肽通常对生物 膜的发展是重要的或必需的。
还提供了调节生物膜的形成的多肽的抑制剂在制备用于预防或治疗牙周疾病的 药物中的用途。
本发明的另一方面涉及用于预防或治疗牙周疾病的组合物， 该组合物包含抑制 剂， 例如本发明第一方面的多肽的拮抗剂或拮抗剂的组合。该组合物通常还包括制药学可 接受的载体。施用该组合物从而所述拮抗剂抑制感染。
任选地， 所述组合物还可以包含一种或多种抗生素， 该抗生素对革兰氏阴性厌氧 菌是有毒的或者抑制革兰氏阴性厌氧菌的生长。 任何抑菌或杀菌抗生素可以潜在地用于本 发明的组合物中。优选地， 合适的抗生素包括阿莫西林、 多西环素或甲硝唑。
本发明的另一方面涉及在口腔中使用的， 用于预防、 抑制或治疗牙周疾病或牙龈 卟啉单胞菌感染的组合物。
本发明的另一方面涉及， 在口腔中使用时， 用于预防、 抑制或治疗牙周疾病或牙龈 卟啉单胞菌感染的组合物。
口服组合物可以沉积在牙齿上或牙龈上， 或者既沉积在牙齿上又沉积在牙龈上。
所述多肽可以是酶。优选地， 该酶与有机酸的代谢有关， 更优选地， 与谷氨酸 / 天 冬氨酸的分解代谢有关。在一实施方案中， 所述多肽是富马酸还原酶。
本发明的另一方面是用于治疗牙龈卟啉单胞菌感染的组合物， 该组合物包含作为 活性成分、 调节生物膜的形成或发展的多肽的抑制剂。
在本发明的另一方面， 提供了干扰 RNA 分子， 该分子在每条链中包含至少 19 个碱 基对的双链区， 其中双链区中的一条链与编码上文所述多肽的多核苷酸区基本上互补。在 一实施方案中， 所述链的一条与编码表 4 所列序列的多肽的多核苷酸的区域互补。
在一实施方案中， 所述抑制剂是所述多肽的抑制剂。对于牙龈卟啉单胞菌， 所述 多肽可以是富马酸还原酶， 并且该拮抗剂选自一种或多种富马酸还原酶的抑制剂。其他合 适的抑制剂包括天然产物， 其包括但不限于来自链霉菌 (Streptomyces spp.) 的紫花前胡 素、 verticipyrone、 paecilaminol、 5- 烯基 -3， 3(2H)- 呋喃酮， nafuredin、 中康酸、 鱼藤酮 及其天然、 半合成和合成的类似物。在另一方面， 本发明的抑制剂可以是合成的化合物， 其 包括但不限于 2- 取代 4， 6- 二硝基酚 ； 巯基吡啶 N- 氧化物 ； L-092,201(Merck Sharpe and Dohme) ； 诸如非昔硝唑 (fexindazole)、 megazol、 苄硝唑、 MK-436、 L-634,549、 米索硝唑的 硝基咪唑 ； 或者诸如阿苯达唑、 坎苯达唑、 甲苯达唑、 奥芬达唑、 帕苯达唑和噻苯达唑的苯并 咪唑 ； 或者奥克太尔或莫仑太尔。优选的抑制剂是奥克太尔、 莫仑太尔或噻苯达唑。特别优 选的抑制剂是奥克太尔。
本领域的技术人员将认识到， 抑制剂的选择将取决于决定该抑制剂是否适合用于 临床环境的许多临床因素。
附图简述
图1： 特定 BSA 比率的 16O/18O 定量。以与实验方法中报道的生物膜样品和浮游样 品相同的方式， 进行已知量的 BSA 的定量， 来验证方法。简而言之， 将预测定量的 BSA 加入 NuPAGE 凝胶的相邻泳道中， 然后进行大小相等条带的切割、 正常或反向蛋白水解标记、 纳米 16 18 HPLC(nanoHPLC) 以及 MALDI TOF-MS/MS。(A)BSA 胰蛋白酶肽的 MS 光谱， 已知 O ∶ O 标 记比率为 1 ∶ 1(i)、 2 ∶ 1(ii)、 1 ∶ 5(iii) 和 10 ∶ 1(iv) 的 RHPEYAVSVLLR， 这显示了 16O 和 18O 标记的肽的特有的双峰同位素外膜 (S0、 S2 和 S4 是同位素峰的测量强度 )(B) 已知的BSA 比率的 SDS PAGE 凝胶， 用于定量方法。
图2： 来自牙龈卟啉单胞菌样品的典型的正向和反向 MS 和 MS/MS 光谱。(i， ii) 质 谱的放大部分， 其显示属于 PG2082 的正常和反向标记的肽 GNLQALVGR 的 [M+H]+ 母前体离 子， 并且以 1 ∶ 1 的比例显示典型的 4Da 质量差异， (iii， iv) 质谱， 其显示属于 PG0232 的 正常和反向标记的肽 YNANNVDLNR 的 [M+H]+ 母前体离子， 并且以 2 ∶ 1 的比率显示典型的 4Da 质量差异， (v， vi) 重标记的 (+218O)YNANNVDLNR 和未标记的 YNANNVDLNR 肽的 MS/MS 光 谱， 其特征为所有 Y 离子的 4Da 漂移。
图3： 正常 / 反向标记的技术重复的相关性。两个生物学重复的正常 (Bio18， Plank16) 与反向 (Plank18， Bio16) 标记的肽丰度比率的转化成 Log10 的散点图比较。已 倒转了反向标记的肽的丰度比率， 用于直接比较。(A) 生物学重复 1(B) 生物学重复 2
图4： 生物学重复的蛋白丰度的分布和相关性。(A) 在两个生物学重复中都鉴定 的 81 种可定量的蛋白的标准化平均倍数变化， 表现出高斯样 (Gaussian-like) 分布。还将 每种蛋白的丰度比率标准化至 0(R-1)， 并且将小于 1 的比率倒转并计算为 (1-(1/R))(18)。 通过渐增的比率 ( 生物膜 / 浮游 ) 将来自每个生物学重复的所有 81 种可定量的蛋白分类 并相等地分成含有相等数目的蛋白的 6 组 (A-F)。组 C 和 D 表示未被明显调控的蛋白 ( 小 于 3SD 从 1.0)。(B) 基于排名的蛋白的分布。插页 ： 用于测定两个生物学重复之间的相似 性的排名表。 将蛋白降序排列， 当两个生物学重复都落在相同的组时， 1 具有最高的相似性， 并且 6 具有最低的相似性。 图5： 基于在一个或两个生物学重复中的鉴定以及所鉴定的特异性肽段 (unique peptide) 的数目， 本研究中所鉴定的 116 种蛋白的细目分类。从两个生物学重复中都鉴定 的蛋白 (81) 示于表 2 中。图例表示每种蛋白的所鉴定的特异性肽段的数目。
图6： 牙龈卟啉单胞菌中谷氨酸和天冬氨酸发酵的分解代谢途径。催化每个步骤 的鉴定的酶用如表 3 所示的它们的 TIGR 登录号表示。加下划线的登录号表示在另一蛋白 质组分析中检测到， 但是未在 ICAT 研究中检测到的酶。
图7： 50 小时内， 奥克太尔对牙龈卟啉单胞菌 W50(A) 和 ATCC33277(B) 的细胞生 长的影响。所用的浓度是 15.625μM-1000μM。所用的阴性对照是 4μL DMSO。牙龈卟啉 单胞菌的 MIC 和 MGT 如表 7 和表 8 所示。结果表示在不同的天数进行的两个生物学重复的 平均值 (n ＝ 10)。( DMSO、 —— 15.625μM、 31.25μM、 62.5μM、 125μM、 250μM、 500μM、 1000μM)
图8： 50 小时内， 莫仑太尔对牙龈卟啉单胞菌的细胞生长的影响。所用的浓度是 15.625μM-1000μM。所用的阴性对照是 4μL DMSO。牙龈卟啉单胞菌的 MIC 和 MGT 如表 7 所 示。( DMSO、 —— 19.53μM、 39.06μM、 78.13μM、 156.25μM、 312.5μM、 625μM、 1250μM、 2500μM、 5000μM)
图9： 50 小时内， 噻苯达唑对牙龈卟啉单胞菌的细胞生长的影响。所用的浓度是 31.25μM-4000μM。所用的阴性对照是 4μL DMSO。牙龈卟啉单胞菌的 MIC 和 MGT 如表 7 所示。( DMSO、 —— 31.25μM、 62.5μM、 125μM、 250μM、 500μM、 1000μM、 2000μM、 4000μM)
图 10 ： 奥克太尔对牙龈卟啉单胞菌菌株 33277 形成的生物膜的影响。(A)24h 的生
物膜 (B)48h 的生物膜。进行了生物学重复的测定， 并且误差棒表示两个生物学重复的标准 偏差 (n ＝ 12)。
图 11 ： 只用水处理并用 Baclight 染色的对照 ATCC 33277 的 CLSM 图像。该图像 是以 2μm 的间隔获得的全部 z- 堆积 (z-stack) 的最大投射。比例尺 ( 白色 ) ＝ 10μm。
图 12 ： 用 125μM 的奥克太尔处理并用 Baclight 染色的 ATCC33277 的 CLSM 图像。 该图像是以 2μm 的间隔获得的全部 z- 堆积的最大投射。比例尺 ( 白色 ) ＝ 10μm。
图 13 ： 用 12.5μM 的奥克太尔处理并用 Baclight 染色的 ATCC33277 的 CLSM 图像。 该图像是以 2μm 的间隔获得的全部 z- 堆积的最大投射。比例尺 ( 白色 ) ＝ 10μm。
图 14 ： 基于静态 24 孔测定的奥克太尔处理后的菌落形成单位。
发明详述
利用蛋白质组策略， 本发明人成功地鉴定并定量了生物膜状态和浮游状态之间的 116 种牙龈卟啉单胞菌细胞外膜蛋白的丰度变化， 并且通过多种肽采样 (peptide hits) 鉴 定了大部分蛋白。本发明人证明了大量位于细胞表面的 C- 末端结构域家族蛋白的表达增 强， 该蛋白包括 RgpA、 HagA、 CPG70 以及 PG99。表现出明显的丰度变化的其他蛋白包括转运 相关蛋白 (HmuY 和 IhtB)、 代谢酶 (FrdA 和 FrdB)、 免疫原性蛋白以及许多功能仍然未知的 蛋白。 因此， 本发明提供了分离的牙龈卟啉单胞菌多肽， 该多肽的氨基酸序列选自对应 于表 4 所列的登录号的序列和与对应于该登录号的序列相同至少 95％的序列。
优选地， 所述分离的多肽与对应于表 4 所列的登录号的任一序列的氨基酸序列相 同至少 96％、 97％、 98％、 99％或 100％。
术语 “肽、 蛋白以及多肽” 在本文中互换地使用。 本发明的多肽可以包括重组多肽， 如融合多肽。制备融合多肽的方法对本领域的技术人员是公知的。
本领域的技术人员应当完全理解的是， 可以改变对应于表 4 所列的登录号的氨基 酸序列。这些改变可以是氨基酸残基的缺失、 插入或取代。改变的多肽可以是天然存在的 ( 即， 从天然来源纯化的或分离的 ) 或者合成的 ( 例如， 通过对编码 DNA 的定点诱变 )。意 图是与对应于表 4 所列的登录号的序列具有至少 85％同一性， 优选至少 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性的此类改变的多肽， 都在本发明的范围内。 抗这些改变的多肽的 抗体还将结合具有一个对应于表 4 所列的登录号的序列的多肽。
尽管本领域的技术人员完全理解保守性取代的概念， 为了清楚起见， 保守性取代 是下文所列的那些取代。
Gly、 Ala、 Val、 Ile、 Leu、 Met ；
Asp、 Glu、 Ser ；
Asn、 Gln ；
Ser、 Thr ；
Lys、 Arg、 His ；
Phe、 Tyr、 Trp、 His ； 以及
Pro、 Nα- 碱性氨基酸。
除非另外指明， 否则本发明的实施将使用化学、 分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 以及免疫学的本领域技术人员公知的常规技术。 在整个下述来源的文献中描述并解释了这
些技术， 例如 J.Perbal， APractical Guide to Molecular Cloning( 分子克隆实践指南 )， John Wileyand Sons(1984)、 J.Sambrook et Molecular Cloning ： A LaboratoryManual( 分 子 克 隆 ： 实 验 室 手 册 )， Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、 T.A.Brown(editor) ，Essential Molecular Biology ： A PracticalApproach( 基 础分子生物学： 实 用 方 法 )， Volumes 1and 2， IRL Press(1991)、 D.M.Glover and B.D.Hames(editors)， DNA Cloning ： APractical Approach(DNA 克 隆 ：实 用 方 法 )， Volumes 1-4， IRL Press(1995and 1996) 以及 F.M.Ausubel et al.(Editors)， Current Protocols inMolecular Biology( 分 子 生 物 学 最 新 方 法 )， Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988， 包括直至目前的所有更新 )。 通过引用将这些原文的公开在 此并入。
