间充质细胞的制造方法、 牙的制造方法及牙形成用间充质 细胞 技术领域 本发明涉及用于形成牙的间充质细胞的制造方法、 牙的制造方法及牙形成用间充 质细胞 (mesenchymal cell)。
背景技术 牙是具有最外层为牙釉质、 其内层为象牙质的硬组织， 进而在象牙质的内侧具有 产生象牙质的牙本质细胞、 进一步在中心部具有牙髓的器官， 有时因龋齿或牙周病等而失 去。通常， 认为牙损失对性命的威胁少， 所以现在主要通过义齿或种植牙来修补。但是， 牙 的有无严重影响外观和对食物的味觉， 并且从维持健康和维持高品质生活的观点来看， 对 开发牙的再生技术的关注越来越高。
认为牙因胎儿期的产生过程的诱导而形成， 是根据多种细胞种类构筑的功能单 元， 与器官和脏器相同。 因此， 牙并不是由成体内的造血干细胞或间充质干细胞之类干细胞 产生细胞种的干细胞体系产生的。由此可知， 现在， 仅因再生医疗进步而移入干细胞 ( 干细 胞移入疗法 ) 不能再生牙。
为此， 近年， 使用分离的牙胚细胞再构筑牙胚， 通过移植该再构成牙胚进行牙再 生， 正以这为中心进行研究。
例如， J.Dent.Res.， 2002， Vol.81(10)， pp.695-700 中公开了下述内容， 将从牙胚 分离的上皮系细胞或间充质的牙囊细胞等细胞与生物体吸收性的载体一起移植到大鼠的 腹腔内， 由此再生牙样组织。
作为牙胚的再生方法， 例如日本特开 2004-331557 号公报中记载了在纤维芽细 胞增殖因子等生理活性物质的存在下培养由生物体分离的牙胚细胞。另外， 日本特开 2004-357567 号公报中提出了将从生物体中分离的牙胚细胞与能分化上述细胞的细胞中的 至少一种与含有纤维蛋白的载体一起培养的方案， 此处， 含有纤维蛋白的载体使用牙胚的 目标形状的载体， 形成具有特定形态的 “牙” 。
美国专利申请公开第 2002/0119180 号公报及美国专利申请公开第 2004/0219489 号公报中公开了下述方法 ： 从 6 个月的猪的下颚骨中， 将来自形成象牙质的牙髓的间充质 细胞与含有利于形成釉质的上皮系细胞的牙胚的细胞混合物接种在使由聚乙醇酸 - 聚乙 酸共聚物构成的生物分解性聚合物固化的载体 (Scaffold) 中， 移植到动物体内， 形成牙。 此处， 还记载了作为载体， 使用牙胚的目标形状的载体， 形成具有特有形态的 “牙” 。
另一方面， 国际公开第 2005/014070 号小册子中公开了用于治疗具有骨缺损或损 伤的患者的牙的再生方法。根据该方法， 在聚乙醇酸丝网载体上接种例如来自牙胚的间充 质细胞后， 将上皮系细胞与胶原一起重叠或用上皮细胞片包裹， 由此形成骨。需要说明的 是， 国际公开第 2005/014070 号小册子中， 为了构筑骨的形状而使用载体。
另外， 国际公开第 2006/129672 号小册子中公开了下述技术 ： 将来自牙胚的上皮 系细胞与间充质细胞分别制成细胞集合体后， 使细胞集合体密接在胶原胶内部， 边保持该
状态边培养， 由此制造具备牙特有的细胞配置的牙。
但是， 上述技术中， 为了再生牙或牙胚， 从生物体中获得牙胚细胞或能分化成该细 胞的细胞。由此， 在使用从生物体中采集的细胞的技术中， 有时能获得的细胞数不充分。另 外， 有时细胞的获得源有限。
另外， 发挥作为组织的功能时， 必须将构成组织的多种细胞配置 ( 细胞配置 ) 在适 当的相对位置， 具有作为组织的方向性。 发明内容 本发明是鉴于上述情况而得到的， 提供牙形成用间充质细胞的制造方法、 牙的制 造方法及牙形成用间充质细胞。
本发明的第一方案提供一种间充质细胞的制造方法， 其是用于形成牙的间充质细 胞的制造方法， 该方法包括下述步骤 ： 在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞， 生成含有 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集 团； 从所述分化诱导处理后的细胞集团中筛选 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞作为牙形成用间充质细胞。
本发明的第二方案在于提供一种牙的制造方法， 所述方法包括下述步骤 ： 使实质 上仅由间充质细胞与上皮系细胞中的任一种构成的第 1 细胞集合体、 和实质上仅由任意其 它一种细胞构成的第 2 细胞集合体在不混合的情况下密接地配置在支持载体的内部 ； 在所 述支持载体的内部培养所述第 1 与第 2 细胞集合体， 其中所述间充质细胞含有上述牙形成 用间充质细胞。
本发明的第三方案是提供由全能性干细胞诱导的 CD44 阳性且 CD29 阳性、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性的牙形成用间充质细胞。
根据本发明， 可以提供能有效且大量制作目标牙的间充质细胞的制造方法、 及有 效且大量制造牙的牙的制造方法， 所述牙保持有由牙釉质及象牙质得到的特有的细胞配 置。
附图说明 [ 图 1] 是示意地表示牙胚形成的概念图。
[ 图 2A] 是表示本发明实施例 1 的 EC 细胞的 CD44 及 CD29 双重染色的状况的图。
[ 图 2B] 是表示本发明实施例 1 的 DMSO 处理后第 6 天的细胞的 CD44 及 CD29 双重 染色的状况的图。
[ 图 2C] 是本发明实施例 1 中的筛选得到的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞的 CD44 及 CD29 双重染色的状况的图。
[ 图 3A] 是概念地表示本发明实施例的、 使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细 胞的牙胚再构筑顺序的图， 是表示细胞配置前的凝胶包装 (gelpack) 的状况的图。
[ 图 3B] 是概念地表示本发明实施例的、 使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细 胞的牙胚再构筑顺序的图， 是表示将第一细胞集合体配置在凝胶包装内的状况的图。
[ 图 3C] 是概念地表示本发明的实施例的、 使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系 细胞的牙胚再构筑的顺序的图， 是表示将第二细胞集合体配置在凝胶包装内的状况的图。
[ 图 3D] 是概念地表示本发明实施例的、 使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细 胞的牙胚再构筑的顺序的图， 是表示将配置有第一细胞集合体与第二细胞集合体的凝胶包 装固化的状况的图。
[ 图 4A] 是本发明实施例 4 的由牙胚上皮组织与牙胚间叶细胞制作而成的牙胚的 HE 染色像 ( 倍率 ： 100 倍 )。
[ 图 4B] 是由本发明实施例 4 的由牙胚上皮组织与 DMSO-EC 细胞制作而成的牙胚 的 HE 染色像 ( 倍率 ： 100 倍 )。
[ 图 4C] 是本发明实施例 4 的由牙胚上皮组织与 DMSO-EC 克隆化细胞制作而成的 牙胚的 HE 染色像 ( 倍率 ： 100 倍 )。
[ 图 5A] 是表示本发明实施例 5 的、 EC 细胞的 CD44 及 CD29 的双重染色的状况的 图。
[ 图 5B] 是表示本发明实施例 5 的、 RA 处理后第 7 天的细胞的 CD44 及 CD29 的双 重染色的状况的图。
[ 图 5C] 是表示本发明的实施例 5 的、 筛选得到的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞的 CD44 及 CD29 双重染色的状况的图。
[ 图 6] 是本发明实施例 5 中由通过 RA 处理得到的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞与 牙胚上皮组织制作而成的牙胚的 HE 染色像 ( 倍率 ： 200 倍、 bar 为 50μm)。
[ 图 7A] 是表示本发明实施例 6 的、 EC 细胞的 CD44 及 CD106 的双重染色状况的 图。
[ 图 7B] 是本发明实施例 6 中的 RA 处理后第 7 天的细胞的 CD44 及 CD106 的双重 染色的状况的图。
[ 图 7C] 本发明实施例 6 中筛选得到的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的 CD44 及 CD106 的双重染色的状况的图。 具体实施方式
[ 间充质细胞的制造方法 ]
本发明的间充质细胞的制造方法是制造用于形成牙的间充质细胞的方法， 其包括 下述步骤 ： 在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞， 生成含有 CD44 阳性且 CD29 阳性细 胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集团 ； 从所述分化诱导处理后 的细胞集团中筛选 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞作为牙形成 用间充质细胞。
本发明发现， 分化诱导全能性干细胞而得到的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞可以用作牙形成用间充质细胞。由此， 也可以从来自生物体的牙或 牙胚以外的物质中得到用于制作牙所需的间充质细胞， 得到用于形成牙的间充质细胞， 因 此可以排除使用来自生物体的牙等的必要性。结果， 不需要考虑从牙胚直接采集的细胞数 不充分的情况或获得场所有无限制的情况就可以容易地根据情况大量得到所需量的间充 质细胞。
本发明中， 所谓 “牙” ， 是指在内侧连续地具有象牙质及在外侧连续地具有牙釉质 层的组织， 特别是指具有牙冠或牙根的具备方向性的组织。牙的方向性可以由牙冠或牙根的配置来特定。牙冠或牙根可以基于形状或组织染色等通过肉眼观察来确认。所谓牙冠， 是指具有牙釉质与象牙质的层结构的部分， 牙根不存在牙釉质层。
象牙质及牙釉质可以由本领域技术人员通过组织染色等形象且容易地特定。另 外， 牙釉质可以通过釉质芽细胞的存在来特定， 釉质芽细胞的存在可以通过有无牙釉质蛋 白来确认。 另一方面， 象牙质可以通过牙本质细胞的存在来特定， 牙本质细胞的存在可以通 过有无牙本质涎蛋白来确认。 牙釉质蛋白与牙本质涎蛋白的确认可以通过该领域中周知的 方法容易地实施， 例如可以举出原位杂交、 抗体染色等。
另外， 为了形成牙， 首先为了形成牙胚， 可以使用本发明的间充质细胞。
本发明中， “牙胚” 及 “牙芽” 是根据后述的发生阶段而区别得到的物质中在没有特 别说明时使用的表现。 所谓此时的 “牙胚” ， 是指决定将来成为牙的牙的初始胚， 是在牙的产 生阶段中从通常所用的蕾状期 (Bud stage) 至钟状期 (Bell stage) 的阶段， 特别是未确认 作为牙的硬组织的特征即象牙质、 牙釉质蓄积的组织。另外， 所谓 “牙芽” ， 是指由本发明中 所用的 “牙胚” 的阶段过渡而来的、 从开始蓄积作为牙的硬组织特征即象牙质、 牙釉质的阶 段开始到牙从牙肉开始萌芽发挥通常作为牙的功能前的阶段的组织。
由牙胚向牙的产生通过如图 1 所示的个体产生的过程中， 经由蕾状期、 帽状期、 钟 状前期及后期的各个阶段来进行。此处， 在蕾状期， 处于上皮系细胞包裹间充质细胞的状 态， 至钟状前期及钟状后期时， 上皮系细胞部分形成外侧的牙釉质， 间充质细胞部分在内部 形成象牙质。因此， 通过上皮系细胞与间充质细胞的细胞间相互作用， 由牙胚形成牙。 需要说明的是， 本发明中， 所谓 “间充质细胞” ， 是指来自间叶组织的细胞， 所谓 “上 皮系细胞” ， 是指来自上皮组织的细胞。
另外， 本发明中， 所谓 “牙周组织” ， 是指牙的主要形成外层的牙槽骨及牙根膜。牙 槽骨及牙根膜可以由本领域技术人员通过组织染色等形象且容易地特定。
以下， 说明本发明的牙形成用间充质细胞。
用于得到本发明的牙形成用间充质细胞的全能性干细胞是指具有能分化为至少 2 种以上细胞的多分化能力的细胞， 可以优选使用选自由胚性癌细胞、 胚性干细胞、 胚性生殖 干细胞构成的组中的细胞。其中， 从获得容易性的观点考虑， 较优选为胚性癌细胞 ( 以下称 为 “EC 细胞” )。能应用于本发明的 EC 细胞可以为来自神经、 睾丸、 卵巢等任一种组织的细 胞。作为上述 EC 细胞， 例如， 作为来自人的 EC 细胞， 可以举出 NCR-G3 细胞以及 NTERA-2 细 胞， 作为来自小鼠的 EC 细胞， 可以举出 c-1300 细胞或 F9 细胞、 LT-2 细胞、 OTT6050 细胞、 PCC4 细胞、 P19 细胞、 METT-1 细胞、 STT-3 细胞等细胞株。上述细胞可以适当根据使用目的 从来自哺乳动物的灵长类 ( 例如人、 猴等 )、 有蹄类 ( 例如猪、 牛、 马等 )、 小型哺乳类的啮齿 类 ( 例如小鼠、 大鼠、 兔等 ) 各种动物的细胞中选择。例如， 作为来自小鼠的胚性癌细胞株， 可以举出上面记载的细胞株或这些细胞株的派生克隆。
全能性干细胞的培养中可以使用通常使用的培养基。作为用于培养的培养基， 可 以使用通常用于培养动物细胞的培养基、 例如 Dulbcco’ sModifed Eagle Medium(DMEM) 等。 上述培养基中可以添加用于促进细胞增殖的血清或添加例如 FGF、 EGF、 PDGF 等细胞增殖因 子或转铁蛋白等已知的血清成分来代替血清。另外， 添加血清时的浓度可以根据此时的培 养状态适当变更， 但通常可以为 10％。细胞的培养可使用通常的培养条件， 例如在 37℃的 温度下、 在浓度为 5％的 CO2 的恒温箱内的培养。另外， 可以适当添加链霉素等抗生素。
本发明中， 通过在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞来进行分化诱导处理。 通过该分化诱导处理， 由全能性干细胞生成含有 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性 且 CD106 阳性细胞的细胞集团。通过诱导处理而得到的细胞集团中含有上述 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞即可， 也可以含有上述两种细胞。
作为上述分化诱导剂， 只要是至少能由全能性干细胞分化诱导为 CD44 表达细胞 的 CD44 阳性细胞诱导因子， 就可以使用。作为上述 CD44 阳性细胞诱导因子， 可以举出神经 嵴细胞系诱导因子、 神经嵴细胞产生相关因子、 神经嵴细胞增殖促进因子。神经嵴细胞系 诱导因子是可以将全能性干细胞诱导为神经嵴细胞或其派生细胞 ( 平滑肌细胞、 心肌细胞 等 ) 的因子， 可以举出例如二甲基亚砜 (DMSO)、 Dex、 cAMP、 六亚甲基二乙酰胺、 5’ - 氮杂胞 苷、 TGFβ、 Noggin 等。作为神经嵴细胞产生相关因子， 可以举出视黄酸 (RA)、 BMP-4、 BMP-7、 Shh、 Wnt、 FGF2、 内皮素 -1、 内皮素 -3、 活化素 βA、 PDGF、 VEGF 等。作为神经嵴细胞增殖促 进因子， 可以举出 FGF2、 FGF8、 FGF10、 BMP-2、 SCF、 活性型维生素 D3 等。神经嵴细胞系诱导 因子、 神经嵴细胞产生相关因子及神经嵴细胞增殖促进因子没有分别明确地区别， 并且可 以单独使用上述分化诱导剂或组合 1 种以上进行使用。其中， 优选能有效生成下述本发明 的目标细胞集团的 DMSO 及 RA， 上述分化诱导剂可以单独或组合使用。 上述分化诱导剂可以按照能分化诱导的浓度添加在全能性干细胞的培养基中。 此 处所谓能分化诱导的浓度， 根据所用的分化诱导剂的种类和全能性干细胞的种类等不同而 不同。
例如， 为 DMSO 时， 通常相对于培养基的容量， 为 0.5 容量％～ 10 容量％， 从对处理 的细胞的生存率及通过培养得到的目标细胞的获得效率的观点来看， 优选为 2.5 容量％～ 5 容量％、 更优选为 4 容量％～ 5 容量％的浓度。为 2.5 容量％以上的浓度时， 可以充分诱 导全能性干细胞分化， 另一方面， 如果为 5 容量％以下的浓度， 则不会显著损害获得目标细 胞的效率。
另外， 为 RA 的情况下， 通常在培养基中为 0.1μM ～ 10μM， 从对处理的细胞的生存 率及通过培养得到的目标细胞的获得效率的观点来看， 可以优选为 0.5μM ～ 5μM、 更优选 为 0.5μM ～ 2μM 的浓度。如果为 0.1μM 以上的浓度， 则可以充分诱导全能性干细胞的分 化， 另一方面， 如果为 10μM 以下的浓度， 则不会显著损害获得目标细胞的效率。
对于全能性干细胞的分化诱导处理可以通过在上述分化诱导剂的存在下培养全 能性干细胞来进行。分化诱导处理 ( 培养 ) 期间根据分化诱导剂的浓度与细胞的生长活性 而不同， 但通常为 2 小时～ 3 天， 从细胞的存活率以及目标细胞的获得效率的观点来看， 可 以优选为 6 小时～ 24 小时。设定为 6 小时以上可以效率良好地得到被充分分化诱导的细 胞， 设定为 24 小时以下不会显著损害效率。
另外， 为了有效引发对全能性干细胞的分化诱导， 在分化诱导处理的期间与分化 诱导剂的浓度之间有一定的关系。即， 通常在分化诱导剂存在下的培养期间 ( 处理时间 ) 因分化诱导剂的浓度与分化诱导剂的种类而不同， 但在特定的分化诱导剂的情况下， 固定 培养天数时， 通常存在最适合其浓度的浓度区域。另外， 缩短培养天数时， 最佳浓度区域移 动到高浓度侧， 相反， 延长培养天数时， 最佳浓度区域移动到低浓度侧。 考虑到上述因素， 能 通过调节培养天数来得到在幅度较宽的浓度区域中的分化诱导效果， 同时本领域技术人员 可以容易地设定能得到诱导效果的最佳浓度区域。
由上述分化诱导处理而得到的分化诱导处理后的细胞集团中生成含有 CD44 阳性 且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的细胞集团。也可以含有上述两种细胞。 然后， 该分化诱导处理后的细胞集团被供给到筛选 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳 性且 CD106 阳性细胞作为牙形成用间充质细胞的筛选处理中。
细胞的筛选只要是可以筛选上述本发明的间充质细胞的方法即可， 可以使用任意 方法。 作为上述筛选方法， 可以举出以基因表达蛋白、 细胞表面抗原、 形态等为基准的筛选， 可以使用上述的一种或二种以上来筛选全能性干细胞。从筛选细胞的效率的观点来看， 筛 选方法优选使用以细胞表面表达为基础的细胞分选仪， 为了确实地筛选间充质细胞， 优选 使用多个组合、 特别是组合基因表达谱与细胞表达抗原的表达来使用。
