抗RAMP3抗体 【发明领域】
本发明涉及与降钙素受体样受体相关的受体活性修饰蛋白(RAMP)结合的抗体及其片段。
【发明背景】
降钙素肽家族通过G蛋白偶联膜受体(GPCR)起作用。已经克隆了降钙素受体基因。它与典型识别调解肽(分泌素、胰高血糖素、VIP)的家族“B”中的GPCR同源。降钙素受体的同源物降钙素受体样受体(CRLR，也称作CL)已经被确定(人461aa；大鼠/小鼠463aa)，与降钙素受体具有55％同源性(Njuki等，Clin.Sci.85，385-388(1993)；Chang等，Neuron 11，1187-1195(1993)；Fluhmann等，Biochem.Biophys.Res.Comun.206，341-347(1995)；Kapas等，J.Biol.Chem.270，25344-25347(1995))。
CRLR单独不能转导对肾上腺髓质素(AM)应答的信号，因为需要RAMP(降钙素受体活性修饰蛋白)的存在来诱导CRLR的配体特异性，结合和活化。RAMP是预测大小为14,000-17,0000Kd的小内在膜蛋白家族。RAMP由约120个氨基酸组成，具有约100个氨基酸的大的胞外结构域；单个跨膜结构域以及约10个氨基酸的短的胞内区。
已表明CRLR能够作为CGRP受体或AM受体起作用，这取决于RAMP家族成员RAMP 1-3的表达。RAMP家族的三个成员RAMP1、2和3引起CRLR的不同配体特异性，因此：
RAMP1+CRLR＝CGRP受体
RAMP2+CRLR＝AM受体
RAMP3+CRLR＝AM受体。
RAMP 1、2和3的序列可如下获得：
RAMP 1-GenBank登录号NM_005855；
RAMP 2-GenBank登录号NM_005854；UniGene ID Hs.155106
RAMP 3-GenBank登录号NM_005856；UniGene ID Hs.25691。
WO2004/050834中公开了与RAMP2结合并可用于治疗癌症的多克隆抗体。所述抗体对RAMP2胞外结构域的区域而产生，该RAMP2胞外结构域认为是CRLR结合RAMP2的关键。
由于此类抗RAMP抗体能够在治疗和诊断中具有高度潜在的应用，因此需要另外的抗RAMP抗体。
本发明的发明人分离并鉴定了另外的抗RAMP抗体。特别是，已经证明这些抗体抑制癌细胞增殖，并可用于预防癌症。
【发明内容】
根据本发明的第一方面，本发明提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR受体的受体活性修饰蛋白(RAMP)，该抗体为IgG、IgA或IgM同种型。
在一个实施方案中，本发明的第一方面的抗体是IgG同种型。所述抗体可以是亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。优选地，所述抗体是IgG1同种型。
在另一个实施方案中，本发明的第一方面的抗体是IgA同种型。所述抗体可以是亚类IgA1或IgA2。
在另一个实施方案中，本发明的第一方面的抗体是IgM同种型。
本发明的第一方面的抗体可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体或五聚体多肽。
所述抗体可以能够结合RAMP1、RAMP2或RAMP3。优选地，本发明的抗体能够结合RAMP3。
本发明的抗体可以是RAMP拮抗剂或激动剂或所述受体的天然或人工配体活性的增强剂。
本发明的抗体可以作为RAMP拮抗剂起作用。本文公开的数据可表明所述抗体可以一方面抑制RAMP和CRLR之间的相互作用或者抑制RAMP/CRLR相关复合物和配体例如肾上腺髓质素之间的相互作用。在一个实施方案中，所述抗体是IgM同种型抗RAMP3抗体且是RAMP拮抗剂。在另一个实施方案中，所述抗体是IgG1同种型抗RAMP3抗体且是RAMP拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的抗体作为RAMP激动剂起作用。本文公开的数据可表明所述抗体可以在一个实施方案中所述抗体是IgG1同种型抗RAMP3抗体且是AM作用的RAMP激动剂或RAMP增强剂。
本发明的第二方面提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR受体的受体活性修饰蛋白(RAMP)，该抗体包含选自以下的结合结构域：
i)包含由图1a中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
ii)包含由图1b中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
iii)包含由图1c中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
iv)包含由图1d中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
v)包含与以上(i)、(ii)、(iii)或(iv)中定义的核酸分子杂交的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
vi)包含由作为(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中定义的核酸序列的遗传密码的结果简并的核酸编码的氨基酸序列的结合结构域。
第三方面，本发明提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR受体的受体活性修饰蛋白(RAMP)，该抗体包含选自以下的结合结构域：
i)包含由图2a中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
ii)包含由图2b中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
iii)包含由图2c中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
iv)包含由图2d中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；
v)包含与以上(i)、(ii)、(iii)或(iv)中定义的核酸分子杂交的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；和
vi)包含由作为(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中定义的核酸序列的遗传密码的结果简并的核酸编码的氨基酸序列的结合结构域。
在本发明的优选方面，本发明提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR的受体活性修饰蛋白，该抗体包含以下结合结构域中的一个或者两个：
i)包含由图1a中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；和/或
ii)包含由图2a中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域。
在本发明的另一个优选方面，提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR的受体活性修饰蛋白，该抗体包含以下结合结构域中的一个或者两个：
i)包含由图1b中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域；和/或
ii)包含由图2b中所示序列代表的核酸序列组成的核酸分子编码的氨基酸序列的结合结构域。
所述核酸分子可以在严格杂交条件下与图1a至d或2a至d中所示的核酸序列或与其互补链退火。严格杂交/漂洗条件在本领域中熟知。例如，在60℃下在0.1xSSC，0.1％SDS中漂洗后稳定的核酸杂交体。本领域熟知如果核酸序列已知则可以计算最适杂交条件。例如，杂交条件可以通过进行杂交的核酸的GC含量来确定。请参见Sambrook等(1989)Molecular Cloning；ALaboratory Approach。用于计算在具体同源性的核酸分子之间实现杂交所需的严格条件的一般公式是：