本文所用的 “分离的多肽” 指的是从与其一起天然存在的其他蛋白质、 脂类以及核 酸中分离的多肽， 或者多肽或肽是可以用合成方法合成的。优选地， 还从诸如抗体或凝胶 基质， 如用于纯化多肽的聚丙烯酰胺的物质中分离多肽。 优选地， 多肽组成纯化制剂干重的 至少 10％、 20％、 50％、 70％以及 80％。优选地， 该制剂含有足以允许蛋白测序的量的多肽 ( 即， 至少 1mg、 10mg 或 100mg)。 可以通过诸如柱层析 ( 利用诸如离子交换基质、 疏水基质等的与蛋白产品相互作 用的各种基质 )、 使用蛋白的特异性抗体或与蛋白结合的其他配体的亲和层析的标准技术 来纯化本文所述的分离的多肽。
本文所用的 “连续的氨基酸序列” 指的是连续的一段氨基酸。
“重组多肽” 是通过涉及使用重组 DNA 技术的方法制备的多肽。
在测定两个氨基酸序列是否落在指定的百分比范围内时， 本领域的技术人员应当 清楚需要进行序列的并行比较或多重比对。在此类比较或比对中， 取决于进行比对所用的 算法， 在定位不相同的残基时将出现差异。在本文的语境中， 两个或更多个氨基酸序列之 间百分比同一性或相似性的含义， 应当认为是分别指使用本领域技术人员已知的任何标准 算法所测定的所述序列之间的相同或相似残基的数目。例如， 氨基酸序列的同一性或相 似性可以利用 Computer Genetics Group， Inc.， University Research Park， Madison， Wisconsin， United States of America(Devereaux et al.， 1984) 的 GAP 程序来计算和 / 或利用该公司的 PILEUP 程序来比对。GAP 程序使用 Needleman 和 Wunsch(1970) 的算法来 使相同 / 相似的残基的数目最大化， 并使比对中序列缺口的数目和长度最小化。可选地或 另外， 当比较多于两个氨基酸序列时， 使用 Thompson 等人 (1994) 的 Clustal W 程序。
本发明的一方面涉及预防或治疗个体的牙周疾病的方法， 该方法包括向该个体施 用本发明的药物组合物。
在一种方法中， 治疗了个体， 包括对牙周疾病的预防性治疗。 牙周疾病的范围从简 单的牙龈炎症到对支持牙齿的软组织和骨头导致严重损伤的严重疾病。 牙周疾病包括龈炎 和牙周炎。诸如牙龈卟啉单胞菌的细菌导致称为 “龈炎” 牙龈的炎症。在龈炎中， 牙龈变成 红色、 肿胀并容易出血。如果不进行治疗， 龈炎能够恶化成 “牙周炎” ( 其表示 “牙齿周围的 炎症” )。在牙周炎中， 牙龈脱离牙齿并形成被感染的 “袋” 。当牙菌斑在龈线下扩散并生长 时， 身体的免疫系统与细菌进行斗争。如果不进行治疗， 骨头、 牙龈和支持牙齿的结缔组织 将遭到破坏。牙齿最后变松并不得不被移除。
本发明还提供用于预防或治疗牙周疾病的组合物， 该组合物包含本发明第一方面 的牙龈卟啉单胞菌多肽的拮抗剂和制药学上可接受的载体， 其中该拮抗剂抑制牙龈卟啉单 胞菌感染。
可以以诸如牙粉 (dentifrice) 的适用于口腔的各种形式来制备和使用本发明 的含有上文所述药物组合物的口服组合物， 该形式包括牙膏、 牙粉 (toothpowder) 和液体 牙粉 (dentifrice)、 漱口剂、 片剂、 口香糖、 牙膏 (dental paste)、 牙龈按摩膏 (gingival massage cream)、 含漱片剂 (gargletablet)、 乳制品和其他食品。 取决于具体口服组合物的 类型和形式， 本发明的口服组合物还可以包括其他公知的成分。
在本发明的某些优选形式中， 口服组合物的性质可以基本上是液态的， 例如漱口 剂或清洗剂。在这种制剂中， 媒介物通常期望地是包括下文所述的湿润剂在内的水 - 醇混 合物。水比醇的重量比通常是约 1 ∶ 1 至约 20 ∶ 1。这种类型制剂中的水 - 醇混合物的总 量通常是制剂重量的约 70％至约 99.9％。所述醇通常是乙醇或异丙醇。乙醇是优选的。
本发明的这种液体和其他制剂的 pH 通常是约 5 至约 9， 并且通常是约 5.0 至约 7.0。pH 可以用酸 ( 例如， 柠檬酸或苯甲酸 ) 或碱 ( 例如， 氢氧化钠 ) 来控制或缓冲 ( 用柠 檬酸钠、 苯甲酸钠、 碳酸钠或碳酸氢钠、 磷酸氢二钠、 磷酸二氢钠等 )。
在本发明的其他期望的形式中， 药物组合物的性质可以基本上是固态或膏状的， 例如牙粉 (toothpowder)、 牙科片剂 (dental tablet) 或牙膏 ( 牙膏 (dental cream)) 或凝 胶牙粉。这类固态或膏状口服制剂的媒介物通常含有牙科可接受的抛光材料。
在牙膏中， 液体媒介物包含的水和湿润剂的量通常是制剂重量的约 10 ％至约 80％。甘油、 丙二醇、 山梨醇和聚丙二醇示例了合适的湿润剂 / 载体。还有利的是水、 甘油 和山梨醇的液态混合物。在折射率是重要的考虑事项的透明凝胶中， 优选地使用约 2.5％ w/w 至 30％ w/w 的水、 0 至约 70％ w/w 的甘油和约 20％ w/w 至 80％ w/w 的山梨醇。
牙膏、 膏和凝胶通常含有比例为约 0.1％ w/w 至约 10％ w/w， 优选约 0.5％ w/w 至 约 5 ％ w/w 的天然或合成的增稠剂或胶凝剂。合适的增稠剂是合成的锂蒙脱石， 其是合 成的胶体硅酸碱金属镁盐复合物粘土， 例如， 可商购自 Laporte Industries Limited 的 Laponite( 例如， LaponiteCP、 Laponite SP 2002、 Laponite D)。 Laponite D 是大约 58.00％ 重量比的 SiO2、 25.40％重量比的 MgO、 3.05％重量比的 Na2O、 0.98％重量比的 Li2O 以及一 些水分和痕量金属。Laponite D 的真实比重是 2.53， 并且在水分为 8％时， 表观松密度为 1.0g/ml。
其他合适的增稠剂包括爱尔兰藓、 约塔角叉菜聚糖 (iotacarrageenan)、 黄蓍树 胶、 淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮、 羟乙基丙基纤维素、 羟丁基甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 羟 乙基纤维素 ( 例如， 可商购的 Natrosol)、 羧甲基纤维素钠和诸如细磨的 Syloid( 例如， 244) 的胶态二氧化硅。还可以包括增溶剂， 例如， 诸如丙二醇、 二丙二醇和己二醇的湿润剂多羟 基化合物、 诸如甲基溶纤剂和乙基溶纤剂的溶纤剂、 诸如橄榄油、 蓖麻油和矿脂的含有的至 少约 12 个直链碳的植物油和蜡以及诸如乙酸戊酯、 乙酸乙酯和苯甲酸苄酯的酯。
应当理解， 常规地， 口服制剂通常以贴上合适标签的包装出售或者分销。因此， 一 瓶口腔清洗剂 (mouth rinse) 基本上具有将其描述为口腔清洗剂或漱口剂的标签， 并且具 有其使用说明 ； 牙膏、 膏或凝胶通常在软管中， 该软管通常是铝管、 衬铅管或塑料管， 或者用 于测量出内容物的其他挤、 泵或加压的分配器， 并且基本上具有将该内容物描述为牙膏、 凝胶或牙膏的标签。
可以在本发明的组合物中使用有机表面活性剂， 以实现增加的预防作用， 这有助 于实现活性剂在整个口腔中的全部和完整的分散， 并使得该即食组合物在外观上更可接 受。 优选地， 该有机表面活性材料性质优选是阴离子的、 非离子的或两性的， 并且优选地， 该 有机表面活性材料不与所述活性剂相互作用。 优选地将所述表面活性剂用作赋予所述组合 物清洁和发泡属性的清洁材料。阴离子表面活性剂的合适实例是高级脂肪酸单甘油酯单 硫酸盐的水溶性盐， 如氢化的椰子油脂肪酸的单甘油酯单硫酸盐的钠盐， 诸如月桂基硫酸 钠的高级烷基硫酸盐， 诸如十二烷基苯磺酸钠的烷基芳基磺酸盐， 高级烷基磺基乙酸盐， 1， 2- 二羟基丙磺酸的高级脂肪酸酯， 以及诸如那些在脂肪酸、 烷基或酰基中具有 12 至 16-16 个碳的低级脂肪氨基羧酸化合物的基本上饱和的高级脂肪酰胺等。 最后描述的酰胺的实例 是 N- 月桂酰肌氨酸和 N- 月桂酰肌氨酸、 N- 肉豆蔻酰肌氨酸或 N- 棕榈酰肌氨酸的钠盐、 钾 盐和乙醇胺盐， 所述酰胺应当基本上不含肥皂或类似的高级脂肪酸材料。在本发明的口服 组合物中使用这些肌氨酸盐 (sarconite) 化合物是特别有用的， 因为除了降低牙釉质在酸 溶液中的某些溶解性以外， 这些材料在抑制由于碳水化合物的分解而在口腔中形成的酸中 还表现出持久的明显效果。 适合使用的水溶性非离子表面活性剂的实例是环氧乙烷与各种 反应性含氢化合物的缩合产物， 与该环氧乙烷反应的含氢化合物具有长疏水链 ( 例如， 约 12 至 20-20 个碳原子的脂肪链 )， 其缩合产物 ( “ethoxamers” ) 含有亲水聚氧乙烯部分， 例 如聚 ( 环氧乙烷 ) 与脂肪酸、 脂肪醇、 脂肪酰胺、 多元醇 ( 例如， 脱水山梨醇单硬脂酸酯 ) 以 及聚环氧丙烷 ( 例如， 普卢龙尼克 (pluronic) 材料 ) 的缩合产物。 表面活性剂的量按重量通常是约 0.1％ -5％。值得注意的是， 表面活性剂可以有 助于溶解本发明的活性剂， 从而减少所需的助溶湿润剂的量。
可以将各种其他材料并入本发明的口服制剂中， 例如， 增白剂、 防腐剂、 硅氧烷、 叶 绿素化合物和 / 或含氨的化合物， 例如尿素、 磷酸氢二铵及其混合物。将这些佐剂， 当存在 时， 以基本上不给期望的属性和特性带来不利影响的量， 并入制剂中。
还可以使用任何合适的调味或甜味材料。合适的调味组分的实例是调味油 (flavouring oils)， 例如， 留兰香油、 薄荷油、 冬青油、 黄樟油、 丁香油、 鼠尾草油、 桉油、 马 郁兰油 (oil of marjoram)、 桂皮油、 柠檬油和橘皮油， 以及水杨酸甲酯。 合适的甜味剂包括 蔗糖、 乳糖、 麦芽糖、 山梨醇、 木糖醇、 环己基氨基磺酸钠、 紫苏亭、 AMP( 天冬氨酰苯丙氨酸甲 酯 )、 糖精等。合适地， 调味剂和甜味剂可以各自或共同组成制剂的约 0.1％ -5％以上。
还可以将本发明的组合物并入锭剂或口香糖或其他产品中， 例如， 通过搅拌加入 加热的香糖胶基 (gum base) 或涂覆香糖胶基的外层， 其实例是节路顿胶 (jelutong)、 橡胶 胶乳、 聚乙酸乙烯酯树脂等， 期望地与常规的增塑剂或软化剂、 糖或诸如葡萄糖、 山梨醇等 其他增甜剂一起并入。
在另一方面， 本发明提供了成套试剂盒， 其包括 (a) 多肽抑制剂的组合物， 和 (b) 制药学上可接受的载体。期望的是， 该试剂盒还包括在需要这种治疗的患者中使用它们抑 制生物膜形成的说明书。
旨在口服使用的组合物可以根据本领域中制备药物组合物的任何已知方法来制 备， 并且此类组合物可以含有选自甜味剂、 调味剂、 着色剂以及防腐剂的一种或多种试剂， 以提供制药学上精美和可口的制剂。 片剂含有与非毒性的制药学上可接受的适合制备片剂
的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是， 例如， 诸如碳酸钙、 碳酸钠、 乳糖、 磷酸钙或 磷酸钠的惰性稀释剂 ； 诸如玉米淀粉或褐藻酸的成粒剂或崩解剂 ； 诸如淀粉、 明胶或金合 欢的结合剂， 以及诸如硬脂酸镁、 硬脂酸或滑石的润滑剂。片剂可以是未包衣的， 或者可以 通过已知的技术将它们包衣以延迟在胃肠道的分解和吸收， 从而提供更长时间段的持续作 用。例如， 可以使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。
