5’经取代腺苷、其制备和作为S腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂的用途.pdf

5’-经取代腺苷、其制备和作为S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂的用途
     有关联邦资助的研究或开发的陈述

    本发明是使用美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)和美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的生物医学研究资源计划(Biomedical Research ResourceProgram)(RR-01646)依据PO1 CA-94000提供的资金发明，并且美国政府对本发明享有某些权利。

     相关申请案的交叉参考

    本申请案主张2007年8月2日申请的美国临时申请案第60/953,621号的优先权，所述专利的全部揭示内容都以引用的方式并入本文中。

    【技术领域】

    本发明涉及某些腺嘌呤衍生物，具体说来，涉及某些5′-取代的腺苷化合物。本发明还涉及腺嘌呤衍生物作为S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂的用途。本发明还涉及腺嘌呤衍生物用于治疗各种疾病(例如癌症和寄生虫感染)且尤其哺乳动物疾病的用途。本发明还关于制备所述化合物的方法。

    背景技术

    S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶是多胺生物合成路径的关键酶，并且取决于脱羧过程的丙酮酰基。这种酶的抑制剂可能作为癌症的化疗药物，并用于治疗各种寄生虫感染。先前已确定在活性位点具有各种抑制剂的酶的晶体结构，并且证实，配体在与酶相互作用的过程中，其腺嘌呤碱基采用一种不常见的顺式构象。举例来说，已知腺嘌呤环的8位取代使此核苷酸在溶液中采用顺式构象(37-40)。在顺式构象中，腺嘌呤碱基堆积于AdoMetDC的F223与F7残基之间。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)是一种丙酮酰基依赖性脱羧酶，而且是多胺生物合成路径中的关键酶，其存在于所有物种中(1-4)。多胺腐胺、亚精胺和精胺对于细胞生长至关重要，并且在细胞增殖和分化过程中起到重要作用(5-7)。人们发现，多胺在多种类型的癌症中会增多，包括非小细胞肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和胰腺癌(8，9)。细胞中多胺的含量取决于多胺的合成和分解路径，以及多胺跨细胞膜的输入和输出。改变多胺路径中关键酶的调控，将是治疗各种类型癌症的一种治疗策略。AdoMetDC催化S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)转化成脱羧-S-腺苷甲硫氨酸(dcAdoMet)，随后dcAdoMet将氨基丙基提供给腐胺或亚精胺，分别形成亚精胺和精胺。AdoMetDC是所述路径的重要分支点，而且其作用于将AdoMet提供到多胺生物合成中，并将其从可用于提供甲基的池中去除。

    调控多胺含量的尝试，已导致开发出靶向生物合成酶鸟氨酸脱羧酶(ODC)(10)、AdoMetDC和分解酶亚精胺/精胺N¹-乙酰转移酶(SSAT)(11)的抑制剂。众所周知的ODC抑制剂为α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)，其会使ODC不可逆失活。由于细胞通过增加多胺的细胞摄入来补偿多胺合成的减少，故DFMO在癌症疗法中的成效是有限的(12)。目前正在将DFMO作为针对癌发生的化学预防剂进行研究(13-15)。抑制AdoMetDC的药物的开发是从结构类似于亚精胺的竞争性抑制剂甲基乙二醛双(脒基腙)(MGBG)开始(16)。使用MGBG会在人体中引起极高毒性，而在尝试降低毒性的过程中，开发出许多MGBG的类似物。由此得到的一种此类AdoMet抑制剂为4-脒基茚-1-酮-2′-脒腙(CGP48664A)，其已作为癌症的化疗剂进行临床试验(17)。另外，还开发出结构类似于天然底物的抑制剂，如MHZPA、MAOEA和MHZEA。这些化合物通过与活性位点的丙酮酰基形成希夫碱(Schiff base)来使AdoMetDC失活(18)。AdoMetDC的另一种已知的核苷抑制剂为5′-(18)-5′-脱氧腺苷。其被设计为酶激活不可逆抑制剂(19)，但随后的实验显示，其通过丙酮酸辅基的转氨基作用来起作用(18)。

    AdoMetDC与其S68A和H243A突变体的晶体结构已得到解决，由此可了解脱羧和自加工的机制(20-22)。先前已解决AdoMetDC与抑制剂(如MAOEA、MHZPA和MeAdoMet)所形成的晶体结构(23)。这些结构显示，抑制剂的腺嘌呤碱基在活性位点呈现一种不常见的顺式构象。

    【发明内容】

    根据本发明发现，某些腺嘌呤类似物会形成在溶液中促成顺式构象的配体。本文揭示数种8-取代的AdoMet结构类似物以及未经取代的腺嘌呤(即，8位取代基为H)的合成，和其抑制AdoMetDC的能力的分析。还揭示AdoMetDC F223A突变体与MeAdoMet的复合物以及野生型蛋白质与抑制剂5′-脱氧-5′-[N-甲基-N-[2-(氨基氧基)乙基]氨基-8-甲基]腺苷(MAOEMA)和5′-脱氧-5′-[N-甲基-N-[4-(氨基氧基)丁基]氨基-8-乙基]腺苷(MAOBEA)的复合物的晶体结构。为便利起见，本文中使用以下所写。AdoMetDC，S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶；AdoMet，S-腺苷甲硫氨酸；MAOEMA，5′-脱氧-5′-[N-甲基-N-[2-(氨基氧基)乙基]氨基-8-甲基]腺苷；MAOBEA，5′-脱氧-5′-[N-甲基-N-[4-(氨基氧基)丁基]氨基-8-乙基]腺苷；MeAdoMet，S-腺苷甲硫氨酸甲酯；Tris，三(羟甲基)氨基甲烷；PEG，聚(乙二醇)；CCD，电荷耦合装置；MGBG，甲基乙二醛双(脒基腙)；CGP48664A，4-脒基茚-1-酮-2′-脒腙；MAOEA，5′-脱氧-5′-[N-甲基-N-[(2-氨基氧基)乙基]氨基]腺苷；MHZPA，5′-脱氧-5′-[N-甲基-N-(3-肼基丙基)氨基]腺苷；Hepes，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸；IPTG，异丙基-1-硫基-β-D-吡喃半乳糖苷；DTT，二硫苏糖醇；EDTA，乙二胺四乙酸。

    具体来说，本发明关于下式所示的化合物：

    

    其医药学上可接受的盐、其溶剂化物和其前药；其中R₁和R₂各自个别地选自由H和烷基组成的群组；R₃选自由H、烷基、NR₁R₂、OR₁R₂、芳基、杂芳基、卤基和CF₃组成的群组；R₄选自由NR₇R₈和SR₁R₂组成的群组；R₇和R₈各自个别地选自由H、烷基、(CH₂)_nNR₁R₂、(CH₂)_nCONR₁R₂和(CH₂)_nC＝ONR₁R₂组成的群组；其中n为1到8的整数；并且R₅和R₆各自个别地选自由H和酰基组成的群组。