T
m＝81.5℃+16.6Log[Na
+]+0.41[％G+C]-0.63(％甲酰胺)。
本发明的另一方面提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR受体的受体活性修饰蛋白(RAMP)，该抗体包含选自以下的结合结构域：
i)包含基本上由图1a中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域；
ii)包含基本上由图1b中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域；
iii)包含基本上由图1c中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域；和
iv)包含基本上由图1d中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域。
另一方面，本发明提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR受体的受体活性修饰蛋白(RAMP)，该抗体包含选自以下的结合结构域：
i)包含基本上由图2a中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域；
ii)包含基本上由图2b中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域；
iii)包含基本上由图2c中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域；和
iv)包含基本上由图2d中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域。
在本发明优选的方面，提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR的受体活性修饰蛋白，该抗体包含以下结合结构域中的一个或者两个：
i)包含基本上由图1a中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域；和/或
ii)包含基本上由图2a中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域。
在本发明优选的方面，提供分离的抗体，所述抗体能够结合CRLR的受体活性修饰蛋白，该抗体包含以下结合结构域中的一个或者两个：
i)包含基本上由图1b中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域；和/或
ii)包含基本上由图2b中所示序列代表的氨基酸序列的结合结构域。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有氨基酸序列的结合结构域，该氨基酸序列基本上如选自图3中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有氨基酸序列的结合结构域，该氨基酸序列基本上如选自图4中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有氨基酸序列的结合结构域，该氨基酸序列基本上如选自图5中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有氨基酸序列的结合结构域，该氨基酸序列基本上如选自图6中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有氨基酸序列的结合结构域，该氨基酸序列基本上如选自图7中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有氨基酸序列的结合结构域，该氨基酸序列基本上如选自图8中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有氨基酸序列的结合结构域，该氨基酸序列基本上如选自图9中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有氨基酸序列的结合结构域，该氨基酸序列基本上如选自图10中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。
本发明包括包含多个具有相同或不同的序列或其组合的结合结构域的抗体。该或各多肽可以被人抗体骨架负载。例如，一个或多个结合区可以取代整个人抗体或其可变区的CDR。
第四方面，本发明提供包含第二方面的抗体和第三方面的抗体的组合或结合。所述抗体可以是Fv、(Fab’)2或scFV抗体片段。
本发明的抗体可以带有可检测的或功能性标记物。
另一方面，本发明提供分离的核酸，所述核酸包含编码本发明第一方面、第二方面、第三方面或第四方面的抗体的序列，以及制备本发明抗体的方法，所述方法包括在引起所述抗体表达的条件下表达所述核酸并回收所述抗体。
根据本发明的抗体可用于人或动物体的治疗、预防或诊断方法中，所述方法例如治疗增殖性障碍例如在患者(优选人)中的肿瘤的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的本发明的抗体。本发明还提供本发明的抗体用于医药以及本发明的抗体在制备用于诊断或治疗增殖性障碍例如肿瘤的药物中的应用。
根据本发明的抗体还可以用于治疗或预防患者(优选人)中的炎症性障碍的方法中，所述方法包括给予所述患者有效量的本发明的抗体。本发明还提供本发明的抗体在制备用于治疗炎症性障碍的药物中的应用。
本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，不论是天然或部分或全部合成产生的。该术语还包括具有结合结构域的任何多肽或蛋白，所述结合结构域是抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源。这些可以来自天然来源，或者它们可以部分或全部合成产生。抗体的实例是含有抗原结合结构域例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的片段以及二体(diabody)。
抗体可以是多克隆或单克隆的。优选地，所述抗体是单克隆抗体，本文可以指“mab”。
可能采用单克隆或其他抗体，并使用重组DNA技术制备保留原抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。这些技术可以包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA引入不同的免疫球蛋白的恒定区或恒定区加骨架区中。参见例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。杂交瘤或其他产生抗体的细胞可以进行基因突变或其他改变，该基因突变或其他改变可以或可以不改变产生的抗体的结合特异性。
因为抗体可以通过多种方式修饰，因此术语“抗体”应理解作包括具有所要求特异性的结合结构域的任何抗体或物质。因此，该术语涵盖抗体片段，抗体衍生物、功能等价物和同源物，人源化抗体，包括任何含有免疫球蛋白结合结构域的多肽，无论是天然或完全或部分合成的。因此，包括含有与其他多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合分子。EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗体的克隆和表达。人源化抗体可以是具有非人例如鼠抗体的可变区以及人抗体的恒定区的修饰抗体。制备人源化抗体的方法在例如美国专利5225539中描述。已表明全抗体的片段可以表现结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CHI结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.等，Nature 341：544-546(1989)；(v)分离的CDR区；(vi)含有两个连接的Fab片段的F(ab′)2二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许该两个结构域结合形成抗原结合位点的肽接头连接(Bird等，Science 242：423-426(1988)；Huston等，PNAS USA 85：5879-5883(1988))；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；以及(ix)通过基因融合构建的“二体”、多价或多特异性片段(W094/13804；P.Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))。