口服使用的制剂还可以表现为硬明胶胶囊， 其中将活性成分与诸如碳酸钙、 磷酸 钙或高岭土 (kaolin) 的惰性固体稀释剂混合， 或者表现为软明胶胶囊， 其中将活性成分与 诸如花生油、 液体石蜡或橄榄油的水或油介质混合。
水性悬浮液含有与适合制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。这种赋形 剂是悬浮剂， 例如， 羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 藻酸钠、 聚乙烯吡 咯烷酮、 黄蓍树胶和阿拉伯树胶 ； 分散剂或湿润剂可以是诸如卵磷脂的天然存在的磷脂， 或诸如聚氧乙烯硬脂酸酯的烯化氧与脂肪酸的缩合产物， 或诸如十七烷乙烯氧基十六醇 (heptadecaethyleneoxycetanol) 的环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物， 或诸如聚氧乙烯 山梨醇单油酸酯的环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的缩合产物， 或诸如聚乙烯脱 水山梨醇单油酸酯的环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇酸酐衍生的部分酯的缩合产物。 水性悬浮液也可以含有一种或多种防腐剂， 例如诸如苯甲酸乙酯或苯甲酸正丙 酯、 对羟基苯甲酸酯的苯甲酸酯， 一种或多种着色剂， 一种或多种调味剂和一种或多种甜味 剂， 例如蔗糖、 糖精。
油性悬浮液可以通过将活性组分悬浮在诸如花生油、 橄榄油、 芝麻油或椰子油的 植物油， 或诸如液体石蜡矿物油中来制备。油性悬浮液可以含有增稠剂， 例如蜂蜡、 硬石蜡 或鲸蜡醇。可以添加如上文所述的那些甜味剂和调味剂来提供美味的口服制剂。这些组合 物可以通过添加诸如抗坏血酸的抗氧化剂来防腐。
作为生物膜生长和浮游状态之间牙龈卟啉单胞菌蛋白丰度的比较揭示了这种致 病菌蛋白质组的许多变化， 特别是对谷氨酸 / 天冬氨酸分解代谢重要的富马酸还原酶的较 低的丰度。 在关于比较血红素限制和血红素过量的牙龈卟啉单胞菌的蛋白质组变化的另外 研究中， 在血红素限制中有可观察到的发酵模式的改变， 这导致乙酸的产量增加并且与牙 龈卟啉单胞菌的主要分解代谢途径中酶的丰度的协调变化是一致的。特别有趣的是， 血红 素限制和生物膜生长期间富马酸还原酶一致的较低丰度。本发明人随后证明了三种 Frd 抑 制剂 ( 奥克太尔、 莫仑太尔和噻苯达唑 ) 抗牙龈卟啉单胞菌生存的作用和破坏生物膜的正 常发展的亚最小抑菌浓度 (subMIC)。
如本文所用的， 术语 “拮抗剂” 指的是抑制目的多肽的生物活性的核酸、 肽、 抗体、 配体或其他化学实体。 本领域的技术人员应当熟悉检测和选择特定蛋白的合适拮抗剂的技 术， 这种技术包括结合测定。
本发明的抗体和拮抗剂有许多应用， 例如， 它们能够用作口腔护理产品中 ( 牙膏 和口腔清洗剂 ) 的抗微生物的防腐剂， 用于控制牙菌斑和抑制与龋齿和牙周疾病有关的病 原体。本发明的抗体和拮抗剂还可以用于药物制剂中 ( 例如， 局部和全身抗感染药物 )。
本发明还提供了靶向编码本发明的第一方面的多肽的 mRNA 分子的干扰 RNA 分子。 因此， 本发明的第七方面提供了干扰 RNA 分子， 该分子在每条链中都包含至少 19 个碱基对 的双链区， 其中双链区中的一条链与编码本发明的第一方面的多肽的 mRNA 分子的区域互
补或者能够在正常细胞内条件下与编码本发明的第一方面的多肽的 mRNA 分子的区域杂 交。
所 谓 的 RNA 干 扰 或 RNAi 是 已 知 的， 并 且 Hannon(2002)Nature418 ： 244-251 和 McManus & Sharp(2002)Nature Reviews ： Genetics3(10) ： 737-747 提供了关于 RNAi 的其 他信息， 它们的公开在此处通过引用并入。
本发明还包括增强 siRNA 的稳定性并支持其体内用途的 siRNA 的化学修饰 ( 参 见， 例如， Shen et al.(2006)Gene Therapy 13 ： 225-234)。这些修饰可以包括位于正义链 寡核苷酸的 5’ 和 3’ 末端的反向无碱基部分， 以及反义链 3’ 末端的最后两个核苷酸之间的 单个硫代磷酸酯键。
优选的是， 干扰 RNA 的双链区在双链区的每条链中包含至少 20、 优选至少 25、 最优 选至少 30 个碱基对。本发明还提供了治疗个体的牙周疾病的方法， 该方法包括向个体施用 至少一种本发明的干扰 RNA 分子。
在整个本说明书中， 词语 “包含 (comprise)” 或者诸如 “包含 (compises)” 或 “包 含 (comprising)” 的变体应当理解为表示包括所宣称的元素、 整数或步骤， 或者元素、 整数 或步骤的集合， 但是并不排除任何其他元素、 整数或步骤， 或者元素、 整数或步骤的集合。 本说明书中所述的全部公开在此处通过引用并入。 本说明书所包含的文件、 行为、 材料、 装置、 文章等的任何讨论， 仅用于为本发明提供语境。 并不认为是承认， 任何或者所有 这些内容形成了部分现有技术的基础， 或者是与本发明有关的技术领域的常识， 尽管在本 申请的每项权利要求的优先日期前， 其存在于澳大利亚或其他地方。
本领域的技术人员应当理解， 在未偏离所广泛描述的本发明的精神或范围的情况 下， 可以对本发明进行许多变化和 / 或修饰， 如具体的实施方案所示。因此， 本实施方案在 各个方面都认为是示例性的而非限制性的。 本发明特别包括本说明书中所述的特征的所有 组合。
为了更清楚地了解本发明的特征， 现在参照下文的实施例， 描述本发明的优选形 式。
用于生物膜与浮游研究的牙龈卟啉单胞菌的生长和收获
利用 C-30 型 BioFlo 恒化器 (New Brunswick Scientific)， 使牙龈卟啉单胞菌 W50(ATCC 53978) 以连续培养的方式生长， 工作体积为 400mL。向培养容器和培养基储蓄器 (medium reservoir) 两者中连续地通入 10％ CO2 和 90％ N2。生长温度为 37℃， 并且将脑 心浸液生长培养基 (brain heart infusion growth， Oxoid) 保持在 pH 7.5。在所有的生 长中， 将氧化还原电势保持在 -300mV。稀释速率为 0.1h-1， 从而获得的平均每代时间 (MGT) 为 6.9h。添加无菌半胱氨酸 -HCl(0.5g/L) 和氯化血红素 (5mg/L)。接种后约 10 天， 培养 物达到稳定态， 并将培养物保持另外的 30 天， 直至在容器的垂直表面形成了生物膜厚层。
在冰上或在 4 ℃下进行所有的细菌细胞操作。收获时， 将浮游细胞倒入干净 的 容 器 中， 并 用 PGA 缓 冲 液 (10.0mM NaH2PO4、 10.0mMKCl、 2.0mM 柠 檬 酸、 1.25mM MgCl2、 20.0mM CaCl2、 25.0mM ZnCl2、 50.0mM MnCl2、 5.0mM CuCl2、 10.0mM CoCl2、 5.0mM H3BO3、 0.1mM Na2MoO4、 10mM 半胱氨酸 -HCl， 并在 37℃下， 用 5M NaOH 将 pH 调整至 7.5， 37℃ ) 将生物膜温 和地洗涤两次， 然后将生物膜收获至 50mL 的离心管中。
然后用 PGA 缓冲液将浮游细胞和生物膜细胞洗涤三次 (7000g)， 并用洗涤缓冲液
(50mM Tris-HCl、 150mM NaCl、 5mM MgCl2、 pH8.0、 蛋白酶抑制剂抑制剂 (Sigma)) 将两个样 品再悬浮至终体积为 30mL， 并在 138Mpa 下， 3 次通过弗氏压碎器 (French Press Pressure Cell， SLM1 AMINCO) 将两个样品裂解。将裂解的细胞在 2000g 下离心 30min 以除去任何未 破碎的细胞。 将上清液在 100000g 下进一步离心 1h 以将裂解的细胞分离成可溶和不溶 ( 细 胞外膜 ) 的组分。在 100000g 下， 用洗涤缓冲液将细胞外膜组分再洗涤 3 次， 每次 20min， 以 除去任何可溶的污染物。然后， 将所有样品冻存于 -80℃。
用于血红素限制和过量研究的牙龈卟啉单胞菌的生长和收获
利用 Bioflo 110 发酵罐 / 生物反应器 (New Brunswick Scientific)， 使牙龈卟啉 单胞菌 W50 以连续培养的方式生长， 工作体积为 400mL。 生长培养基是 37g/L 的脑心浸液培 养基 (Oxoid)， 并补充了 5mg/mL 的无菌过滤的盐酸半胱氨酸、 5.0μg/mL 的氯化血红素 ( 血 红素过量 ) 或者 0.1μg/mL 的氯化血红素 ( 血红素限制 )。通过向培养容器接种在相同的 培养基 ( 血红素过量 ) 中生长的牙龈卟啉单胞菌的 24h 分批培养物 (100mL) 开始生长。分 批培养生长 24 小时后， 打开培养基储蓄器泵并将培养基流速调整至稀释速率为 0.1h-1( 平 均每代时间 (MGT) 为 6.9h)。将容器的温度保持在 37℃并将 pH 保持在 7.4±0.1。向培养 物中连续地通入 95％ N2 中的 5％的 CO2。在稳定态生长中收获细胞， 并用洗涤缓冲液 (50mM Tris-HCl pH 8.0、 150mM NaCl、 5mM MgCl2)， 在 5000g 下， 将细胞洗涤三次， 达 30min， 并在 138Mpa 下， 使细胞三次通过弗氏压碎器 (SLM， AMINCO) 将细胞分解。然后将裂解的细胞在 2000g 下离心 30min 以除去未破碎的细胞， 然后在 100000g 下超离心， 从而获得可溶 ( 上清 液 ) 组分和膜组分。在冰上进行所有的分级。 18
O 蛋白水解标记的生物膜和浮游细胞外膜组分的制备和分析
首先将细胞外膜组分再悬浮于 1mL 冰冷的含有 2％ SDS 的洗涤缓冲液中， 然后进行 超声处理和漩涡以促进细胞团 (pellet) 的再悬浮。再悬浮的最终步骤包括使用 29 号胰岛 素针 (29-gauge-insulin needle) 帮助破碎微粒。然后将该混合物在 40000g 下离心以除 去不溶颗粒， 并根据生产商的说明书使用 BCA 试剂 (Pierce) 测定上清液中蛋白的浓度。
然后在 -20℃下， 使用 5 体积冰冷的丙酮沉淀再悬浮的样品， 过夜， 这进一步帮助 失活任何蛋白水解活性。丙酮沉淀后， 用 pH 8.0 的 25mM Tris 和 1％ SDS 将两个样品再悬 浮至终浓度为 3mg/mL， 并用间歇的超声处理、 漩涡搅拌以及使用 29 号胰岛素针进行辅助。 然后进行第二 BCA 蛋白测定以使最终蛋白的量标准化。
根据生产商的方法， 使用 MOP 运行缓冲液 (NuPAGE， Invitrogen)， 进行 NuPAGE 凝 胶上的凝胶电泳， 除了在向使用 MOP 作为运行缓冲液的 10 孔 10％ NuPAGE 凝胶加样前， 将样 品在 99℃下煮沸 5min。将生物膜样品和浮游样品 ( 各 30μg) 加样至凝胶中相邻的泳道。 然后在 126V( 恒定 )、 4℃的条件下进行 SDS-PAGE， 至染料前沿距离凝胶的底部约 1cm。 对于 生物学重复， 所用的凝胶是使用 MOP 作为运行缓冲液的 4-12％ NUPAGE 梯度凝胶， 以获得相 似但不确切 (exact) 的分离模式， 从而克服分离成两个组分的蛋白条带的潜在变化。在考 马斯亮蓝 (Coomassie brilliant blue)G-250(31) 中过夜染色， 然后在超纯水中过夜脱色。