    本发明还关于医药组合物，其包含有效量的如上所揭示的化合物或其医药学上可接受的盐，或其溶剂化物，或其前药，以及医药学上可接受的载剂。

    本发明另一方面涉及抑制有需要的宿主的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶，其包含对所述宿主投予有效量的上述化合物、其医药学上可接受的盐、其溶剂化物或其前药。

    本发明另一方面关于治疗罹患寄生虫感染或由卡氏肺孢子虫(Pneumocystis cainii)引起的感染的宿主。

    所属领域技术人员将易于从以下实施方式而对本发明的其它目的和优势显而易见，在以下实施方式中将简单地借助于说明预期的最佳模式展示和描述优选实施例。如将意识到，本发明能够具有其它和不同实施例，并且在不偏离本发明的情况下，可对各个明显方面的多处细节进行修改。因此，所述描述应实际上视为说明而非限制。

    【附图说明】

    图1A描绘在活性位点具有MeAdoMet的hAdoMetDC的实际晶体结构。

    图1B描绘通过将MeAdoMet在AdoMetDC活性位点的模型(以较深的形状显示)叠加到所述实际晶体结构(以较亮的阴影显示)上得到的结构。

    图2A和2B分别描述hAdoMetDC F223A与MeAdoMet的复合物以及hAdoMetDCF7A与MeAdoMet的复合物的模型。

    图3描绘MeAdoMet在AdoMetDC F223A突变体的活性位点中的晶体结构。

    图4绘示hAdoMetDC的潜在抑制剂的结构。

    图5描绘hAdoMetDC与所述酶的两种抑制剂的相互作用。

    【具体实施方式】

    本发明关于下式所示的化合物：

    

    其医药学上可接受的盐、其溶剂化物和其前药；其中R₁和R₂各自个别地选自由H和烷基组成的群组；R₃选自由H、烷基、NR₁R₂、OR₁R₂、芳基、杂芳基、卤基和CF₃组成的群组；R₄选自由NR₇R₈和SR₁R₂组成的群组；R₇和R₈各自个别地选自由H、烷基、(CH₂)_nNR₁R₂、(CH₂)_nCONR₁R₂和(CH₂)_nC＝ONR₁R₂组成的群组；其中n为1到8的整数；并且R₅和R₆各自个别地选自由H和酰基组成的群组。

    下文将列出用于描述本发明的各个术语的定义。当术语在本说明书全篇中独立使用，或作为较大基团的一部分使用时，除非在特定情况中另作限定，否则这些定义适用于所述术语。另外，在本文描述和主张的各结构式中，预期当任一符号在一个特定结构式或取代基中出现不止一次时，其在一种情形中的含义与在另一情形中的含义无关。

    “有效量”是指可治疗有效地增强药剂的功效的本文所述化合物的量。这些所需要的化合物的确切剂量将随所用特定化合物或衍生物、待治疗个体的年龄和病状以及病状的性质和严重程度而变化。然而，所属领域技术人员在理解本发明后，可在不进行过多实验的情况下确定有效量。

    “医药学上可接受”是指在合理医学判断的范围内，适于与人类和动物组织接触使用而无不当毒性、刺激、过敏反应或其它问题并发症，且与合理的效益/风险比相符的化合物、材料、组合物和/或剂型。

    “医药学上可接受的盐”是指所述化合物的衍生物，其中通过制备母体化合物的酸或碱盐来对其进行修饰。医药学上可接受的盐的实例包括(但不限于)碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱金属或有机盐，等等。医药学上可接受的盐包括例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。用于形成此类盐的典型无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、连二磷酸等。也可使用衍生自有机酸的盐，所述有机酸例如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸和羟基烷二酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸。由此，所述医药学上可接受的盐包括乙酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、溴化物、异丁酸盐、苯基丁酸盐、β-羟基丁酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，4-二酸盐、癸酸盐(cabrate)、辛酸盐、氯化物、肉桂酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、异烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、焦硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磺酸盐、苯磺酸盐、对溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、甲磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐等。

    常用于形成盐的碱包括氢氧化铵以及碱金属和碱土金属氢氧化物、碳酸盐，以及脂肪族和伯胺、仲胺和叔胺、脂肪族二胺。特别适用于制备加成盐的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾、甲胺、二乙胺和乙二胺。

    “前药”是在体内转化成具有医学作用的活性形式的化合物。当活性药物毒性过高而无法全身投药；消化道对活性药物的吸收不良；或在活性药物到达其靶之前就被身体分解时，可使用前药。前药的制备方法揭示于汉斯·邦德加德(Hans Bundgaard)，前药的设计(Design of Prodrugs)(爱思维尔科学出版社B.V.(Elsevier Science Publishers B.V.)，1985)中，所述文献是以全文引用的方式并入本文中。

    具有各种氮官能团(氨基、羟氨基、肼基、胍基、脒基、酰胺等)的化合物的前药形式可包括以下各类衍生物，其中R基团可各独立地为氢、经取代或未经取代的烷基、芳基、烯基、炔基、杂环基、烷基芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基或环烯基(如上文所定义)。

    羧酰胺，-NHC(O)R

    氨基甲酸酯，-NHC(O)OR

    氨基甲酸(酰氧基)烷酯，NHC(O)OROC(O)R

    烯胺，-NHCR(＝CHCRO₂R)或-NHCR(＝CHCRONR₂)

    希夫碱，-N＝CR₂

    曼尼希碱(Mannich Base)(来自羧酰亚胺化合物)，RCONHCH₂NR₂

    所述前药衍生物的制备论述于各文献来源(实例为：亚历山大(Alexander)等人，药物化学杂志(J.Med.Chem.)1988，31，318；艾利格斯-马丁(Aligas-Martin)等人，PCT WOpp/41531，第30页)中。在制备这些衍生物的过程中转化的氮官能团为本发明化合物的一个(或多个)氮原子。

    本发明的含羧基化合物的前药形式包括酯(-CO₂R)，其中R基团对应于任何醇，其在体内通过酶或水解过程而以医药学上可接受的水平释放。

    衍生自本发明的羧酸形式的另一前药可为博德(Bodor)等人，药物化学杂志(J.Med.Chem.)1980，23，469中所述的季盐型结构。

    

    当然，除非另作说明，否则应了解本发明化合物涉及所述分子中的各个可能原子的所有光学异构体和立体异构体。

    “溶剂化物”是指由溶剂与溶质相互作用形成的化合物，并且包括水合物。溶剂化物一般为在晶体结构中含有化学计量或非化学计量比例的溶剂分子的结晶固体加合物。

    术语“卤素”或“卤基”是指氟、氯、溴和碘。

    术语“芳基”是指在环部分中具有6到12个碳原子的单环或双环芳香族烃基，例如苯基、萘基、联苯基和二苯基，其各自可经取代。芳香族基团或芳基较为常见为苯基和经烷基取代的芳香族基团(芳烷基)，例如苯基C_1-3烷基和苯甲基。