二体是多肽的多聚体，各个多肽包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包含免疫球蛋白轻链的结合区，所述第二结构域包含免疫球蛋白重链的结合区，该两个结合域(例如通过肽接头)连接但是不能彼此结合形成抗原结合位点：抗原结合位点通过多聚体中的一个多肽的第一结合域与多聚体中另一个多肽的第二结合域结合来形成(W094/13804)。
本发明的抗体可以是对于至少两个不同抗原具有特异性的多特异性抗体。尽管此类分子通常与两个抗原结合(即双特异性抗体)，但是在本发明中的术语“多特异性抗体”包括对两个或多个(例如三个)抗原具有特异性的抗体。多特异性抗体可能是全长抗体或所述抗体的片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。在使用双特异性抗体的情况下，这些可以是常规的双特异性抗体，其可以以多种方式((Hollinger&Winter，Current Opinion Biotechnol.4：446-449(1993)))制备，例如化学地制备或者从杂交瘤制备，或者可以是以上提及的双特异性抗体片段中的任何一种。可以优选使用scFv二聚体或二体而不是全抗体。可以仅使用可变结合域而没有Fc区构建二体和scFv，有力地降低抗独特型反应的作用。双特异性抗体的其他形式包括Traunecker等，EMBO Journal 10：3655-3659(1991)中描述的单链″Janusins″。所述双特异性抗体还包括异源偶联(heteroconjugate)抗体，其中一个抗体与抗生物素蛋白偶联，而另一个与生物素偶联等(美国专利4,676,980、WO 91/00360、WO92/200373和EP 03089)4,676,980。可用于制备所述异源偶联抗体的交联剂是众所周知的，例如在美国专利4,676,980中描述。
与双特异性全抗体相对，双特异性二体也可以使用，因为它们可容易地构建并在大肠杆菌(E.coli)中表达。适宜结合特异性的二体(以及许多其他多肽例如抗体片段)可以使用噬菌体展示(W094/13804)从库中容易地选择。如果二体的一个臂保持恒定，例如具有针对抗原X的特异性，则可以制备其中其他臂变化且选择合适特异性的抗体的库。
“抗原结合结构域”或“结合结构域”是抗体的一部分，其包含特异性结合抗原的一部分或全部且与抗原的一部分或全部互补的区域。当抗原是大的的情况下，抗体可以仅结合抗原的特定部分，该部分称为表位。抗原结合结构域可以通过一个或多个抗体可变结合域提供。抗原结合结构域可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
“分离的”指其中本发明的抗体或编码该抗体的核酸根据本发明优选处于的状态。抗体和核酸通常不合或基本不含它们天然相关的物质例如它们在它们的天然环境中或制备(该制备通过体外或体内进行的重组DNA技术进行)它们的环境(例如细胞培养)中存在的其他多肽或核酸。抗体和核酸可以用稀释剂或助剂配制且以实际的目的仍为分离的-例如，如果用于包埋微量滴定板用于免疫测定法时，抗体通常与凝胶或其他载体一起混合，或者当用于诊断或治疗时，与药学上可接受的载体或稀释剂一起混合。抗体可以天然地或通过异源真核细胞糖基化，或者它们可以(例如如果通过在原核细胞中表达生产)是非糖基化的。
“基本上...代表的”是指结合结构域的氨基酸序列与图1a至d、图2a至d或图3至10中所示的氨基酸序列所代表的氨基酸序列相同或者高度同源。
“高度同源”包括所述氨基酸序列与图1a至d、图2a至d或图3至10中代表的氨基酸序列具有至少70％的相同性。优选地，所述氨基酸序列将与图1a至d、图2a至d或图3至10中代表的氨基酸序列具有至少80％的相同性，更优选80％相同性，更优选至少90％的相同性，还更优选至少95％的相同性，例如98％的相同性。
如本文所述，“治疗”包括能够有益人或非人动物，优选哺乳动物的任何疗法。哺乳动物、鸟和其他动物可以被治疗，所述动物包括狗、猫或家畜，例如马、牛和羊。所述治疗可以是存在的病症或可以是预防性的(预防性治疗)。
如本文所述，“肿瘤”是组织的异常生长。其可以是局限性的(良性)或侵袭邻近组织(恶性)或远处组织(转移)。肿瘤包括引起癌症的赘生物生长，包括食管的、结直肠的、胃的、乳房的和子宫内膜的肿瘤，以及癌性组织或细胞系，包括但不限于白血病细胞。如本文所用，“肿瘤”在其范围内还包括子宫内膜异位。可以根据本发明治疗的肿瘤的实例包括皮肤、肺、纵隔、心包、前列腺、乳房、结肠和直肠、肝、胰腺、脑、颅内结构、眼、睾丸、卵巢、子宫、子宫颈、肾脏、甲状腺、膀胱、胃肠道、血液组织、骨、关节或结肠的肿瘤。
如本文所述，“炎症性障碍”包括选自以下的障碍：动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风、红斑狼疮、硬皮病、干燥综合征、多发性和皮肌炎、血管炎、腱炎、滑膜炎、细菌性心内膜炎、骨髓炎、银屑病、肺炎、纤维化肺泡炎、慢性支气管炎、支气管扩张、肺气肿、硅肺病、尘肺病、结核病、溃疡性结肠炎、克隆氏病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多发性硬化症、格林-巴利综合征以及重症肌无力、乳房炎、蹄叶炎、喉炎、慢性胆囊炎、桥本氏甲状腺炎、腕管综合征以及炎症性乳房疾病。在一个实施方案中，所述炎症性障碍可以是移植后组织或器官排斥的结果、在特定的实施方案中，所述炎症性障碍选自动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒症以及多发性关节炎。
本发明在其范围内还包括具有如图1a-d或2a-d中所述的氨基酸序列的多肽、具有如图1a-d或2a-d中所述的氨基酸序列的多核苷酸以及具有与此基本上相同的序列，例如与此具有70％、80％、85％、90％、95％或99％相同性。两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比相同性通常通过比对用于最适比较目的的序列(例如可以在第一序列中引入间隔用于与第二序列进行最佳比对)并比较在相应位置的氨基酸残基或核苷酸来确定。“最佳比对”是导致最高百分比相同性的两个序列的比对。百分比相同性通过比较所述序列中相同氨基酸残基或核苷酸的数目(即％相同性＝相同位置数目/总位置数目x100)来确定。
在两个序列之间的百分比相同性的确定可以通过使用本领域技术人员已知的数学算法完成。用于比较两个序列的数学算法的实例是在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中修改的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268算法。Altschul等(1990)J.MoI.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序引入该算法。可用BLAST程序，分值＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸研究以获得与本发明的核酸分子同源的核酸序列。可用XBLAST程序，分值＝100，字长＝3进行BLAST蛋白研究以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的间隔比对，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述利用Gapped BLAST。或者，可以使用PSI-Blast进行迭代研究，检测分子之间的远缘关系(Id.)。当使用BLAST、Gapped BLAST以及PSI-Blast程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov.。用于比较序列的数序算法的另一个实例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。作为GCG序列比对软件包一部分的ALIGN程序(版本2.0)引入该算法。