本发明中筛选得到的牙形成用间充质细胞除显示 CD44 阳性之外， 还显示 CD29 阳 性或 CD106 阳性的细胞性状。已知 CD44 是作为透明质酸受体在细胞表面表达的膜蛋白质。 另一方面， 已知 CD29 是作为整连蛋白 β1 分子在细胞表面表达的膜蛋白质， 分别报道有在 EC 细胞中表达为弱阳性， 在间充质细胞中以 mRNA 水平来表达的情况。另外， 已知 CD106 是 作为粘连分子而已知的 VCAM-1 分子， 通常主要作为上皮系细胞的标记使用。如果是显示上 述性状的细胞， 则可以在下述牙的形成中作间充质细胞使用。 本发明的牙形成用间充质细胞只要是除了 CD44 阳性之外， CD29 及 CD106 中的至 少一种抗原也表现为阳性的集团即可， 也可以含有 CD44、 CD29、 CD106 这 3 种抗原均为阳性 的三重阳性细胞。
本发明的牙形成用间充质细胞除了基于上述 CD44、 CD29 及 CD106 的细胞表面抗原 筛选之外， 还可以基于其他细胞性状进行筛选。
作为其他细胞性状， 可以举出其他细胞表面抗原谱或基因表达谱。作为细胞表面 抗原谱， 可以举出例如 CD14 阴性、 CD34 阴性、 CD45 阴性等， 上述细胞表达抗原谱可以单独使 用或组合进行使用。另外， 作为基因表达谱， 可以举出例如 Slug 表达、 Wnt5a 表达、 Lhx8 表 达、 BMP4 表达、 Pax3 表达、 Pax9 表达、 Msx1 表达、 Oct3/4 不表达、 nanog 不表达、 Sox9 不表 达、 Sox5 不表达等， 可以单独或组合上述基因表达谱进行使用， 但并不限定于此。
本发明的牙形成用间充质细胞优选除表达上述 CD44、 CD29、 CD106 之外， 从牙形成 性能高低出发， 优选表达选自 Slug 基因、 Pax3 基因、 Msx1 基因及 Pax9 基因的组中的至少一 个基因， 更优选均表达 Slug 基因及 Pax3 基因， 特别优选全部表达上述 4 个基因。
上述细胞表面抗原或基因表达谱的确认及基于此的筛选中使用识别表面抗原的 各种抗体或能确认基因表达的核酸序列等。 上述抗体及核酸序列均是公知的， 能容易获得。 另外， 基于上述表面抗原或基因表达的确认与筛选可以使用通常用于该用途的方法、 例如 利用各种抗体进行的免疫染色、 流式细胞仪、 细胞分选仪、 RT-PCR 等。
另外， 本发明的制造方法中， 可以与上述筛选方法组合， 使用用于制成单一的间充 质细胞的克隆。作为克隆的方法， 可以使用通常用于该目的的方法， 例如极限稀释法、 细胞 分选仪、 克隆等。 克隆可以在用上述筛选方法进行的筛选前后的任一阶段进行， 但为了效率 良好地得到目标间充质细胞， 优选在筛选后进行。
筛选工序中， 为了效率良好地得到目标细胞数， 可以在筛选工序前设置增殖工序。 上述增殖工序中， 使用不含有分化诱导剂的通常用于培养的培养基进行分化诱导后的细胞 集团的培养。由此， 可以使分化诱导得到的目标细胞增殖到规定的细胞数。结果， 可以通过
充分的细胞数容易地实施筛选。
上述增殖工序的期间可以基于分化诱导处理后的细胞数及细胞的状态来适当设 定， 但从目标细胞的浓缩效率的观点考虑， 通常为 3 ～ 30 天， 可以优选为 5 ～ 10 天。结果， 通过在作为筛选工序对象的细胞集团中含有目标牙形成用间充质细胞， 并将上述细胞集团 供给到筛选工序中， 从而可以有效且大量地得到本发明的牙形成用间充质细胞。
由本发明的方法得到的间充质细胞可用于形成牙。 牙的形成只要使用本发明的间 充质细胞即可， 可以为任一种方法， 最优选用于以下的本发明的牙制造方法中。
以下， 说明本发明的牙的制造方法。
[ 牙的制造方法 ]
使用本发明的牙形成用间充质细胞的优选的牙制造方法包括下述工序 ： 在使实质 上仅由间充质细胞与上皮系细胞中的任一种细胞构成的第 1 细胞集合体、 和实质上由任意 另一种细胞构成的第 2 细胞集合体在不混合的情况下密接地配置在支持载体的内部 ( 配置 工序 ) ； 在所述支持载体的内部培养所述第 1 及第 2 细胞集合体 ( 培养工序 )， 其中所述间 充质细胞含有上述牙形成用间充质细胞。
本制造方法中， 由于不使间充质细胞与上皮系细胞作为细胞集合体而混合在支持 载体的内部， 而是使其以密接的状态生长， 所以可以通过紧密的接触状态， 有效地重现细胞 间相互作用， 并且可以得到内侧为象牙质、 外侧为牙釉质的具有牙所特有的细胞配置的牙。 此时， 由于实质上由间充质细胞构成的细胞集合体含有本发明的牙形成用间充质细胞， 所 以可以有效且大量地制造具有特有的细胞配置的牙。
配置工序中， 使第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体接触地配置在支持载体的内部。
此处， 第 1 细胞集合体及第 2 细胞集合体分别实质上仅由间充质细胞或仅由上皮 系细胞构成。此处， 实质上仅由间充质细胞构成的细胞集合体含有上述牙形成用间充质细 胞。该含有牙形成用间充质细胞的细胞集合体可以根据上述制造方法的调制工序来调制， 另一方面， 实质上仅由上皮系细胞构成的细胞集合体可以与实质上由间充质细胞得到的细 胞集合体独立地调制 ( 第 1 细胞调制工序及第 2 细胞调制工序 )。
另外， 所谓 “细胞集合体” 是指细胞密集的状态， 可以为组织的状态， 也可以为由单 一细胞的状态调制得到的细胞集合体 ( 细胞凝集体 )。另外， 所谓 “实质” ， 是指尽量不含有 作为对象的细胞以外的细胞。因此， 由上皮系细胞构成的细胞集合体可以为一部分组织或 单一细胞的集合体。另外， 上皮系细胞及间充质细胞可以为均由单一细胞构成的细胞集合 体。
第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体可以均为上皮系细胞及间充质细胞， 构成该细 胞集合体的细胞的数量根据动物的种类、 支持载体的种类、 硬度及大小而不同， 相对于 1 个 1 8 3 8 细胞集合体， 通常为 10 ～ 10 个， 可以优选为 10 ～ 10 个。
实质上由间充质细胞构成的细胞集团只要含有牙形成用间充质细胞即可， 也可以 含有其他间充质细胞。
作为上述间充质细胞以外的其他间充质细胞， 可以举出来自于牙胚及牙胚以外的 间充质细胞。作为来自于牙胚以外的间充质细胞， 是来自生物体内的其他间充质组织的细 胞， 可以优选举出不含有血液细胞的骨髓细胞或间充质干细胞， 更优选举出来自于口腔内 间充质细胞或颚骨内部的骨髓细胞、 头部神经嵴细胞的间充质细胞、 能产生所述间充质细胞的间充质前体细胞或其干细胞等。
为了重现在生物体内的细胞配置、 有效形成具有特有的结构及方向性的牙， 用于 本制造方法的上皮系细胞优选为来自牙胚， 从细胞的分化阶段的不成熟性和均质性的观点 考虑， 优选来自蕾状期至帽状期的细胞。
另外， 可以为来自牙胚以外的上皮系细胞， 这可以举出来自生物体内的其他上皮 系组织的细胞。可以优选举出皮肤或口腔内粘膜或牙肉的上皮系细胞， 更优选皮肤或粘膜 等分化的例如能生出角化或角化不全的上皮系细胞的不成熟的上皮系前体细胞、 例如未角 化的上皮系细胞或其干细胞等。
为了调制细胞集合体而从组织中分离各细胞时， 牙胚及其他组织可以从下述各种 动物的颚骨等中采集 ： 哺乳动物的灵长类， 例如人、 猴等 ； 有蹄类， 例如猪、 牛、 马等 ； 小型哺 乳类的啮齿类， 例如小鼠、 大鼠、 兔等。牙胚及组织的采集通常可以直接应用通常用于采集 组织的条件， 可以在无菌状态下取出， 保存在适当的保存液中。需要说明的是， 作为人的牙 胚， 除可以举出第 3 臼齿， 即所谓的智齿的牙胚之外， 还可以举出胎儿牙胚， 但从利用自身 组织的观点来看， 优选使用智齿牙胚。
由组织、 例如牙胚调制上述细胞时， 首先， 将从周围组织分离的牙胚根据形状分为 牙胚间叶组织与牙胚上皮组织。 此时， 由于牙胚组织能在显微镜下从结构上区分， 所以可以 用解剖用剪刀或镊子等切断、 或通过剥下等容易地分离。 另外， 从牙胚组织分离牙胚间叶组 织及牙胚上皮组织可以根据其形状用注射针、 钨针、 镊子等切断， 或通过剥下容易地进行。 为了从周围组织容易地分离牙胚细胞及 / 或从牙胚组织分离上皮组织及间叶组 织， 可以优选使用酶。作为用于上述用途的酶， 可以举出分散酶、 胶原酶、 胰蛋白酶等。
构成细胞集合体的细胞可以由采集的组织中调制为单一细胞的状态。调制工序 中， 为了能容易地分离单一细胞， 可以使用酶。作为上述酶， 可以举出分散酶、 胶原酶、 胰 蛋白酶等。此时， 由上皮组织分离上皮系细胞时， 优选胶原酶处理后进行胰蛋白酶处理与 DNase 处理。 另一方面， 由间叶组织分离间充质细胞时， 优选同时用胶原酶与胰蛋白酶处理， 最终进行 DNase 处理。此时进行 DNase 处理的原因在于， 防止因酶处理导致一部分细胞受 到破坏， 因细胞膜溶解时释放到溶液中的 DNA 而发生细胞凝集， 从而细胞回收量降低。
另外， 为了分别得到充分的细胞数， 构成细胞集合体的细胞可以在配置工序前经 过预培养。细胞的培养可以直接使用通常用于培养动物细胞的温度等条件。
作 为 用 于 培 养 的 培 养 基， 可 以 使 用 通 常 用 于 培 养 动 物 细 胞 的 培 养 基、 例如 Dulbcco’ s Modifed Eagle Medium(DMEM) 等， 可以添加用于促进细胞增殖的血清， 或者可 以添加例如 FGF、 EGF、 PDGF 等细胞增殖因子或转铁蛋白等已知血清成分来代替血清。另外， 添加血清时的浓度可以根据此时的培养状态进行适当变更， 但通常可以为 10 容量％。细胞 的培养中应用通常的培养条件， 例如在 37℃的温度下、 在浓度为 5％的 CO2 的恒温箱内的培 养。另外， 可以适当添加链霉素等抗生素。
将预培养应用于间充质细胞中时， 可以为兼具用于将上述牙形成用间充质细胞增 殖的培养， 也可以为筛选工序后进行的培养， 或这两种培养。
另外， 从不改变细胞性质的观点考虑， 在间充质细胞的预培养或用于上述牙形成 用间充质细胞的简单增殖的培养中， 可以在不含有上述分化诱导剂的培养基中进行。
配置工序中的细胞集合体的配置是将上述第 1 及第 2 细胞集合体配置在能保持细
胞的接触状态的支持载体的内部。此时， 各细胞集合体不会彼此混合。由于如上所述不混 合各细胞集合体地进行配置， 所以在细胞集合体间形成边界线。 在本说明书中， 将该配置形 态适当表达为 “间隔化” 。
作为此处所用的支持载体， 只要是能在内部培养细胞的支持载体即可， 优选为与 上述培养基的混合物。作为上述支持载体， 可以举出胶原、 琼脂糖凝胶、 羧甲基纤维素、 明 胶、 琼脂、 水凝胶、 Cellmatrix( 商品名 )、 メビォ一ルゲル ( 商品名 )、 Matrigel( 商品名 )、 弹力蛋白、 纤维蛋白、 层粘蛋白、 细胞外基质混合物、 聚乙醇酸 (PGA)、 聚乳酸 (PLA)、 乳酸 / 乙醇酸共聚物 (PLGA) 等。上述支持载体具有将细胞配置在内部时能基本维持配置位置的 硬度即可， 可以举出凝胶状、 纤维状、 固体状的支持载体。 其中， 从细胞外基质混合物等凝胶 容易提供适当的硬度和保持力的观点考虑， 较优选胶原、 琼脂糖凝胶、 羧甲基纤维素、 明胶、 琼脂、 水凝胶、 Cellmatrix、 メビォ一ルゲル、 Matrigel、 细胞外基质混合物、 弹力蛋白、 纤维 蛋白、 层粘蛋白。 此处， 所谓能维持细胞位置的硬度， 通常为用作三维培养的硬度、 即在保持 细胞配置的同时不阻碍由增殖导致肥大化的硬度即可， 可以容易地确定。
需要说明的是， 此处， 支持载体具有第 1 及第 2 细胞集合体可以在载体内部生长的 程度的厚度即可， 可以根据目标组织的大小等适当设定。 另外， 支持载体具备使细胞不分散、 能保持细胞的接触状态的保持力即可。 此处所 说的 “接触状态” ， 优选在各细胞集合体中、 或细胞集合体间， 确实地使细胞相互作用的紧密 ( 高密度 ) 的状态， 上述高密度的状态是指在细胞凝集体的情况下， 例如， 可以用能维持比 简单彼此接触更强的密接状态的保持力来培养细胞。 例如， 在胶原的情况下， 提供最终浓度 为 2 ～ 3mg/ml 的浓度， 即基于 JIS-K6503-1996 的方法 ( 作为用直径为 12.7mm 的冲头挤压 4mm 所需的负荷进行测定 ) 达到凝胶强度为 120g ～ 250g 的浓度下适合使用的硬度。另外， 该凝胶强度没有限定， 对于其他种类的支持载体只要根据同样的评价方法可测得同样的强 度， 就可以优选用作本发明的支持载体。另外， 通过混合 1 种或多种支持载体， 可以得到相 当于目标凝胶强度的硬度的支持载体。
所谓高密度的状态， 是指与构成组织时的密度同等程度的状态， 例如， 为细胞集合 7 9 体的情况下， 在细胞配置时为 5×10 ～ 1×10 个 /ml， 为了在无损细胞活性的情况下确实 8 9 地使细胞相互作用， 优选为 1×10 ～ 1×10 个 /ml， 最优选为 2×108 ～ 8×108 个 /ml 的密 度。以上述细胞密度调制细胞集合体时， 通过离心使细胞凝集并沉淀化， 可以在无损细胞 存活的情况下简便地高密度化， 所以优选。上述离心可以在无损细胞存活的相当于 300 ～ 1200×g、 优选为 500 ～ 1000×g 的离心力的旋转数下进行 3 ～ 10 分钟。在低于 300×9 进 行离心时， 细胞沉淀不充分， 有时细胞密度降低， 另一方面， 在高于 1200×g 下离心时， 有时 细胞受到损伤， 所以均不优选。
通过离心分离来调制高密度的细胞时， 通常在用于离心分离细胞的管等容器中调 制单一细胞的混悬液后进行离心分离， 将沉淀物即细胞残留， 尽可能除去上清液即可。 从完 全除去上清液的观点来看， 此时所用的管等容器优选为进行过硅涂布的容器。
使用离心分离得到沉淀物时， 可以将沉淀物直接配置到支持载体的内部。 此时， 优 选目标细胞以外的成分 ( 例如， 培养液、 缓冲液、 支持载体等 ) 的量在与细胞容量相等的量 以下， 最优选不含有目标细胞以外的成分。上述高密度的细胞集合体中， 细胞紧密接触， 有 效地发挥细胞间相互作用。 特别是将目标细胞以外的成分极少的细胞集合体配置在支持载
体的内部时， 通过支持载体的固化等进一步凝集， 成为更紧密的状态。
以组织的状态使用时， 优选进行酶处理等以除去对象细胞以外的结合组织等。目 标细胞以外的成分较多时， 例如， 它们的量在与细胞容量相等的量以上时， 不能充分发挥细 胞间相互作用， 所以不优选。
另外， 第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体的接触优选第 1 细胞集合体与第 2 细胞 集合体的接触为密接， 特别优选将第 2 细胞集合体挤压于第 1 细胞集合体来进行配置。另 外， 用培养液、 不阻碍氧透过的固态物包裹第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体的周围对于使 细胞集合体之间的接触密接是有效的。 在粘度不同的溶液中加入高密度的细胞混悬液进行 配置， 直接将溶液固化的方式也可达成容易地保持细胞的接触， 故而优选。此时， 以第 1 细 胞集合体为牙胚间充质细胞的单一细胞集合物、 以第 2 细胞集合体为牙胚上皮组织时， 优 选以牙胚上皮组织的釉质结节与第 1 细胞集合体接触的方式进行配置， 但并不限定于此。
支持载体为凝胶状或溶液状等时， 可以在配置工序后设置固化支持载体的固化工 序。通过固化工序， 配置在支持载体内部的细胞被固定在支持载体内部。支持载体的固化 中可以直接应用通常使用的支持载体的固化条件。例如， 在支持载体中使用胶原等能固化 的化合物时， 在通常使用的条件下， 例如， 在培养温度下使其静置数分钟～数十分钟， 由此 可以固化。由此， 可以使支持载体内部的细胞间的结合固化， 同时可以使该结合牢固。 本发明的制造方法的培养工序中， 在支持载体内部培养第 1 细胞集合体及第 2 细 胞集合体。该培养工序中， 通过彼此紧密接触的第 1 细胞集合体及第 2 细胞集合体， 可有效 地进行细胞间相互作用， 从而可再构成组织， 即牙。
可以通过支持载体维持第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体的接触状态进行培养工 序， 该培养工序可以是用具有第 1 及第 2 细胞集合体的支持载体单独进行的培养， 也可以是 在其他动物细胞的存在下的培养。
作为培养期间， 因配置在支持载体内部的细胞数与细胞集合体的状态、 以及培养 工序的实施条件而不同， 但通常为 1 ～ 300 天， 为了形成外侧具有牙釉质、 内侧具有象牙质 的牙， 优选为 1 ～ 120 天， 从能迅速提供的观点考虑， 可以优选为 1 ～ 60 天。进而为了制成 具备牙周组织的牙， 通常为 1 ～ 300 天， 可以优选为 1 ～ 60 天。
仅用支持载体进行培养时， 可以采用在用于培养动物细胞的通常条件下的培养。 此处的培养通常可以直接采用在动物细胞下的培养条件， 也可以直接采用上述条件。 另外， 培养中可以添加来自哺乳动物的血清， 还可以添加对于上述细胞增殖或分化有效的已知的 各种细胞因子。作为上述细胞因子， 可以举出 FGF、 BMP 等。
另外， 从组织或细胞集合体的换气或供给营养的观点考虑， 优选使用器官培养。 器 官培养中， 通常在适合动物细胞增殖的培养基上平铺多孔性膜， 在该膜上放置被支持载体 包埋的细胞集合体， 由此进行培养。此处所用的多孔性膜中， 优选为具有大量 0.3 ～ 5μm 左右的孔的膜， 具体而言， 可以举出 Cell Culture Insert( 商品名 )、 ァィソボァフィルタ 一 ( 商品名 )。
在其他动物细胞的存在下进行培养时， 由于受到来自动物细胞的各种细胞因子等 的作用， 可以尽快形成具有特定细胞配置的牙， 所以优选。 上述其他动物细胞的存在下的培 养可以使用分离细胞或培养细胞而通过生物体外的培养来进行。
另外， 可以将具有第 1 与第 2 细胞集合体的支持载体移植到生物体中， 在生物体内
进行培养。上述在生物体内的培养由于可以尽快形成牙、 以及牙周组织， 所以特别优选。此 时， 将第 1 和第 2 细胞集合体与支持载体一起移植到生物体内。
能用于该用途的动物可以优选举出哺乳动物， 例如人、 猪、 小鼠等， 更优选来自与 牙胚组织相同种类的动物。 移植人牙胚组织时， 优选使用人、 或变成免疫功能不全的人以外 的其他哺乳动物。为了尽可能地正常产生动物细胞的器官或组织， 作为适合上述生物体内 生长的生物体部位， 优选肾脏皮膜下、 肠间膜、 皮下移植、 口腔内等。
作为移植的生长期间， 根据移植时的大小与产生的牙的大小而不同， 通常可以为 3 ～ 400 天。 例如， 移植到肾脏皮膜下的移植期间也根据移植的培养物的大小与再生牙的大 小而不同， 但从牙的再生与在移植部位产生的牙大小的观点考虑， 优选为 7 ～ 60 天。