    术语“芳烷基”或“烷基芳基”或“烷芳基(alaryl)”是指直接经由烷基键结的芳基，例如苯甲基或苯乙基。

    术语“经取代芳基”或“经取代烷基芳基”是指经例如1到4个取代基(例如烷基、经取代烷基、卤基和烷氧基)取代的芳基或烷基芳基。“经取代苯甲基”是指经例如上文关于经取代芳基所列的任一基团取代的苯甲基。

    术语“烷基”是指具有1到20个碳原子并且更通常具有1到8个碳原子的直链或分支链未经取代的烃基，并且甚至更通常为具有1到4个碳原子的未经取代的烷基。合适烷基的实例包括甲基、乙基和丙基。分支链烷基的实例包括异丙基和叔丁基。

    术语“杂芳基”是指在环中具有至少一个杂原子和至少一个碳原子的任选取代的不饱和芳香族环基，例如其为4到7元单环、7到11元双环，或10到15元三环系统。杂环基含杂原子的各个环可具有1、2或3个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，其中氮和硫杂原子还可任选经氧化，并且氮杂原子还可任选经季铵化。杂环基可在任一杂原子或碳原子处连接。杂芳基的实例包括(但不限于)吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、噻吩、呋喃和异吡咯。杂芳香族部分可如上文关于芳基所述任选经取代，包括经一个或多个选自烷氧基、卤基和烷基的取代基取代。

    典型脂肪族酰基含有1到6个碳原子并且包括甲酰基、乙酰基和丙酰基。

    本发明化合物可利用以下方案制备。

    方案1提供所用前体核苷系列3和4以及其合成方法。

    方案1

    

     ^a(CH₃)₄S_n或(CH₃CH₂)₄Sn，HMDS/二噁烷，NMP，(Ph₃P)₄Pd，110℃；^bCH₃NH₂，MeOH，110℃；^cC₈H₅B(OH)₂，K₂CO₃，(Ph₃P)₄Pd，1，2-DME·H₂O(2∶1)，90℃；^dSOCl₂，CH₃CN/吡啶，O℃-RT，NH₄OH，RT；^eMsCl，吡啶，0℃；^f33％CH₃NH₂，EtOH，RT(4e，f，g)或80℃(4a-d)；^gNaOMe/MeOH，RT

    在C-5′处具有氨基氧基烷基氨基侧链的目标化合物是使用方案2中所示的两种不同途径制备。在利用2′，3′-O-亚异丙基进行保护的初始顺序中，通过用所需胺置换甲苯磺酰基，产生羟烷基氨基前体10。使用N-羟基邻苯二甲酰亚胺、三苯膦和DEAD，³⁸制备氨基氧基前体11，随后在酸性条件下，将其转化成所需目标化合物12。随后发现，首先产生氨基氧基前体N-(2-溴乙氧基)乙酰亚胺乙酯⁴⁸和N-(N-4-溴丁氧基)乙酰亚胺乙酯⁴⁹(方案2)更为有效，其可通过用5′-甲氨基-5′-脱氧核苷进行卤化物置换侧接至C-5′，由此制得产物系列6和8。此置换反应是在核苷上具有亚异丙基保护基的情况下进行。后来确定在没有保护基的情况下，所述反应也能进行或更好地进行。借助于上述方式，制备出目标化合物7a-c和9a-f。

    方案2

    

     ^aCH₃(OEt)C＝NO(CH₂)₂Br(参看48)，DMF，DIEA，50℃；^b1NH₂SO₄，RT；^cCH₃(OEt)C＝NO(CH₂)₄Br(参看49)，DMF，DIEA，60℃；^d2-(甲氨基乙醇)，RT；^eN-羟基邻苯二甲酰亚胺，PPh₃，DEAD，THF(参看38)，RT；^f1N H₂SO₄，60℃

    如方案3中所示，以类似程序制备所有酰胺和酰肼。用适当的ω-氯酯处理5′-甲氨基-5′-脱氧核苷，随后用氨或肼处理。如果涉及亚异丙基，则在酸脱保护步骤中将其去除。以此方式，制备出具有两种不同的键联基长度和各种8-取代基的目标化合物13d-f、j-m。

    方案3

    

     ^aCl(CH₂)_n CO₂Et(n＝1或2)，DMF，DIEA，60℃；^bNH₃/MeOH，RT；^c1NH₃SO₄，RT；^d NH₂NH₂，H₂O，EtOH，回流在C-5′处具有氨基烷基氨基侧链的目标化合物主要是通过用不对称胺置换C-5′离去基制备得到(方案4)。举例来说，用3-甲氨基乙胺处理3a，得到14f与15d的混合物，将其分离得到纯14f，即所需目标化合物。在此程序涉及具有亚异丙基的起始物质的情况下，用酸处理，得到所需终产物。在早期的工作中，通过用3-溴丙基邻苯二酰亚胺处理5′-甲氨基-5′-脱氧核苷，随后进行两个脱保护步骤，制备出化合物17c，d。

    方案4

    

     ^aCH₃NH(CH₂)_nNH₂(n＝1或2)，RT；^b1NH₂SO₄，RT；^c3-溴丙基邻苯二甲酰亚胺，DMF，DIEA，60℃；^dNH₂NH₂，H₂O，回流；^e1H-吡唑-1-甲脒·HCI(参看50)，DMF，DIEA，RT；^f3-(甲氨基)丙腈，RT(参看51)；^gNH₂OH·HCl，MeOH，DMF，KOH，RT

    基于氨基烷基氨基侧链，14e与1-甲脒基吡唑⁵⁰反应，得到目标胍18a。在相关顺序中，通过用3-(甲氨基)丙腈处理3j得到腈18b，⁵¹在碱性条件下用羟胺盐酸盐处理，制备出目标酰胺肟(amidoxime)18c。

    5′-二甲氨基和5′-二甲基锍基化合物19a，b和21a-d都是通过常规方法制备(方案5)。通过用二甲胺置换3a或3g⁴³上的5′-氯，来引入二甲氨基。用溴甲烷处理5′-甲基硫基化合物20a，b制得21a和21c。利用离子交换制备氯化物盐21b和21d。通过用硫代甲醇钠置换3a中的5′-氯，制备出8-甲基-5′-甲基硫基核苷20a。

    方案5

    