本领域已知的用于序列分析的其他算法包括如Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.，10：3-5中描述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-8中描述的FASTA。在FASTA中，ktup是设定研究敏感性和速度的对照选项。
本发明在其范围内还包括包含结合结构域的抗体，该结合结构域包含选自图1a至d或2a至d所代表的氨基酸序列的氨基酸序列或其变体，其中所述变体序列通过至少一个氨基酸残基的添加、取代或缺失来改变而对抗体的生物学功能没用实质性影响。
本文所用的多肽的“变体”包括氨基酸序列与参比多肽不同的多肽。一般而言，不同是有限的以使得参比与变体的序列非常相似并且在许多区域是相同的。变体多肽可以通过一个或多个可以以任何组合存在的取代、添加、缺失、截短而使氨基酸序列不同。优选的变体是与参比多肽在保守氨基酸取代不同的那些变体。所述取代是由另一个类似特征的氨基酸取代给定氨基酸的那些。氨基酸的以下非限制性列出认为是保守替换(类似的)：a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
本发明的一个实施方案提供包含一对基于基本上分别如图1a-d和2a-d所述的VH和VL区的氨基酸序列的结合结构域的抗体。基于这些序列之一的单个结合结构域构成本发明的另一方面。在基于基本上如图1a-d中所述的VH区的氨基酸序列的结合结构域的情况下，所述结合结构域可以用作靶向试剂，因为已知免疫球蛋白VH结构域能够以特异方式结合目标抗原。
在任何单链特异性结合结构域的情况下，这些结构域可以用于筛选能够形成两结构域抗体的互补结合域，该两结构域抗体在体内具有与本文所公开的单克隆抗体一样或相等的特性。
这可以通过噬菌体展示筛选方法使用W092/01047中所公开的所谓的等级双重组合方法(hierarchical dual combinatorial approach)获得，在等级双重组合方法中含H或L链克隆的单个集落用于感染编码另一链(L或H)的完整克隆库并根据噬菌体展示技术例如该参考文献中描述的那些来选自所获得的两链抗体。该技术还在Marks等，同前中公开。
本发明的抗体另外还可以包括抗体恒定区或其部分。例如，基于图2a-d中所示的VL区的抗体可以在其C末端连接于抗体轻链恒定区包括人CK或C#链。类似地，基于图1a-e中所示的VH区的抗体可以在其C末端连接于整个免疫球蛋白重链或其部分，所述免疫球蛋白重链来自任何抗体同种型，例如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同种型亚类。
尽管本发明的抗体本身表明在预防癌症细胞增殖中是有效的，但是它们另外可以被功能性标记物标记。功能性标记物包括设计靶向至癌症部位以引起其破坏的物质。此类功能性标记物包括毒素例如蓖麻毒素以及酶例如细菌性羧肽酶或硝基还原酶，它们能够将前药转化为活性药。另外，抗体可以连接或与化学治疗性剂或毒性剂例如卡奇霉素或放射性标记物例如90Y或11结合。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够抑制人肾上腺癌(SW-13)细胞的增殖至少10％，其中所述抑制使用MTT细胞增殖测定法测量。优选地，所述抗体能够调节例如干扰RAMP-3和CRLP的相互作用。
典型地，所述抗体能够抑制增殖至少12％。在一些实施方案中，所述抗体可以能够抑制增殖至少20％，任选地至少25％。在另一个实施方案中，所述抗体可以能够抑制增殖至少30％，任选地至少40％。
在一个实施方案中，当用肾上腺髓质素刺激时，所述抗体能够降低或抑制人MG63骨肉瘤细胞中cAMP的产生至少约15％，例如至少15％、16％、17％、18％和19％。在一些实施方案中，所述抗体可以能够抑制cAMP产生至少约20％，例如21％、22％或25％。典型地，所述抗体能够调节RAMP-3和CRLP的相互作用。
本发明的抗体可以通过化学合成全部或部分产生。所述抗体可以根据已经很好建立的标准液相或优选固相肽合成方法容易地制备，所述方法的一般描述可广泛地获得(参见例如J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase PeptideSynthesis，第2版，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)；M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，The Practice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，New York(1984)；以及Applied Biosystems 430A Users Manual，ABI Inc.，Foster City，California)，或者它们可以通过液相方法或通过固相、液相和溶液化学的任何组合，例如通过先完成相应的肽部分，然后如果需要和适宜，在去除存在的任何保护基后通过经相应的碳酸或磺酸或其活性衍生物的反应引入残基X来制备。
制备根据本发明的抗体的另一方便方法是通过使用在表达系统中的核酸来表达编码其的核酸。
本发明另外提供编码本发明的抗体的分离的核酸。核酸包括DNA和RNA。在优选的方面，本发明提供编码如上所定义的本发明的抗体的核酸。所述核酸的实例在1a-d和2a-d中显示。本领域技术人员能够确定仍提供本发明的抗体的此类核酸的取代、缺失和/或添加。
本发明还提供包含至少一种上述核酸的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体。本发明还提供重组宿主细胞，其包含上述一种或多种构建体。如上所述，编码本发明的抗体的核酸构成本发明的一方面，制备抗体的方法也一样，所述方法包括从编码核酸的表达。表达可以通过在适宜的条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来获得。表达产生后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化抗体，然后适宜时使用。
用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统众所周知。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。现有技术中可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞等。常用的优选细菌宿主是大肠杆菌。原核细胞例如大肠杆菌中抗体和抗体片段的表达在本领域已很好地建立。综述参考见例如Pluckthun，BiolTechnology 9：545-551(1991)。培养物中真核细胞中的表达对于本领域技术人员而言也可以获得作为抗体生产的选择，参见最近综述，例如Reff，Curr.Opinion Biotech.4：573-576(1993)；Trill等，Curr.Opinion Biotech.6：553-560(1995)。
可以选择或构建包含合适的调控序列的合适的载体，所述调控序列包含启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及其他适宜的序列。