向生物体内移植前， 可以在生物体外进行培养 ( 前培养 )。通过该前培养， 使细胞 间的结合和第 1 与第 2 细胞集合体之间的结合牢固， 从而可以使细胞间相互作用更牢固， 所 以优选。结果可以缩短总体生长期。
前培养的期间可以为短期， 也可以为长期。在长期例如 3 天以上、 优选为 7 天以上 的情况下， 可以由牙胚产生牙芽， 所以可以缩短移植后形成牙的时间， 所以优选。作为前培 养期， 例如， 作为在肾脏皮膜下进行移植时的器官培养， 由于 1 ～ 7 天能有效再生牙， 所以优 选。
由本发明的制造方法制造的牙具有内侧为象牙质、 外侧为牙釉质的牙所特有的细 胞配置 ( 结构 )， 并且优选还具备牙的前端 ( 牙冠 ) 与牙根的方向性。通过至少除上述特有 的细胞配置、 优选细胞配置之外， 还具有方向性， 也可以发挥作为牙的机能。 因此， 能广泛用 作牙的代替物。 特别是， 使用来自本身的牙胚的间充质细胞与上皮系细胞时， 可以在避免排 斥反应导致的问题的情况下进行使用。另外， 使用来自通常适合移植抗原的他人的牙胚的 细胞时， 也能避免因排斥反应导致的问题。
另外， 通过本发明的制造方法制造的牙可以为具有牙特有的细胞配置的牙的集合 体。
由于上述牙的集合体由具有牙特有的细胞配置的多颗牙构成， 所以可以从聚合体 中分离各个牙， 按照以下所述的方式用作一个牙的移植片。 结果， 可以有效制作作为移植片 的牙。
为了得到由多颗牙构成的牙的集合体， 并为了容易再诱导用于产生多颗牙的牙 胚， 优选第 1 与第 2 细胞集合体均由单一细胞构成。
需要说明的是， 与上述相同， 培养工序可以为器官培养， 也可以为在肾脏皮膜下的 培养， 但将所得的牙用作移植片时， 优选为不与其他动物细胞接触、 并且全部过程在体外调 制的器官培养。
进而， 本发明的制造方法中， 可以将培养期间继续到形成牙周组织为止。由此， 除 牙本身之外， 将牙支持在颚骨上， 也可以形成固定化的牙槽骨和牙根膜等牙周组织。 结果可 提供一种移植后能实用的牙。
需要说明的是， 为了制造牙周组织， 可以在上述培养工序后设置分离由上述培养 得到的牙周组织的工序， 仅得到牙周组织。分离牙周组织只要可以分离在培养工序的过程 中所形成的牙周组织与牙即可， 可以用任意的方法进行， 可以举出用镊子等进行分离或用 酶进行部分消化等。根据本发明得到的牙与牙周组织除可以用作移植片之外， 还可以优选用于研究阐 明牙的发生过程， 也可以用作今后的对于产生与牙相关的组织有效的研究工具。
需要说明的是， 将所得的牙或牙周组织用作移植片时， 优选制造方法的培养工序 为不与其他动物细胞接触并且全部过程可以在体外调制的器官培养。
另外， 本发明包括牙的移植方法。该移植方法中， 包括得到上述牙的集合体的工 序； 由牙的复合体分离各个牙的工序 ； 调整分离的牙进行移植， 使其具有与在移植部位的 其他牙相同的方向性。
由此， 可以同时得到具备特有的细胞配置与方向性的多颗牙， 有效实施牙的移植。
本发明的牙可以适用于治疗或处置伴有牙欠缺与损伤的各种症状、 例如龋齿、 边 缘性牙周炎 ( 牙槽脓肿 )、 牙周病导致的牙欠缺、 事故等导致的折损或脱落等。
即， 本发明的治疗方法包括将由本发明的制造方法得到的牙及 / 或牙周组织移植 到欠缺及 / 或损伤部位的步骤。由此， 可以治疗及 / 或缓和欠缺及 / 或损伤部位的上述症 状。
本发明的其他治疗方法包括在欠缺及 / 或损伤部位仅实施本发明的培养工序或 配置工序与培养工序。此时， 作为支持载体， 除上述载体之外， 还可以将欠缺及 / 或损伤部 位的周围组织本身作为支持载体。 由此， 利用来自生物体内的周边组织的细胞因子等， 可以 更迅速地治疗欠缺及 / 或损伤部位等。
实施例
以下， 说明本发明的实施例， 但并不限定于此。 另外， 只要没有特别说明， 实施例中 的％均为重量 ( 质量 ) 基准。
[ 实施例 1]
1.EC 细胞的培养方法
EC 细胞使用 AT805 细胞 ( 作为 129 系 EC 细胞的 OTT6050 的派生克隆， 由理化学 研究所生物资源中心细胞材料开发室得到 )。AT805 细胞的培养使用添加了 10 容量％牛 胎血清 (FCS ： JRH 或 JBS、 Hyclone 公司制 ) 以及 55μM 2- 巯基乙醇 (GIBCO 公司制 ) 的 Dulbcco’ s Modifed EagleMedium(DMEM ： SIGMA 公司或 Kohjin-Bio 公司制 ) 来进行。通常 5 以每 100mm 皿为 5 ～ 8×10 个浓度来接种 EC 细胞， 隔一天交换全部量的培养基进行反复 继代培养。继代培养中， 将细胞用 HCMF 缓冲液 (pH7.4、 10mMHepes、 136.9mM NaCl、 0.34mM Na2HPO3、 13.9mM 葡萄糖、 5.37mM 23KCl) 洗涤 1 次后， 添加 5ml 最终浓度为 0.025％的溶解 有胰蛋白酶 -EDTA·2Na(GIBCO 公司制 ) 的酶溶液， 在 37℃下进行 1 分钟酶处理。然后， 加 入等量的添加有 10％ FCS 的 DMEM， 使细胞分散后， 通过离心分离， 回收沉淀， 将沉淀回收得 到的细胞再次混悬， 接种在新的培养皿中， 进行继代培养。
2.EC 细胞的分化诱导与细胞的回收
将用胰蛋白酶处理回收后的 EC 细胞用最终浓度为 0.5 ～ 5 容量％的添加有二甲 基亚砜 (DMSO ： SIGMA 公司制 ) 的添加 10 容量％ FCS 的 DMEM 混悬， 以 1.0×106 个 /100mm 皿 的浓度进行接种。在 CO2 浓度为 5％的条件下， 于 37℃下培养， 14 小时后， 用 HCMF 缓冲液将 细胞洗涤 1 次， 将培养液换成添加有 10 容量％ FCS 的 DMEM。
对于用 DMSO 处理后的 EC 细胞， 每 3 天将培养液的一半量换成添加 10 容量％ FCS 的 DMEM， 继续培养 6 天 ( 仅 5 容量％ DMSO， 为 19 天 )， 进行适当观察。在含有未分化细胞的细胞集团增殖的时刻， 用 HCMF 缓冲液洗涤 1 次后， 添加 3mM EDTA 以及含有 0.5％ BSA 且 2+ 2+ 不含 Ca 、 Mg 的 PBS(-)(EDTA/BSA-PBS)， 将细胞分散， 通过离心操作以沉淀的形式回收细 胞。将细胞再次混悬在 EDTA/BSA-PBS 中， 通过 FITC 标记的抗 CD44 抗体 (CD44-FITC ： BD Pharmingen 公司制 ) 与 PE 标记的抗 CD29 抗体 (CD29-PE ： BD Pharmingen 公司制 ) 进行双 重染色， 使用细胞分选仪、 EpicsALTRA(Beckman Coulter 公司制 ) 分离获得 CD44 阳性且 CD29 阳性的细胞成分， 由此得到除去了未分化 EC 细胞的用 DMSO 处理进行了分化诱导的 EC 细胞成分 ( 参见图 2)。将该细胞命名为 DMSO-EC 细胞。
另外， 关于以各 DMSO 浓度处理时的 DMSO-EC 细胞的比例， 示于表 1。如表 1 所示， 明确了 CD44 阳性且 CD29 阳性的细胞依赖于 DMSO 处理浓度而增加。需要说明的是， 用5容 量％ DMSO 处理得到的 EC 细胞由于大部分细胞在刚处理后就死亡， 所以处理后的培养天数 必须比其他处理浓度长， 另一方面， 培养后所得的 CD44 阳性且 CD29 阳性的细胞比例较高。
在以下的实验中， 使用由使用 5 容量％的 DMSO 而得到的细胞。
[ 表 1]
DMSO 浓度 (v/v％ ) 0 0.5 1.0 2.5 5.0
培养天数 (天)细胞数 (×107 个 )CD44 阳性且 CD29 阳 性细胞 (％ )6 6 6 191.15 1.19 1.64 2.830.3 0.5 13.7 93.0DMSO-EC 细胞的克隆化
DMSO-EC 细胞的克隆化通过利用克隆环的菌落的分离、 或者极限稀释法来进行。
利用克隆环获得细胞时， 以低浓度 ( 约 100 个 ) 在培养皿中接种 DMSO-EC 细胞并 通过增殖而能够得到的菌落的细胞数为 10 个以上， 此时将灭菌后的硅脂涂布在克隆环的 一端， 以包围细胞的菌落的方式粘附在除去培养基的皿底面。 然后， 在克隆环内进行胰蛋白 酶处理， 回收细胞， 由增殖的细胞依次进行放大培养， 获得克隆。
用极限稀释法得到克隆如下进行 ： 将通过上述方法得到的 DMSO-EC 细胞用 HCMF 缓 冲液洗涤 1 次后， 通过胰蛋白酶处理回收细胞。计测回收得到的细胞数， 接种在 96 孔培养 板中， 使其达到 1 细胞 /200μl/ 孔 ( 说明 )。3 ～ 5 天后确认单一菌落。然后， 每 5 天， 边 交换一半量的培养基边继续培养， 从增殖的细胞依次进行放大培养， 获得克隆。
由 此， 得 到 来 自 DMSO-EC 细 胞 的 克 隆 1(DMSO-EC 克 隆 1 ： Clone#1) 与 克 隆 2(DMSO-EC 克隆 2 ： Clone#2)。
[ 实施例 2]
DMSO-EC 细胞的性状(1) 相位差显微镜像
用相位差显微镜分别观察上述得到的克隆 1 与 2 的形态与 EC 细胞、 DMSO-EC 细胞、 以及作为来自 EC 细胞的软骨系前体细胞的 ATDC5 细胞 ( 从理化学研究所生物资源中心细 胞材料开发室得到 ) 的形态。
结果， 观察到 EC 细胞中， 菌落内的细胞小， 以高密度增殖， 此外， 菌落周边突起， 是 典型的全能性干细胞样的形态。与此相对， DMSO-EC 或 DMSO-EC 克隆 1 与 2、 ATDC5 细胞中， 构成菌落的每个细胞面积较大， 形成作为粘附性细胞的特征即单一层， 显示与特征 EC 细胞 的形态明显不同的形态。相较于 EC 细胞， 上述粘附性的细胞形态类似于间充质细胞。
(2) 各种基因表达
通过实时 (Real time)PCR(RT-PCR) 解析 EC 细胞、 DMSO-EC、 DMSO-EC 克隆 1 与 2、 ATDC5 细胞中的各种基因表达， 研究各种标识基因的表达。
使用 TRIzol Reagent(Invitrogen 公司制 ) 从 EC 细胞以及 DMSO-EC、 DMSO-EC 克 隆 1 与 2、 ATDC5 细胞中提取全 RNA。除去解析的细胞培养液， 在 100mm 培养皿中直接滴入 2ml TRIzol Reagent， 用 Cell Scraper(Falcon 公司制 ) 充分混合后， 回收到离心管中， 用 Polytron Homogenizer(Polytron 公司制 ) 进行匀浆。然后至提取 RNA 为止的操作根据后 附的使用说明书来进行。将从细胞· 组织中提取的全 RNA 溶解于 DEPC 处理水中， 用分光光 度计进行浓度计算后， 保存在 -30℃。 为了进行实时 PCR(RT-PCR) 解析， 以从细胞提取的全 RNA 为模板， 合成形成模板的 cDNA。cDNA 合成使用 ReverTra Ace(TOYOBO) 来进行， 根据后附的使用说明书进行操作。
PCR 与解析使用 ABI PRISM 7000(Applied Biosystems 公司制 ) 来进行。聚合酶 使用 SYBR Premix Ex Taq(TAKARA 公司制 )， 内部对照使用 β- 肌动蛋白。在 RT-PCR 专用 96 孔板中以每个试样分别添加 13μl SYBR Premix ExTaq(TAKARA 公司制 )、 2μl 稀释 20 倍 得到的 cDNA 反应溶液、 5μl 浓度为 1μM 的引物， 添加 5μl 灭菌水， 调制最终容量为 25μl 的反应体系， 根据常规方法进行 PCR 反应。另外， 对各个基因进行对照反应， 制作标准曲线， 分别进行定量化。将用于解析的引物序列示于表 2 与表 3。
基因表达通过各个细胞中的 β- 肌动蛋白的表达量进行标准化， 与 β- 肌动蛋白 表达量为一定时的相对表达量进行比较。结果示于表 4。
[ 表 2]
16101842477 A CN 101842478说明书( 序列号 ： 1) ( 序列号 ： 2) ( 序列号 ： 3) ( 序列号 ： 4) ( 序列号 ： 5) ( 序列号 ： 6) ( 序列号 ： 7) ( 序列号 ： 8) ( 序列号 ： 9) ( 序列号 ： 10) ( 序列号 ： 11) ( 序列号 ： 12) ( 序列号 ： 13) ( 序列号 ： 14) ( 序列号 ： 15) ( 序列号 ： 16) ( 序列号 ： 17) ( 序列号 ： 18)15/21 页Oct3/4-F Oct3/4-R nanog-F nanog-R Slug-F Slug-R Pax3-F Pax3-R Wnt1-F Wnt1-R Sox9-F Sox9-R Sox5-F Sox5-R Msx1-F Msx1-R Pax9-F Pax9-R
ATTGAGAACCGTGTGAGGTGGA GCGCCGGTTACAGAACCATAC CAAGGGTCTGCTACTGAGATGCT ATCAGGGCTGCCTTGAAGAG GACCCTGGCTGCTTCAAGGA TATTGCAGTGAGGGCAAGAG CAAGCTGGAGCCAATCAACTG GCGGTGGGAGGGAATCC CCTACGCTTCCTCATGAACCTT TGGCGCATCTCAGAGAACAC GAGGCCACGGAACAGACTC CAGCGCCTTGAAGATAGCATT GCGTTGGACGGGAAGGT TCCTTTTCTGTCCGGCAGTT CAGCCCTATAGAAAGCAAGGA CCCCTCAGAGCAATGCTTTG GGCCAGGCACCGAATG GCCATGCTGGATGCTGAGA[ 表 3] Wnt5a-F Wnt5a-R Lhx8-F Lhx8-R BMP4-F BMP4-R Runx2-F Runx2-R Dlx1-F Dlx1-R FGF10-F FGF10-R BMP7-F BMP7-R βActin-F βActin-R CGCCATGAAGAAGCCCATT TCCAGCGGTCCCCAAAG AAGTGGAGAACGGTAATGGGATTAG GCTTTGGATGATTGACGTCTTG TCAAGACACCATGATTCCTGGTAA GCTCGCGCCTCCTAGCA ACGGCCCTCCCTGAACTC GGGATCTGTAATCTGACTCTGTCCTT AGCCGAGCCCGAGCTT CAGCCGGTCCTTCCTAGAAGTT TCCCTCTGGGTACGGATCTG TGGTCGGCTCTCTTGCATAA CGCTCCAAGACGCCAAAG GCTGCTGTTTTCTGCCACACT TGACAGGATGCAGAAGGAGA GCTGGAAGGTGGACAGTGAG ( 序列号 ： 19) ( 序列号 ： 20) ( 序列号 ： 21) ( 序列号 ： 22) ( 序列号 ： 23) ( 序列号 ： 24) ( 序列号 ： 25) ( 序列号 ： 26) ( 序列号 ： 27) ( 序列号 ： 28) ( 序列号 ： 29) ( 序列号 ： 30) ( 序列号 ： 31) ( 序列号 ： 32) ( 序列号 ： 33) ( 序列号 ： 34)
[ 表 4]如表 4 所示， 仅在 EC 细胞中检测出作为未分化干细胞标识基因的 Oct3/4 与 Nanog 的表达， 在用 DMSO 处理而得到的 EC 细胞或其克隆细胞、 ATDC5 细胞中未确认到。在 EC 细 胞中未确认作为神经嵴细胞标识基因的 Slug、 Pax3、 Wnt1 的表达， 而在 EC 细胞以外的所有 细胞组中确认到 Slug， 虽然有表达量的差异， 但在 EC 细胞与 ATDC5 细胞以外的 DMSO-EC 细 胞组中确认到 Pax3 与 Wnt1。
由此提示了 DMSO-EC 细胞与其克隆化细胞是因为添加了 DMSO 而由未分化干细胞 分化诱导为神经嵴细胞的细胞， 由基因表达的特性可知， 是 Oct3/4 阴性、 Nanog 阴性、 Slug 阳性、 Pax3 阳性、 Wnt1 阳性的细胞。
另一方面， 在牙间叶细胞的标识组中， 除在 EC 细胞中表达 Msx1 与 BMP-7 之外， 其他任意基因均未表达， 而在 DMSO-EC 细胞、 以及其克隆化细胞中， 特异性地高度表达了 Msx1、 Pax9、 Wnt5a、 Lhx8。虽然表达量有少许差异， 但在 DMSO-EC 细胞以及其克隆化细胞和 ATDC5 细胞中确认到 BMP4、 Runx2、 Dlx1 的表达。
另外， 判断如下 ： 作为软骨细胞的特异性标识基因即 Sox9、 Sox5 的表达仅在 ATDC5 细胞中高度表达， DMSO-EC 细胞和其克隆化细胞为不分化为软骨系的细胞。
因此， 明确了通过 DMSO， EC 细胞向神经嵴细胞样或间充质细胞样的细胞分化诱 导。
[ 实施例 3]
评价由 EC 细胞分化诱导的细胞的牙形成性能
然后， 按照以下所述的方式， 确认由本发明得到的 DMSO-EC 细胞、 其克隆化细胞具 有向牙本质细胞分化的性能、 以及牙的象牙质形成性能。
(1) 牙胚上皮组织的调制
在显微镜下通过常规方法从 C57BL/6 小鼠 ( 由 SLC 购得 ) 的胎龄 14.5 天的胚仔 中摘出下颚切牙牙胚组织。 用 PBS(-) 洗涤摘出的下颚切牙牙胚组织， 在室温下用在 PBS(-)
中添加最终浓度为 1.2U/ml 的分散酶 II(Roche， Mannheim， Germany) 而得到的酶液， 处理 12.5 分钟后， 用添加有 10％ FCS(JRH Biosciences， Lenexa， KS) 的 DMEM(Sigma， St.Louis， MO) 洗涤 3 次。进而， 添加 DNaseI 溶液 (Takara， Siga， Japan) 使其达到最终浓度为 70U/ ml， 使牙胚组织分散， 使用 25G 注射针 (Terumo， Tokyo， Japan)， 外科上分离牙胚上皮组织。
(2) 再构成牙胚的制作
再构成牙胚的制作中使用上述调制得到的牙胚上皮组织， 以及作为间充质细胞的 EC 细胞、 DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 和 2 中的任一个评价对象细胞。
分别通过胰蛋白酶处理从皿中回收用于牙胚再构筑的评价对象细胞组。在涂布 有硅脂的 1.5ml 微管 (Eppendorf， Hamburg， Germany) 中加入用添加有 10 ％ FcS(JRH) 的 DMEM(Sigma) 混悬而得到的评价对象细胞， 利用离心分离 (580×g) 将细胞以沉淀的形式回 收。 尽可能除去离心后的培养液的上清液， 再次进行离心操作， 边用实体显微镜观察边使用 GELoaderTip0.5-20μL(Eppendorf 公司制 ) 完全除去残留在细胞沉淀周围的培养液， 准备 用于制作再构成牙胚的各个评价对象细胞。