     ^a(CH₃)₂NH，2M的MeOH溶液，90℃；^bCH₃SNa，DMF，RT；

     ^cCH₃Br，Et₂O，HCO₂H，HOAc，RT；^dIRA-400(CI^-)离子交换树脂

    提供以下非限制性实例以进一步说明本发明。

    实例1

    5′-氯-5′-脱氧-8-甲基腺苷(3a)。向经搅拌的2a⁴⁰(892mg，3.17mmol)于在冰浴中冷却的无水吡啶(501mg，0.51mL，6.33mmol)和CH₃CN(2.5mL)中的悬浮液中缓慢添加SOCl₂(1.88g，1.15mL，15.80mmol)。在0-5℃下持续搅拌3到4小时，随后升温到环境温度过夜。在真空中浓缩所得悬浮液。向此反应混合物中添加甲醇(20mL)、水(2mL)和NH₄OH(4mL)，随后在室温下搅拌0.5小时。将反应混合物浓缩至干。将化合物溶解于MeOH中，添加硅胶(3g)，随后去除溶剂。将硅胶上的混合物倒于填充有硅胶的柱上，并用氯仿∶甲醇(7∶1)洗脱。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量661mg(70％)；MS m/z 300(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.09(bs，1H，H-2)，7.15(bs，2H，6-NH₂)，5.81(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.7Hz)，5.49(d，1H，2′OH，J_2′-2′OH＝6.1Hz)，5.45(d，1H，3′OH，J_3′-3′OH＝5.3Hz)，5.13(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.7Hz，J_2′，3′＝4.8Hz，J_2′-2′OH＝6.1Hz)，4.31(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝4.8Hz，J_3′，4′＝4.0Hz，J_3′-3′OH＝5.3Hz)，4.03-4.10(bm，1H，H-4′)，3.93-3.99(m，1H，5′-CH₂)，3.82-3.88(m，1H，5′-CH₂)，2.55(s，3H，8-CH₃)。

    实例2

    5′-氯-5′-脱氧-8-乙基腺苷(3b)。本程序与上文关于3a所报导的相同，使用2b⁴⁰(1.28g，4.33mmol)、吡啶(685mg，0.70mL，8.65mmol)、CH₃CN(10mL)和SOCl₂(2.57g，1.58mL，21.60mmol)进行：产量498mg(37％)；MS m/z 314(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.09(bs，1H，H-2)，7.14(bs，2H，6-NH₂)，5.80(d，1H，H-1′，J_1′，2′.＝5.7Hz)，5.48(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝6.1Hz)，5.45(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝5.4Hz)，5.20(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.7Hz，J_2′，.3′＝4.6Hz，J_2′-2′OH＝6.1Hz)，4.30-4.37(bm，1H，H-3′)，4.03-4.10(bm，1H，H-4′)，3.94-4.0(m，1H，5′-CH₂)，3.83-3.89(m，1H，5′-CH₂)，2.89(q，2H，8-CH₂CH₃)，1.31(t，3H，8-CH₂CH₃)。

    实例3

    5′-氯-5′-脱氧-8-(甲氨基)腺苷(3c)。利用与关于制备3a所述相同的程序，使用2c⁴¹(2.9g，9.78mmol)、吡啶(1.54g，1.57mL，19.46mmol)、CH₃CN(5mL)和SOCl₂(5.82g，3.56mL，48.91mmol)制备化合物3c：产量1.95g(63％)；MS m/z 315(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.91(bs，1H，H-2)，)，6.78(q，1H，8CH₃-NH)，6.50(bs，2H，6-NH₂)，5.70(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.0Hz)，5.41(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝5.6Hz)，5.32(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝5.3Hz)，5.18(ddd，1H，H-2′，J_1′，2＝5.0Hz，J_2′，3′＝5.4Hz，J_2′-2′OH＝5.6Hz)，4.33(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.4Hz，J_3′，4′＝4.4Hz，J_3′-3′OH＝5.3Hz)，)，3.91-4.02(bm，2H，H-4′，5′-CH₂)，3.76-3.82(m，1H，5′-CH₂)，2.88(d，3H，8NH-CH₃，J＝4.5Hz)。

    实例4

    5′-氯-5′-脱氧-8-苯基腺苷(3d)。使用关于3a所述的程序，由2d⁴²(4.5g，13.10mmol)、吡啶(2.07g，2.12mL，26.2mmol)、CH₃CN(6mL)和SOCl₂(7.79g，4.78mL，65.47mmol)制备3d：产量2.21g(47％)；MS m/z 362(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.20(s，1H，H-2)，7.71-7.76(m，2H，8-苯基邻-H)，7.59-7.64(m，3H，8-苯基间-H和对-H)，7.40(bs，2H，6-NH₂)，5.75(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.0Hz)，5.52(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝5.6Hz)，5.39-5.44(m，2H，H-2′，3′-OH)，4.33(bs，1H，H-3′)，3.98-4.06(bm，2H，H-4′，5′-CH₂)，3.88-3.94(m，2H，5′-CH₂)。

    实例5

    5′-脱氧-5′-甲氨基-8-甲基腺苷(4a)。在钢制反应釜中，将3a(660mg，2.20mmol)于33％甲胺/乙醇溶液(30mL)中的混合物在90℃下加热2天。将反应混合物浓缩至干，并利用柱色谱分离法(用4∶1∶0.3的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量294mg(45％)；MS m/z 295(M+H)+；¹HNMR(DMSO-d₆)68.08(bs，1H，H-2)，7.14(bs，2H，6-NH₂)，5.72(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.5Hz)，5.30(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝6.3Hz)，5.17(bd，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝3.5Hz)，5.01(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝6.5Hz，J_2′，3′＝5.5Hz，J_2′-2′OH＝6.3Hz)，4.16(bs，1H，H-3′)，3.96-4.0(m，1H，H-4′)，2.64-2.77(bm，2H，5′-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.29(s，3H，5′NH-CH₃)。

    实例6

    5′-脱氧-5′-甲氨基-8-乙基腺苷(4b)。本程序与上文关于4a所报导相同，使用3b(1.00g，3.18mmol)和33％甲胺/乙醇溶液(30mL)进行。柱色谱分离法(用5∶1∶0.3的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)后，获得玻璃状黄色固体：498mg(50％)；MS m/z 309(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(bs，1H，H-2)，7.13(bs，2H，6-NH₂)，5.70(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.6Hz)，5.30(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝6.4Hz)，5.16(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝4.5Hz)，5.08(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝6.6Hz，J_2′，3′＝5.4Hz，J_2′-2′OH＝6.4Hz)，4.14-4.18(m，1H，H-3′)，3.96-4.0(m，1H，H-4′)，2.88(q，2H，8-CH₂CH₃)，2.64-2.78(m，2H，5′-CH₂)，2.29(s，3H，5′NH-CH₃)，1.30(t，3H，8CH₂CH₃)。

    实例7

    5′-脱氧-5′，8-双(甲氨基)腺苷(4c)。利用与关于制备4a所述相同的程序，使用3c(1.00g，3.17mmol)和33％甲胺/乙醇溶液(30mL)制备化合物4c。柱色谱分离法(用7∶1∶0.4的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)后，获得玻璃状黄色固体：505mg(51％)；MS m/z 310(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.89(bs和q，2H，H-2和8CH₃-NH)，6.44(bs，2H，6-NH₂)，5.84(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝7.0Hz)，5.22(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝6.4Hz)，5.12(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝4.0Hz)，4.66(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝7.0Hz，J_2′，3′＝5.4Hz，J_2′-2′OH＝6.4Hz)，4.14(bm，1H，H-3′)，3.94-4.0(bm，1H，H-4′)，2.90(d，3H，8NH-CH₃，J＝4.4Hz)，2.77-2.83(m，1H，5′-CH₂)，2.57-2.62(m，1H，5′-CH₂)，2.35(s，3H，5′NH-CH₃)。