适宜地，载体可以是质粒，病毒，例如噬菌体或噬菌粒。进一步详细信息，参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual：第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。用于操作核酸，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞中以及基因表达和蛋白分析的多种已知技术和操作方案在Ausubel等编著，Short Protocols in Molecular Biology，第2版，John Wiley&Sons(1992)中已经详细描述。
因此，本发明的另一方面提供含有本文公开的核酸的宿主细胞。另一方面提供包括将所述核酸引入宿主细胞中的方法。所述引入可以采用任何可获得的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用逆转录病毒或其他病毒例如牛痘病毒或者用于昆虫细胞的杆状病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用细菌噬菌体的转染。所述引入可以在引起或允许核酸表达例如通过在基因表达条件下培养宿主细胞后进行。
在一个实施方案中，本发明的核酸整合入宿主细胞的基因组(例如染色体)中。整合可以根据标准技术通过包含启动基因组重组的序列来促进。
本发明还提供包括在表达系统中使用如上所述构建体以表达上述抗体或多肽的方法。
诊断方法 本发明的抗体可以用于诊断人或动物受试者中的肿瘤的方法中。
编码RAMP的基因显示在特定癌组织中表达增加。RAMP的表达可以在方法例如蛋白质印迹、ELISA方法或组织学染色中使用本发明的抗体在组织或细胞中检测。在使得形成免疫复合物的条件下使来自受试者的组织的样品(例如活检样品或血液样品)与本发明的抗体接触。样品中RAMP的存在或其量可以通过测定样品是否与所述抗体结合来确定。以此方法，可以进行癌症的诊断、癌症的进展或治愈的监测，以及诊断的预测。
在一个实施方案中，本发明提供用于检测在生物样品中肿瘤或炎症性障碍存在的方法，所述方法包括使所述生物样品与本发明的抗体接触并检测相对于在阴性对照或在来自正常健康受试者的生物样品中检测到的抗体结合而言抗体结合的增加的步骤。
本发明还提供本发明的抗体在体内诊断方法中的应用。在一个实施方案中，本发明提供用于检测受试者中肿瘤或炎症性障碍的存在的方法，所述方法包括给予所述受试者本发明的抗体并检测相对于在阴性对照或正常健康受试者中检测到的抗体结合而言抗体结合的增加的步骤。
所述抗体可以被标记或与其他分子缀合以辅助诊断性成像或其他检测。例如，可以制备123-碘放射性标记抗体用于通过单光子发射断层扫描和计算机断层扫描(SPECT/CT)闪烁扫描检测。这些方法可以与其他诊断和成像技术组合，例如可以进行18F-氟脱氧葡糖(18FDG)正电子发射断层扫描和计算机断层扫描。这些技术对于本领域技术人员而言是已知的，并在Birchler等，Otolaryngology-Head and Neck Surgery，Volume 136，Issue 4，Pages 543-548)中例示。
在另一个实施方案中，本发明提供监测受试者中的治疗方案的肿瘤或炎症性障碍的进展的方法，所述方法包括从所述受试者分离生物样品，使所述生物样品和本发明的抗体接触，并检测相对于阴性对照或来自正常健康受试者的生物样品中检测到的抗体结合相比抗体结合的增加的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供监测受试者中的治疗方案的肿瘤或炎症性障碍的进展的方法，所述方法包括给予所述受试者本发明的抗体并检测相对于阴性对照或正常健康受试者中检测到的抗体结合而言抗体结合的增加的步骤。
要检测的生物样品可以包括来自受试者的任何组织例如活检组织(例如来自例如本文所描述的肿瘤的组织或体液(例如血液))。
当在诊断中使用时，抗体可以用可检测的标记物标记，所述可检测的标记物例如放射性标记物例如I或99Tc，其可使用抗体成像领域中已知的常规化学与本发明的抗体连接。标记物还包括酶标记物例如辣根过氧化物酶。标记物还包括化学部分例如生物素，其可以通过与特定的关联的可检测部分例如标记的抗生物素蛋白结合来被检测。
产品、药物组合物和治疗性应用 本发明的抗体可以单独给予或与其他治疗组合同时或顺序给予，这取决于要治疗的病症。因此，本发明还提供产品，所述产品含有本发明的抗体和活性剂作为组合配制物用于同时、分开或顺序使用治疗肿瘤。活性剂可以包括化疗剂或细胞毒性剂，包括5-氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素C、奥沙利铂和他莫西芬，它们可以与本发明的抗体协同起作用。其他活性剂可以包括合适剂量的止痛药例如非甾体抗炎药(例如阿斯匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或鸦片类例如吗啡或抗呕吐药。
尽管不希望被理论所束缚，但是本发明的抗体与活性剂协同增强杀肿瘤能力可能不是由于免疫效应机制，而可能是抗体与细胞表面RAMP结合的直接结果。
本发明的抗体通常以药物组合物的形式给予，所述药物组合物除抗体外还可以包含至少一种成分。除活性成分外，所述药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他物质。所述物质应该是无毒性的，并且不应干扰所述活性成分的效力。载体或其他物质的精确性质取决于给药途径，给药途径可以是口服或注射，例如静脉内。
设想通常途径的全身注射(例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内或皮下注射)是治疗性给予所述组合物的主要途径，但是局部注射或者通过导管或其他外科管的局部给药也可以使用，通过留置贮存微型泵或其他缓慢释放装置进行的局部注射或输注也可以使用。局部给药可以进入含有靶组织的病理性组织或进入含有靶组织的体腔中。这些腔的实例可以包括脑室、滑膜关节或胸膜腔。液体制剂在从粉末制剂复制后可以使用。
对于静脉内注射或在患病部位的注射，所述活性成分将是不含热原且具有适宜的pH、等张性和稳定性的肠胃外可接受的含水溶液的形式。本领域相关的技术人员使用例如等张载体例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐林格注射液能够很好地制备合适的溶液。如果需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
用于口服给药的药物组合物可以为片剂、胶囊剂、散剂或液体形式。片剂可以包含固体载体例如凝胶或助剂。液体药物组合物通常包含液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。
可以包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在所述制剂是液体的情况下，其可以例如是含有非磷酸盐缓冲剂pH 6.8-7.6的生理盐溶液或冻干粉剂。
所述组合物还可以经微球、脂质体、其他微颗粒递送系统或缓释制剂置于某些组织包括血液中来给予。缓释载体的合适实例包括共享品形式的半透性聚合物基质，例如栓剂或微胶囊。可植入或微胶囊缓释基质包括聚交酯(美国专利3,773,919；EP-A-0058481)，L-谷氨酸和γL-谷氨酸乙酯共聚物(Sidman等，Biopolymers 22(1)：1985)，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或乙烯基乙酸乙烯酯(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277，1981，以及Langer，Chem.Tech.12：98-105，1982)。
通过众所周知的方法：DE3.218，121A；Epstein等，PNAS USA，82：3688-3692，1985；Hwang等，PNAS USA，77：4030-4034，1980；EP-A-0052522；E-A-0036676；EP-A-0088046；EP-A-0143949；EP-A-0142541；JP-A-83-11808；美国专利4,485,045和4,544,545制备含多肽的脂质体。