在涂布有硅脂的皮氏培养皿中滴入 30μl 2.4mg/ml 的 Cellmatrix typeI-A( 新 田明胶公司制 )， 制作胶原凝胶微滴。使用 0.1-10μl 的吸头 (Eppendorf 公司制 )， 向该溶 液中供给 0.2μl ～ 10.3μl 上述评价对象细胞， 制成细胞凝集体作为高密度的细胞集合体 8 ( 细胞密度 ： 2×10 个 /ml)。然后， 使用 10μl 吸头， 将牙胚上皮组织或牙胚间叶组织供给 到相同的凝胶液滴内， 使用钨针， 使来自分离到的牙胚的上皮组织原本与间叶组织接触的 面密接于评价对象细胞的细胞凝集体。 然后， 通过使凝胶液滴固化， 使牙胚组织与评价对象 细胞间的结合更牢固， 从而制作高密度的再构成牙胚。
参见图 3 说明这点。
利用吸头 16 预先配置于凝胶液滴 10( 参见图 3A) 内的细胞凝集体 12 在凝胶液滴 10 内构成球体 ( 参见图 3B)。然后通过挤入另一种细胞凝集体 14， 从而球体的细胞凝集体 12 被破坏， 包裹另一种细胞凝集体 14 的情况较多 ( 参见图 3C)。 然后， 将凝胶液滴 10 固化， 由此细胞间的结合变牢固 ( 参见图 3D)。
(3) 再构成的牙胚的器官培养
将在凝胶中制作的高密度再构成牙胚在 CO2 培养箱中静置 10 分钟， 将 Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin) 固化。准备培养容器， 使 Cell CultureInsert( 孔径尺寸为 0.4 微米的 PET 膜 ； BD 公司制 ) 接触添加有 10 容量％ FCS(JRH 公司制 )、 0.1mg/ml 的 L- 抗坏血 酸 (Sigma 公司制 )、 2mM 的 L- 谷氨酰胺 (GIBCO 公司制 ) 的 DMEM(Sigma 公司制 )。将再构 成牙胚与作为支持载体的周围凝胶一起转移到培养容器的 Cell Culture Insert 的膜上， 进行器官培养。
对利用器官培养而产生牙的现象进行解析时， 通常进行 14 天间的培养。器官培养 时， 在移植后第 10 ～ 30 天摘出再构成牙胚， 用 4％仲甲醛 - 磷酸缓冲液固定 6 小时后， 使用 4.5％ EDTA 溶液 (pH7.4) 进行 24 小时的中性脱灰。然后， 通过常规方法进行石蜡包埋， 制 作 10μm 的切片。为了进行组织学解析， 根据常规方法进行苏木素 - 伊红染色染色 (HE 染 色 )。
用器官培养进行评价
在 14.5 日龄、 下颚切牙牙胚上皮组织与 EC 细胞的高密度再构成牙胚中， 因 EC 细胞的异常增殖而再构成牙胚肥大化， 在 HE 染色中也未观察到来自牙间叶细胞的牙本质细 胞和象牙质。
与此相对， 在 DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 中， 与上皮组织的相互作用被诱 导， 并且在相位差显微镜像中也观察到与牙胚的器官培养同样地组织诱导。进而， DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 均可以由 HE 染色像确认可以形成外侧具有牙釉质、 内侧具有象 牙质的再构成牙胚的 HE 染色像， 能形成牙特有的组织结构。
由上述内容可知， DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 通过与牙胚上皮细胞的相互 作用， 分化为作为牙的间叶组织的牙本质细胞， 可以产生牙特有的象牙质。另外， 通过高密 度再构成牙胚法， 在器官培养中， 也可以形成外侧为牙釉质、 内侧为象牙质、 内部为牙髓细 胞、 具有牙前端与牙根的牙所特有的组织结构的牙。
[ 实施例 4]
肾皮膜下移植方法
下面， 由 DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 和 2 的细胞与 14.5 日龄胎儿下颚切牙牙 胚上皮细胞制作高密度再构成牙胚， 将所得的再构成牙胚移植到 C57BL6 小鼠 ( 从日本 Clea 公司购得 ) 肾皮膜下， 评价牙形成性能。
将与实施例 3 相同地制作的再构成牙胚进行器官培养 48 小时至 96 小时后， 将周 围的每份凝胶移植到 8 周龄 NOD-SCID 小鼠 ( 从 Charles River 公司购得 ) 的肾皮膜下， 使 其进行不同场所的牙的产生， 并进行解析。
移植到肾皮膜下时， 在移植后第 10 ～ 30 天， 对于周围的每个肾组织， 摘出再构 成牙胚。将摘出组织在 4 ％仲甲醛 - 磷酸缓冲液中固定 6 小时后， 使用 4.5 ％ EDTA 溶液 (pH7.4)， 进行 24 小时的中性脱灰。然后， 根据常规方法进行石蜡包埋， 制作 10μm 的切片。 为了进行组织学解析， 根据常规方法进行 HE 染色。
(1) 用肾皮膜下移植的评价
在肾皮膜下移植中， 移植 14.5 日龄胎儿切牙牙胚时， 在 16 天的期间内因肾皮膜下 移植而产生具有内侧为象牙质与外侧和牙釉质的特征结构的牙 ( 参见图 4)。用来自 14.5 日龄胎儿切牙牙胚的牙胚上皮组织和牙胚间叶细胞 ( 参见图 4A)、 牙胚上皮组织和 DMSO-EC 细胞 ( 参见图 4B)、 牙胚上皮组织和 DMSO-EC 克隆 ( 克隆 #1、 参见图 4C) 的再构成牙胚中， 通过肾皮膜下移植进行移植后第 14 天， 与直接将正常牙胚移植到肾皮膜的情况相同， 容易 确认外侧为釉质芽细胞、 牙釉质， 其内侧为象牙质、 牙本质细胞。所形成的牙具有前端与牙 根， 具有与正常产生的牙相同的结构。
关于形成牙的频率， 在 EC 细胞与 ATDC 细胞中为 0 ％， 而在 DMSO-EC 细胞中为 51.3±8.8％， 在 DMSO-EC 克隆 1 中为 23.3％ ±16.7％， 在克隆 2 中为 33.3％ ±47.1％。
由上述内容可知， DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 中， 能分化为作为来自牙间叶 的组织的牙本质细胞， 并能产生作为牙的硬组织的象牙质。 进而可知， 通过高密度再构成牙 胚法， 即使在肾皮膜下移植中， 也可以通过 DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 形成具有特 有的组织结构的牙。
(2) 原位杂交
将来自 14.5 日龄胎儿切牙牙胚的牙胚上皮组织与 DMSO-EC 细胞移植到皮膜下， 对 14 天后摘出的组织， 通过原位杂交解析作为牙釉质的构成分子的牙釉质蛋白、 作为象牙质的构成要素的牙本质涎磷蛋白 (DSPP) 的 mRNA 表达、 以及作为牙根膜特异性基因的 Periostin mRNA 表达。
摘出肾皮膜下移植后第 14 天的再构成牙胚， 用 4％仲甲醛 - 磷酸缓冲液固定 6 小 时后， 使用 4.5％ EDTA 溶液 (pH7.4)， 进行 24 小时的中性脱灰。然后， 依次浸渍 12.5％蔗糖 溶液、 25％蔗糖溶液后， 包埋在 OCT compound(SAKURA Finetechnica 公司制 ) 中。包埋后 在低温恒温器 (Leica 公司制 ) 中制作 10μm 的切片。
将 上 述 切 片 用 含 有 最 终 浓 度 为 2μg/ml 的 蛋 白 酶 K(Nacalaitesque， kyoto， Japan) 的 PBS(-) 处理 10 分钟， 用含有最终浓度为 4 ％的仲甲醛 (Nacalai tesque) 的 PBS(-) 固定 10 分钟。分别用含有最终浓度为 1.325 ％三乙醇胺、 0.0175N 的 HCl(Wako)、 0.25％乙酸酐的丙酸二乙酯处理 (DEPC) 水处理 10 分钟后， 用 PBS(-) 在 5 分钟内洗涤 3 次。 用含有 1.5％ (v/v) 三乙醇胺 (Nacalai tesque)、 0.33N 的 HCl(Wako)、 0.25％ (v/v) 的乙酸 酐 (Nacalai tesque) 的 DEPC 水溶液处理 10 分钟后， 用 2×SSC 在 10 分钟内洗涤 2 次。作 为牙根膜特异性基因的 Periostin(Genbank accession no.NM_015784) 探针， 将使用正义 引物 (-7 ； ggctgaagatggttcctctc ： 序列号 35) 与反义引物 (573 ； gtacattgaaggaataacca ： 序列号 36) 并通过 PCR 而获得的 cDNA 片段作为 DIG 标识。
根据常规方法进行原位杂交， 用抗 DIG- 碱性磷酸酯酶 (AP)Fab 片段 (Roche) 和 NBT/BCIPStock Solution(Roche) 使 其 显 色， 用 Axio ImagerA.1(Zeiss) 与 AxioCam MRc5(Zeiss) 进行解析。
由该结果可知， 在 HE 染色像的釉质芽细胞中， 确认到牙釉质蛋白 mRNA 的表达， 在 牙本质细胞中确认到 DSPPmRNA 的表达。另外， 确认到 Periostin mRNA 的表达。由此可知， 与形成硬组织相关的分子的 mRNA 分别适当地在其产生细胞中明显表达。另外， 由于检测到 在牙根膜中表达的 Periostin， 提示形成有牙周组织。
[ 实施例 5]
用视黄酸进行诱导
(1) 用于获得 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞的 EC 细胞分化诱导方法
与实施例 1 相同地操作， 以 1.0×106 个 /100mm 皿的浓度接种用胰蛋白酶处理回收 得到的 AT805 细胞， 第二天， 置换成添加有终浓度为 0 ～ 10.0μM 的视黄酸 (RA)(SIGMA 公 司制 ) 的 10 容量％ FCS DMEM， 施加刺激。培养 72 小时后， 用 HCMF 缓冲液洗涤 2 次， 用全部 量的 10 容量％ FCS DMEM 进行培养基交换。
(2) 获得 RA 处理后的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞
每 3 天使用 10 容量％ FCSD MEM 进行一半量的培养基交换， 同时继续培养 7 天， 进行适当观察。将 RA 处理后增殖的含有未分化细胞的细胞集团用 HCMF 洗涤 1 次后， 添 加 3mM 的 EDTA-0.5 ％ BSA-PBS(-)， 在 37 ℃下进行培育， 回收。回收后的细胞通过 CD44 FITC(BD Pharmingen) 与 CD29(BDPharmingen)PE 进行双重染色， 使用 Epics ALTRA(Beckman Coulter) 分离获得 CD44 阳性且 CD29 阳性的细胞， 由此仅得到除去了未分化细胞的细胞集 团。将该细胞命名为 RA-EC 细胞。结果示于图 5。
另外， 用各 RA 浓度处理时的 RA-EC 细胞的比例示于表 5。由表 5 明确， CD44 阳性 且 CD29 阳性细胞依赖于 RA 浓度而发生变化。
另外， 对于 RA 处理后的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞， 与实施例 2(2) 相同地确认基因表达时， 判定与 DMSO-EC 细胞相同， 为 Oct3/4 阴性、 Nanog 阴性、 Slug 阳性、 Pax3 阳性、 Wnt1 阳性的细胞。
[ 表 5]
RA 浓度 (μM) 0 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0
培养天数 (天)细胞数 (×106 个 )CD44 阳性且 CD29 阳性细胞 (％ )7 7 7 7 71.5 1.1 1.3 0.5 0.710.8 10.0 11.3 11.5 10.4(3)RA 处理后的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞的牙形成性能评价
使用如上所述得到的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞 (RA 浓度 2μM)， 与实施例 3 相同 地操作， 进行牙胚再构筑及器官培养， 并进行评价。在器官培养 14 天后， 通过与牙胚上皮细 胞的相互作用， 分化为作为牙间叶组织的牙本质细胞。另外， 通过高密度再构成牙胚法， 形 成具有外侧为牙釉质、 内侧为象牙质、 内部为牙髓细胞的牙所特有的组织结构的牙 ( 参见 图 6)。
并且对 RA 处理后的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞， 与实施例 4(2) 相同地操作， 确认 牙釉质蛋白与 DSPP、 Periostin 表达时， 确认与 DMSO-EC 相同地表达各 mRNA。这提示了形 成含有硬组织、 牙根膜的牙周组织。
[ 实施例 6]
(1) 用于获得 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的 EC 细胞分化诱导方法
与实施例 1 相同地操作， 以 1.0×106 个 /100mm 皿的浓度接种通过胰蛋白酶处理回 收得到的 AT805 细胞， 第二天置换成终浓度为 2μM 的 RA(SIGMA 公司制 ) 的 10 容量％ FCS DMEM， 施加刺激。培养 72 小时后， 用 HCMF 缓冲液洗涤 2 次， 用全部量的 10 容量％ FCS DMEM 进行培养基交换。第二天， 用 HCMF 缓冲液洗涤 2 次， 除去死细胞后， 进而用 10 容量％ FCS DMEM 继续培养。以后每隔 1 天进行培养基交换， 培养 7 天。
(2) 获得 CD44 阳性且 CD106 阳性的细胞
用 HCMF 将含有通过上述处理获得的未分化细胞的细胞集团洗涤 1 次后， 添加 3mM EDTA-0.5 ％ BSA-PBS(-)， 在 37 ℃培育， 回收。将回收后的细胞通过 CD44 FITC(BD Pharmingen) 与 抗 CD106 抗 体 (CD106(BDPharmingen)PE) 进 行 双 重 染 色， 使 用 Epics ALTRA(Beckman Coulter) 分离获得 CD44 阳性且 CD106 阳性成分， 由此仅得到除去了未分化 细胞的细胞集团。结果示于图 7。
(3)RA 处理后的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的牙形成性能评价使用如上所述得到的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞， 与实施例 3 相同地操作， 进行 牙胚再构筑与器官培养， 并进行评价。器官培养 14 天后， 通过与牙胚上皮细胞的相互作用， 分化为作为牙的间叶组织的牙本质细胞。 另外， 通过高密度再构成牙胚法， 形成具有外侧为 牙釉质、 内侧为象牙质、 内部为牙髓细胞的牙特有的组织结构的牙。
另外， 对于上述 CD44 阳性且 CD106 阳性的 DMSO-EC 细胞， 与实施例 2(2) 相同地确 认基因表达。 结果， 显示与 CD44 阳性且 CD29 阳性 DMSO-EC 细胞相同， 为 Oct3/4 阴性、 Nanog 阴性、 Slug 阳性、 Pax3 阳性、 Wnt1 阳性的细胞。
进而， 与实施例 4(2) 相同地操作， 确认牙釉质蛋白与 DSPP、 Periostin 表达时， 确 认与 DMSO-EC 相同地表达各 mRNA。这提示了形成含有硬组织、 牙根膜的牙周组织。
[ 实施例 7]
与实施例 6(2) 和 (3) 相同地操作， 使用 CD44 FITC 与 CD106 PE 对 DMSO-EC 细胞进 行双重染色， 显示存在 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞。对于上述 CD44 阳性且 CD106 阳性的 DMSO-EC 细胞， 与实施例 2 相同地确认基因表达时， 判定与 CD44 阳性且 CD29 阳性 DMSO-EC 细胞相同， 为 Oct3/4 阴性、 Nanog 阴性、 Slug 阳性、 Pax3 阳性、 Wnt1 阳性的细胞。
使用此处所得的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的细胞集团， 与实施例 3 和实施例 4(2) 相同地进行牙胚再构筑、 器官培养与 mRNA 表达， 并进行评价。结果通过与牙胚上皮细 胞的相互作用形成具有特有的组织结构的牙。另外， 与实施例 4(2) 相同地操作， 确认牙釉 质蛋白与 DSPP、 Periostin 表达。这提示了能形成含有硬组织、 牙根膜的牙周组织。
如上所述， 可以由全能性干细胞分化诱导 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞或 CD44 阳性 且 CD106 阳性细胞， 通过将上述细胞与上皮系细胞一起间隔化进行培养， 由此再构成牙胚， 从而可以提供具有牙釉质与象牙质的特有结构的牙。
因此， 根据本发明， 可以由全能性干细胞得到牙形成用间充质细胞， 并可以有效大 量地制作牙。
通过参考将日本专利申请第 2007-011805 号的公开内容全部引用到本说明书中。
背景技术 牙是具有最外层为牙釉质、 其内层为象牙质的硬组织， 进而在象牙质的内侧具有 产生象牙质的牙本质细胞、 进一步在中心部具有牙髓的器官， 有时因龋齿或牙周病等而失 去。通常， 认为牙损失对性命的威胁少， 所以现在主要通过义齿或种植牙来修补。但是， 牙 的有无严重影响外观和对食物的味觉， 并且从维持健康和维持高品质生活的观点来看， 对 开发牙的再生技术的关注越来越高。
认为牙因胎儿期的产生过程的诱导而形成， 是根据多种细胞种类构筑的功能单 元， 与器官和脏器相同。 因此， 牙并不是由成体内的造血干细胞或间充质干细胞之类干细胞 产生细胞种的干细胞体系产生的。由此可知， 现在， 仅因再生医疗进步而移入干细胞 ( 干细 胞移入疗法 ) 不能再生牙。
为此， 近年， 使用分离的牙胚细胞再构筑牙胚， 通过移植该再构成牙胚进行牙再 生， 正以这为中心进行研究。
例如， J.Dent.Res.， 2002， Vol.81(10)， pp.695-700 中公开了下述内容， 将从牙胚 分离的上皮系细胞或间充质的牙囊细胞等细胞与生物体吸收性的载体一起移植到大鼠的 腹腔内， 由此再生牙样组织。