    实例8

    5′-脱氧-5′-甲氨基-8-苯基腺苷(4d)。利用与关于制备4a所述相同的程序，使用3d(2.00g，5.52mmol)和33％甲胺/乙醇溶液(40mL)制备化合物4d。柱色谱分离法(用4∶1∶0.2的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)后，获得玻璃状黄色固体：963mg(49％)；MS m/z 357(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.19(s，1H，H-2)，7.72-7.76(m，2H，8-苯基邻-H)，7.58-7.61(m，3H，8-苯基间-H和对-H)，7.40(bs，2H，6-NH₂)，5.70(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.4Hz)，5.38(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝6.2Hz)，5.29(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝6.4Hz，J_2′，3′＝5.1Hz，J_2′-2′OH＝6.2Hz)，5.14(bs，1H，3′-OH)，4.19(bs，1H，H-3′)，3.95-4.0(m，1H，H-4′)，2.82(d，2H，5′-CH₂，J＝5.2Hz)，2.34(s，3H，5′NR-CH₃)。

    实例9

    5′-脱氧-5′-[[2-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]乙基]甲氨基]-8-甲基腺苷(6a)。在氮气下，于50℃下将化合物4a(416mg，1.41mmol)、N-(2-溴乙氧基)乙酸酰胺乙酯⁴⁸(350mg，1.66mmol)和DIEA(11mg，0.014mL，0.085mmol)于DMF(5mL)中的混合物加热过夜。将反应混合物浓缩至干。利用柱色谱分离法(用7∶1∶0.1的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化所得浆液。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥，得到玻璃状黄色粘性固体：产量50mg(8％)；MS m/z 424(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.07(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，6-NH₂)，5.73(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.5Hz)，4.31(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝6.3Hz)，5.15(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝5.5Hz)，5.04(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.5Hz，J_2′，3′＝5.1Hz，J_2′-2′OH＝6.3Hz)，4.13(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.1Hz，J_3′，4′＝4.7Hz，J_3′-3′OH＝5.5Hz)，3.92(q，2H，CH₂CH₃)，3.88(t，2H，NO-CH₂)，2.72-2.78(m，1H，5′-CH₂)，2.56-2.62(m，4H，5′-CH₂，H-4′，N(CH₃)-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.21(s，3H，N-CH₃)，1.83(s，3H，C-CH₃)，1.19(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例10

    5′-脱氧-5′-[[2-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]乙基]甲氨基]-8-(甲氨基)腺苷(6b)。利用与关于6a所报导相同的程序，使用4c(500mg，1.61mmol)、N-(2-溴乙氧基)乙酰胺乙酯⁴⁸(407mg，1.93mmol)、DIEA(104mg，0.14mL，0.80mmol)和DMF(5mL)制备化合物6b。柱色谱分离法(用7∶1∶0.3的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)后，获得玻璃状黄色粘性固体：产量209mg(30％)；MS∶m/z 439(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.89(s，1H，H-2)，6.85(q，1H，8CH₃-NH)，647(bs，2H，6-NH₂)，5.69(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.0Hz)，5.27(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝5.5Hz)，5.06(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝5.0Hz)，4.88(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.0Hz，J_2′，3′＝5.8Hz，J_2′-2′OH＝5.5Hz)，4.17(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.8Hz，J_3′，4′＝4.7Hz，J_3′-3′OH＝5.0Hz)，3.86-3.95(m，3H，H-4′，NO-CH₂)，3.92(q，2H，CH₂CH₃)，2.88(d，3H，8NH-CH₃，J＝4.6Hz)，2.71-2.77(m，1H，5′-CH₂)，2.56-2.67(m，3H，5′-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.24(s，3H，N-CH₃)，1.83(s，3H，C-CH₃)，1.19(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例11

    5′-脱氧-5′-[[2-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]乙基]甲氨基]-8-苯基腺苷(6c)。使用关于6a所述的程序，由4d(400mg，1.12mmol)、N-(2-溴乙氧基)乙酰胺乙酯⁴⁸(283mg，1.34mmol)和DIEA(72mg，0.10mL，0.55mmol)制备6c。柱色谱分离法(用7∶1的氯仿∶甲醇洗脱)后，获得玻璃状黄色粘性固体：产量105mg(20％)；MS：m/z 486(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.17(s，1H，H-2)，7.72-7.78(m，2H，8-苯基邻-H)，7.58-7.63(m，3H，8-苯基间-H和对-H)，7.36(bs，2H，6-NH₂)，5.67(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.2Hz)，5.29-5.34(m，2H，2′-OH，H-2′)，5.13(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝5.3Hz)，4.14-4.18(m，1H，H-3′)，3.88-3.97(m，3H，H-4′，NO-CH₂)，3.92(q，2H，CH₂CH₃)，2.78-2.84(m，1H，5′-CH₂)，2.60-2.70(m，3H，5′-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.24(bs，3H，N-CH₃)，1.83(s，3H，C-CH₃)，1.19(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例12

    5′-[(2-氨基氧基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷硫酸盐(2.2∶1的盐)(7a)。将化合物6a(50mg，0.11mmol)溶解于2mL 2N H₂SO₄中，并在室温下搅拌2天。用NaHCO₃中和反应混合物，并冻干。用EtOH(2×10mL)萃取化合物，并浓缩至干。利用柱色谱分离法(硅胶230-400目，用7∶1∶0.3的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化残余物。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥。将产物溶解于3mL EtOH中并逐滴添加2N H₂SO₄。过滤沉淀析出的所得硫酸盐，并用EtOH洗涤。将此具有吸湿性的产物溶解于水(2mL)中，并冻干，得到白色固体：产量20mg(29％)；MS：m/z 354(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.25(s，1H，H-2)，7.80(bs，2H，O-NH₂)，5.87(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.7Hz)，4.88(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.2Hz)，4.35-4.40(bm，1H，H-4′)，4.23(t，1H，H-3′，J_2′，3′＝3.2Hz)，4.10(t，2H，NH₂O-CH₂)，3.50-3.57(m，1H，5′-CH₂)，3.65-3.72(m，1H，5′-CH₂)，3.45(bm，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.85(s，3H，N-CH₃)，2.58(s，3H，8-CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，274(ε15,200)，pH 7，276(ε15,500)，pH 13，277(ε15,900)。分析(C₁₄H₂₃N₇O₄.2.2H₂SO₄.0.1C₂H₅OH.0.5H₂O)C，H，N。