通常地，脂质体是小(约200-800埃)单层类型，其中脂质含量大于约30mol.％胆固醇，所选的比例用于多肽渗漏的最适速率的调整。
所述组合物可以以局部的方式给予肿瘤部位或其他期望的部位或者可以以靶向肿瘤或其他细胞的方式递送。
所述组合物优选以“治疗有效量”给予个体，该治疗有效量足以向所述个体显示益处。实际的给药量以及给药速率和时间-进程取决于要治疗的性质和严重程度。治疗的描述，例如剂量的确定等在普通医生以及其他医务人员的职责内，通常考虑要治疗的疾病、个体患者的状态、递送的部位、给药方法以及医生所知的其他因素。本发明的组合物与存在的肿瘤，特别是癌症的治疗以及在最初的治疗或手术后这些病症的复发的预防特别相关。以上提及的技术和方案的实例可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.(ed)，1980中找到。
最适剂量可以由医生基于多个参数包括例如年龄、性别、体重、要治疗的病症的严重程度、给予的活性成分以及给药途径来确定。一般而言，多肽和抗体的血清浓度使得受体饱和是期望的。超过约0.1nM的浓度通常是足够的。例如，100mg/m的抗体剂量提供约8天约20nM的血清浓度。
组合物的剂量将取决于抗体的性质，例如其结合活性以及体内血浆半衰期、所述制剂中多肽的浓度、给药途径、给药部位和速率、所述患者临床耐受性、患者赢患的病症等，这些在熟练医生所知的范围内。本发明还涉及用于增强针对癌症的保护性免疫应答的最适免疫方案。
根据本发明的抗体或组合物可用于治疗、延迟和/或预防增殖性障碍例如肿瘤至例如抑制血管生成或癌细胞增殖。
根据本发明要治疗的肿瘤的具体实例包括肺、颅内(包括脑)和皮肤肿瘤。优选颅内肿瘤，例如脑肿瘤。肺肿瘤或癌症可以分类为小细胞癌、腺癌、大细胞癌、细支气管肺泡癌、鳞癌以及良性肿瘤。可以根据本发明治疗任何肺肿瘤。皮肤肿瘤或癌可以分类为黑色素瘤、口腔鳞癌和畸胎瘤。颅内和脑肿瘤可以分类为胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤、生长激素瘤、催乳素瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤以及脉络丛癌。肾上腺肿瘤可以分类为肾上腺皮质癌、嗜铬细胞瘤、醛固酮瘤。所述肿瘤可以是眼肿瘤。
要治疗的肿瘤可以选自骨肉瘤、肾上腺癌、成胶质细胞瘤、前列腺肿瘤、乳房肿瘤和间皮瘤。要治疗的肿瘤可以是脑肿瘤，例如成胶质细胞瘤。
要治疗的肿瘤可以是肾上腺肿瘤，例如肾上腺皮质癌。
要治疗的肿瘤可以是间皮瘤。
要治疗的肿瘤可以是骨肿瘤，例如骨肉瘤。
要治疗的肿瘤可以是前列腺肿瘤。
要治疗的肿瘤可以是乳房肿瘤。
要治疗的肿瘤可以是结肠肿瘤。
在一个实施方案中，用于治疗肿瘤的本发明的抗体是RAMP(例如RAMP 3)拮抗剂。
要治疗的其他增殖性障碍可以包括过度角化。
根据本发明的抗体或组合物可以用于治疗、延迟和/或预防炎症性障碍，例如本文所定义的炎症性障碍。在一个实施方案中，用于治疗炎症性障碍的本发明的抗体是RAMP(例如RAMP 3)拮抗剂。
根据本发明的抗体或组合物可以用于治疗、延迟和/或预防心血管病症，例如促进血管生成和血管发生。心血管病症的特定实例可以包括心脏衰竭、中风(特别是中风后血管再形成)、冠心病、血管性疾病、心肌梗死(特别是心肌梗死后血管再形成)以及糖尿病性血管病变，特别是视网膜病变。在一个实施方案中，用于治疗心血管病症的本发明的抗体是RAMP(例如RAMP 3)激动剂。
根据本发明的抗体或组合物还可以用于治疗选自骨质疏松、肥胖、脓毒症和创伤的病症的治疗。如本文所述，术语“创伤”包括溃疡和损害，例如皮肤创伤如切伤或烧伤以及与此相关的病症。本发明的抗体或组合物可以用于刺激增殖和组织生长例如通常的伤口愈合。这可以包括愈合促进剂可能具有益处的手术后皮肤创伤的愈合，皮肤或组织缺失的开放性皮肤创伤的愈合，由于糖尿病、床上休息患者的褥疮或其他原因引起的溃疡的愈合，延迟组织修复例如骨折的延迟或不结合的愈合，有或没有手术的损伤后软骨和关节组织的修复，腱损伤例如跟腱撕裂以及马中的腱损伤的愈合。其他适应症将包括组织缺失例如骨质疏松发生的治疗。在一个实施方案中，用于治疗高血压、肥胖、创伤和骨质疏松的本发明的抗体是RAMP(例如RAMP 3)激动剂。或者，用于治疗骨质疏松的抗体可以是RAMP(例如RAMP 3)拮抗剂。
在本申请的整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和“包含”以及该词语的不同形式是指“包括但不限于”，不意欲(和不)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。
在本申请的整个说明书和权利要求书中，单数包括复数，除非上下文要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，说明书要理解为涵盖复数以及单数，除非上下文要求。
与本发明特定方面、实施方案或实施例相关描述的特征、整数、特点、化合物、化学部分或基团要理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与此不相容。
图1a-d显示单克隆抗RAMP 3抗体的重链可变区的核酸和氨基酸序列；
图2a-d显示单克隆抗RAMP 3抗体的氢链可变区的核酸和氨基酸序列；
图3至6显示单克隆抗RAMP 3抗体的重链的氨基酸序列；
图7至10显示单克隆抗RAMP 3抗体的氢链的氨基酸序列；
图11为测试多克隆抗RAMP-3抗体的调节肾上腺髓质素增加人MG63骨肉瘤细胞中的cAMP的作用的能力。所有抗体降低肾上腺髓质素的作用；
图12显示单克隆抗体体外对SW-13细胞生长的作用。检测单克隆抗RAMP-3抗体诱导SW-13(肾上腺癌细胞)增殖抑制的能力。1∶50浓度等于约5ng/孔终浓度；
图13显示体外单克隆抗体HB10对U87细胞生长的作用。肿瘤细胞以2000个细胞接种在96孔板中，加入为2×10-7的AM以及剂量范围的抗体。作为对照，加入非哺乳动物IgG抗体。该治疗方案每2天进行一次。在第4天，制备细胞用于MTT测定ATTC。
图14显示评价在不同浓度的抗体JF2存在下U-87成胶质细胞瘤细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
图15显示评价在不同浓度的抗体JB3存在下U-87成胶质细胞瘤细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
图16显示评价在不同浓度的抗体JB3存在下MDA-MB-436-GFP乳癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
图17显示评价在不同浓度的抗体JF2存在下MDA-MB-436-GFP乳癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
图18显示评价在10μg浓度的抗体JB3存在下PC-3前列腺癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
图19显示评价在10μg浓度的抗体JF2存在下PC-3前列腺癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
图20显示评价在10μg浓度的抗体JB3存在下SAOS骨肉瘤细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
图21显示评价在10μg浓度的抗体JB3和JF2存在下HCT116结肠癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
图22显示评价在抗体JB3和JF2存在下U-87成胶质细胞瘤癌细胞系中的caspase-3标记物的水平的凋亡测定。