作为牙胚的再生方法， 例如日本特开 2004-331557 号公报中记载了在纤维芽细 胞增殖因子等生理活性物质的存在下培养由生物体分离的牙胚细胞。另外， 日本特开 2004-357567 号公报中提出了将从生物体中分离的牙胚细胞与能分化上述细胞的细胞中的 至少一种与含有纤维蛋白的载体一起培养的方案， 此处， 含有纤维蛋白的载体使用牙胚的 目标形状的载体， 形成具有特定形态的 “牙” 。
美国专利申请公开第 2002/0119180 号公报及美国专利申请公开第 2004/0219489 号公报中公开了下述方法 ： 从 6 个月的猪的下颚骨中， 将来自形成象牙质的牙髓的间充质 细胞与含有利于形成釉质的上皮系细胞的牙胚的细胞混合物接种在使由聚乙醇酸 - 聚乙 酸共聚物构成的生物分解性聚合物固化的载体 (Scaffold) 中， 移植到动物体内， 形成牙。 此处， 还记载了作为载体， 使用牙胚的目标形状的载体， 形成具有特有形态的 “牙” 。
另一方面， 国际公开第 2005/014070 号小册子中公开了用于治疗具有骨缺损或损 伤的患者的牙的再生方法。根据该方法， 在聚乙醇酸丝网载体上接种例如来自牙胚的间充 质细胞后， 将上皮系细胞与胶原一起重叠或用上皮细胞片包裹， 由此形成骨。需要说明的 是， 国际公开第 2005/014070 号小册子中， 为了构筑骨的形状而使用载体。
另外， 国际公开第 2006/129672 号小册子中公开了下述技术 ： 将来自牙胚的上皮 系细胞与间充质细胞分别制成细胞集合体后， 使细胞集合体密接在胶原胶内部， 边保持该
认为牙因胎儿期的产生过程的诱导而形成， 是根据多种细胞种类构筑的功能单 元， 与器官和脏器相同。 因此， 牙并不是由成体内的造血干细胞或间充质干细胞之类干细胞 产生细胞种的干细胞体系产生的。由此可知， 现在， 仅因再生医疗进步而移入干细胞 ( 干细 胞移入疗法 ) 不能再生牙。
为此， 近年， 使用分离的牙胚细胞再构筑牙胚， 通过移植该再构成牙胚进行牙再 生， 正以这为中心进行研究。
例如， J.Dent.Res.， 2002， Vol.81(10)， pp.695-700 中公开了下述内容， 将从牙胚 分离的上皮系细胞或间充质的牙囊细胞等细胞与生物体吸收性的载体一起移植到大鼠的 腹腔内， 由此再生牙样组织。
作为牙胚的再生方法， 例如日本特开 2004-331557 号公报中记载了在纤维芽细 胞增殖因子等生理活性物质的存在下培养由生物体分离的牙胚细胞。另外， 日本特开 2004-357567 号公报中提出了将从生物体中分离的牙胚细胞与能分化上述细胞的细胞中的 至少一种与含有纤维蛋白的载体一起培养的方案， 此处， 含有纤维蛋白的载体使用牙胚的 目标形状的载体， 形成具有特定形态的 “牙” 。
美国专利申请公开第 2002/0119180 号公报及美国专利申请公开第 2004/0219489 号公报中公开了下述方法 ： 从 6 个月的猪的下颚骨中， 将来自形成象牙质的牙髓的间充质 细胞与含有利于形成釉质的上皮系细胞的牙胚的细胞混合物接种在使由聚乙醇酸 - 聚乙 酸共聚物构成的生物分解性聚合物固化的载体 (Scaffold) 中， 移植到动物体内， 形成牙。 此处， 还记载了作为载体， 使用牙胚的目标形状的载体， 形成具有特有形态的 “牙” 。
另一方面， 国际公开第 2005/014070 号小册子中公开了用于治疗具有骨缺损或损 伤的患者的牙的再生方法。根据该方法， 在聚乙醇酸丝网载体上接种例如来自牙胚的间充 质细胞后， 将上皮系细胞与胶原一起重叠或用上皮细胞片包裹， 由此形成骨。需要说明的 是， 国际公开第 2005/014070 号小册子中， 为了构筑骨的形状而使用载体。
另外， 国际公开第 2006/129672 号小册子中公开了下述技术 ： 将来自牙胚的上皮 系细胞与间充质细胞分别制成细胞集合体后， 使细胞集合体密接在胶原胶内部， 边保持该
状态边培养， 由此制造具备牙特有的细胞配置的牙。
但是， 上述技术中， 为了再生牙或牙胚， 从生物体中获得牙胚细胞或能分化成该细 胞的细胞。由此， 在使用从生物体中采集的细胞的技术中， 有时能获得的细胞数不充分。另 外， 有时细胞的获得源有限。
另外， 发挥作为组织的功能时， 必须将构成组织的多种细胞配置 ( 细胞配置 ) 在适 当的相对位置， 具有作为组织的方向性。 发明内容 本发明是鉴于上述情况而得到的， 提供牙形成用间充质细胞的制造方法、 牙的制 造方法及牙形成用间充质细胞。
本发明的第一方案提供一种间充质细胞的制造方法， 其是用于形成牙的间充质细 胞的制造方法， 该方法包括下述步骤 ： 在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞， 生成含有 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集 团； 从所述分化诱导处理后的细胞集团中筛选 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞作为牙形成用间充质细胞。
本发明的第一方案提供一种间充质细胞的制造方法， 其是用于形成牙的间充质细 胞的制造方法， 该方法包括下述步骤 ： 在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞， 生成含有 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集 团； 从所述分化诱导处理后的细胞集团中筛选 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞作为牙形成用间充质细胞。
本发明的第二方案在于提供一种牙的制造方法， 所述方法包括下述步骤 ： 使实质 上仅由间充质细胞与上皮系细胞中的任一种构成的第 1 细胞集合体、 和实质上仅由任意其 它一种细胞构成的第 2 细胞集合体在不混合的情况下密接地配置在支持载体的内部 ； 在所 述支持载体的内部培养所述第 1 与第 2 细胞集合体， 其中所述间充质细胞含有上述牙形成 用间充质细胞。
本发明的第三方案是提供由全能性干细胞诱导的 CD44 阳性且 CD29 阳性、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性的牙形成用间充质细胞。
根据本发明， 可以提供能有效且大量制作目标牙的间充质细胞的制造方法、 及有 效且大量制造牙的牙的制造方法， 所述牙保持有由牙釉质及象牙质得到的特有的细胞配 置。
本发明的第三方案是提供由全能性干细胞诱导的 CD44 阳性且 CD29 阳性、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性的牙形成用间充质细胞。
根据本发明， 可以提供能有效且大量制作目标牙的间充质细胞的制造方法、 及有 效且大量制造牙的牙的制造方法， 所述牙保持有由牙釉质及象牙质得到的特有的细胞配 置。
附图说明 [ 图 1] 是示意地表示牙胚形成的概念图。
[ 图 2A] 是表示本发明实施例 1 的 EC 细胞的 CD44 及 CD29 双重染色的状况的图。
[ 图 2B] 是表示本发明实施例 1 的 DMSO 处理后第 6 天的细胞的 CD44 及 CD29 双重 染色的状况的图。
[ 图 2C] 是本发明实施例 1 中的筛选得到的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞的 CD44 及 CD29 双重染色的状况的图。
[ 图 3A] 是概念地表示本发明实施例的、 使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细 胞的牙胚再构筑顺序的图， 是表示细胞配置前的凝胶包装 (gelpack) 的状况的图。
[ 图 3B] 是概念地表示本发明实施例的、 使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细 胞的牙胚再构筑顺序的图， 是表示将第一细胞集合体配置在凝胶包装内的状况的图。
[ 图 3C] 是概念地表示本发明的实施例的、 使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系 细胞的牙胚再构筑的顺序的图， 是表示将第二细胞集合体配置在凝胶包装内的状况的图。
[ 图 3D] 是概念地表示本发明实施例的、 使用来自牙胚的间充质细胞与上皮系细 胞的牙胚再构筑的顺序的图， 是表示将配置有第一细胞集合体与第二细胞集合体的凝胶包 装固化的状况的图。
[ 图 4A] 是本发明实施例 4 的由牙胚上皮组织与牙胚间叶细胞制作而成的牙胚的 HE 染色像 ( 倍率 ： 100 倍 )。
[ 图 4B] 是由本发明实施例 4 的由牙胚上皮组织与 DMSO-EC 细胞制作而成的牙胚 的 HE 染色像 ( 倍率 ： 100 倍 )。
[ 图 4C] 是本发明实施例 4 的由牙胚上皮组织与 DMSO-EC 克隆化细胞制作而成的 牙胚的 HE 染色像 ( 倍率 ： 100 倍 )。
[ 图 5A] 是表示本发明实施例 5 的、 EC 细胞的 CD44 及 CD29 的双重染色的状况的 图。
[ 图 5B] 是表示本发明实施例 5 的、 RA 处理后第 7 天的细胞的 CD44 及 CD29 的双 重染色的状况的图。
[ 图 5C] 是表示本发明的实施例 5 的、 筛选得到的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞的 CD44 及 CD29 双重染色的状况的图。
[ 图 6] 是本发明实施例 5 中由通过 RA 处理得到的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞与 牙胚上皮组织制作而成的牙胚的 HE 染色像 ( 倍率 ： 200 倍、 bar 为 50μm)。
[ 图 7A] 是表示本发明实施例 6 的、 EC 细胞的 CD44 及 CD106 的双重染色状况的 图。
[ 图 7B] 是本发明实施例 6 中的 RA 处理后第 7 天的细胞的 CD44 及 CD106 的双重 染色的状况的图。
[ 图 7C] 本发明实施例 6 中筛选得到的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的 CD44 及 CD106 的双重染色的状况的图。 具体实施方式
[ 间充质细胞的制造方法 ]
本发明的间充质细胞的制造方法是制造用于形成牙的间充质细胞的方法， 其包括 下述步骤 ： 在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞， 生成含有 CD44 阳性且 CD29 阳性细 胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的分化诱导处理后的细胞集团 ； 从所述分化诱导处理后 的细胞集团中筛选 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞作为牙形成 用间充质细胞。
本发明发现， 分化诱导全能性干细胞而得到的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞可以用作牙形成用间充质细胞。由此， 也可以从来自生物体的牙或 牙胚以外的物质中得到用于制作牙所需的间充质细胞， 得到用于形成牙的间充质细胞， 因 此可以排除使用来自生物体的牙等的必要性。结果， 不需要考虑从牙胚直接采集的细胞数 不充分的情况或获得场所有无限制的情况就可以容易地根据情况大量得到所需量的间充 质细胞。
本发明中， 所谓 “牙” ， 是指在内侧连续地具有象牙质及在外侧连续地具有牙釉质 层的组织， 特别是指具有牙冠或牙根的具备方向性的组织。牙的方向性可以由牙冠或牙根的配置来特定。牙冠或牙根可以基于形状或组织染色等通过肉眼观察来确认。所谓牙冠， 是指具有牙釉质与象牙质的层结构的部分， 牙根不存在牙釉质层。
象牙质及牙釉质可以由本领域技术人员通过组织染色等形象且容易地特定。另 外， 牙釉质可以通过釉质芽细胞的存在来特定， 釉质芽细胞的存在可以通过有无牙釉质蛋 白来确认。 另一方面， 象牙质可以通过牙本质细胞的存在来特定， 牙本质细胞的存在可以通 过有无牙本质涎蛋白来确认。 牙釉质蛋白与牙本质涎蛋白的确认可以通过该领域中周知的 方法容易地实施， 例如可以举出原位杂交、 抗体染色等。
另外， 为了形成牙， 首先为了形成牙胚， 可以使用本发明的间充质细胞。
本发明中， “牙胚” 及 “牙芽” 是根据后述的发生阶段而区别得到的物质中在没有特 别说明时使用的表现。 所谓此时的 “牙胚” ， 是指决定将来成为牙的牙的初始胚， 是在牙的产 生阶段中从通常所用的蕾状期 (Bud stage) 至钟状期 (Bell stage) 的阶段， 特别是未确认 作为牙的硬组织的特征即象牙质、 牙釉质蓄积的组织。另外， 所谓 “牙芽” ， 是指由本发明中 所用的 “牙胚” 的阶段过渡而来的、 从开始蓄积作为牙的硬组织特征即象牙质、 牙釉质的阶 段开始到牙从牙肉开始萌芽发挥通常作为牙的功能前的阶段的组织。
由牙胚向牙的产生通过如图 1 所示的个体产生的过程中， 经由蕾状期、 帽状期、 钟 状前期及后期的各个阶段来进行。此处， 在蕾状期， 处于上皮系细胞包裹间充质细胞的状 态， 至钟状前期及钟状后期时， 上皮系细胞部分形成外侧的牙釉质， 间充质细胞部分在内部 形成象牙质。因此， 通过上皮系细胞与间充质细胞的细胞间相互作用， 由牙胚形成牙。 需要说明的是， 本发明中， 所谓 “间充质细胞” ， 是指来自间叶组织的细胞， 所谓 “上 皮系细胞” ， 是指来自上皮组织的细胞。
另外， 本发明中， 所谓 “牙周组织” ， 是指牙的主要形成外层的牙槽骨及牙根膜。牙 槽骨及牙根膜可以由本领域技术人员通过组织染色等形象且容易地特定。
以下， 说明本发明的牙形成用间充质细胞。
用于得到本发明的牙形成用间充质细胞的全能性干细胞是指具有能分化为至少 2 种以上细胞的多分化能力的细胞， 可以优选使用选自由胚性癌细胞、 胚性干细胞、 胚性生殖 干细胞构成的组中的细胞。其中， 从获得容易性的观点考虑， 较优选为胚性癌细胞 ( 以下称 为 “EC 细胞” )。能应用于本发明的 EC 细胞可以为来自神经、 睾丸、 卵巢等任一种组织的细 胞。作为上述 EC 细胞， 例如， 作为来自人的 EC 细胞， 可以举出 NCR-G3 细胞以及 NTERA-2 细 胞， 作为来自小鼠的 EC 细胞， 可以举出 c-1300 细胞或 F9 细胞、 LT-2 细胞、 OTT6050 细胞、 PCC4 细胞、 P19 细胞、 METT-1 细胞、 STT-3 细胞等细胞株。上述细胞可以适当根据使用目的 从来自哺乳动物的灵长类 ( 例如人、 猴等 )、 有蹄类 ( 例如猪、 牛、 马等 )、 小型哺乳类的啮齿 类 ( 例如小鼠、 大鼠、 兔等 ) 各种动物的细胞中选择。例如， 作为来自小鼠的胚性癌细胞株， 可以举出上面记载的细胞株或这些细胞株的派生克隆。
全能性干细胞的培养中可以使用通常使用的培养基。作为用于培养的培养基， 可 以使用通常用于培养动物细胞的培养基、 例如 Dulbcco’ sModifed Eagle Medium(DMEM) 等。 上述培养基中可以添加用于促进细胞增殖的血清或添加例如 FGF、 EGF、 PDGF 等细胞增殖因 子或转铁蛋白等已知的血清成分来代替血清。另外， 添加血清时的浓度可以根据此时的培 养状态适当变更， 但通常可以为 10％。细胞的培养可使用通常的培养条件， 例如在 37℃的 温度下、 在浓度为 5％的 CO2 的恒温箱内的培养。另外， 可以适当添加链霉素等抗生素。
本发明中， 通过在分化诱导剂的存在下培养全能性干细胞来进行分化诱导处理。 通过该分化诱导处理， 由全能性干细胞生成含有 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性 且 CD106 阳性细胞的细胞集团。通过诱导处理而得到的细胞集团中含有上述 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞即可， 也可以含有上述两种细胞。
作为上述分化诱导剂， 只要是至少能由全能性干细胞分化诱导为 CD44 表达细胞 的 CD44 阳性细胞诱导因子， 就可以使用。作为上述 CD44 阳性细胞诱导因子， 可以举出神经 嵴细胞系诱导因子、 神经嵴细胞产生相关因子、 神经嵴细胞增殖促进因子。神经嵴细胞系 诱导因子是可以将全能性干细胞诱导为神经嵴细胞或其派生细胞 ( 平滑肌细胞、 心肌细胞 等 ) 的因子， 可以举出例如二甲基亚砜 (DMSO)、 Dex、 cAMP、 六亚甲基二乙酰胺、 5’ - 氮杂胞 苷、 TGFβ、 Noggin 等。作为神经嵴细胞产生相关因子， 可以举出视黄酸 (RA)、 BMP-4、 BMP-7、 Shh、 Wnt、 FGF2、 内皮素 -1、 内皮素 -3、 活化素 βA、 PDGF、 VEGF 等。作为神经嵴细胞增殖促 进因子， 可以举出 FGF2、 FGF8、 FGF10、 BMP-2、 SCF、 活性型维生素 D3 等。神经嵴细胞系诱导 因子、 神经嵴细胞产生相关因子及神经嵴细胞增殖促进因子没有分别明确地区别， 并且可 以单独使用上述分化诱导剂或组合 1 种以上进行使用。其中， 优选能有效生成下述本发明 的目标细胞集团的 DMSO 及 RA， 上述分化诱导剂可以单独或组合使用。 上述分化诱导剂可以按照能分化诱导的浓度添加在全能性干细胞的培养基中。 此 处所谓能分化诱导的浓度， 根据所用的分化诱导剂的种类和全能性干细胞的种类等不同而 不同。
例如， 为 DMSO 时， 通常相对于培养基的容量， 为 0.5 容量％～ 10 容量％， 从对处理 的细胞的生存率及通过培养得到的目标细胞的获得效率的观点来看， 优选为 2.5 容量％～ 5 容量％、 更优选为 4 容量％～ 5 容量％的浓度。为 2.5 容量％以上的浓度时， 可以充分诱 导全能性干细胞分化， 另一方面， 如果为 5 容量％以下的浓度， 则不会显著损害获得目标细 胞的效率。
另外， 为 RA 的情况下， 通常在培养基中为 0.1μM ～ 10μM， 从对处理的细胞的生存 率及通过培养得到的目标细胞的获得效率的观点来看， 可以优选为 0.5μM ～ 5μM、 更优选 为 0.5μM ～ 2μM 的浓度。如果为 0.1μM 以上的浓度， 则可以充分诱导全能性干细胞的分 化， 另一方面， 如果为 10μM 以下的浓度， 则不会显著损害获得目标细胞的效率。
对于全能性干细胞的分化诱导处理可以通过在上述分化诱导剂的存在下培养全 能性干细胞来进行。分化诱导处理 ( 培养 ) 期间根据分化诱导剂的浓度与细胞的生长活性 而不同， 但通常为 2 小时～ 3 天， 从细胞的存活率以及目标细胞的获得效率的观点来看， 可 以优选为 6 小时～ 24 小时。设定为 6 小时以上可以效率良好地得到被充分分化诱导的细 胞， 设定为 24 小时以下不会显著损害效率。