    实例13

    5′-[(2-氨基氧基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-(甲氨基)腺苷硫酸盐(2.1∶1的盐)(7b)。使用关于7a所述的程序，由6b(200mg，0.45mmol)制备7b：产量125mg(46％)；MS：m/z 369(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.16(s，1H，H-2)，7.50-7.65(bm，2H，O-NH₂)，5.83(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.3Hz)，6.56(bs，2H，6-NH₂)，4.96(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝4.8Hz)，4.28-4.35(bm，1H，H-4′)，4.25(t，1H，H-3′，J_2′，3′＝4.1Hz)，3.96(t，2H，NH₂O-CH₂)，3.59-3.66(m，1H，5′-CH₂)，3.49-3.57(m，1H，5′-CH₂)，3.36-3.40(bm，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.94(s，3H，8NH-CH₃)，2.81(s，3H，N-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，274(ε14,300)，pH 7，276.7(ε17,100)，pH 13，276.1(ε17,500)。分析(C₁₄H₂₄N₈O₄.2.1H₂SO₄.0.3C₂H₅OH.0.2H₂O)C，H，N，S。

    实例14

    5′-[(2-氨基氧基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-苯基腺苷硫酸盐(2∶1的盐)(7c)。利用与关于制备7a所述相同的程序，使用6c(99mg，0.20mmol)制备化合物7c：产量57mg(42％)；MS：m/z 416(M+H)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.37(s，1H，H-2)，7.73-7.76(m，2H，8-苯基邻-H)，7.60-7.70(m，3H，8-苯基间-H和对-H)，6.02(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.7Hz)，5.25(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝4.9Hz)，4.46-4.54(bm，2H，H-3′，4′)，4.03(t，2H，NH₂O-CH₂)，3.87-4.0(m，1H，5′-CH₂)，3.61-3.67(m，1H，5′-CH₂)，3.50-3.55(m，2H，N(CH₃)-CH₂)，3.0(s，3H，N-CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，275(ε21,600)，pH 7，275(ε17,100)，pH 13，274.4(ε16,800)。分析(C₁₉H₂₅N₇O₄.2.0H₂SO₄.3H₂O)C，H，N，S。

    实例15

    5′-脱氧-5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-8-(甲氨基)腺苷(8a)。利用与关于6a所报导相同的程序，使用4c(1.00g，3.23mmol)、N-(4-溴丁氧基)乙酰亚胺乙酯⁴⁹(924mg，3.87mmol)和DIEA(209mg，0.28mL，1.6mmol)制备化合物8a：产量635mg(42％)；MS：m/z 467(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.89(s，1H，H-2)，6.87(q，1H，8CH₃-NH)，646(bs，2H，6-NH₂)，5.69(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝4.8Hz)，5.25(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝5.6Hz)，5.06(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝5.4Hz)，4.91(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝4.8Hz，J_2′，3′＝5.4Hz，J_2′-2′OH＝5.6Hz)，4.16(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.4Hz，J_3′，4′＝4.9Hz，J_3′-3′OH＝5.4Hz)，3.85-3.94(m，1H，H4′)，3.92(q，2H，OCH₂CH₃)，3.80(t，2H，NO-CH₂)，2.88(d，3H，8NH-CH₃，J＝4.6Hz)，2.65-2.74(m，1H，5′-CH₂)，2.46-2.58(m，1H，5′-CH₂)，2.34(t，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.17(s，3H，N-CH₃)，1.83(s，3H，C-CH₃)，1.37-1.61(bm，4H，NOCH₂-CH₂CH₂)，1.19(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例16

    5′-脱氧-5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-8-苯基腺苷(8b)。使用与关于6a所述相同的程序，由4d(450mg，1.26mmol)、N-(4-溴丁氧基)乙酰亚胺乙酯⁴⁹(360mg，1.51mmol)和DIEA(81mg，0.10mL，0.62mmol)制备8b。柱色谱分离法(用7∶1的氯仿∶甲醇洗脱)后，获得玻璃状黄色粘性固体：产量312mg(48％)；MS：m/z 514(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.17(s，1H，H-2)，7.71-7.78(m，2H，8-苯基邻-H)，7.58-7.64(m，3H，8-苯基间-H和对-H)，7.36(bs，2H，6-NH₂)，5.67(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.7Hz)，5.32(bs，1H，2′-OH)，5.31(t，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.7Hz，J_2，3＝5.4Hz)，5.11(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝4.8Hz)，4.16(bddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.4Hz，J_3′，4′＝4.0Hz)，3.92-3.97(m，1H，H-4′)，3.91(q，2H，OCH₂CH₃)，3.79(t，2H，NO-CH₂)，2.72-2.80(m，1H，5′-CH₂)，2.54-2.59(m，1H，5′-CH₂)，2.34(bt，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.17(bs，3H，N-CH₃)，1.83(s，3H，C-CH₃)，1.39-1.60(bm，4H，NOCH₂-CH₂CH₂)，1.18(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例17

    5′-脱氧-5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-8-氧代腺苷(8c)。使用关于6a所述的程序，由4i⁴⁵(500mg，1.68mmol)、N-(4-溴丁氧基)乙酰亚胺乙酯⁴⁹(481mg，2.01mmol)、DIEA(109mg，0.14mL，0.84mmol)和DMF(5mL)制备8c。柱色谱分离法(用4∶1∶0.2的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)后，获得玻璃状黄色粘性固体：产量200mg(26％)；MS：m/z 454(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ10.34(bs，1H，8-OH)，8.02(s，1H，H-2)，6.49(bs，2H，6-NH₂)，5.62(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.0Hz)，4.99(bs，1H，3′-OH)，5.19(bs，1H，2′-OH)，4.90(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.4Hz)，4.16-4.24(bm，1H，H-3′)，3.83-3.89(m，1H，H-4′)，3.92(q，2H，OCH₂CH₃)，3.77(t，2H，NO-CH₂)，2.62-3.68(m，1H，5′-CH₂)，2.40-2.46(m，1H，5′-CH₂)，2.30(t，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.13(s，3H，N-CH₃)，1.84(s，3H，C-CH₃)，1.35-1.60(bm，4H，NOCH₂-CH₂CH₂)，1.21(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例18