图23显示评价在抗体JB3和JF2存在下MDA-MB-436-GFP乳癌细胞系中的caspase-3标记物的水平的凋亡测定。
图24代表注射入CD1裸鼠右肋腹中的MDA-MB-436-GFP的肿瘤体积，该CD1裸鼠用JF2抗体和对照处理6周。
图25代表注射入CD1裸鼠右肋腹中的MDA-MB-436-GFP的肿瘤重量，该CD1裸鼠用JF2抗体和对照处理6周。
图26显示注射入裸鼠右肋腹的MDA-MB-436-GFP癌细胞系的荧光性。
图27显示处理6周后从裸鼠中去除的肿瘤的组织切片。
实施例-本发明现将进一步通过以下非限制性实施例进行描述：
材料和方法 RAMP胞外结构域(ECD)蛋白的产生 RAMP的ECD区通过使用来自Novagen Toyobo的KOD热启动DNA聚合酶试剂盒进行高保真PCR反应来产生。模板DNA从购买的人脑cDNA样品(Ambion)获得。
该反应进行两次，使用以下引物进行第一次反应以分离比整个RAMPECD更大的区域：
RAMP1 正向
CGAGCGGACTCGACTCGGCAC
反向
CTTCCTAGGGTGGCGGTGGCC
RAMP2 正向
GTC CGC CTC CTC CTT CT GCT
反向
AAG TGG AGT AAC ATG GTT ATT GT
RAMP3 正向
AGC CAT GGA GAC TGG AGC GCT GC
反向
GTG GCC CAG TAG CTG GAG ATT GGC
第二次PCR反应使用来自用以上引物进行的反应的产物。使用以下引物，这些引物具有EcoR1和BamH1限制性位点插入其中：
RAMP1 正向
GCGAATTCCTGCCAGACCACCAG
反向
GTGGATCCTACCGGGCCCGGGACA
RAMP2 正向
GCG AAT TCA ATC CCC ACG AGG CCC TGG CTC AGC C
反向
CAG GAT CCTACA AGA GTG ATG AGG AAG GGG ATG
RAMP3 正向
CAG AATT TCC AGA GCA GGC CGC TGC AAC CAG ACA G
反向
GTG GAT CCC ACC ACC AGG CCA GCC ATG GCG ACA GT
进行产物的基因组测序以确切检测产品。从前面这点来看，ECD蛋白称做“插入物”，除非另外指出。
蛋白纯化 表达和纯化ECD肽。该蛋白使用谷光甘肽S-转移酶(GST)基因融合系统进行纯化。
抗体产生 ECD肽的抗体使用以下方案产生。
小鼠和大鼠免疫方案 进行以下免疫方案产生针对RAMP-3胞外结构域的抗体：
在免疫前从小鼠取免疫前血清。四只小鼠用相应于RAMP-3胞外结构域的肽注射：
1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 GCPRAGGCNE TGMLERLPLC GKAFADMMGK VDVWKWCNLS EFIVYYESFT NCTEMEANW
7
0 8
0 9
0 9
9 GCYWPNPLAQ GFITGIHRQF FSNCTVDRVH LEDPPDEVL
用4次另外的注射以大约每月的间隔进行加强注射。取来自小鼠的样品放血分离含多克隆抗体的血清。使用的佐剂是弗氏佐剂(第一次注射弗氏完全佐剂，然后其余期间用弗氏不完全佐剂)。可以注射啮齿动物中的总体积是0.2ml(对于小鼠优选不超过0.1ml)。其一半是抗原，一半是佐剂，因此抗原应该是足够浓度的以提供所要求的最大注射0.1ml或0.05ml的毫克数。
蛋白质印迹方案
使用抗体的蛋白质印迹探测原ECD肽的印迹，与分子大小标记物以双份重复泳道跑电泳。抗体1和2显示与在14KDa预期大小处的蛋白带的清楚结合(数据未显示)。抗体3显示在相同大小处的非常强的结合，而AB4在该实验中没有检测到(数据未显示)。
抗体阻断可能性 为检测抗体与RAMP结合的能力，进行测定以确定抗体的阻断可能性：
·用10pmol AM处理人MG63骨肉瘤细胞，测定cAMP反应(方法如以上所述，例如使用cAMP荧光偏振(FP)Biotrak免疫测定法(AmershamBiosciences))。(如果检测RAMP-1试剂，则该测定法还可以使用CGRP作为配体进行以检测该试剂的阻断能力)
·所述细胞用抗体预处理1小时
·施用AM的EC
50剂量(10pmol)，并测定cAMP反应。
使用多克隆检测它们调节肾上腺髓质素增加人MG63骨肉瘤细胞中cAMP的作用的能力。
单克隆抗体产生 使用第3只小鼠制备单克隆抗体。该用于制备单克隆抗体的方法已经被Kohler和Milstein在Nature 256，495-497(1975)中公开，还被在Schwartz编辑的Compendium of Immunology V.II，1981中的Donillard和Hoffman，″BasicFacts about Hybridomas″所公开，这些文献引入本文作为参考。
筛选克隆并基于不与肽上的GST标签结合来选择。在这些克隆中，获得ELISA数据，选出最好的5个用于进一步的工作。
抗体同种型 使用同种型试剂盒IsoStrip(Roche Diagnostics GmbH)测定单克隆抗体的同种型的特征。
所述单克隆抗体的同种型如下：
CD12-IgG-IgG1亚型
HB10-IgG-IgG1亚型
JF2-IgG-IgG1亚型
JB3-IgM
CC2-IgA
增殖测定 细胞培养
在无菌条件下在Nunclon处理的组织培养塑料物上进行细胞培养。用于该项目的U-87成胶质细胞瘤细胞(ATCC noHTB-14)在具有10％胎牛血清(Gibco)和5％青霉素/链霉素抗生素(Sigma)的标准EMEM(Earle极限必需培养基)培养基(Gibco)中培养。冻存的细胞在37℃下解冻2分钟。然后细胞立即转移至具有10ml培养基的75cm
2瓶中。培养物在37℃和5％CO
2下培养以达到汇合。培养基每三天更换，然后细胞在达到80-90％汇合后传代培养。细胞用PBS(Gibco)洗涤以去除血清的存在，因为血清存在作为胰蛋白酶的抑制剂起作用。加入3ml10％胰蛋白酶EDTA(Sigma)以从瓶上移去细胞层。允许胰蛋白酶化在37℃下发生15分钟以有利于分散。在显微镜下观察瓶以确认细胞与瓶分离。将6-8ml培养液加入瓶中并轻轻吸出细胞。将细胞以1000rpm离心3分钟，并去除上清液，将得到的细胞小丸重悬于1ml培养基中，并以1∶6比例传代培养入适宜数量的瓶中(对于细胞培养材料参考附录1a)。
培养板的制备
在标准条件(如上所述)下培养U87成胶质细胞瘤细胞。使用血细胞计数板(Hawksley)计数细胞总数，并使用以下等式计算浓度：
![]()
将细胞浓度调整到2000个细胞/50μl。
将以上细胞配制物50μl接种在透明的96孔板(Costar，polystyrene，Flatbottom)中。
实验条件
对各抗体进行两组增殖研究。一组用于研究在内源性肾上腺髓质素存在下抗体对增殖的作用，而另一组用于研究在外源添加的肾上腺髓质素的存在下抗体的作用。在PBS中制备不同浓度的抗体以获得孔终浓度为10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg。每个抗体的每种浓度进行重复6次。在两组中均使用该剂量范围。将肾上腺髓质素加入适宜组中至孔终浓度为200nM。使用5-氟尿嘧啶(Fluka)作为用于增殖降低的阳性对照(100mM)。还制备PBS对照。然后将培养板在标准条件下孵育。每2天进行抗体和对照的更换和再给药。还以类似的方式计算小鼠抗GST抗体浓度反应，因为其是实验的抗体对照。
测定程序
为检测接种的细胞的一致性，进行12-24小时研究。在2、4、6和8天进行另外的时间点。用于进行增殖测定的试剂盒是MTT细胞增殖测定(ATCC)。在各时间点，将10μl MTT试剂加入所有的孔中，保持在37℃下孵育2小时。2小时后，将100μl MTT去污剂加入孔中，孵育过夜并避光摇动。在595nM(Spectramax M5e)处使用软件softmax Pro 5.2.X 100035读板的吸光度。
使用MTT测定法(关于该测定法的细节参见
www.lgcpromochem-atcc.com)测定SW-13和U87(成胶质细胞瘤细胞系)细胞的增殖/存活。