使用定制的模板 (stencil) 将两个凝胶泳道分成 10 个相同大小的凝胶条带， 并且 3 将每个部分切成约 1mm 的方块。在 50mMNH4HCO3/ACN(1 ∶ 1) 的溶液中脱色三次。脱色后， 将该凝胶方块用 100％ ACN 脱水， 然后在 56℃下， 用含于 ABC 缓冲液 (50mM NH4HCO3) 中的 10mM 二硫苏糖醇的溶液进行再水合 / 还原， 达 30min。在室温下避光添加 55mM 碘乙酰胺的ABC 缓冲液的溶液达 60min 前， 除去过量的溶液。烷化反应后， 将凝胶方块在 ABC 缓冲液中 洗涤 3 次， 然后在 100％ ACN 中将该凝胶方块脱水两次， 达 10min。 使用真空离心蒸发浓缩器 (speedvac) 将该凝胶方块在离心下进一步干燥 90min。在 37℃下， 在每个凝胶部分 60μl 16 18 18 的溶液中， 消化 20h， 该溶液含有在 H2 O 或 H2 O(H2 O， 纯度大于 97％， Marshall Isotopes) 中制备的 2μg 测序等级 (sequence grade) 的修饰的胰蛋白酶 (Promega) 和 1/2 强度的 ABC 缓冲液。消化后， 使用 50％ ACN/0.1％ TFA 在它们各自的水 (H216O/H218O) 中的溶液以及 0.1％ TFA， 在超声处理的辅助下， 将肽从凝胶中提取两次， 每次 5min。将合并的提取物在 99℃下煮沸 5min 以失活胰蛋白酶， 然后冷冻干燥 48h。
在使用纳米 HPLC 和 MALDI TOF-MS/MS 分析进行分析前， 将冷冻干燥的肽再悬浮于 16 18 5％ ACN/0.1％ TFA 在它们各自的水 (H2 O/H2 O) 中的溶液中。 然后， 利用高级 μL 取样模式 下的 FAMOS 自动加样器， 将肽溶液 (20μl) 加样至 Ultimate 纳米 LC 系统 (Nano LC system， LCPackings)。首先， 以 200μL/min 的流速， 将样品加样至捕获柱 (300μm 内径 ×5mm) 达 5min。使用反向柱 (LC Packings， C18 PepMap100， 75μm i.d.×15cm， 3μm， )以 300nL/min 的 流 速 实 现 分 离， 用 0-5min(0 ％ )、 5-10min(0-16 ％ )、 10-90min(16-80 ％ )、 90-100min(80-0％ ) 的 ACN 梯度， 在 0.1％甲酸中洗脱。
使用 Proteineer Fc 自动装置 (Bruker Daltonics)， 以 30s 的时间间隔， 将洗脱液 直接点样至预点样的 anchorchip 平板 (Bruker Daltonics) 上。点样前， 将每个点样位置 用 0.2μL 的超纯水预点样， 以降低与基质结晶过程期间的乙腈的浓度。 在使用 MALDI-TOF/ TOF(LIFT II 升级的 Ultraflex， Bruker Daltonics) 进行自动分析前， 将平板用 10mM 磷 酸铵和 0.1％ TFA 洗涤并空气干燥。首先使用 25kV 的加速电压， 在测量 800Da-3500Da 的 反射方式 (reflectron mode) 下， 进行消化物的 MS 分析。从 8 套 30 个激光发射产生所有 MS 光谱， 并且每套需要包括 S/N 大于 6 的信噪比、 大于 3000 的分辨率。对 4 个样品的每个 组， 使用预点样的内部标准品的 [M+H]+ 离子 ( 血管紧张素 II、 血管紧张素 I、 神经降压素、 肾素底物和 ACTH_Clip)， 对设备进行外部校准。使用 Flexcontrol 和 WarpLC 软件 (Bruker Daltonics)， 在完全自动的模式下， 进行 MALDI-TOF/TOF 的 LIFT 模式。在 TOF1 阶段， 将所 有离子加速至 8kV， 随后在 LIFT 室中提升至 19kV， 从累加的 550 个连续激光发射中产生 MS/ MS 光谱。
使 用 WarpLC 软 件 ( 第 1.0 版 ) 和 LC MALDI SILE(Stable IsotopeLabelling Experiment) 作业流程， 选择母体前体 (parent precursors)。只选择了通过 4Da 所分离的 每个重或轻对 (heavy or light pair) 的最丰富的峰， 这提供了大于 50 的 S/N。通过小于 6 次 LC MALDI 分级所分离的化合物被认为是相同的， 因此只选择 1 次。
使用 Flexanalysis 2.4Build 11(Bruker Daltonics) 和 Apex 峰寻找算法， 生成 峰列表， 并且 S/N 大于 6。使用 0.2m/z 的宽度， 用 Savitzky Golay 算法， 使 MS 扫描平滑， 并 且使用平坦度为 0.8 的 Median 算法实现基线扣除。
对于针对从基因组研究所 (The Institute for Genomic Research)(TIGR) 的网 页 (www.tigr.org) 获得的牙龈卟啉单胞菌数据库所查询的 MS/MS 数据， 使用 MASCOT 搜寻 引擎 (MASCOT 第 2.1.02 版， MatrixScience)， 实现蛋白鉴定。MASCOT 搜寻参数是 ： 电荷 状态 1+， 以胰蛋白酶作为蛋白酶， 允许一个未切割 (missed cleavage)， 并且 MS 的公差为 250ppm， MS/MS 峰的公差为 0.8m/z。固定修饰设定为半胱氨酸的脲基甲基， 并且可变修饰为C- 末端 18O 标记的赖氨酸和精氨酸残基。
使用前述的反向数据库策略 (32) 测定忽略单个肽鉴定的假阳性所要求的最小肽 MASCOT 得分。简而言之， 数据库由正常方向的每个预测的牙龈卟啉单胞菌蛋白的序列以及 反向序列的相同蛋白 (3880 个序列 ) 组成。 然后用所有 MS/MS 数据集搜寻组合的数据库， 以 测定获得 0％的假阳性的最低 Mascot 得分。 假阳性被定义为与反向序列的阳性匹配 ( 粗体、 红色并且高于肽阈值得分 )。单个采样肽 (hits peptide) 的假阳性速率经测定为 0.5％， 并且 Mascot 肽离子得分大于阈值， 且小于 25。当 Mascot 肽离子得分大于 30 时， 与反向数 据库没有匹配。根据 Mascot 评分算法， 为了增加单个采样肽鉴定的置信度， 我们使用了大 于 50 的最小 Mascot 肽离子得分， 其获得了比使用 30 的得分时低两个数量级的错误鉴定的 概率。
使 用 下 述 标 准 评 价 匹 配 的 肽 i) 具 有 对 应 于 小 于 0.05 的 p 值 的 基 于 概 率 的 得分的至少 2 个特异性肽段被认为是鉴定为阳性的 ( 要求粗体红色匹配 )， 其中得分 是 -log×10log(P)， P 为观察到的匹配是随机事件的概率 (33)， ii) 当在特定蛋白的鉴定中 只使用了一个特异性肽段时 ( 重或者轻标记的肽的鉴定被认为是一个 )， MASCOT 肽离子得 分必须大于 50， 或者在 4 个独立的实验 (2 个生物学重复和 2 个技术重复 ) 的超过一个的实 验中鉴定了该肽。18 由于一个或两个 18O 原子混合地并入肽、 O 同位素天然丰度的贡献以及 H218O 纯度 (a ＝ 0.97)， 使用下述公式以数学方式修正肽的比率 R ：
R ＝ (I1+I2)/I0 (1)
根据下述公式计算 I0、 I1 和 I2(27)
I0 ＝ S0-(1-a)I1(3)
其中 S0、 S2 和 S4 分别为没有 18O 标记的肽的单同位素峰的测量强度， 高于单同位素 峰 2Da 的峰， 和高于单同位素峰 4Da 的峰 ( 图 1A)。J0、 J2 和 J4 是肽的同位素外膜的相应的理论相对强度， 由 MS-Isotope(http://prospector.ucsf.edu) 计算。然而， 当第二同位素 峰 (S1 和 S5) 比第一同位素峰 (S0 和 S4) 更强时， 将该比率简单地计算为 S1 除以 S5。这是真 实的， 特别是对于大于 2000m/z 的大肽而言， 其中 16O 标记的肽的第五同位素峰对 S4 峰的 贡献变得显著。通过作为实验 S4 的百分比的实验 S2 和理论 S2(J2) 之间的差别， 计算混合并 16 18 入的 O O。
通过求相同蛋白的所有鉴定的肽的平均数来测定蛋白的丰度比率， 甚至当在多于 一个凝胶部分中鉴定了相同的蛋白时也是如此。 将来自每个 “正常” 重复的数据与来自其各 自 “反向” 重复的反比组合， 从而获得每个生物学重复中每种蛋白的平均比率和标准误差。 然后以与以前报道的类似的方式 (34、 35) 进行两个生物学重复的标准化。简而言之， 将每个生物学重复的平均比率乘以系数， 从而使该比率的几何平均数等于 1。
ICAT 标记的血红素限制和过量的细胞的制备和分析
蛋白标记和分离基于使用可切割的 ICAT 试剂 (Applied Biosystems) 的 geLC-MS/ MS 方法 (Li et al.， 2003)。PCT/AU2007/000890 采用了另一种蛋白质组方法， 在此将其通 过引用并入。 首先用 TCA(16％ ) 将蛋白沉淀， 然后用 6M 尿素、 5mM EDTA、 0.05％ SDS 和 50mM pH 8.3 的 Tris-HCl 将蛋白溶解。使用 BCA 蛋白试剂来测定蛋白浓度， 并将该浓度调整至 1mg/ml。 在 37℃下， 使用 2μl 50mM 三 (2- 羧乙基 ) 膦盐酸盐将来自每个生长条件的 100μg 的蛋白单独还原 1h。 然后， 用 ICAT 重试剂将来自血红素限制生长条件的还原的蛋白烷基化， 并用 ICAT 轻试剂将来自血红素过量生长条件的蛋白烷基化。然后将两个样品合并， 并在预 制的 Novex 10％ NUPAGE 凝胶 (Invitrogen) 上进行 SDS-PAGE。将该凝胶用 SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen) 染色 5min， 之后用水脱色。然后从凝胶的顶部至染料的前端将该 凝胶泳道切成 20 份。
将切下的部分进一步切成 1mm3 的方块， 在凝胶内过夜消化并按照上文的方法提 取两次。将合并的上清液在减压下干燥至约 50μL， 然后在按照生产商的说明书 (Applied Biosystems) 加样于亲和柱上前， 将该上清液与 500μL 亲和加样缓冲液混合。将洗脱的肽 干燥， 并在 37℃下用纯化的 TFA 切割生物素标签 2h， 然后在减压下干燥。将干燥的样品悬 浮于 35μL 含于 0.1％ TFA 的 5％乙腈中。 利 用 与 ultiMate 纳 米 LC 系 统 (LC Packings-Dionex) 偶 联 的 EsquireHCT 离 子 阱 质 谱 仪 进 行 MS。 利 用 LC Packings 反 相 柱 (C18 PepMap100， 75μm i.d.×15cm，
3μm，) 实 现 分 离， 并 利 用 下 述 乙 腈 梯 度 在 0.1 ％ 甲 酸 中 洗 脱 ： 0-5min(0 ％ )、5-10min(0 ％ -10 ％ )、 10-100min(10 ％ -50 ％ )、 100-120min(50 ％ -80 ％ )、 120-130min(80％ -100％ )。
将 LC 的输出直接通过界面连接至纳米喷雾离子源。在 m/z 范围为 300-1500 与离 子电荷控制为 100000 的条件下， 进行 MS 采集， 并且最大积累时间为 100ms。当使用 GPF 时， 使用三个另外的 m/z 范围 (300-800、 700-1200 和 1100-1500) 选择前体离子， 并重复进行每 个 m/z 范围以增加所鉴定的肽的数目。 从 100-3000m/z 的质量范围内获得 MS/MS 采集， 对高 达 10 个的前体进行 MS/MS 采集以用于初始的完整蛋白质组分析， 并且对 3 个前体进行 MS/ MS 采集以用于最大强度的多电荷离子的 ICAT 分析， 并且主动排除时间 (active exclusion time) 为 2min。 使用利用 Apex 峰寻找算法的 DataAnalysis 3.2(Bruker Daltonics) 产生峰列 表， 该算法的化合物检测阈值为 10000， 信噪比阈值为 5。为输出数据设定 +2 和 +3 的整体 电荷限制。对于针对从基因组研究所 (TIGR) 的网页 (www.tigr.org) 获得的牙龈卟啉单胞 菌数据库所查询 MS/MS 数据， 利用 MASCOT 搜寻引擎 (MASCOT 2.1.02， MatrixScience)， 实现 蛋白的鉴定。 利用下述标准进一步评价匹配的肽 ： i) 具有对应于最大 0.05 的 p 值的基于概 率的 Mowse 得分的肽被认为是阳性鉴定的， 其中得分是 -log×10log(P)， P 为观察到的匹配 是随机事件的概率， ii) 当在特定的蛋白鉴定中只使用了一种肽， 并且 MASCOT 得分小于 30 时， 进行该光谱的人工验证。为了增加 ICAT 标记的蛋白， 特别是那些具有单个肽采集的蛋 进行了下述另外的过滤 ： i)ICAT 对的重和轻肽必须表现出如从它们 白的鉴定中的置信度， 的提取离子层析中所鉴定的接近的洗脱峰 ii) 对于具有单个特异性肽段的蛋白， 该肽必须