另外， 为了有效引发对全能性干细胞的分化诱导， 在分化诱导处理的期间与分化 诱导剂的浓度之间有一定的关系。即， 通常在分化诱导剂存在下的培养期间 ( 处理时间 ) 因分化诱导剂的浓度与分化诱导剂的种类而不同， 但在特定的分化诱导剂的情况下， 固定 培养天数时， 通常存在最适合其浓度的浓度区域。另外， 缩短培养天数时， 最佳浓度区域移 动到高浓度侧， 相反， 延长培养天数时， 最佳浓度区域移动到低浓度侧。 考虑到上述因素， 能 通过调节培养天数来得到在幅度较宽的浓度区域中的分化诱导效果， 同时本领域技术人员 可以容易地设定能得到诱导效果的最佳浓度区域。
由上述分化诱导处理而得到的分化诱导处理后的细胞集团中生成含有 CD44 阳性 且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的细胞集团。也可以含有上述两种细胞。 然后， 该分化诱导处理后的细胞集团被供给到筛选 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞、 或 CD44 阳 性且 CD106 阳性细胞作为牙形成用间充质细胞的筛选处理中。
细胞的筛选只要是可以筛选上述本发明的间充质细胞的方法即可， 可以使用任意 方法。 作为上述筛选方法， 可以举出以基因表达蛋白、 细胞表面抗原、 形态等为基准的筛选， 可以使用上述的一种或二种以上来筛选全能性干细胞。从筛选细胞的效率的观点来看， 筛 选方法优选使用以细胞表面表达为基础的细胞分选仪， 为了确实地筛选间充质细胞， 优选 使用多个组合、 特别是组合基因表达谱与细胞表达抗原的表达来使用。
本发明中筛选得到的牙形成用间充质细胞除显示 CD44 阳性之外， 还显示 CD29 阳 性或 CD106 阳性的细胞性状。已知 CD44 是作为透明质酸受体在细胞表面表达的膜蛋白质。 另一方面， 已知 CD29 是作为整连蛋白 β1 分子在细胞表面表达的膜蛋白质， 分别报道有在 EC 细胞中表达为弱阳性， 在间充质细胞中以 mRNA 水平来表达的情况。另外， 已知 CD106 是 作为粘连分子而已知的 VCAM-1 分子， 通常主要作为上皮系细胞的标记使用。如果是显示上 述性状的细胞， 则可以在下述牙的形成中作间充质细胞使用。 本发明的牙形成用间充质细胞只要是除了 CD44 阳性之外， CD29 及 CD106 中的至 少一种抗原也表现为阳性的集团即可， 也可以含有 CD44、 CD29、 CD106 这 3 种抗原均为阳性 的三重阳性细胞。
本发明的牙形成用间充质细胞除了基于上述 CD44、 CD29 及 CD106 的细胞表面抗原 筛选之外， 还可以基于其他细胞性状进行筛选。
作为其他细胞性状， 可以举出其他细胞表面抗原谱或基因表达谱。作为细胞表面 抗原谱， 可以举出例如 CD14 阴性、 CD34 阴性、 CD45 阴性等， 上述细胞表达抗原谱可以单独使 用或组合进行使用。另外， 作为基因表达谱， 可以举出例如 Slug 表达、 Wnt5a 表达、 Lhx8 表 达、 BMP4 表达、 Pax3 表达、 Pax9 表达、 Msx1 表达、 Oct3/4 不表达、 nanog 不表达、 Sox9 不表 达、 Sox5 不表达等， 可以单独或组合上述基因表达谱进行使用， 但并不限定于此。
本发明的牙形成用间充质细胞优选除表达上述 CD44、 CD29、 CD106 之外， 从牙形成 性能高低出发， 优选表达选自 Slug 基因、 Pax3 基因、 Msx1 基因及 Pax9 基因的组中的至少一 个基因， 更优选均表达 Slug 基因及 Pax3 基因， 特别优选全部表达上述 4 个基因。
上述细胞表面抗原或基因表达谱的确认及基于此的筛选中使用识别表面抗原的 各种抗体或能确认基因表达的核酸序列等。 上述抗体及核酸序列均是公知的， 能容易获得。 另外， 基于上述表面抗原或基因表达的确认与筛选可以使用通常用于该用途的方法、 例如 利用各种抗体进行的免疫染色、 流式细胞仪、 细胞分选仪、 RT-PCR 等。
另外， 本发明的制造方法中， 可以与上述筛选方法组合， 使用用于制成单一的间充 质细胞的克隆。作为克隆的方法， 可以使用通常用于该目的的方法， 例如极限稀释法、 细胞 分选仪、 克隆等。 克隆可以在用上述筛选方法进行的筛选前后的任一阶段进行， 但为了效率 良好地得到目标间充质细胞， 优选在筛选后进行。
筛选工序中， 为了效率良好地得到目标细胞数， 可以在筛选工序前设置增殖工序。 上述增殖工序中， 使用不含有分化诱导剂的通常用于培养的培养基进行分化诱导后的细胞 集团的培养。由此， 可以使分化诱导得到的目标细胞增殖到规定的细胞数。结果， 可以通过
充分的细胞数容易地实施筛选。
上述增殖工序的期间可以基于分化诱导处理后的细胞数及细胞的状态来适当设 定， 但从目标细胞的浓缩效率的观点考虑， 通常为 3 ～ 30 天， 可以优选为 5 ～ 10 天。结果， 通过在作为筛选工序对象的细胞集团中含有目标牙形成用间充质细胞， 并将上述细胞集团 供给到筛选工序中， 从而可以有效且大量地得到本发明的牙形成用间充质细胞。
由本发明的方法得到的间充质细胞可用于形成牙。 牙的形成只要使用本发明的间 充质细胞即可， 可以为任一种方法， 最优选用于以下的本发明的牙制造方法中。
以下， 说明本发明的牙的制造方法。
[ 牙的制造方法 ]
使用本发明的牙形成用间充质细胞的优选的牙制造方法包括下述工序 ： 在使实质 上仅由间充质细胞与上皮系细胞中的任一种细胞构成的第 1 细胞集合体、 和实质上由任意 另一种细胞构成的第 2 细胞集合体在不混合的情况下密接地配置在支持载体的内部 ( 配置 工序 ) ； 在所述支持载体的内部培养所述第 1 及第 2 细胞集合体 ( 培养工序 )， 其中所述间 充质细胞含有上述牙形成用间充质细胞。
本制造方法中， 由于不使间充质细胞与上皮系细胞作为细胞集合体而混合在支持 载体的内部， 而是使其以密接的状态生长， 所以可以通过紧密的接触状态， 有效地重现细胞 间相互作用， 并且可以得到内侧为象牙质、 外侧为牙釉质的具有牙所特有的细胞配置的牙。 此时， 由于实质上由间充质细胞构成的细胞集合体含有本发明的牙形成用间充质细胞， 所 以可以有效且大量地制造具有特有的细胞配置的牙。
配置工序中， 使第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体接触地配置在支持载体的内部。
此处， 第 1 细胞集合体及第 2 细胞集合体分别实质上仅由间充质细胞或仅由上皮 系细胞构成。此处， 实质上仅由间充质细胞构成的细胞集合体含有上述牙形成用间充质细 胞。该含有牙形成用间充质细胞的细胞集合体可以根据上述制造方法的调制工序来调制， 另一方面， 实质上仅由上皮系细胞构成的细胞集合体可以与实质上由间充质细胞得到的细 胞集合体独立地调制 ( 第 1 细胞调制工序及第 2 细胞调制工序 )。
另外， 所谓 “细胞集合体” 是指细胞密集的状态， 可以为组织的状态， 也可以为由单 一细胞的状态调制得到的细胞集合体 ( 细胞凝集体 )。另外， 所谓 “实质” ， 是指尽量不含有 作为对象的细胞以外的细胞。因此， 由上皮系细胞构成的细胞集合体可以为一部分组织或 单一细胞的集合体。另外， 上皮系细胞及间充质细胞可以为均由单一细胞构成的细胞集合 体。
第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体可以均为上皮系细胞及间充质细胞， 构成该细 胞集合体的细胞的数量根据动物的种类、 支持载体的种类、 硬度及大小而不同， 相对于 1 个 1 8 3 8 细胞集合体， 通常为 10 ～ 10 个， 可以优选为 10 ～ 10 个。
实质上由间充质细胞构成的细胞集团只要含有牙形成用间充质细胞即可， 也可以 含有其他间充质细胞。
作为上述间充质细胞以外的其他间充质细胞， 可以举出来自于牙胚及牙胚以外的 间充质细胞。作为来自于牙胚以外的间充质细胞， 是来自生物体内的其他间充质组织的细 胞， 可以优选举出不含有血液细胞的骨髓细胞或间充质干细胞， 更优选举出来自于口腔内 间充质细胞或颚骨内部的骨髓细胞、 头部神经嵴细胞的间充质细胞、 能产生所述间充质细胞的间充质前体细胞或其干细胞等。
为了重现在生物体内的细胞配置、 有效形成具有特有的结构及方向性的牙， 用于 本制造方法的上皮系细胞优选为来自牙胚， 从细胞的分化阶段的不成熟性和均质性的观点 考虑， 优选来自蕾状期至帽状期的细胞。
另外， 可以为来自牙胚以外的上皮系细胞， 这可以举出来自生物体内的其他上皮 系组织的细胞。可以优选举出皮肤或口腔内粘膜或牙肉的上皮系细胞， 更优选皮肤或粘膜 等分化的例如能生出角化或角化不全的上皮系细胞的不成熟的上皮系前体细胞、 例如未角 化的上皮系细胞或其干细胞等。
为了调制细胞集合体而从组织中分离各细胞时， 牙胚及其他组织可以从下述各种 动物的颚骨等中采集 ： 哺乳动物的灵长类， 例如人、 猴等 ； 有蹄类， 例如猪、 牛、 马等 ； 小型哺 乳类的啮齿类， 例如小鼠、 大鼠、 兔等。牙胚及组织的采集通常可以直接应用通常用于采集 组织的条件， 可以在无菌状态下取出， 保存在适当的保存液中。需要说明的是， 作为人的牙 胚， 除可以举出第 3 臼齿， 即所谓的智齿的牙胚之外， 还可以举出胎儿牙胚， 但从利用自身 组织的观点来看， 优选使用智齿牙胚。
由组织、 例如牙胚调制上述细胞时， 首先， 将从周围组织分离的牙胚根据形状分为 牙胚间叶组织与牙胚上皮组织。 此时， 由于牙胚组织能在显微镜下从结构上区分， 所以可以 用解剖用剪刀或镊子等切断、 或通过剥下等容易地分离。 另外， 从牙胚组织分离牙胚间叶组 织及牙胚上皮组织可以根据其形状用注射针、 钨针、 镊子等切断， 或通过剥下容易地进行。 为了从周围组织容易地分离牙胚细胞及 / 或从牙胚组织分离上皮组织及间叶组 织， 可以优选使用酶。作为用于上述用途的酶， 可以举出分散酶、 胶原酶、 胰蛋白酶等。
构成细胞集合体的细胞可以由采集的组织中调制为单一细胞的状态。调制工序 中， 为了能容易地分离单一细胞， 可以使用酶。作为上述酶， 可以举出分散酶、 胶原酶、 胰 蛋白酶等。此时， 由上皮组织分离上皮系细胞时， 优选胶原酶处理后进行胰蛋白酶处理与 DNase 处理。 另一方面， 由间叶组织分离间充质细胞时， 优选同时用胶原酶与胰蛋白酶处理， 最终进行 DNase 处理。此时进行 DNase 处理的原因在于， 防止因酶处理导致一部分细胞受 到破坏， 因细胞膜溶解时释放到溶液中的 DNA 而发生细胞凝集， 从而细胞回收量降低。
另外， 为了分别得到充分的细胞数， 构成细胞集合体的细胞可以在配置工序前经 过预培养。细胞的培养可以直接使用通常用于培养动物细胞的温度等条件。
作 为 用 于 培 养 的 培 养 基， 可 以 使 用 通 常 用 于 培 养 动 物 细 胞 的 培 养 基、 例如 Dulbcco’ s Modifed Eagle Medium(DMEM) 等， 可以添加用于促进细胞增殖的血清， 或者可 以添加例如 FGF、 EGF、 PDGF 等细胞增殖因子或转铁蛋白等已知血清成分来代替血清。另外， 添加血清时的浓度可以根据此时的培养状态进行适当变更， 但通常可以为 10 容量％。细胞 的培养中应用通常的培养条件， 例如在 37℃的温度下、 在浓度为 5％的 CO2 的恒温箱内的培 养。另外， 可以适当添加链霉素等抗生素。
将预培养应用于间充质细胞中时， 可以为兼具用于将上述牙形成用间充质细胞增 殖的培养， 也可以为筛选工序后进行的培养， 或这两种培养。
另外， 从不改变细胞性质的观点考虑， 在间充质细胞的预培养或用于上述牙形成 用间充质细胞的简单增殖的培养中， 可以在不含有上述分化诱导剂的培养基中进行。
配置工序中的细胞集合体的配置是将上述第 1 及第 2 细胞集合体配置在能保持细
胞的接触状态的支持载体的内部。此时， 各细胞集合体不会彼此混合。由于如上所述不混 合各细胞集合体地进行配置， 所以在细胞集合体间形成边界线。 在本说明书中， 将该配置形 态适当表达为 “间隔化” 。
作为此处所用的支持载体， 只要是能在内部培养细胞的支持载体即可， 优选为与 上述培养基的混合物。作为上述支持载体， 可以举出胶原、 琼脂糖凝胶、 羧甲基纤维素、 明 胶、 琼脂、 水凝胶、 Cellmatrix( 商品名 )、 メビォ一ルゲル ( 商品名 )、 Matrigel( 商品名 )、 弹力蛋白、 纤维蛋白、 层粘蛋白、 细胞外基质混合物、 聚乙醇酸 (PGA)、 聚乳酸 (PLA)、 乳酸 / 乙醇酸共聚物 (PLGA) 等。上述支持载体具有将细胞配置在内部时能基本维持配置位置的 硬度即可， 可以举出凝胶状、 纤维状、 固体状的支持载体。 其中， 从细胞外基质混合物等凝胶 容易提供适当的硬度和保持力的观点考虑， 较优选胶原、 琼脂糖凝胶、 羧甲基纤维素、 明胶、 琼脂、 水凝胶、 Cellmatrix、 メビォ一ルゲル、 Matrigel、 细胞外基质混合物、 弹力蛋白、 纤维 蛋白、 层粘蛋白。 此处， 所谓能维持细胞位置的硬度， 通常为用作三维培养的硬度、 即在保持 细胞配置的同时不阻碍由增殖导致肥大化的硬度即可， 可以容易地确定。
需要说明的是， 此处， 支持载体具有第 1 及第 2 细胞集合体可以在载体内部生长的 程度的厚度即可， 可以根据目标组织的大小等适当设定。 另外， 支持载体具备使细胞不分散、 能保持细胞的接触状态的保持力即可。 此处所 说的 “接触状态” ， 优选在各细胞集合体中、 或细胞集合体间， 确实地使细胞相互作用的紧密 ( 高密度 ) 的状态， 上述高密度的状态是指在细胞凝集体的情况下， 例如， 可以用能维持比 简单彼此接触更强的密接状态的保持力来培养细胞。 例如， 在胶原的情况下， 提供最终浓度 为 2 ～ 3mg/ml 的浓度， 即基于 JIS-K6503-1996 的方法 ( 作为用直径为 12.7mm 的冲头挤压 4mm 所需的负荷进行测定 ) 达到凝胶强度为 120g ～ 250g 的浓度下适合使用的硬度。另外， 该凝胶强度没有限定， 对于其他种类的支持载体只要根据同样的评价方法可测得同样的强 度， 就可以优选用作本发明的支持载体。另外， 通过混合 1 种或多种支持载体， 可以得到相 当于目标凝胶强度的硬度的支持载体。
所谓高密度的状态， 是指与构成组织时的密度同等程度的状态， 例如， 为细胞集合 7 9 体的情况下， 在细胞配置时为 5×10 ～ 1×10 个 /ml， 为了在无损细胞活性的情况下确实 8 9 地使细胞相互作用， 优选为 1×10 ～ 1×10 个 /ml， 最优选为 2×108 ～ 8×108 个 /ml 的密 度。以上述细胞密度调制细胞集合体时， 通过离心使细胞凝集并沉淀化， 可以在无损细胞 存活的情况下简便地高密度化， 所以优选。上述离心可以在无损细胞存活的相当于 300 ～ 1200×g、 优选为 500 ～ 1000×g 的离心力的旋转数下进行 3 ～ 10 分钟。在低于 300×9 进 行离心时， 细胞沉淀不充分， 有时细胞密度降低， 另一方面， 在高于 1200×g 下离心时， 有时 细胞受到损伤， 所以均不优选。
通过离心分离来调制高密度的细胞时， 通常在用于离心分离细胞的管等容器中调 制单一细胞的混悬液后进行离心分离， 将沉淀物即细胞残留， 尽可能除去上清液即可。 从完 全除去上清液的观点来看， 此时所用的管等容器优选为进行过硅涂布的容器。
使用离心分离得到沉淀物时， 可以将沉淀物直接配置到支持载体的内部。 此时， 优 选目标细胞以外的成分 ( 例如， 培养液、 缓冲液、 支持载体等 ) 的量在与细胞容量相等的量 以下， 最优选不含有目标细胞以外的成分。上述高密度的细胞集合体中， 细胞紧密接触， 有 效地发挥细胞间相互作用。 特别是将目标细胞以外的成分极少的细胞集合体配置在支持载
体的内部时， 通过支持载体的固化等进一步凝集， 成为更紧密的状态。
以组织的状态使用时， 优选进行酶处理等以除去对象细胞以外的结合组织等。目 标细胞以外的成分较多时， 例如， 它们的量在与细胞容量相等的量以上时， 不能充分发挥细 胞间相互作用， 所以不优选。
另外， 第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体的接触优选第 1 细胞集合体与第 2 细胞 集合体的接触为密接， 特别优选将第 2 细胞集合体挤压于第 1 细胞集合体来进行配置。另 外， 用培养液、 不阻碍氧透过的固态物包裹第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体的周围对于使 细胞集合体之间的接触密接是有效的。 在粘度不同的溶液中加入高密度的细胞混悬液进行 配置， 直接将溶液固化的方式也可达成容易地保持细胞的接触， 故而优选。此时， 以第 1 细 胞集合体为牙胚间充质细胞的单一细胞集合物、 以第 2 细胞集合体为牙胚上皮组织时， 优 选以牙胚上皮组织的釉质结节与第 1 细胞集合体接触的方式进行配置， 但并不限定于此。
支持载体为凝胶状或溶液状等时， 可以在配置工序后设置固化支持载体的固化工 序。通过固化工序， 配置在支持载体内部的细胞被固定在支持载体内部。支持载体的固化 中可以直接应用通常使用的支持载体的固化条件。例如， 在支持载体中使用胶原等能固化 的化合物时， 在通常使用的条件下， 例如， 在培养温度下使其静置数分钟～数十分钟， 由此 可以固化。由此， 可以使支持载体内部的细胞间的结合固化， 同时可以使该结合牢固。 本发明的制造方法的培养工序中， 在支持载体内部培养第 1 细胞集合体及第 2 细 胞集合体。该培养工序中， 通过彼此紧密接触的第 1 细胞集合体及第 2 细胞集合体， 可有效 地进行细胞间相互作用， 从而可再构成组织， 即牙。
可以通过支持载体维持第 1 细胞集合体与第 2 细胞集合体的接触状态进行培养工 序， 该培养工序可以是用具有第 1 及第 2 细胞集合体的支持载体单独进行的培养， 也可以是 在其他动物细胞的存在下的培养。
作为培养期间， 因配置在支持载体内部的细胞数与细胞集合体的状态、 以及培养 工序的实施条件而不同， 但通常为 1 ～ 300 天， 为了形成外侧具有牙釉质、 内侧具有象牙质 的牙， 优选为 1 ～ 120 天， 从能迅速提供的观点考虑， 可以优选为 1 ～ 60 天。进而为了制成 具备牙周组织的牙， 通常为 1 ～ 300 天， 可以优选为 1 ～ 60 天。
仅用支持载体进行培养时， 可以采用在用于培养动物细胞的通常条件下的培养。 此处的培养通常可以直接采用在动物细胞下的培养条件， 也可以直接采用上述条件。 另外， 培养中可以添加来自哺乳动物的血清， 还可以添加对于上述细胞增殖或分化有效的已知的 各种细胞因子。作为上述细胞因子， 可以举出 FGF、 BMP 等。