    5′-脱氧-2′，3′-亚异丙基-5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-8-甲基腺苷(8d)。利用与关于6a所报导相同的程序，使用4e(1.00g，3.11mmol)、MsCl(392mg，0.26mL，3.42mmol)、甲胺(25mL)、N-(4-溴丁氧基)乙酰亚胺乙酯(853mg，3.58mmol)、DIEA(200mg，0.27mL，1.54mmol)和DMF(8mL)制备化合物8d。柱色谱分离法(95∶5的氯仿∶甲醇)后，获得玻璃状固体：产量176mg(12％)；MS：m/z492(M+H)⁺；¹HNMR(CDCl₃)δ8.27(s，1H，H-2)，5.99(d，1H，H-1′，J_1，2＝1.8Hz)，5.75(dd，1H，H-2′，J_1，2＝1.8Hz，J_2，3＝6.4Hz)，5.39(bs，2H，6-NH₂)，5.08(dd，1H，H-3′，J_2，3＝6.4Hz，J_3，4＝3.5Hz)，4.27-4.34(m，1H，H-4′)，4.0(q，2H，OCH₂CH₃)，3.84(t，2H，NO-CH₂)，2.64(s，3H，8-CH₃)，2.55-2.61(m，1H，5′-CH₂)，2.45-2.55(m，1H，5′-CH₂)，2.29-2.34(m，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.21(s，3H，N-CH₃)，1.91(s，3H，C-CH₃)，1.61和1.40(2s，6H，C(CH₃)₂)，1.51-1.60(m，2H，NOCH₂-CH₂)，1.37-1.45(m，2H，N(CH₃)CH₂-CH₂)，1.27(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例19

    5′-脱氧-2′，3′-亚异丙基-5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-8-乙基腺苷(8e)。使用关于6a所述的程序，由4f(1.00g，2.98mmol)、MsCl(375mg，0.25mL，3.27mmol)、甲胺(25mL)、N-(4-溴丁氧基)乙酰亚胺乙酯(852mg，3.57mmol)、DIEA(192mg，0.25mL，1.48mmol)和DMF(10mL)制备8e。柱色谱分离法(95∶5的氯仿∶甲醇)后，获得玻璃状固体：产量159mg(11％)；MS：m/z506(M+H)⁺；¹HNMR(CDCl₃)δ8.27(s，1H，H-2)，5.99(d，1H，H-1′，J_1，2＝2.0Hz)，5.73(dd，1H，H-2′，J_1，2＝2.0Hz，J_2，3＝6.4Hz)，5.40(bs，2H，6-NH₂)，5.09(dd，1H，H-3′，J_2，3＝6.4Hz，J_3，4＝3.6Hz)，4.26-4.33(m，1H，H-4′)，4.0(q，2H，OCH₂CH₃)，3.84(t，2H，NO-CH₂)，2.91-2.99(m，2H，8-Et的CH₂)，2.59-2.65(m，1H，5′-CH₂)，2.46-2.53(m，1H，5′-CH₂)，2.30-2.35(m，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.21(s，3H，N-CH₃)，1.91(s，3H，C-CH₃)，1.61和1.40(2s，6H，C(CH₃)₂)，1.51-1.59(m，2H，NOCH₂-CH₂)，1.49-1.38(m，2H，N(CH₃)CH₂-CH₂)，1.43(s，3H，8-Et的CH₃)，1.27(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例20

    5′-脱氧-2′，3′-亚异丙基-5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-腺苷(8f)。利用与关于6a所报导相同的程序，使用4g⁴³(1.00g，3.25mmol)、MsCl(447mg，0.30mL，3.90mmol)、甲胺(25mL)、N-(4-溴丁氧基)乙酰亚胺乙酯(511mg，2.15mmol)、DIEA(125mg，0.17mL，0.96mmol)和DMF(5mL)制备化合物8f。柱色谱分离法(95∶5的氯仿∶甲醇)后，获得浅黄色浆液：产量839mg(86％)；MS∶m/z 478(M+H)⁺；¹HNMR(CDCl₃)δ8.36(s，1H，H-2)，7.96(s，1H，H-8)，6.07(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝2.2Hz)，5.60(bs，2H，6-NH₂)，5.49(dd，1H，H-2′，J_1′，2′＝2.2Hz，J_2′，3′＝6.4Hz)，4.95(dd，1H，H-3′，J_2′，3′＝6.4Hz，J_3′，4′＝3.4Hz)，4.36-4.40(m，1H，H-4′)，4.0(q，2H，OCH₂CH₃)，3.86(t，2H，NO-CH₂)，2.61(dd，1H，5′-CH₂)，2.55(dd，1H，5′-CH₂)，2.38(bt，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.26(s，3H，N-CH₃)，1.91(s，3H，C-CH₃)，1.61和1.40(2s，6H，C(CH₃)₂)，1.55-1.61(m，2H，NOCH₂-CH₂)，1.44-1.52(m，2H，N(CH₃)CH₂-CH₂)，1.27(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例21

    5′-[(4-氨基氧基丁基)甲氨基]-5′-脱氧-8-(甲氨基)腺苷硫酸盐(0.4∶1的盐)(9a)。使用与用于制备7a相同的程序，使用8a(600mg，1.28mmol)和2NH₂SO₄(10mL)制备9a：产量514mg(87％)；MS：m/z 510(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.91(s，1H，H-2)，6.88(bq，1H，8CH₃-NH)，6.50(bs，2H，6-NH₂)，5.72(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.1Hz)，5.08-5.39(bm，2H，2′，3′-OH)，4.0-5.02(m，1H，H-2′)，4.19(t，1H，H-3′)，3.94-4.06(bm，1H，H-4′)，3.45(bt，2H，NH₂O-CH₂)，3.36-3.54(m，2H，5′-CH₂)，2.89(d，3H，8NH-CH₃)，2.78-2.95(bm，2H，NCH₃-CH₂)，2.04(bs，3H，N-CH₃)，1.38-1.52(bm，4H，NH₂OCH₂-CH₂CH₂)；UV λ_max，nm，pH 1，274.8(ε14,300)，pH 7，276(ε16,700)，pH 13，277(ε17,400)。分析(C₁₆H₂₈N₈O₄.0.4H₂SO₄.0.2C₂H₅OH.0.9H₂O)C，H，N，S。

    实例22

    5′-[(4-氨基氧基丁基)甲氨基]-5′-脱氧-8-苯基腺苷硫酸盐(1.75∶1的盐)(9b)。利用与关于制备7a所述相同的程序，使用8b(305mg，0.59mmol)和2NH₂SO₄(4mL)制备化合物9b：产量252mg(64％)；MS：m/z 444(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.18(s，1H，H-2)，7.20-7.78(m，2H，8-苯基邻-H)，7.59-7.61(m，3H，8-苯基间-H和对-H)，7.37(bs，2H，6-NH₂)，5.85(s，2H，O-NH₂)，5.68(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.7Hz)，5.31(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.5Hz)，5.13(bd，1H，3′-OH)，4.18(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝3.9Hz)，3.94-3.99(bm，1H，H-4′)，3.49(t，2H，NH₂O-CH₂)，2.73-2.79(m，1H，5′-CH₂)，2.54-2.62(m，1H，5′-CH₂)，2.27-2.36(bm，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.16(bs，3H，N-CH₃)，1.33-1.53(bm，4H，NH₂OCH₂-CH₂CH₂)；¹HNMR(D₂O)δ8.36(s，1H，H-2)，7.72-7.78(m，2H，8-苯基邻-H)，7.63-7.71(m，3H，8-苯基间-H和对-H)，6.02(d，1H，H-1′，J_1′，2′.＝5.8Hz)，5.28-5.41(bm，1H，H-2′)，4.43-4.53(bm，2H，H-3′，4′)，3.92-4.03(m，1H，5′-CH₂)，3.90(t，2H，NH₂O-CH₂)，3.49-3.59(m，1H，5′-CH₂)，3.22-3.32(bm，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.92(bs，3H，N-CH₃)，1.61-1.83(bm，4H，NH₂OCH₂-CH₂CH₂)；UVλ_max，nm，pH 1，275(ε21,400)，pH 7，274.5(ε16,900)，pH 13，274.8(ε16,700)。分析(C₂₁H₂₉N₇O₄.1.75H₂SO₄.0.05C₂H₅OH.2.4H₂O)C，H，N，S。