被鉴定多于一次 ( 例如， 在不同的 SDS-PAGE 分级中， 或在轻和重 ICAT 这两种形式中 )iii) 如果单个肽不满足 (ii) 的标准， 则 MASCOT 得分必须大于等于 25， 期望值小于等于 0.01， 并 且 MS/MS 光谱必须表现出连续系列的 “b” 或 “y” 型离子， 并且考虑了强离子。假阳性的确 定如上文所述。
同 位 素 重 13C 比 轻 12C ICAT 标 记 的 肽 的 比 率， 利 用 DataAnalysis(Bruker Daltonics) 的脚本来测定， 并基于单个 MS 光谱中的单同位素峰强度 ( 信号强度和峰面积 ) 来人工核实， 进行人工核实。用于定量的母离子的最小离子数目为 2000， 尽管超过 96％的 重和轻前体离子都大于 10000。在分辨率很差的光谱情况下， 由母离子的重新构建的提取 离子层析 (extracted ion chromatograms， EIC) 的面积来测定比率。计算源自单个母蛋白 (partent protein) 的多个肽的平均值， 利用 α ＝ 0.05 的 Grubb 检验 (Grubb’ s test) 移 除无关项。
牙 龈 卟 啉 单 胞 菌 蛋 白 的 细 胞 定 位 利 用 CELLO(http://cello.life.nctu.edu. tw(36)) 来预测。细胞外、 外膜、 内膜和胞质的预测被认为来自外膜组分。
在无细胞培养上清液 ( 未接种的、 血红素过量和血红素限制 ) 中的短链脂肪酸的 浓度， 通过基于 Richardson 等人的衍生法 (37) 的毛细管气相层析来测定。
两个生物学重复之间的相关系数 (r) 利用来自 Microsoft Excel 的 Pearson 相关 系数函数来评价。方差的系数 (CV) 通过用肽丰度比率除以平均值的标准偏差来计算， 并且 表示为百分数。
用于转录物组学分析 (transcriptomic analysis) 的核酸的提取
从直接收获自恒化器的 5ml 牙龈卟啉单胞菌细胞的样品中提取 RNA。向每个样品 中添加 0.2 体积的 RNA 稳定剂 ( 含于纯乙醇的 5％ v/v 的苯酚溶液 )。通过离心 (9000g， 5min， 25℃ ) 使细胞成团， 立即在液氮中将细胞团冷冻， 并保存于 -70℃， 用于后续处理。将 10 冷冻的细胞每 1×10 个细胞悬浮于 1ml 的 TRIzol 试剂 (Invitrogen) 中， 然后利用 Lysing Matrix B 玻 璃 珠 (MP Biomedicals) 和 Precellys 24 匀 浆 器 (BerlinTechnologies， France) 将该细胞分解。按照 TRIzol 的生产商 (Invitrogen) 的方法， 除了在 RNA 沉淀阶段 添加了乙醇 ( 终浓度为 35％ ) 而不是异丙醇以外， 通过离心除去玻璃珠， 并将 RNA 组分纯 化， 然后将样品转移至 IIIustra RNAspin Mini RNA 分离试剂盒 (GE Healthcare) 的旋转 离心柱中 (spin-column) 中。 按照生产商的说明书纯化来自上文结合步骤的 RNA， 包括柱上 (on-column) 的 DNA 酶处理以移除残留的 DNA。利用 Experion 自动电泳工作站 (Bio-Rad) 来测定 RNA 的完整性。
利用 Dneasy 血液和组织试剂盒 (Qiagen)， 按照生产商的说明书， 从以连续培养的 方式生长的牙龈卟啉单胞菌细胞中提取基因组 DNA。
微阵列设计、 杂交和分析
微 阵 列 芯 片 (microarray slide) 由 Australian Genome ResearchFacility 印制， 并由 1977 个定制设计的、 用于牙龈卟啉单胞菌 W83 基因组的预测的蛋白编码区的 60mer( 单元单体 ) 寡核苷酸探针组成， 该编码区包括 Los Alamos National Laboratory Oralgen 项目所预测的其他蛋白编码区在内。包括了微阵列样品库 (Microarray Sample Pool， MSP) 对 照 探 针， 以 辅 助 依 赖 于 强 度 的 标 准 化。 将 所 有 探 针 (full complement ofprobes) 印制至涂覆了 Corning UltraGAPS 的芯片上， 每个微阵列芯片印制 3 次。利用用 Cy3 标记的血红素过量或血红素限制的样品将芯片杂交， 该样品与用 Cy5 标记的通用基因组 DNA 参考 (GE Lifesciences) 组合。利用 Superscript plus 间接 cDNA 标记系统 (Invitrogen)， 用 5μg 随机六聚体 (Invitrogen) 引发 cDNA 合成反应， 由 10μg 总 RNA 合成 cDNA。利用 Amersham CyDye 标记后反应染料包 (post-labelling reactive dyepack)(GE Lifesciences) 将 cDNA 用 Cy3 标记， 并利用 Invitrogen 标记系统的纯化模块 将 cDNA 纯化。 利用 BioPrime Plus Array CGH 间接基因组标记系统 (Invitrogen)， 以类似 的方法， 由 400ng DNA 合成 Cy5-dUTP 标记的基因组 cDNA。
杂交前， 在 42℃下， 将微阵列芯片浸入封闭溶液 (35％甲酰胺、 1％ BSA、 0.1％ SDS、 5×SSPE[1×SSPE 是 150mM NaCl、 10mMNaH2PO4、 1mM EDTA]) 达 1h。封闭后， 在 H2O 中， 然后 在 99％乙醇中将芯片短暂地洗涤， 然后通过离心干燥。将标记的 cDNA 再悬浮于在 95℃下 变性 5min 的 55μL 的杂交缓冲液中 (35％甲酰胺、 5×SSPE、 0.1％ SDS、 0.1mg mL-1 鲑鱼精 子 DNA)， 然后将 cDNA 应用于芯片并用 LifterSlips(Erie Scientific) 覆盖。在 42 ℃下 将杂交进行 16h。杂交后， 将芯片在 0.1 ％ SDS 加 2×SSC[1×SSC 是 150mM NaCl、 15mM 柠 檬酸钠 ](42℃下达 5min， 在室温下进行所有另外的洗涤 )、 0.1％ SDS 加 0.1×SSC(10min)、 0.1×SSC( 洗涤 4 次， 每次 1min) 中连续洗涤， 然后快速地浸入 0.01×SSC， 然后浸入 99％乙 醇中， 并利用离心干燥该芯片。
利 用 GenePix 4000B 微 阵 列 扫 描 仪 扫 描 芯 片， 并 利 用 GenePix Pro6.0 软 件 (Molecular Devices) 分析图像。对于表示 3 个生物学重复的每次处理 ( 血红素限制或血 红素过量 )， 使用 3 个芯片。
利用 GenePix Pro 6.0 软件 (Molecular Devices) 进行图像分析， 并在进一步的 分析中使用 “变形 (morph)” 背景值作为背景估计。 为了鉴定差异表达的基因， 使用 LIMMA 软 件包， 截止值 (cut off) 为 P ＜ 0.005。在阵列中， 通过经由 MSP 对照斑点拟合整体黄土曲 线 (global loesscurve)， 并将该曲线应用于所有其他的斑点， 进行标准化。 利用 Benjamini Hochberg 方法控制假发现率， 以修正多重测试。
基因预测基于来自基因组研究所 (TIGR， www.tiqr.org) 的牙龈卟啉单胞菌 W83 基 因组注释。由微生物在线 (Microbesonline) 网页 (http://microbesonline.org) 进行操 纵子预测。
利用 DNA 微阵列分析所测定的牙龈卟啉单胞菌对血红素限制的应答
在与蛋白质组分析所用相同的生长条件下， 对血红素限制生长对牙龈卟啉单胞菌 整体基因表达的影响进行 DNA 微阵列分析。来自 3 个生物学重复的数据的分析鉴定了总共 160 个基因， 所述基因表现出血红素过量和血红素限制之间的统计学显著差异调控， 并且大 部分这些基因在血红素限制的条件下表现出表达水平的增加， 只有 8 个基因被下调了。预 测许多上调的基因位于操纵子中， 并且其中的大部分表现出转录物水平上的类似变化 ( 表 3 和 5)。转录物组数据和蛋白质组数据之间有广泛的一致性， 并且两组数据之间有显著的 相关性， 其中观察到了对血红素限制的差异调控 [Spearman 相关性 0.6364， p 小于 0.05]。 然而， 对于经蛋白质组分析表现出丰度差异的某些蛋白而言， 相应基因的转录物组分析没 有检测到 mRNA 丰度的任何统计学显著差异。微阵列分析仅旨在鉴定编码如蛋白质组分析 所测定的丰度变化很大的蛋白的那些基因 ( 表 3 和 5)。 当发现来自相同基因的蛋白和转录 物被血红素限制明显地调控时， 大部分蛋白和转录物表现出相同的调控方向。两个基因产物是例外， 即 CTD 家族推断的细胞表面蛋白酶 PG0026 和菌毛蛋白 (FimA)PG2132。 这些蛋白 的丰度在血红素限制条件下的蛋白质组分析中下降， 但是经转录物组分析预测被上调。这 两种蛋白都位于细胞表面， 并且很有可能， 它们从细胞表面释放或者被翻译后修饰， 这能够 将它们从在蛋白质组分析中被鉴定为上调中排除。
牙龈卟啉单胞菌对 Frd 抑制剂的易感性
在液体培养中进行 Frd 抑制剂对牙龈卟啉单胞菌的影响。简而言之， 将 W50 培养 8 在 200mL BHI 培养基中至 OD 为 0.6( 约 2.9×10 cfu/mL)。然后将细胞再悬浮于新鲜的生 长培养基中至终浓度为 2.5×107cfu/mL。将双羟萘酸奥克太尔 (oxantel pamonate)、 柠檬 酸莫仑太尔 (morantel citrate) 和噻苯达唑 (Sigma) 溶解于 DMSO 中以获得 250mM 的储存 浓度。然后将 4μL 检测溶液与 196μL 细胞悬浮液混合， 并转移至 96 孔平底板， 然后在厌 氧和 37℃的条件下孵育， 并且在 50 小时的时间段内， 通过利用 iEMS 全自动定量绘图酶标仪 (microplate reader)(Labsystems OY Research Technologies Division) 测量 620nm 的 光密度来进行每小时的监测。在不同抑制剂的存在下， 牙龈卟啉单胞菌的平均每代时间通 过用倍增时间 [(Log10Nt-Log10N0)/Log102] 除以时间 (Nt-N0) 来计算， 其中 Nt 和 N0 分别是时 间 t 和时间 0 时的细胞群体。
Frd 抑制剂对牙龈卟啉单胞菌生物膜的影响
如以前所述， 测定了在静态 96 孔模型中， 48h 内， 牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成。 简而言之， 在将牙龈卟啉单胞菌 ATCC 33277 细胞与检测物质混合， 然后转移至 96 孔平底 板并在 37℃下厌氧孵育前， 将牙龈卟啉单胞菌 ATCC 33277 细胞再悬浮至最终细胞密度为 7 2.5×10 。通过用 250μL 超纯水将细胞洗涤两次以除去松散粘附的细胞， 然后在 37℃下干 燥达 3h， 进行 24h 和 48h 的生物膜质量的评价。然后将干燥的生物膜在 0.1％结晶紫溶液 中染色 15min， 并用 250μL 超纯水洗涤两次。然后在将生物膜转移至用于测量 620nm 的光 密度的新 96 孔板前， 通过重复的吸液， 利用 80％乙醇和 20％丙酮将该结晶紫染色从生物膜 溶解达 2min。