另外， 从组织或细胞集合体的换气或供给营养的观点考虑， 优选使用器官培养。 器 官培养中， 通常在适合动物细胞增殖的培养基上平铺多孔性膜， 在该膜上放置被支持载体 包埋的细胞集合体， 由此进行培养。此处所用的多孔性膜中， 优选为具有大量 0.3 ～ 5μm 左右的孔的膜， 具体而言， 可以举出 Cell Culture Insert( 商品名 )、 ァィソボァフィルタ 一 ( 商品名 )。
在其他动物细胞的存在下进行培养时， 由于受到来自动物细胞的各种细胞因子等 的作用， 可以尽快形成具有特定细胞配置的牙， 所以优选。 上述其他动物细胞的存在下的培 养可以使用分离细胞或培养细胞而通过生物体外的培养来进行。
另外， 可以将具有第 1 与第 2 细胞集合体的支持载体移植到生物体中， 在生物体内
进行培养。上述在生物体内的培养由于可以尽快形成牙、 以及牙周组织， 所以特别优选。此 时， 将第 1 和第 2 细胞集合体与支持载体一起移植到生物体内。
能用于该用途的动物可以优选举出哺乳动物， 例如人、 猪、 小鼠等， 更优选来自与 牙胚组织相同种类的动物。 移植人牙胚组织时， 优选使用人、 或变成免疫功能不全的人以外 的其他哺乳动物。为了尽可能地正常产生动物细胞的器官或组织， 作为适合上述生物体内 生长的生物体部位， 优选肾脏皮膜下、 肠间膜、 皮下移植、 口腔内等。
作为移植的生长期间， 根据移植时的大小与产生的牙的大小而不同， 通常可以为 3 ～ 400 天。 例如， 移植到肾脏皮膜下的移植期间也根据移植的培养物的大小与再生牙的大 小而不同， 但从牙的再生与在移植部位产生的牙大小的观点考虑， 优选为 7 ～ 60 天。
向生物体内移植前， 可以在生物体外进行培养 ( 前培养 )。通过该前培养， 使细胞 间的结合和第 1 与第 2 细胞集合体之间的结合牢固， 从而可以使细胞间相互作用更牢固， 所 以优选。结果可以缩短总体生长期。
前培养的期间可以为短期， 也可以为长期。在长期例如 3 天以上、 优选为 7 天以上 的情况下， 可以由牙胚产生牙芽， 所以可以缩短移植后形成牙的时间， 所以优选。作为前培 养期， 例如， 作为在肾脏皮膜下进行移植时的器官培养， 由于 1 ～ 7 天能有效再生牙， 所以优 选。
由本发明的制造方法制造的牙具有内侧为象牙质、 外侧为牙釉质的牙所特有的细 胞配置 ( 结构 )， 并且优选还具备牙的前端 ( 牙冠 ) 与牙根的方向性。通过至少除上述特有 的细胞配置、 优选细胞配置之外， 还具有方向性， 也可以发挥作为牙的机能。 因此， 能广泛用 作牙的代替物。 特别是， 使用来自本身的牙胚的间充质细胞与上皮系细胞时， 可以在避免排 斥反应导致的问题的情况下进行使用。另外， 使用来自通常适合移植抗原的他人的牙胚的 细胞时， 也能避免因排斥反应导致的问题。
另外， 通过本发明的制造方法制造的牙可以为具有牙特有的细胞配置的牙的集合 体。
由于上述牙的集合体由具有牙特有的细胞配置的多颗牙构成， 所以可以从聚合体 中分离各个牙， 按照以下所述的方式用作一个牙的移植片。 结果， 可以有效制作作为移植片 的牙。
为了得到由多颗牙构成的牙的集合体， 并为了容易再诱导用于产生多颗牙的牙 胚， 优选第 1 与第 2 细胞集合体均由单一细胞构成。
需要说明的是， 与上述相同， 培养工序可以为器官培养， 也可以为在肾脏皮膜下的 培养， 但将所得的牙用作移植片时， 优选为不与其他动物细胞接触、 并且全部过程在体外调 制的器官培养。
进而， 本发明的制造方法中， 可以将培养期间继续到形成牙周组织为止。由此， 除 牙本身之外， 将牙支持在颚骨上， 也可以形成固定化的牙槽骨和牙根膜等牙周组织。 结果可 提供一种移植后能实用的牙。
需要说明的是， 为了制造牙周组织， 可以在上述培养工序后设置分离由上述培养 得到的牙周组织的工序， 仅得到牙周组织。分离牙周组织只要可以分离在培养工序的过程 中所形成的牙周组织与牙即可， 可以用任意的方法进行， 可以举出用镊子等进行分离或用 酶进行部分消化等。根据本发明得到的牙与牙周组织除可以用作移植片之外， 还可以优选用于研究阐 明牙的发生过程， 也可以用作今后的对于产生与牙相关的组织有效的研究工具。
需要说明的是， 将所得的牙或牙周组织用作移植片时， 优选制造方法的培养工序 为不与其他动物细胞接触并且全部过程可以在体外调制的器官培养。
另外， 本发明包括牙的移植方法。该移植方法中， 包括得到上述牙的集合体的工 序； 由牙的复合体分离各个牙的工序 ； 调整分离的牙进行移植， 使其具有与在移植部位的 其他牙相同的方向性。
由此， 可以同时得到具备特有的细胞配置与方向性的多颗牙， 有效实施牙的移植。
本发明的牙可以适用于治疗或处置伴有牙欠缺与损伤的各种症状、 例如龋齿、 边 缘性牙周炎 ( 牙槽脓肿 )、 牙周病导致的牙欠缺、 事故等导致的折损或脱落等。
即， 本发明的治疗方法包括将由本发明的制造方法得到的牙及 / 或牙周组织移植 到欠缺及 / 或损伤部位的步骤。由此， 可以治疗及 / 或缓和欠缺及 / 或损伤部位的上述症 状。
本发明的其他治疗方法包括在欠缺及 / 或损伤部位仅实施本发明的培养工序或 配置工序与培养工序。此时， 作为支持载体， 除上述载体之外， 还可以将欠缺及 / 或损伤部 位的周围组织本身作为支持载体。 由此， 利用来自生物体内的周边组织的细胞因子等， 可以 更迅速地治疗欠缺及 / 或损伤部位等。
实施例
以下， 说明本发明的实施例， 但并不限定于此。 另外， 只要没有特别说明， 实施例中 的％均为重量 ( 质量 ) 基准。
[ 实施例 1]
1.EC 细胞的培养方法
EC 细胞使用 AT805 细胞 ( 作为 129 系 EC 细胞的 OTT6050 的派生克隆， 由理化学 研究所生物资源中心细胞材料开发室得到 )。AT805 细胞的培养使用添加了 10 容量％牛 胎血清 (FCS ： JRH 或 JBS、 Hyclone 公司制 ) 以及 55μM 2- 巯基乙醇 (GIBCO 公司制 ) 的 Dulbcco’ s Modifed EagleMedium(DMEM ： SIGMA 公司或 Kohjin-Bio 公司制 ) 来进行。通常 5 以每 100mm 皿为 5 ～ 8×10 个浓度来接种 EC 细胞， 隔一天交换全部量的培养基进行反复 继代培养。继代培养中， 将细胞用 HCMF 缓冲液 (pH7.4、 10mMHepes、 136.9mM NaCl、 0.34mM Na2HPO3、 13.9mM 葡萄糖、 5.37mM 23KCl) 洗涤 1 次后， 添加 5ml 最终浓度为 0.025％的溶解 有胰蛋白酶 -EDTA·2Na(GIBCO 公司制 ) 的酶溶液， 在 37℃下进行 1 分钟酶处理。然后， 加 入等量的添加有 10％ FCS 的 DMEM， 使细胞分散后， 通过离心分离， 回收沉淀， 将沉淀回收得 到的细胞再次混悬， 接种在新的培养皿中， 进行继代培养。
2.EC 细胞的分化诱导与细胞的回收
将用胰蛋白酶处理回收后的 EC 细胞用最终浓度为 0.5 ～ 5 容量％的添加有二甲 基亚砜 (DMSO ： SIGMA 公司制 ) 的添加 10 容量％ FCS 的 DMEM 混悬， 以 1.0×106 个 /100mm 皿 的浓度进行接种。在 CO2 浓度为 5％的条件下， 于 37℃下培养， 14 小时后， 用 HCMF 缓冲液将 细胞洗涤 1 次， 将培养液换成添加有 10 容量％ FCS 的 DMEM。
对于用 DMSO 处理后的 EC 细胞， 每 3 天将培养液的一半量换成添加 10 容量％ FCS 的 DMEM， 继续培养 6 天 ( 仅 5 容量％ DMSO， 为 19 天 )， 进行适当观察。在含有未分化细胞的细胞集团增殖的时刻， 用 HCMF 缓冲液洗涤 1 次后， 添加 3mM EDTA 以及含有 0.5％ BSA 且 2+ 2+ 不含 Ca 、 Mg 的 PBS(-)(EDTA/BSA-PBS)， 将细胞分散， 通过离心操作以沉淀的形式回收细 胞。将细胞再次混悬在 EDTA/BSA-PBS 中， 通过 FITC 标记的抗 CD44 抗体 (CD44-FITC ： BD Pharmingen 公司制 ) 与 PE 标记的抗 CD29 抗体 (CD29-PE ： BD Pharmingen 公司制 ) 进行双 重染色， 使用细胞分选仪、 EpicsALTRA(Beckman Coulter 公司制 ) 分离获得 CD44 阳性且 CD29 阳性的细胞成分， 由此得到除去了未分化 EC 细胞的用 DMSO 处理进行了分化诱导的 EC 细胞成分 ( 参见图 2)。将该细胞命名为 DMSO-EC 细胞。
另外， 关于以各 DMSO 浓度处理时的 DMSO-EC 细胞的比例， 示于表 1。如表 1 所示， 明确了 CD44 阳性且 CD29 阳性的细胞依赖于 DMSO 处理浓度而增加。需要说明的是， 用5容 量％ DMSO 处理得到的 EC 细胞由于大部分细胞在刚处理后就死亡， 所以处理后的培养天数 必须比其他处理浓度长， 另一方面， 培养后所得的 CD44 阳性且 CD29 阳性的细胞比例较高。
在以下的实验中， 使用由使用 5 容量％的 DMSO 而得到的细胞。
[ 表 1]
DMSO 浓度 (v/v％ ) 0 0.5 1.0 2.5 5.0
培养天数 (天)细胞数 (×107 个 )CD44 阳性且 CD29 阳 性细胞 (％ )6 6 6 191.15 1.19 1.64 2.830.3 0.5 13.7 93.0DMSO-EC 细胞的克隆化
DMSO-EC 细胞的克隆化通过利用克隆环的菌落的分离、 或者极限稀释法来进行。
利用克隆环获得细胞时， 以低浓度 ( 约 100 个 ) 在培养皿中接种 DMSO-EC 细胞并 通过增殖而能够得到的菌落的细胞数为 10 个以上， 此时将灭菌后的硅脂涂布在克隆环的 一端， 以包围细胞的菌落的方式粘附在除去培养基的皿底面。 然后， 在克隆环内进行胰蛋白 酶处理， 回收细胞， 由增殖的细胞依次进行放大培养， 获得克隆。
用极限稀释法得到克隆如下进行 ： 将通过上述方法得到的 DMSO-EC 细胞用 HCMF 缓 冲液洗涤 1 次后， 通过胰蛋白酶处理回收细胞。计测回收得到的细胞数， 接种在 96 孔培养 板中， 使其达到 1 细胞 /200μl/ 孔 ( 说明 )。3 ～ 5 天后确认单一菌落。然后， 每 5 天， 边 交换一半量的培养基边继续培养， 从增殖的细胞依次进行放大培养， 获得克隆。
由 此， 得 到 来 自 DMSO-EC 细 胞 的 克 隆 1(DMSO-EC 克 隆 1 ： Clone#1) 与 克 隆 2(DMSO-EC 克隆 2 ： Clone#2)。
[ 实施例 2]
DMSO-EC 细胞的性状(1) 相位差显微镜像
用相位差显微镜分别观察上述得到的克隆 1 与 2 的形态与 EC 细胞、 DMSO-EC 细胞、 以及作为来自 EC 细胞的软骨系前体细胞的 ATDC5 细胞 ( 从理化学研究所生物资源中心细 胞材料开发室得到 ) 的形态。
结果， 观察到 EC 细胞中， 菌落内的细胞小， 以高密度增殖， 此外， 菌落周边突起， 是 典型的全能性干细胞样的形态。与此相对， DMSO-EC 或 DMSO-EC 克隆 1 与 2、 ATDC5 细胞中， 构成菌落的每个细胞面积较大， 形成作为粘附性细胞的特征即单一层， 显示与特征 EC 细胞 的形态明显不同的形态。相较于 EC 细胞， 上述粘附性的细胞形态类似于间充质细胞。
(2) 各种基因表达
通过实时 (Real time)PCR(RT-PCR) 解析 EC 细胞、 DMSO-EC、 DMSO-EC 克隆 1 与 2、 ATDC5 细胞中的各种基因表达， 研究各种标识基因的表达。
使用 TRIzol Reagent(Invitrogen 公司制 ) 从 EC 细胞以及 DMSO-EC、 DMSO-EC 克 隆 1 与 2、 ATDC5 细胞中提取全 RNA。除去解析的细胞培养液， 在 100mm 培养皿中直接滴入 2ml TRIzol Reagent， 用 Cell Scraper(Falcon 公司制 ) 充分混合后， 回收到离心管中， 用 Polytron Homogenizer(Polytron 公司制 ) 进行匀浆。然后至提取 RNA 为止的操作根据后 附的使用说明书来进行。将从细胞· 组织中提取的全 RNA 溶解于 DEPC 处理水中， 用分光光 度计进行浓度计算后， 保存在 -30℃。 为了进行实时 PCR(RT-PCR) 解析， 以从细胞提取的全 RNA 为模板， 合成形成模板的 cDNA。cDNA 合成使用 ReverTra Ace(TOYOBO) 来进行， 根据后附的使用说明书进行操作。
PCR 与解析使用 ABI PRISM 7000(Applied Biosystems 公司制 ) 来进行。聚合酶 使用 SYBR Premix Ex Taq(TAKARA 公司制 )， 内部对照使用 β- 肌动蛋白。在 RT-PCR 专用 96 孔板中以每个试样分别添加 13μl SYBR Premix ExTaq(TAKARA 公司制 )、 2μl 稀释 20 倍 得到的 cDNA 反应溶液、 5μl 浓度为 1μM 的引物， 添加 5μl 灭菌水， 调制最终容量为 25μl 的反应体系， 根据常规方法进行 PCR 反应。另外， 对各个基因进行对照反应， 制作标准曲线， 分别进行定量化。将用于解析的引物序列示于表 2 与表 3。
基因表达通过各个细胞中的 β- 肌动蛋白的表达量进行标准化， 与 β- 肌动蛋白 表达量为一定时的相对表达量进行比较。结果示于表 4。
[ 表 2]
16101842477 A CN 101842478说明书( 序列号 ： 1) ( 序列号 ： 2) ( 序列号 ： 3) ( 序列号 ： 4) ( 序列号 ： 5) ( 序列号 ： 6) ( 序列号 ： 7) ( 序列号 ： 8) ( 序列号 ： 9) ( 序列号 ： 10) ( 序列号 ： 11) ( 序列号 ： 12) ( 序列号 ： 13) ( 序列号 ： 14) ( 序列号 ： 15) ( 序列号 ： 16) ( 序列号 ： 17) ( 序列号 ： 18)15/21 页Oct3/4-F Oct3/4-R nanog-F nanog-R Slug-F Slug-R Pax3-F Pax3-R Wnt1-F Wnt1-R Sox9-F Sox9-R Sox5-F Sox5-R Msx1-F Msx1-R Pax9-F Pax9-R
ATTGAGAACCGTGTGAGGTGGA GCGCCGGTTACAGAACCATAC CAAGGGTCTGCTACTGAGATGCT ATCAGGGCTGCCTTGAAGAG GACCCTGGCTGCTTCAAGGA TATTGCAGTGAGGGCAAGAG CAAGCTGGAGCCAATCAACTG GCGGTGGGAGGGAATCC CCTACGCTTCCTCATGAACCTT TGGCGCATCTCAGAGAACAC GAGGCCACGGAACAGACTC CAGCGCCTTGAAGATAGCATT GCGTTGGACGGGAAGGT TCCTTTTCTGTCCGGCAGTT CAGCCCTATAGAAAGCAAGGA CCCCTCAGAGCAATGCTTTG GGCCAGGCACCGAATG GCCATGCTGGATGCTGAGA[ 表 3] Wnt5a-F Wnt5a-R Lhx8-F Lhx8-R BMP4-F BMP4-R Runx2-F Runx2-R Dlx1-F Dlx1-R FGF10-F FGF10-R BMP7-F BMP7-R βActin-F βActin-R CGCCATGAAGAAGCCCATT TCCAGCGGTCCCCAAAG AAGTGGAGAACGGTAATGGGATTAG GCTTTGGATGATTGACGTCTTG TCAAGACACCATGATTCCTGGTAA GCTCGCGCCTCCTAGCA ACGGCCCTCCCTGAACTC GGGATCTGTAATCTGACTCTGTCCTT AGCCGAGCCCGAGCTT CAGCCGGTCCTTCCTAGAAGTT TCCCTCTGGGTACGGATCTG TGGTCGGCTCTCTTGCATAA CGCTCCAAGACGCCAAAG GCTGCTGTTTTCTGCCACACT TGACAGGATGCAGAAGGAGA GCTGGAAGGTGGACAGTGAG ( 序列号 ： 19) ( 序列号 ： 20) ( 序列号 ： 21) ( 序列号 ： 22) ( 序列号 ： 23) ( 序列号 ： 24) ( 序列号 ： 25) ( 序列号 ： 26) ( 序列号 ： 27) ( 序列号 ： 28) ( 序列号 ： 29) ( 序列号 ： 30) ( 序列号 ： 31) ( 序列号 ： 32) ( 序列号 ： 33) ( 序列号 ： 34)
[ 表 4]如表 4 所示， 仅在 EC 细胞中检测出作为未分化干细胞标识基因的 Oct3/4 与 Nanog 的表达， 在用 DMSO 处理而得到的 EC 细胞或其克隆细胞、 ATDC5 细胞中未确认到。在 EC 细 胞中未确认作为神经嵴细胞标识基因的 Slug、 Pax3、 Wnt1 的表达， 而在 EC 细胞以外的所有 细胞组中确认到 Slug， 虽然有表达量的差异， 但在 EC 细胞与 ATDC5 细胞以外的 DMSO-EC 细 胞组中确认到 Pax3 与 Wnt1。
由此提示了 DMSO-EC 细胞与其克隆化细胞是因为添加了 DMSO 而由未分化干细胞 分化诱导为神经嵴细胞的细胞， 由基因表达的特性可知， 是 Oct3/4 阴性、 Nanog 阴性、 Slug 阳性、 Pax3 阳性、 Wnt1 阳性的细胞。
另一方面， 在牙间叶细胞的标识组中， 除在 EC 细胞中表达 Msx1 与 BMP-7 之外， 其他任意基因均未表达， 而在 DMSO-EC 细胞、 以及其克隆化细胞中， 特异性地高度表达了 Msx1、 Pax9、 Wnt5a、 Lhx8。虽然表达量有少许差异， 但在 DMSO-EC 细胞以及其克隆化细胞和 ATDC5 细胞中确认到 BMP4、 Runx2、 Dlx1 的表达。
另外， 判断如下 ： 作为软骨细胞的特异性标识基因即 Sox9、 Sox5 的表达仅在 ATDC5 细胞中高度表达， DMSO-EC 细胞和其克隆化细胞为不分化为软骨系的细胞。
因此， 明确了通过 DMSO， EC 细胞向神经嵴细胞样或间充质细胞样的细胞分化诱 导。
[ 实施例 3]
评价由 EC 细胞分化诱导的细胞的牙形成性能
然后， 按照以下所述的方式， 确认由本发明得到的 DMSO-EC 细胞、 其克隆化细胞具 有向牙本质细胞分化的性能、 以及牙的象牙质形成性能。
(1) 牙胚上皮组织的调制