凋亡测定 使用Caspase-3测定试剂盒(Sigma)进行凋亡测定。(关于所要求的材料参考附录1c)
细胞制备
在标准条件下制备U-87细胞。将2×10
7细胞的细胞溶液制在2ml培养基中，悬浮在聚丙烯管中。
实验条件
各处理用2×10
7细胞。治疗组为抗体处理的细胞(各抗体)、抗Fas抗体、抗体和肾上腺髓质素处理的细胞、空白和肾上腺髓质素处理的细胞。阳性对照是抗Fas单克隆抗体(MBL)。使用的抗体终浓度是10g，而对于抗Fas抗体是500ng。抗Fas抗体是IgM抗体，具有溶细胞活性，从而诱导细胞凋亡。
将在2ml培养基中的处理的细胞悬浮液在37℃和5％CO
2气氛下孵育3小时。
测定程序
根据在所述方案中给出的标准说明使用17兆欧姆水制备试剂盒中给出的测定缓冲液和裂解缓冲液。孵育3小时后，将细胞在4℃下以600g离心5分钟。丢弃悬浮液，并将细胞重悬于1ml PBS中。使用上述条件再离心细胞一次，丢弃悬浮液。将细胞小丸重悬于200μl 1x裂解缓冲液中，并在冰上孵育20分钟。将裂解的细胞在4℃下以20,000g离心15分钟。然后，如图6中所示，将细胞裂解物放置在96孔平底培养板中，并培养过夜。使用软件softmax Pro 5.2.36，在405nm(Spectramax M5e)处读取吸光度。
动物研究 用于异种移植的细胞的细胞培养
将MDA-MB-436-GFP细胞在含有青霉素(50U/ml)、链霉素(50μg/ml)、谷氨酰胺(1mg/ml)并补充有10％胎牛血清的RPMI培养基中培养。细胞在湿度5％CO
2/95％空气气氛下培养，每2天给一次新鲜血清，常规监测支原体污染。使用胰蛋白酶EDAT溶液收集对数生长的细胞。所有培养基成分购买自Invitrogen Life Technologies。
动物条件
动物工作在谢菲尔德大学的动物设施中进行。使用雄性4至5周龄CD1裸鼠(nu/nu)。小鼠适应环境，并在温度控制的房间中在层流净化罩下在无菌的笼子里各组四个或更少进行豢养，12小时光/12小时黑暗的时间表，并喂以高压消毒的食品以及自由饮水。
治疗和异种移植
CD1(nu/nu)裸鼠用MDA-MB-436-GFP乳癌细胞植入。为细胞植入，在培养基中培养的MDA-MB-436-GFP用PBS洗涤，分散在0.05％的胰蛋白酶溶液中并重悬。离心(在8℃下，1000rpm，3分钟)后，将细胞小丸重悬在PBS中，调整终浓度至3×10
7个细胞/ml，并将悬浮液置于冰上。将部位用乙醇清洁后，将0.1ml(0.5×10
6个细胞)悬浮液皮下注射入裸鼠的右肋腹。用数字游标卡尺(部位)测量肿瘤，使用公式宽×长×高×0.52(对于椭圆形)确定肿瘤体积，这些测量每周两次。允许肿瘤发展21天，随机地将动物分成三组。一组(n＝8)每周的每星期二和星期五接受腹膜内注射作为于PBS中的体积为0.2ml的悬浮液的JB3抗体(200μg纯化的IgG)。作为对照，一组(n＝8)接受无关抗体(相同同种型的IgG，该抗体的灭火形式)，而另一组(n＝8)接受相当的单独载体(PBS)注射。在所示的时间进行方案1。
肿瘤切片
麻醉后从小鼠切除肿瘤，并固定在10％福尔马林盐水溶液中。将肿瘤切片包埋在石蜡中(标准操作方案)。过整个肿瘤体以5μm进行切片。各个标本切片用苏木精和曙红(H&E)染色，并用玻璃盖玻片固定。
结果 测试的所有多克隆抗体降低了肾上腺髓质素对cAMP产生的作用。在图11中显示的结果表明针对RAMP-3产生的多克隆抗体抑制MG63细胞cAMP产生至少15％。
产生的各单克隆抗体诱导SW-13细胞的增殖抑制在12-45％范围内，参见图12(1∶50的浓度等于约5毫微克/孔的终浓度)。
测试的单克隆抗体之一HB10增加U87细胞的增殖(参见图13)。随抗体的剂量增加，吸光度的水平亦增加，因此对于增殖水平表明该抗体的激动剂作用。
图14显示评价在不同浓度的抗体JF2存在下U-87成胶质细胞瘤细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。与对照相比，10μg剂量的抗体JF2产生增殖的显著降低，这代表增殖40％的降低。
图15显示评价在不同浓度的抗体JB3存在下U-87成胶质细胞瘤细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。
与对照相比，所有剂量的抗体JB3产生增殖的显著降低，这代表所有剂量下增殖～35％的降低。这表明EC50低于1pg。
图16显示评价在不同浓度的抗体JB3存在下MDA-MB-436-GFP乳癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。与对照相比，所有剂量的抗体JB3产生增殖的显著降低，不过没有观察到剂量反应。10ng产生29％的最大降低，不过该反应与其他治疗组没有显著差异。
图17显示评价在不同浓度的抗体JF2存在下MDA-MB-436-GFP乳癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。与对照相比，剂量1μg和10μg的抗体JF2产生增殖的显著降低。10μg产生12％的最大降低。
图18显示评价在10μg浓度的抗体JB3存在下PC-3前列腺癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。与对照相比，剂量10μg的抗体JB3在外源性添加的肾上腺髓质素存在或不存在下均产生增殖的显著降低。10μg产生57％的增殖降低。
图19显示评价在10μg浓度的抗体JF2存在下PC-3前列腺癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。与对照相比，剂量10μg的抗体JF3在外源性添加的肾上腺髓质素存在或不存在下均产生增殖的显著降低。10μgJF2在肾上腺髓质素存在下产生37％的增殖降低，而在外源性添加的肾上腺髓质素不存在下产生22％降低。
图20显示评价在10μg浓度的抗体JB3存在下SAOS骨肉瘤细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。与对照相比，剂量10μg的抗体JF3在外源性添加的肾上腺髓质素存在下产生增殖的显著降低，但是在外源性添加的肾上腺髓质素不存在下没有观察到显著的降低。10μg JB3在肾上腺髓质素存在下产生34％的增殖降低。
图21显示评价在10μg浓度的抗体JB3和JF2存在下HCT116结肠癌细胞系的增殖速率的MTT测定(培养8天后)。与对照相比，剂量10μg的抗体JB3产生增殖的显著降低，不过JF2没有产生增殖的统计学上显著降低。10μgJB3在肾上腺髓质素存在下产生27％的增殖降低。
图22代表凋亡的水平，通过测量caspase-3凋亡标记物的水平进行。在10μg浓度的抗体JB3和JF2存在下U-87成胶质细胞瘤癌细胞系均显示caspase-3水平的显著增加以及它们对于凋亡。治疗组代表caspase-3的26％增加水平。
图23代表凋亡的水平，通过测量caspase-3凋亡标记物的水平进行。在10μg浓度的抗体JB3和JF2存在下MDA-MB-436-GFP乳癌细胞系，仅JB3显示caspase-3水平的显著增加以及它们对于凋亡。JB3治疗组代表caspase-3的59％增加水平。
图24代表注射入CD1裸鼠右肋腹中的MDA-MB-436-GFP的肿瘤体积，该CD1裸鼠用JF2抗体和对照处理6周。对照组均显示在3周后大的肿瘤体积增加，而在治疗组的生长速率相当大地减慢。在对照组中的误差棒在整个实验中均是大的，而治疗组中误差始终是小的。
图25代表注射入CD1裸鼠右肋腹中MDA-MB-436-GFP的肿瘤重量，该CD1裸鼠用JF2抗体和对照处理6周。在死后称取肿瘤重量，并使用肿瘤体积计算回去。对照组显示从最初的时间点重量就增加，而治疗组显示较缓慢的增加直至4周重量增加，不过仍是低于对照组。
图26显示注射入裸鼠右肋腹的MDA-MB-436-GFP癌细胞系的荧光性。
图27显示处理6周后从裸鼠中去除的肿瘤的组织切片。切片用H&E染色，这些图片是肿瘤的代表。在对照组中，较多的血管是可见的(红色箭头)，而较少面积的坏死细胞。在治疗组中有较少的血管以及大面积的坏死前细胞，由上面的黄色环表示。