流式细胞生物膜培养和 CSLM 分析
流式细胞中牙龈卟啉单胞菌 ATCC 33277 的生物膜培养， 类似于以前所述的培养， 不过有某些修改。在厌氧培养室 (MK3 Anaerobicworkstation ； Don Whitley Scientific Ltd.) 中建立三通道流式细胞系统 (Stovall Life Science， USA)， 并且改进是将硅泵管 (Gilson， France) 和活塞用于细菌生物膜的孵育、 检测和染色。将所有的部分组装， 并将 0.5％次氯酸钠泵入系统， 并保持过夜以使系统灭菌。然后在添加生长培养基前， 用无菌水 (200mL) 冲刷系统。用 1mL 指数生长的稀释至 0.1OD600 的牙龈卟啉单胞菌接种系统。在补 充了 0.1g/L 半胱氨酸、 1mg/L 氯化血红素和 1mg/L 维生素 K 的 5× 稀释的 BHI(Oxoid) 的恒 流前， 将该系统孵育 1h。18h 后， 将 1mL 125μM 或 12.5μM 的奥克太尔或无菌水注入系统 的每个通道中， 并孵育达 30min。 将培养基的流动恢复另外的 10min 以洗去由于检测而未结 合的细胞。然后用 BacLight 染色 (Molecular Probes) 将生物膜原位染色 ( 参见下文 )。
在倒转镜台的 Meta 510 共焦显微镜 (Zeiss) 上进行细菌生物膜的共焦激光扫 描显微术 (CLSM)。利用 63× 的物镜以 512×512 的像素 ( 每像素 0.28μm)， 并且每帧在 143.86μm(x)×143.86μm(y) 对全部生物膜厚度上 (z) 每个 2μm 厚的水平 (xy) 光学数字 (optodigital) 剖面进行成像。为确定生物膜各处的再现性， 在每个通道的 488nm 和 568nm的波长下， 从两个生物学重复的每一个的随机位置获得 5 个图像。将获得的所有图像利用 COMSTAT 软件来分析。微菌落被定义为大于 500 个像素数的细胞簇。
被奥克太尔处理分散的细胞的生存力
为了检测被奥克太尔处理分散的细胞的生存力， 进行了如上所述的静态生物膜测 定， 但是有轻微的改变。简而言之， 允许牙龈卟啉单胞菌 (ATCC 33277) 在 18h 的孵育后， 在 24 孔微板中形成生物膜。首先除去自由浮动的浮游细胞， 并将该生物膜用 PBS 洗涤一次。 向每孔中添加 1mL 125μM 或 12.5μM 的奥克太尔或无菌水 ( 阳性对照 )， 并将该孔孵育达 30min。仍然存活的分散的牙龈卟啉单胞菌细胞的数目， 在 BHI 中连续稀释后， 在马血琼脂 板上， 通过培养分析来测定。
统计学分析
两个生物学重复之间的相关系数 (r) 利用来自 Microsoft Excel 的 Pearson 相关 系数函数来评价。方差的系数 (CV) 通过用肽丰度比率除以平均值的标准偏差来计算， 表示 为百分数。
连续培养与生物膜的形成
将牙龈卟啉单胞菌 W50 以连续培养的方式培养超过 40 天的时间段， 在该过程 中， 培养物的细胞密度在开始的十天后保持不变， 并且生物学重复 1 和 2 的 OD650 分别为 2.69±0.21 和 2.80±0.52。这相当于约 3mg 细胞干重 /mL 的细胞密度。在这个时间段内， 在发酵罐的垂直玻璃壁上发展了牙龈卟啉单胞菌细胞的生物膜。 这种生物膜收获时的厚度 为约 2mm。
使用 BSA 对 16O/18O 定量方法的验证
为了确定 16O/18O 定量方法的精确度和可重复性， 将已知量的 BSA 加样至相邻的 凝胶泳道， 以获得 1 ∶ 1、 1 ∶ 2、 1 ∶ 5 和 10 ∶ 1 的比率 ( 图 1B)。在 H216O 或 H218O 的存 在下， 将条带进行凝胶内胰蛋白酶消化 (in-geltryptic digestion)、 混合， 然后通过 LC MALDI-MS/MS 进行分析。 所有 4 个比率的单个 BSA 胰蛋白酶消化肽段的一套典型光谱表现出 18 两个 O 原子优选并入， 通过 BSA 比率为 10 ∶ 1 的 +4Da 峰的优势以及通过 1 ∶ 1 的光谱中 几乎对称的双峰， 非常清楚地观察到了这种情况， 这既简化了定量也简化了鉴定 ( 图 1A)。 18 基于 1 ∶ 1 的标记 ( 附表 )， 单个 O 原子的平均并入估计小于 7 ％。对于 1 ∶ 1(3 次 )、 2 ∶ 1( 和 1 ∶ 2)、 1 ∶ 5 和 10 ∶ 1 的比率， 所有鉴定的 BSA 肽的计算平均比率为 0.98±0.12、 2.22±0.26、 4.90±0.75 和 10.74±2.04， 这分别表示好的动态范围、 ±2 ％ -11 ％的高精 确度以及 11.75 ％ -18.95 ％的低 CV 范围 ( 表 1)。1 ∶ 1 的混合物 ( 进行三次 ) 的可重 复的精确度暗示标记偏差很低。还通过只利用在两个实验中都得以鉴定的肽， 比较比率为 2 ∶ 1 的正常和反向标记的 BSA， 证实了这一点。正常比率测定为 2.11±0.33， 而反向测定 为 2.30±0.20( 表 1)。
生物膜样品和浮游样品的定量分析的实验设计
本研究的设计包括使用两个独立连续培养的两个生物学重复， 每个重复分成从容 器的壁上获得的生物膜样品和从容器的液体内容物获得的浮游样品。 每个生物学重复进行 了两个技术重复， 尽管我们已经确定用 BSA 无明显标记偏差， 但是我们选择使用反向标记 16 18 策略， 因为缺乏对复杂生物样品进行的 O/ O 标记验证研究 (30)。因此， 总共有 4 个实验， 每个实验由源自 2×10 个凝胶片段的 10 个 LC-MALDI MS/MS 运行 (run) 组成。图 2 示出来自生物膜 / 浮游样品的两个正常和反向标记的肽的典型 MS 和 MS/MS 光 谱， 这表明了典型的反向标记方式。和用 BSA 数据一样， 可以看出， 有高水平的双 18O 并入， 对于所有的肽， 平均混合并入经计算小于 15％， 这证实 16O/18O 蛋白水解标记方法对复杂样 品也是有效的 ( 数据未显示 )。还通过 +2Da 种类的相对很少的 Mascot 采样进一步肯定了 双重标记的肽的优势。重标记的肽的 MS/MS 光谱还揭示了 Y 离子中预期的 +4Da 偏移 ( 图 2)。
技术重复之间的相关性
为了比较生物学数据的技术重复， 将每对正常和反向标记的实验的转换成 Log10 的蛋白丰度比率互相作图 ( 图 3)。 这些点的线性回归表明， 每一对是高度相关的， 并且生物 2 学重复 1 和 2 的 R 值分别为 0.92 和 0.82。每个线性拟合的斜率也和期望值 1 接近， 生物 学重复 1 和 2 的斜率为 0.97 和 0.93， 这分别表明技术重复之间没有标记偏差 ( 图 3)。计 算来自技术重复的蛋白丰度比率的平均值， 以获得每个生物学重复的单个比率。
生物学重复之间的相关性
在比较两个生物学重复的平均数据前， 将每个生物学重复的蛋白丰度比率标准 化， 以获得 1.0 的平均比率。来自两个生物学重复的标准化的蛋白丰度的作图， 表现出紧密 的以 0 为中心的高斯样分布 ( 图 4A)， 这与其他人所述的情况类似 (40、 41)。两个生物学重 复之间有显著的正相关性 (Pearson 相关系数 r ＝ 0.701， p ＜ 0.0001)， 这表明能够将生物 膜 / 浮游培养物的生长和样品的所有下游过程再现至令人满意的水平。为了确定哪些蛋白 在两个生物学重复中都被一致地调控， 构建了简单的排名表， 其中根据蛋白的丰度比率， 将 它们分成 6 组 (A-F)， 然后根据基于组的相关性， 将它们排名为 1-6， 并且当来自两个生物学 重复的蛋白都落在相同的组时， 排名为 1 的蛋白具有最高的相似性 ( 图 4B)。利用排名表， 我们能够确定， 在从两个重复中所鉴定的 81 种 (42％ ) 蛋白中， 有 34 种蛋白排名第一， 这明 显地高于随机相关性的期望值 17％ ( 或 1/6)。大部分剩余的蛋白排名第二， 因此， 总共 70 种蛋白 (86.4％ ) 被认为在两个实验中都被类似地调控 ( 排名为 1 或 2， 表 2)。
基于测量的 2 ∶ 1 BSA 标记实验的标准偏差 (±0.26)( 表 1)， 当蛋白丰度变化与 1.0 的不同为标准偏差大于 3 时 ( 大于 1.78 或者小于 0.56)， 认为蛋白丰度变化是生物学 显著的 (18、 42)。利用这个标准， 在两个重复中都鉴定的 81 种蛋白中， 有 47 种蛋白的丰度 明显地发生了变化 ( 基于平均比率 )， 并且其中 42 种蛋白排名为 1 或 2( 表 2)。在排名为 1 和 2 的 42 种蛋白中， 24 种蛋白的丰度明显地增加了， 而 18 种蛋白的丰度下降了。
表现出协调调控的代谢途径的酶
在利用 ICAT 标记策略的血红素限制与血红素过量的研究中， 鉴定了参与谷氨酸 / 天冬氨酸分解代谢的 20 种蛋白 ( 表 3)。 在这些蛋白中， 鉴定了催化直接参与将谷氨酸代谢 成丁酸的 8 个步骤中 6 个步骤的酶， 并发现这些酶在血红素限制的条件下增加了 1.8-4 倍 ( 图 6， 表 3)。尽管利用 ICAT 没有检测到另外 2 种催化酶 (PG0690， 4- 羟丁酸 CoA- 转移酶 和 PG1066， 丁酸 - 乙酰乙酸 CoA- 转移酶 )， 但是在与表 3 中所报道的那些蛋白相当的高离 子强度下， 发现它们存在于另外的定性研究中 ( 未显示 )， 并且属于表现为受到上调的操纵 子。 另一方面， 血红素限制对天冬氨酸分解代谢途径酶的丰度的影响是混合的， 并且在氧化 降解途径中催化天冬氨酸分解成草酰乙酸的酶没有发生变化， 且参与将丙酮酸转换成乙酸 的酶增加了 2-4.4 倍。经由天冬氨酸还原途径， 共同催化富马酸转化成琥珀酸的两种含铁的富马酸还原 酶即 FrdA(PG1615) 和 FrdB(PG1614) 的丰度， 在血红素限制下培养的细胞中明显地降低了 ( 图 6， 表 3)。在操纵子中编码的这两种蛋白 (Baughn et al.， 2003)， 响应血红素限制， 表 现出类似的丰度变化 (FrdA L/E ＝ 0.35 ； FrdB L/E ＝ 0.25)。
有机酸终产物的分析
在生长于血红素限制下的牙龈卟啉单胞菌的已耗尽的培养基 (spent culture medium) 中， 乙酸、 丁酸和丙酸的量分别是 13.09±1.82、 7.77±0.40 和 0.71±0.05mmole/ g 细胞干重。在生长于血红素过量下的牙龈卟啉单胞菌的已耗尽的培养基中， 乙酸、 丁酸和 丙酸的水平分别是 6.00±0.36、 6.51±0.04 和 0.66±0.07mmole/g 细胞干重。
Frd 抑制剂对牙龈卟啉单胞菌生长的影响
不同浓度的三种抗蠕虫剂奥克太尔、 莫仑太尔和噻苯达唑在 50 小时内对牙龈卟 啉单胞菌 W50 生长的影响示于图 7、 8 和 9 中。如在以前报道的研究和 W50 单独的牙龈卟 啉单胞菌的类似 MGT 中所见的 (43、 44)， DMSO 对生长的影响是可以忽略的。这三种抑制剂 对牙龈卟啉单胞菌生长影响最严重的是奥克太尔 ( 图 7)。从生长曲线明显可见， 浓度大于 15μM 的奥克太尔对牙龈卟啉单胞菌的生长有正抑制。奥克太尔的最小抑菌浓度 (MIC) 如 以前所述 (45) 经测定为 112μM。如对奥克太尔的 subMIC 所见的， 奥克太尔渐增的浓度与 较高的 MGT 还有显著的相关性 ( 图 7A)。 莫仑太尔的杀菌效果可比较地低于奥克太尔， 并且 MIC 为约 3mM， 但是在 subMIC 下仍然表现出明显的抑制效果 ( 图 8)。噻苯达唑看起来对牙 龈卟啉单胞菌的生长没有非常明显的抑制效果， 并且明显地要求大于 1mM 来表现轻微的生 长抑制效果 ( 图 9)。综上所述， 不同的 Frd 抑制剂抑制效果的次序估计为奥克太尔＞＞莫 仑太尔＞噻苯达唑。
亚最小抑菌浓度的奥克太尔对生物膜形成的影响