在显微镜下通过常规方法从 C57BL/6 小鼠 ( 由 SLC 购得 ) 的胎龄 14.5 天的胚仔 中摘出下颚切牙牙胚组织。 用 PBS(-) 洗涤摘出的下颚切牙牙胚组织， 在室温下用在 PBS(-)
中添加最终浓度为 1.2U/ml 的分散酶 II(Roche， Mannheim， Germany) 而得到的酶液， 处理 12.5 分钟后， 用添加有 10％ FCS(JRH Biosciences， Lenexa， KS) 的 DMEM(Sigma， St.Louis， MO) 洗涤 3 次。进而， 添加 DNaseI 溶液 (Takara， Siga， Japan) 使其达到最终浓度为 70U/ ml， 使牙胚组织分散， 使用 25G 注射针 (Terumo， Tokyo， Japan)， 外科上分离牙胚上皮组织。
(2) 再构成牙胚的制作
再构成牙胚的制作中使用上述调制得到的牙胚上皮组织， 以及作为间充质细胞的 EC 细胞、 DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 和 2 中的任一个评价对象细胞。
分别通过胰蛋白酶处理从皿中回收用于牙胚再构筑的评价对象细胞组。在涂布 有硅脂的 1.5ml 微管 (Eppendorf， Hamburg， Germany) 中加入用添加有 10 ％ FcS(JRH) 的 DMEM(Sigma) 混悬而得到的评价对象细胞， 利用离心分离 (580×g) 将细胞以沉淀的形式回 收。 尽可能除去离心后的培养液的上清液， 再次进行离心操作， 边用实体显微镜观察边使用 GELoaderTip0.5-20μL(Eppendorf 公司制 ) 完全除去残留在细胞沉淀周围的培养液， 准备 用于制作再构成牙胚的各个评价对象细胞。
在涂布有硅脂的皮氏培养皿中滴入 30μl 2.4mg/ml 的 Cellmatrix typeI-A( 新 田明胶公司制 )， 制作胶原凝胶微滴。使用 0.1-10μl 的吸头 (Eppendorf 公司制 )， 向该溶 液中供给 0.2μl ～ 10.3μl 上述评价对象细胞， 制成细胞凝集体作为高密度的细胞集合体 8 ( 细胞密度 ： 2×10 个 /ml)。然后， 使用 10μl 吸头， 将牙胚上皮组织或牙胚间叶组织供给 到相同的凝胶液滴内， 使用钨针， 使来自分离到的牙胚的上皮组织原本与间叶组织接触的 面密接于评价对象细胞的细胞凝集体。 然后， 通过使凝胶液滴固化， 使牙胚组织与评价对象 细胞间的结合更牢固， 从而制作高密度的再构成牙胚。
参见图 3 说明这点。
利用吸头 16 预先配置于凝胶液滴 10( 参见图 3A) 内的细胞凝集体 12 在凝胶液滴 10 内构成球体 ( 参见图 3B)。然后通过挤入另一种细胞凝集体 14， 从而球体的细胞凝集体 12 被破坏， 包裹另一种细胞凝集体 14 的情况较多 ( 参见图 3C)。 然后， 将凝胶液滴 10 固化， 由此细胞间的结合变牢固 ( 参见图 3D)。
(3) 再构成的牙胚的器官培养
将在凝胶中制作的高密度再构成牙胚在 CO2 培养箱中静置 10 分钟， 将 Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin) 固化。准备培养容器， 使 Cell CultureInsert( 孔径尺寸为 0.4 微米的 PET 膜 ； BD 公司制 ) 接触添加有 10 容量％ FCS(JRH 公司制 )、 0.1mg/ml 的 L- 抗坏血 酸 (Sigma 公司制 )、 2mM 的 L- 谷氨酰胺 (GIBCO 公司制 ) 的 DMEM(Sigma 公司制 )。将再构 成牙胚与作为支持载体的周围凝胶一起转移到培养容器的 Cell Culture Insert 的膜上， 进行器官培养。
对利用器官培养而产生牙的现象进行解析时， 通常进行 14 天间的培养。器官培养 时， 在移植后第 10 ～ 30 天摘出再构成牙胚， 用 4％仲甲醛 - 磷酸缓冲液固定 6 小时后， 使用 4.5％ EDTA 溶液 (pH7.4) 进行 24 小时的中性脱灰。然后， 通过常规方法进行石蜡包埋， 制 作 10μm 的切片。为了进行组织学解析， 根据常规方法进行苏木素 - 伊红染色染色 (HE 染 色 )。
用器官培养进行评价
在 14.5 日龄、 下颚切牙牙胚上皮组织与 EC 细胞的高密度再构成牙胚中， 因 EC 细胞的异常增殖而再构成牙胚肥大化， 在 HE 染色中也未观察到来自牙间叶细胞的牙本质细 胞和象牙质。
与此相对， 在 DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 中， 与上皮组织的相互作用被诱 导， 并且在相位差显微镜像中也观察到与牙胚的器官培养同样地组织诱导。进而， DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 均可以由 HE 染色像确认可以形成外侧具有牙釉质、 内侧具有象 牙质的再构成牙胚的 HE 染色像， 能形成牙特有的组织结构。
由上述内容可知， DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 通过与牙胚上皮细胞的相互 作用， 分化为作为牙的间叶组织的牙本质细胞， 可以产生牙特有的象牙质。另外， 通过高密 度再构成牙胚法， 在器官培养中， 也可以形成外侧为牙釉质、 内侧为象牙质、 内部为牙髓细 胞、 具有牙前端与牙根的牙所特有的组织结构的牙。
[ 实施例 4]
肾皮膜下移植方法
下面， 由 DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 和 2 的细胞与 14.5 日龄胎儿下颚切牙牙 胚上皮细胞制作高密度再构成牙胚， 将所得的再构成牙胚移植到 C57BL6 小鼠 ( 从日本 Clea 公司购得 ) 肾皮膜下， 评价牙形成性能。
将与实施例 3 相同地制作的再构成牙胚进行器官培养 48 小时至 96 小时后， 将周 围的每份凝胶移植到 8 周龄 NOD-SCID 小鼠 ( 从 Charles River 公司购得 ) 的肾皮膜下， 使 其进行不同场所的牙的产生， 并进行解析。
移植到肾皮膜下时， 在移植后第 10 ～ 30 天， 对于周围的每个肾组织， 摘出再构 成牙胚。将摘出组织在 4 ％仲甲醛 - 磷酸缓冲液中固定 6 小时后， 使用 4.5 ％ EDTA 溶液 (pH7.4)， 进行 24 小时的中性脱灰。然后， 根据常规方法进行石蜡包埋， 制作 10μm 的切片。 为了进行组织学解析， 根据常规方法进行 HE 染色。
(1) 用肾皮膜下移植的评价
在肾皮膜下移植中， 移植 14.5 日龄胎儿切牙牙胚时， 在 16 天的期间内因肾皮膜下 移植而产生具有内侧为象牙质与外侧和牙釉质的特征结构的牙 ( 参见图 4)。用来自 14.5 日龄胎儿切牙牙胚的牙胚上皮组织和牙胚间叶细胞 ( 参见图 4A)、 牙胚上皮组织和 DMSO-EC 细胞 ( 参见图 4B)、 牙胚上皮组织和 DMSO-EC 克隆 ( 克隆 #1、 参见图 4C) 的再构成牙胚中， 通过肾皮膜下移植进行移植后第 14 天， 与直接将正常牙胚移植到肾皮膜的情况相同， 容易 确认外侧为釉质芽细胞、 牙釉质， 其内侧为象牙质、 牙本质细胞。所形成的牙具有前端与牙 根， 具有与正常产生的牙相同的结构。
关于形成牙的频率， 在 EC 细胞与 ATDC 细胞中为 0 ％， 而在 DMSO-EC 细胞中为 51.3±8.8％， 在 DMSO-EC 克隆 1 中为 23.3％ ±16.7％， 在克隆 2 中为 33.3％ ±47.1％。
由上述内容可知， DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 中， 能分化为作为来自牙间叶 的组织的牙本质细胞， 并能产生作为牙的硬组织的象牙质。 进而可知， 通过高密度再构成牙 胚法， 即使在肾皮膜下移植中， 也可以通过 DMSO-EC 细胞、 DMSO-EC 克隆 1 与 2 形成具有特 有的组织结构的牙。
(2) 原位杂交
将来自 14.5 日龄胎儿切牙牙胚的牙胚上皮组织与 DMSO-EC 细胞移植到皮膜下， 对 14 天后摘出的组织， 通过原位杂交解析作为牙釉质的构成分子的牙釉质蛋白、 作为象牙质的构成要素的牙本质涎磷蛋白 (DSPP) 的 mRNA 表达、 以及作为牙根膜特异性基因的 Periostin mRNA 表达。
摘出肾皮膜下移植后第 14 天的再构成牙胚， 用 4％仲甲醛 - 磷酸缓冲液固定 6 小 时后， 使用 4.5％ EDTA 溶液 (pH7.4)， 进行 24 小时的中性脱灰。然后， 依次浸渍 12.5％蔗糖 溶液、 25％蔗糖溶液后， 包埋在 OCT compound(SAKURA Finetechnica 公司制 ) 中。包埋后 在低温恒温器 (Leica 公司制 ) 中制作 10μm 的切片。
将 上 述 切 片 用 含 有 最 终 浓 度 为 2μg/ml 的 蛋 白 酶 K(Nacalaitesque， kyoto， Japan) 的 PBS(-) 处理 10 分钟， 用含有最终浓度为 4 ％的仲甲醛 (Nacalai tesque) 的 PBS(-) 固定 10 分钟。分别用含有最终浓度为 1.325 ％三乙醇胺、 0.0175N 的 HCl(Wako)、 0.25％乙酸酐的丙酸二乙酯处理 (DEPC) 水处理 10 分钟后， 用 PBS(-) 在 5 分钟内洗涤 3 次。 用含有 1.5％ (v/v) 三乙醇胺 (Nacalai tesque)、 0.33N 的 HCl(Wako)、 0.25％ (v/v) 的乙酸 酐 (Nacalai tesque) 的 DEPC 水溶液处理 10 分钟后， 用 2×SSC 在 10 分钟内洗涤 2 次。作 为牙根膜特异性基因的 Periostin(Genbank accession no.NM_015784) 探针， 将使用正义 引物 (-7 ； ggctgaagatggttcctctc ： 序列号 35) 与反义引物 (573 ； gtacattgaaggaataacca ： 序列号 36) 并通过 PCR 而获得的 cDNA 片段作为 DIG 标识。
根据常规方法进行原位杂交， 用抗 DIG- 碱性磷酸酯酶 (AP)Fab 片段 (Roche) 和 NBT/BCIPStock Solution(Roche) 使 其 显 色， 用 Axio ImagerA.1(Zeiss) 与 AxioCam MRc5(Zeiss) 进行解析。
由该结果可知， 在 HE 染色像的釉质芽细胞中， 确认到牙釉质蛋白 mRNA 的表达， 在 牙本质细胞中确认到 DSPPmRNA 的表达。另外， 确认到 Periostin mRNA 的表达。由此可知， 与形成硬组织相关的分子的 mRNA 分别适当地在其产生细胞中明显表达。另外， 由于检测到 在牙根膜中表达的 Periostin， 提示形成有牙周组织。
[ 实施例 5]
用视黄酸进行诱导
(1) 用于获得 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞的 EC 细胞分化诱导方法
与实施例 1 相同地操作， 以 1.0×106 个 /100mm 皿的浓度接种用胰蛋白酶处理回收 得到的 AT805 细胞， 第二天， 置换成添加有终浓度为 0 ～ 10.0μM 的视黄酸 (RA)(SIGMA 公 司制 ) 的 10 容量％ FCS DMEM， 施加刺激。培养 72 小时后， 用 HCMF 缓冲液洗涤 2 次， 用全部 量的 10 容量％ FCS DMEM 进行培养基交换。
(2) 获得 RA 处理后的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞
每 3 天使用 10 容量％ FCSD MEM 进行一半量的培养基交换， 同时继续培养 7 天， 进行适当观察。将 RA 处理后增殖的含有未分化细胞的细胞集团用 HCMF 洗涤 1 次后， 添 加 3mM 的 EDTA-0.5 ％ BSA-PBS(-)， 在 37 ℃下进行培育， 回收。回收后的细胞通过 CD44 FITC(BD Pharmingen) 与 CD29(BDPharmingen)PE 进行双重染色， 使用 Epics ALTRA(Beckman Coulter) 分离获得 CD44 阳性且 CD29 阳性的细胞， 由此仅得到除去了未分化细胞的细胞集 团。将该细胞命名为 RA-EC 细胞。结果示于图 5。
另外， 用各 RA 浓度处理时的 RA-EC 细胞的比例示于表 5。由表 5 明确， CD44 阳性 且 CD29 阳性细胞依赖于 RA 浓度而发生变化。
另外， 对于 RA 处理后的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞， 与实施例 2(2) 相同地确认基因表达时， 判定与 DMSO-EC 细胞相同， 为 Oct3/4 阴性、 Nanog 阴性、 Slug 阳性、 Pax3 阳性、 Wnt1 阳性的细胞。
[ 表 5]
RA 浓度 (μM) 0 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0
培养天数 (天)细胞数 (×106 个 )CD44 阳性且 CD29 阳性细胞 (％ )7 7 7 7 71.5 1.1 1.3 0.5 0.710.8 10.0 11.3 11.5 10.4(3)RA 处理后的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞的牙形成性能评价
使用如上所述得到的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞 (RA 浓度 2μM)， 与实施例 3 相同 地操作， 进行牙胚再构筑及器官培养， 并进行评价。在器官培养 14 天后， 通过与牙胚上皮细 胞的相互作用， 分化为作为牙间叶组织的牙本质细胞。另外， 通过高密度再构成牙胚法， 形 成具有外侧为牙釉质、 内侧为象牙质、 内部为牙髓细胞的牙所特有的组织结构的牙 ( 参见 图 6)。
并且对 RA 处理后的 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞， 与实施例 4(2) 相同地操作， 确认 牙釉质蛋白与 DSPP、 Periostin 表达时， 确认与 DMSO-EC 相同地表达各 mRNA。这提示了形 成含有硬组织、 牙根膜的牙周组织。
[ 实施例 6]
(1) 用于获得 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的 EC 细胞分化诱导方法
与实施例 1 相同地操作， 以 1.0×106 个 /100mm 皿的浓度接种通过胰蛋白酶处理回 收得到的 AT805 细胞， 第二天置换成终浓度为 2μM 的 RA(SIGMA 公司制 ) 的 10 容量％ FCS DMEM， 施加刺激。培养 72 小时后， 用 HCMF 缓冲液洗涤 2 次， 用全部量的 10 容量％ FCS DMEM 进行培养基交换。第二天， 用 HCMF 缓冲液洗涤 2 次， 除去死细胞后， 进而用 10 容量％ FCS DMEM 继续培养。以后每隔 1 天进行培养基交换， 培养 7 天。
(2) 获得 CD44 阳性且 CD106 阳性的细胞
用 HCMF 将含有通过上述处理获得的未分化细胞的细胞集团洗涤 1 次后， 添加 3mM EDTA-0.5 ％ BSA-PBS(-)， 在 37 ℃培育， 回收。将回收后的细胞通过 CD44 FITC(BD Pharmingen) 与 抗 CD106 抗 体 (CD106(BDPharmingen)PE) 进 行 双 重 染 色， 使 用 Epics ALTRA(Beckman Coulter) 分离获得 CD44 阳性且 CD106 阳性成分， 由此仅得到除去了未分化 细胞的细胞集团。结果示于图 7。
(3)RA 处理后的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的牙形成性能评价使用如上所述得到的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞， 与实施例 3 相同地操作， 进行 牙胚再构筑与器官培养， 并进行评价。器官培养 14 天后， 通过与牙胚上皮细胞的相互作用， 分化为作为牙的间叶组织的牙本质细胞。 另外， 通过高密度再构成牙胚法， 形成具有外侧为 牙釉质、 内侧为象牙质、 内部为牙髓细胞的牙特有的组织结构的牙。
另外， 对于上述 CD44 阳性且 CD106 阳性的 DMSO-EC 细胞， 与实施例 2(2) 相同地确 认基因表达。 结果， 显示与 CD44 阳性且 CD29 阳性 DMSO-EC 细胞相同， 为 Oct3/4 阴性、 Nanog 阴性、 Slug 阳性、 Pax3 阳性、 Wnt1 阳性的细胞。
进而， 与实施例 4(2) 相同地操作， 确认牙釉质蛋白与 DSPP、 Periostin 表达时， 确 认与 DMSO-EC 相同地表达各 mRNA。这提示了形成含有硬组织、 牙根膜的牙周组织。
[ 实施例 7]
与实施例 6(2) 和 (3) 相同地操作， 使用 CD44 FITC 与 CD106 PE 对 DMSO-EC 细胞进 行双重染色， 显示存在 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞。对于上述 CD44 阳性且 CD106 阳性的 DMSO-EC 细胞， 与实施例 2 相同地确认基因表达时， 判定与 CD44 阳性且 CD29 阳性 DMSO-EC 细胞相同， 为 Oct3/4 阴性、 Nanog 阴性、 Slug 阳性、 Pax3 阳性、 Wnt1 阳性的细胞。
使用此处所得的 CD44 阳性且 CD106 阳性细胞的细胞集团， 与实施例 3 和实施例 4(2) 相同地进行牙胚再构筑、 器官培养与 mRNA 表达， 并进行评价。结果通过与牙胚上皮细 胞的相互作用形成具有特有的组织结构的牙。另外， 与实施例 4(2) 相同地操作， 确认牙釉 质蛋白与 DSPP、 Periostin 表达。这提示了能形成含有硬组织、 牙根膜的牙周组织。
如上所述， 可以由全能性干细胞分化诱导 CD44 阳性且 CD29 阳性细胞或 CD44 阳性 且 CD106 阳性细胞， 通过将上述细胞与上皮系细胞一起间隔化进行培养， 由此再构成牙胚， 从而可以提供具有牙釉质与象牙质的特有结构的牙。
因此， 根据本发明， 可以由全能性干细胞得到牙形成用间充质细胞， 并可以有效大 量地制作牙。
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