将对牙龈卟啉单胞菌生长具有最严重影响的奥克太尔用于研究其对生物膜形成 的影响。在生物膜检测中， 用牙龈卟啉单胞菌菌株 ATCC33277 代替 W50， 因为 W50 在大部分 环境下仅形成不好的生物膜。由于奥克太尔对菌株 ATCC 33277 的生长抑制效果类似于在 125μM 的浮游测定中对 W50 的生长抑制效果， 因此这代表了研究奥克太尔对生物膜形成的 好的模型。低达 0.1μM 的亚最小抑菌浓度 (SubMIC) 的奥克太尔在 24h 时， 明显地减少了 生物膜的质量 ( 图 10A)， 尽管在 48h 时， 对生物膜质量具有抑制效果需要 3.9μM 或更高的 浓度 ( 图 10B)。
奥克太尔对生物膜分散的影响
为了更仔细地研究 SubMIC 的奥克太尔对牙龈卟啉单胞菌生物膜的影响， 使用了 流式细胞培养系统。当用奥克太尔处理成熟的生物膜时， 生物膜的深度和微菌落的大小有 明显的减小 (P ＜ 0.01)， 而对照和处理样品之间的微菌落的数目没有明显变化 ( 图 11-13， 表 6)。
从生物膜释放的牙龈卟啉单胞菌保持活力， 特别是用 12.5μM 奥克太尔处理的生 物膜 ( 图 14)。与奥克太尔处理的细胞相比， 未处理的对照细胞看起来对分散更具有抵抗 力。 从生物膜回收的细胞的数目与在 CLSM 下所观察到的数目一致 ( 图 11-13)， 并且对照样 品中细胞的数目明显更多。
上文的结果表明了蛋白丰度的变化， 该变化在浮游牙龈卟啉单胞菌粘附至固体表面并成长为成熟的单物种生物膜的一部分时发生。 这是第一个利用 Gygi 小组的 geLC MS 方 16 18 法 (46) 或 O/ O 蛋白水解标记方法测定蛋白丰度变化的细菌生物膜与浮游生长的对比研 究， 而到目前为止所公开的所有其他此类研究都利用了基于 2D 凝胶电泳的方法 (10-12)。 成功地利用了两个技术重复和两个生物学重复 16O/18O 反向标记方法定量和验证了蛋白丰 度的变化。
牙龈卟啉单胞菌的连续培养
在本研究中， 与分批培养的更常规的方法相反， 以连续培养的方式培养牙龈卟啉 单胞菌。由于诸如以下的批次之间的变化， 分批培养向细菌分析中导入了大范围和程度的 变量 ： 接种体的大小和生存力、 收获时细菌的准确生长阶段、 培养基中可用营养物的水平以 及培养基的氧化还原电势等。 在连续培养中， 使细菌在严格控制的条件下生长许多代， 该条 件包括生长速率、 细胞密度、 营养物浓度、 温度、 pH 以及氧化还原电势 (44、 47、 48)。以前的 研究证明， 在不同实验室的恒化器中连续培养的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 转 录物组分析的高水平的再现性 (49)。 而且， 在我们的研究中， 生物膜细胞和浮游细胞这两者 的生长都在单个发酵容器中进行， 与分离培养相比， 这减少了变异性。 在 86.4％已鉴定蛋白 ( 排名 1 和 2) 的生物学重复之间， 本研究所观察到的牙龈卟啉单胞菌细胞外膜蛋白丰度的 16 一致变化， 表明连续培养系统和 O/18O 蛋白水解标记策略适用于分析生物膜生长对牙龈卟 啉单胞菌蛋白质组的影响。 18
O 标记的效率
由于 SDS-PAGE 方法提供的膜蛋白的高分辨率和可溶性， 本研究所用的基本蛋白 质组方法是 geLC MS 方法 (46、 50)。在与其他人所述的方法 (26-29) 类似的凝胶内消化方 18 法期间， 将本方法与单个 O 标记反应组合。 有效的标记应当将两个 18O 原子并入至每个肽的 C- 末端， 并且应当抵抗与 16O 的反交换 (back-exchange)。在我们用 BSA 的研究中发现情况 就是如此， 其中单个 18O 原子的并入水平据估计小于 7％， 并且发现各种 BSA 实验所获得的平 16 均比率并未发现明显地偏好 O( 表 1)， 这表明与普通水的反交换不成为问题。对于生物学 样品而言， 也获得了类似的结果。有效的 18O 标记的关键步骤是需要完全除去天然 H216O， 然 18 后使用 “单消化 (single-digestion)” 方法， 在胰蛋白酶消化前， 将蛋白再溶解于 H2 O 中。 尽管许多研究使用了 “双消化 (doubledigestion)” 方法 (51、 52)， 但是该单酶切消化方法 18 具有获得更高 O 标记效率的优势， 而在双消化方法中， 某些胰蛋白酶消化的肽在初始消化 16 18 后， 不能将它们任何 C- 末端 O 原子交换为 O 原子 (53)。我们还使用了凝胶内消化方法， 其中如任何标准的凝胶内消化方法一样， 利用有机溶剂， 在初始脱水步骤期间， 将蛋白保持 16 在凝胶基质中。完全除去任何痕量的天然 H2 O 是在真空下， 通过离心的冷冻干燥实现的， 而蛋白仍然在凝胶基质中， 以防止初始冷冻干燥步骤期间进一步吸附损失。在含有大量过 18 量的胰蛋白酶的 H2 O 中进行再水合和凝胶内消化， 该胰蛋白酶也在 H218O 中被还原。在消 化方法期间， 并入了第一个 18O 原子后从凝胶中释放的胰蛋白酶消化的肽， 可以进行过量的 胰蛋白酶介导的第二个羰基氧交换过程。这应当促进第二个羰基氧的取代， 因为释放的肽 18 比蛋白具有更高的可溶性， 从而获得更高水平的双重 O 标记的胰蛋白酶消化的肽 ( 图 1 和 2； (54))。为了防止与普通水的反交换， 通过煮沸使胰蛋白酶失活， 这在以前就被证明是有 效的 (51、 54)。 另外， 在加样至纳米 LC 前， 只将干燥、 失活的混合物再悬浮并立即混合， 以便 将自发的交换降至最低， 尽管这种自发交换已经被证实为是低的 (15、 40)。反向标记
在稳定的同位素标记和利用 MS 定量的情况下， 在标记和离子化方法期间潜在地 导入了误差。这些误差包括 MALDI 方法期间标记的潜在的不同亲和力， 和重或轻标记的肽 的可能的抑制效果 (13、 55)。常规技术重复包括重复相同的标记， 能够导致对特定标记的 未修正的偏差， 或者由于污染峰而导致具体肽的随机误差的增加。我们的正常和反向标记 的技术重复证明了高度的相关性， 并且生物学重复 1 和 2 的散点图斜率分别为 0.97(R2 ＝ 0.92) 和 0.93(R2 ＝ 0.82)( 图 3)， 这接近无标记偏差的预期比率 1.0。这些斜率还表明， 该 方法对于蛋白评估、 凝胶加样、 凝胶切割和凝胶内消化而言是可再现的。偏差的缺乏表明， 诸如微阵列实验中常用的染料交换或 LOWESS 数据标准化的标准化途径 (35) 可能是不必要 的。 然而， 当考虑轻微污染肽对 18O/16O 比率的计算的影响以及需要验证变化极大的肽时， 比 本研究所用的细菌细胞外膜明显复杂的样品仍然要求反向标记验证。 除了提供修正系统误 差的评估和方法以外， 反向标记设计还有助于使重和轻标记的肽这两者都易于鉴定， 因为 MS/MS 采集方法只选择片段的每个重 / 轻对中最强的肽。 通过这种方式， 减少了错误分配的 可能性。据我们所知， 除了最近的 17 种细胞色素 P450 蛋白的定量 (26、 30) 以外， 这是在复 16 18 杂生物样品中的第一个反向 O/ O 标记的报道。
生物膜与浮游培养
我们已经证明了生物学重复之间强烈的正相关性 (r ＝ 0.701， p ＜ 0.0001)， 这表 明了生物膜形成和发展的再现性。通过观察到 81 种可定量的蛋白中的 70 种蛋白在两个生 物学重复中都表现出类似的比率这一发现， 也观察到了这一情况 ( 表 2， 排名 1 或 2)。超过 四分之三的本研究所鉴定的牙龈卟啉单胞菌蛋白是通过大于 2 个的特异性肽段鉴定的， 这 进一步增加了本标记方法的鉴定和定量的置信度。 在从两个生物学重复都一致地鉴定的 81 种蛋白中， 47 种蛋白的丰度在从浮游至生物膜状态的转变中明显地变化了。检测到的蛋白 质组， 特别是细胞外膜中蛋白质组的丰度百分比的变化， 与对诸如绿脓假单胞菌的生物膜 形成细菌的其他研究是一致的， 其中超过 50％的检测的蛋白质组在浮游和成熟生物膜生长 期之间表现出明显的丰度变化 (12)。 我们还观察到牙龈卟啉单胞菌的细胞外膜蛋白质组中 对作为生物膜生长的各种应答。 还发现以前被证明对生物膜培养做出反应而丰度发生变化 的许多蛋白在我们的研究中丰度也发生了变化。明显地发现某些蛋白的丰度变化高达 5 倍 ( 表 2)， 这表明了对生物膜培养做出反应的蛋白质组的主要变化。
代谢
牙龈卟啉单胞菌的主要能量来源是源自氨基酸的发酵， 该氨基酸是通过宿主蛋白 的蛋白水解以肽的形式获得的 (47、 80、 81)。 牙龈卟啉单胞菌的主要分解代谢途径是谷氨酸 和天冬氨酸的发酵， 其中谷氨酸被代谢为丁酸、 丙酸和氨， 而天冬氨酸被代谢为丁酸、 丙酸、 乙酸和氨 ( 图 6)。以前的报道已经表明牙龈卟啉单胞菌优先使用来自培养基的天冬氨酸 / 天冬酰胺、 谷氨酸 / 谷氨酰胺、 苏氨酸、 丝氨酸、 亮氨酸和缬氨酸 (47、 81、 82)。
与 谷 氨 酸 分 解 代 谢 有 关 的 两 种 牙 龈 卟 啉 单 胞 菌 蛋 白， PG1076(L/E ＝ 1.8) 和 PG1078(L/E ＝ 2.0) 的丰度在血红素限制期间明显地增加了。这些蛋白由排列在预测的大 操纵子的 15 个基因编码。这些基因的上游是编码丰度在血红素限制期间也增加的推断蛋 白和保守的推断蛋白的两个基因 ( 分别是 PG1067， L/E ＝ 2.4 和 PG1068， L/E ＝ 1.7)。这 个大操纵子的分析还表明， 以许多铁调控基因为特征的推断的 Fur 共有序列结合区 (83)，这表明这种表达可能被铁的可用性所控制。 尽管我们预期操纵子中所有编码的蛋白的倍数 变化是相同的， 但是在所有的情况下这并不都是必需的， 因为转录物水平有时不与蛋白水 平关联 (84)。这可能是由于翻译后修饰或者转录物的稳定性， 从而允许细胞事件的基本调 控在蛋白水平上发生， 而 mRNA 的丰度无明显变化。
由两种细胞质酶 FrdA(1615) 和 FrdB(1614) 以及跨膜的酶 FrdC(1616) 组成的异 源三聚琥珀酸 - 醌氧化还原酶 (SQOR) 复合物经由天冬氨酸途径将富马酸催化转化成琥珀 酸。 两种细胞质富马酸还原酶， FrdA(PG1615) 和 FrdB(PG1614) 的丰度在血红素限制 ( 分别 是 3 和 4 倍 ) 和生物膜生长 ( 分别是 17 和 5.9 倍 ) 中培养的细胞中明显地下降了。在操 纵子中编码的这两种蛋白 (85) 对血红素限制 (FrdA L/E ＝ 0.35 ； FrdBL/E ＝ 0.25) 和生物 膜生长 (FrdA B/P ＝ 0.06 ； FrdB B/P ＝ 0.17) 都表现出类似的丰度变化。以前在脆弱拟杆 菌 (Bacteroides fragilis) 中的研究表明， 血红素对于细胞色素 b 依赖的 Frd 复合物的合 成是必需的 (86)。考虑到牙龈卟啉单胞菌不能从头合成 PPIX， 因而在血红素限制生长条件 下的牙龈卟啉单胞菌中观察到较低水平的 Frd 并不奇怪。脆弱拟杆菌和牙龈卟啉单胞菌这 两者的生长研究表明， 它们的生长要求血红素， 并且这种要求能够部分地被外源琥珀酸代 替 (87、 88)。利用生长不被血红素刺激而被添加的琥珀酸刺激的脆弱拟杆菌 Frd 缺陷突变 体也证实了这个观察结果 (85)。摩尔生长量研究还表明， 脆弱拟杆菌 Frd 缺陷突变体具有 类似于血红素限制野生型菌株的 ATP 产量。在最优生长期间， 琥珀酸被转化成琥珀酰 CoA， 以用于进入能量产生途径或用于必需氨基酸 ( 赖氨酸和甲硫氨酸 ) 的生物合成。这些研究 证明了将天冬氨酸转化成琥珀酸对平衡生长的重要性。在血红素过量的条件下， 被牙龈卟 啉单胞菌分解代谢的一部分天冬氨酸通过富马酸还原酶 (FrdA 和 FrdB) 开始被还原成琥珀 酸， 然后通过谷氨酸途径被分解代谢而产生丁酸 ( 图 6)。 在血红素限制期间， 这些富马酸还 原酶丰度的降低 3-4 倍， 表明较少的天冬氨酸将进入谷氨酸分解代谢途径， 因此大部分分 解代谢的天冬氨酸将经由氧化途径被转化成乙酸 ( 图 6)。为了检验这个假设， 我们在以连 续培养方式培养的牙龈卟啉单胞菌的耗尽培养基上进行了有机酸分析。 这个研究表明与在 血红素过量条件下产生的乙酸水平 (6.00±0.36mmole/g 细胞干重 ) 相比， 在血红素限制条 件下产生了 2 倍多的乙酸 (13.09±1.82mmole/g 细胞干重 )， 而其他主要的终产物， 丁酸和 丙酸的水平在两种生长条件下是类似的。 这与我们天冬氨酸发酵所用的途径有偏移的假设 是一致的。 催化丙酮酸转化成乙酸的酶 ( 乙酸激酶 PG1081、 磷酸转乙酰酶 PG1082 和丙酮酸 铁氧还蛋白 PG0548) 的丰度的增加也与在耗尽培养基中发现的乙酸的量的增加是一致的 (表2； 图 6)。
因此， 这些结果促使我们研究通过抑制这种脆弱的代谢调控途径来控制细菌的方 法。
富马酸还原酶抑制剂对生长的影响
我们已经证明了在牙龈卟啉单胞菌的生物膜生长期间 Frd 复合物的丰度下降 17.0 倍和 5.9 倍 ( 分别是 FrdA 和 FrdB)， 这甚至大于血红素限制生长期间 FrdA 和 FrdB 下 降 3 倍和 4 倍。 Frd 复合物一致的较低丰度与细菌生长减少相关， 该细菌生长减少既与生物 膜生长条件期间和血红素限制生长条件期间两者的血红素限制有关。 Smith 等人 (89) 以前 证明， 曲状杆菌 (Campylobacter spp) 的 Frd 活性在对数生长的培养物中更高， 但是在进入 稳定期时下降。因此， 这表明 Frd 活性限制了生长速率， 这使 Frd 显得重要而成为吸引人的新治疗靶标。 富马酸呼吸是最广泛类型的厌氧呼吸， 并且是唯一的代谢中间体， 该代谢中间 体已知充当电子受体， 产生约 0.5ATP/ 电子， 形成终产物琥珀酸 (90)。 Shah 和 William(91) 报道， 牙龈卟啉单胞菌从天冬氨酸产生琥珀酸， 并且 Takahashi 等人 (81) 认为产生的琥珀 酸被转化成琥珀酰 CoA， 然后该琥珀酰 CoA 被转化成丁酸或丙酸。
已 证 明 通 常 用 于 治 疗 动 物 和 人 的 蠕 虫 感 染 的 抗 蠕 虫 剂， 对幽门螺旋杆菌 (Helicobacter pylori) 和空肠弯曲杆菌 (Campylobacter jejuni) 有抑制和杀菌效果 (89、 94)。已经证实， 这些药物中的一种， 奥克太尔是幽门螺旋杆菌 (H.pylori) 和空肠弯曲 杆菌 (C.jejuni) 的富马酸还原酶的抑制剂， 可能通过未知的机制作用于 Frd 复合物的亲水 亚基 (94-96)。
有趣的是， 并非所有的厌氧菌具有 Frd， 并且当 Frd 被抑制时， 具有 Frd 的某些细菌 具有用于生存的替代生化途径 (97、 98)。 因此， 牙龈卟啉单胞菌的生存力受到 Frd 抑制剂存 在的严重影响这一发现 ( 图 7-10) 表明， 生长绝对必须的酶和来自天冬氨酸途径的 ATP 的 贡献， 在牙龈卟啉单胞菌的幸存中起关键的作用。由于人和其他动物缺乏 Frd 复合物 (92、 93)， 所以 Frd 抑制剂提供了抗病原体导致的疾病的靶标， 特别是那些对 Frd 有基本需求的 病原体。
富马酸还原酶抑制剂对生物膜形成的影响
下文示出 Frd 抑制剂对牙龈卟啉单胞菌形成生物膜的能力的影响。 subMIC 奥克太 尔浓度下生物膜质量的减少是非常有趣的， 因为这表明存在最佳的生物膜形成所要求的最 小量的 Frd 或能量。
subMIC 浓度的 Frd 抑制剂对 Frd 的部分抑制能够被转换成， 例如营养不良环境中 的类似信号。例如， 在包括绿脓假单胞菌和大肠杆菌在内的许多细菌中详细地记录了碳调 控的生物膜形成， 因此在营养限制的条件下， 该生物膜形成被诸如 RpoS、 Crc 和 CsrA 的转 录调节子所调节 (99-101)。在大肠杆菌中， csrA 基因编码整体调节蛋白即 CsrA( 碳储存 调节子 )， 该调节蛋白抑制某些代谢途径， 例如糖原合成和糖原异生 (101、 102)。大肠杆菌 中 csrA 的破坏导致生物膜形成增强 (101、 103)， 并且有趣的是， 由于 CsrA 对其他靶标的影 响， 鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella enterica serovar Typhimurium) 中 CsrA 同源物的激活 导致上皮细胞侵入的增加 (104、 105)。因此， 非常吸引人的推断是， 由于 Frd 活性降低引起 的 ATP 水平较低， 血红素限制的牙龈卟啉单胞菌不大可能形成生物膜， 因为包括内化蛋白 (internalin) 在内的这些宿主细胞侵入蛋白被上调以促进逃入上皮细胞中， 直至营养缺乏 结束。
与浮游状态相比， 生物膜状态期间的糖酵解酶， 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 的 丰度更高， 这与以前从单核细胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 和绿脓假单胞 菌获得的结果是一致的 (12、 106)。尽管 GAPDH 被分类为与糖酵解和糖异生有关的四聚 NAD 结合酶， 但是许多报道认为这种蛋白是多功能的， 并且当表达于革兰氏阳性菌的细胞表面 时， 其看起来与纤维蛋白溶酶、 纤维蛋白溶酶原和转铁蛋白的结合有关 (107、 108)。有趣的 是， 已证实口腔链球菌 (Streptococcus oralis) 和牙龈卟啉单胞菌 33277 之间的共聚集， 是由牙龈卟啉单胞菌菌毛和口腔链球菌 GAPDH 之间的相互作用介导的 (109)。 然而， 如果存 在， GAPDH 在牙龈卟啉单胞菌的底物结合中的确切作用还不得而知。
生物膜形成与 生 物 膜 细 胞 相 比， 浮 游 细 胞 中 通 用 应 激 蛋 白 (universal stressprotein) (UspA) 的丰度明显更高。发现各种细菌中 Usp 的产生受大量条件刺激， 例如进入稳定期、 某些营养物的缺乏、 氧化剂或其他刺激物 (110、 111)。浮游期细胞丰度的增加与以下事实 一致， 即牙龈卟啉单胞菌已经进化成作为生物膜的一部分而生长， 以及浮游期可能更有压 力。牙龈卟啉单胞菌中 UspA 的表达被认为与生物膜形成有关， 因为 uspA 的失活导致由浮 游细胞形成的早期生物膜变薄 (112)。在本研究中， 生物膜已经建立并成熟， 因此其看起来 对 UspA 的需求不如自由漂浮的浮游细胞。
发现内化蛋白家族蛋白 InlJ(PG0350) 的同源物的丰度在生物膜状态期间更高。 已经证实， PG0350 对牙龈卟啉单胞菌 33277 的生物膜形成是重要的， 因为基因的失活导致 生物膜的形成减少 (39)。 生物膜中更高水平的 PG0350 表明， 这种蛋白可能不仅是初始生物 膜形成必需的， 而且还充当使牙龈卟啉单胞菌互相结合或与生物膜中的细胞外基质结合的 粘附素。
功能未知的蛋白
本研究中鉴定的最大的组的蛋白是 41 种功能未知的蛋白， 其包括在本研究中首 次鉴定的 4 种蛋白 ( 表 2)。在 41 种鉴定的蛋白中， 预测 37 种蛋白来自细胞外膜， 并且在这 一组中， 17 种蛋白在生物膜和浮游细胞之间表现出明显的变化。大部分这些蛋白与有确定 的名字但是功能还不明确的 GenBank 蛋白具有同源性。特别令人感兴趣的是， 发现某些蛋 白的丰度在生物膜状态中基本上一致地增加， 所述蛋白即 PG0181、 PG0613、 PG1304、 PG2167 和 PG2168。
上文的结果表示应用于复杂混合物的 16O/18O 蛋白水解标记方法的大规模验证， 并 且首次用该方法比较细菌生物膜和浮游生长状态。发现多种具有各种功能的蛋白的丰度， 在生物膜细胞中一致地增加或减少， 这表明了细胞是如何适应生物膜条件的， 并且还为生 物膜控制策略提供了潜在的靶标。 实施例
为了帮助示例体现本发明的涉及治疗的方面的组合物， 提供了下文的实施例。 下文是牙膏制剂的实施例。 成分 ％ w/w 二水磷酸氢钙 50.0 甘油 20.0 羧甲基纤维素钠 1.0 十二烷基硫酸钠 1.5 月桂酰肌氨酸钠 0.5 食用香料 1.0 糖精钠 0.1 葡萄糖酸氯己定 0.01 葡聚糖酶 0.01 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.2 水 平衡下文是牙膏制剂的实施例。 成分 ％ w/w 二水磷酸氢钙 50.0 山梨醇 10.0 甘油 10.0 羧甲基纤维素钠 1.0 十二烷基硫酸钠 1.5 月桂酰肌氨酸钠 0.5 食用香料 1.0 糖精钠 0.1 单氟磷酸钠 0.3 葡萄糖酸氯己定 0.01 葡聚糖酶 0.01 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.2 水 平衡 下文是牙膏制剂的实施例。 成分 ％ w/w 二水磷酸氢钙 50.0 山梨醇 10.0 甘油 10.0 羧甲基纤维素钠 1.0 月桂酰二乙醇胺 1.0 蔗糖单月桂酸酯 2.0 食用香料 1.0 糖精钠 0.1 单氟磷酸钠 0.3 葡萄糖酸氯己定 0.01 葡聚糖酶 0.01 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.1 水 平衡 下文是牙膏制剂的实施例。 成分 ％ w/w 山梨醇 22.0 爱尔兰藓 1.0 氢氧化钠 (50％ ) 1.0 Gantrez 19.0 水 ( 去离子 ) 2.69 单氟磷酸钠 0.76 糖精钠 0.3焦磷酸 2.0 水合氧化铝 48.0 风味油 (flavouring oil) 0.95 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.3 十二烷基硫酸钠 2.00 下文是液体牙膏制剂的实施例。 成分 ％ w/w 聚丙烯酸钠 50.0 山梨醇 10.0 甘油 20.0 食用香料 1.0 糖精钠 0.1 单氟磷酸钠 0.3 葡萄糖酸氯己定 0.01 乙醇 3.0 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.2 亚油酸 0.05 水 平衡 下文是漱口剂制剂的实施例。 成分 ％ w/w 乙醇 20.0 食用香料 1.0 糖精钠 0.1 单氟磷酸钠 0.3 葡萄糖酸氯己定 0.01 月桂酰二乙醇胺 0.3 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.2 水平衡 下文是漱口剂制剂的实施例。 成分 ％ w/w S-97 甘油 10.0 风味油 0.4 单氟磷酸钠 0.05 葡萄糖酸氯己定 0.01 月桂酰二乙醇胺 0.2 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.3 水 平衡 下文是锭剂制剂的实施例。292.成分 ％ w/w 糖 75-80 玉米糖浆 1-20 风味油 1-2 NaF 0.01-0.05 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.3 硬脂酸镁 1-5 水 平衡 下文是牙龈按摩膏制剂的实施例。 成分 ％ w/w 白矿脂 8.0 丙二醇 4.0 十八烷醇 8.0 聚乙二醇 4000 25.0 聚乙二醇 400 37.0 蔗糖单硬脂酸酯 0.5 葡萄糖酸氯己定 0.1 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.3 水 平衡 下文是牙周凝胶制剂的实施例。 成分 ％ w/w 普卢龙尼克 F127( 来自 BASF) 20.0 十八烷醇 8.0 双羟萘酸奥克太尔 3.0 TM 胶态二氧化硅 ( 例如， 200 ) 葡萄糖酸氯己定 0.1 水 平衡 下文是口香糖制剂的实施例。 成分 ％ w/w 香糖胶基 30.0 碳酸钙 2.0 结晶山梨醇 53.0 甘油 0.5 风味油 0.1 生物膜抑制剂 ( 双羟萘酸奥克太尔 ) 0.3 水 平衡 16 18 表1： 利用 O/ O 蛋白水解标记预测定的 BsA 比率的定量1.0
a) 对于 1 ∶ 1 的预期比率， 仅将在所有三个独立实验中都被鉴定的肽包括于本表 b) 对于 2 ∶ 1 和 1 ∶ 2 的预期比率， 仅将在两个实验中都被鉴定的肽包括于本表 **n ＝ 55 ***n ＝ 24格中
格中
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