    实例23

    5′-[(4-氨基氧基丁基)甲氨基]-5′-脱氧-8-氧代腺苷硫酸盐(1.9∶1的盐)(9c)。本程序与上文关于7a所报导相同，使用8c(190mg，0.41mmol)和2NH₂SO₄(3mL)进行。利用柱色谱分离法(用4∶1∶0.5的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化化合物：产量208mg(82％)；MS：m/z 384(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ10.45(bs，1H，8-OH)，8.05(s，1H，H-2)，6.58(bs，2H，6-NH₂)，5.77(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.0Hz)，5.37-5.71(bm，2H，O-NH₂)，4.83(t，1H，H-2′，J_2′，3′.＝4.2Hz)，4.18-4.29(m，2H，H-3′，H-4′)，3.88(t，2H，NH₂O-CH₂)，3.34-3.54(m，2H，5′-CH₂)，3.06(bt，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.73(s，3H，N-CH₃)，1.46-1.74(bm，4H，NH₂OCH₂-CH₂CH₂)；UV λ_max，nm，pH 1，263.3(ε12,200)，pH 7，268.9(ε13,600)，pH 13，279.9(ε15,600)。分析(C₁₅H₂₅N₇O₅.1.9H₂SO₄.0.1C₂H₅OH.2H₂O)C，H，N，S。

    实例24

    5′-[(4-氨基氧基丁基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷硫酸盐(1.9∶1的盐)(9d)。将化合物8d(149mg，0.30mmol)溶解于2.5mL 1N H₂SO₄中，并在室温下搅拌12天。用NaHCO₃中和反应混合物，并冻干。用EtOH(2×10mL)萃取化合物，并浓缩至干。利用柱色谱分离法(硅胶230-400目，用4∶1∶0.2的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化残余物。收集所需部分，浓缩并在真空中干燥。将产物溶解于8mL EtOH中并逐滴添加2N H₂SO₄。过滤沉淀析出的所得硫酸盐，并用EtOH洗涤。将此产物溶解于水(2mL)中，并冻干，得到白色固体：产量59mg(33％)；MS：m/z 382(M+H)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.39(s，1H，H-2)，6.08(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.5Hz)，5.0-5.19(bm，1H，H-2′)，4.51-4.58(bm，2H，H-3′，4′)，4.08(t，2H，NH₂O-CH₂)，3.73-4.0(m，1H，5′-CH₂)，3.44-3.69(m，1H，5′-CH₂)，3.16-3.36(bm，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.92(bs，3H，N-CH₃)，2.70(s，3H，8-CH₃)，1.68-1.88(bm，4H，NH₂OCH₂-CH₂CH₂)；UVλ_max，nm，pH 1，258.2(ε15,400)，pH 7，259.7(ε15,500)，pH 13，260.9(ε15,900)。分析(C₁₆H₂₇N₇O₄.1.9H₂SO₄.0.4C₂H₅OH)C，H，N。

    实例25

    5′-[(4-氨基氧基丁基)甲氨基]-5′-脱氧-8-乙基腺苷硫酸盐(1.9∶1的盐)(9e)。本程序与上文关于9d所报导相同，使用8e(155mg，0.30mmol)进行：产量55mg(30％)；MS：m/z 396(M+H)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.39(s，1H，H-2)，6.09(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.6Hz)，5.07-5.23(bm，1H，H-2′)，4.50-4.60(bm，2H，H-3′，4′)，4.06(t，2H，NH₂O-CH₂)，3.82-3.96(m，1H，5′-CH₂)，3.45-3.69(m，1H，5′-CH₂)，3.27(bs，2H，N(CH₃)-CH₂)，3.0-3.10(m，2H，8CH₂CH₃)，2.91(bs，3H，N-CH₃)，1.68-1.86(bm，4H，NH₂OCH₂-CH₂CH₂)，1.39(t，3H，8CH₂CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，259.1(ε16,400)，pH 7，260(ε15,700)，pH 13，260.2(ε15,900)。分析(C₁₇H₂₉N₇O₄.1.9H₂SO₄.0.2C₂H₅OH)C，H，N。

    实例26

    5′-[(4-氨基氧基丁基)甲氨基]-5′-脱氧腺苷硫酸盐(2∶1的盐)(9f)。本程序与上文关于9d所报导相同，使用8f(750mg，1.5mmol)进行：产量457mg(48％)；MS：m/z 368(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.43(s，1H，H-8)，8.23(s，1H，H-2)，7.58(bs，2H，6-NH₂)，6.03(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，4.75(t，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.4Hz，J_2′，3′＝4.8Hz)，4.32-4.40(bm，2H，H-4′)，4.23(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝3.8Hz)，3.93(t，2H，NH₂O-CH₂)，3.68(dd，1H，5′-CH₂)，3.49(bdd，1H，5′-CH₂)，3.13(bt，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.80(s，3H，N-CH₃)，1.50-1.78(bm，4H，NH₂OCH₂-CH₂CH₂)。分析(C₁₅H₂₄N₇O₄.2.0H₂SO₄.0.3C₂H₅OH.1.5H₂O)C，H，N，S。

    实例27

    5′-脱氧-2′，3′-O-亚异丙基-5′-[(2-羟乙基)甲氨基]腺苷(10)。将化合物3i⁴⁵(8.20g，17.79mmol)溶解于2-(甲氨基)乙醇(54mL，673mmol)中，并在室温下搅拌41小时。蒸发溶剂，得到黄色残余物。将残余物溶解于100mL氯仿中，并用NaHCO₃(3×50mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，并浓缩至干，得到黄色泡沫状物。利用柱色谱分离法(硅胶230-400目，用9∶1∶0.1的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化残余物。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量2.55g(39％)；MS：m/z 365(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.34(s，1H，H-2)，8.18(s，1H，H-8)，7.33(bs，2H，6-NH₂)，6.13(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝2.5Hz)，5.48(dd，1H，H-2′，J_2′，3′＝6.3Hz)，4.96(dd，1H，H-3′，J_3′，4′＝3.0Hz)，4.33(t，1H，OH)，4.24(dt，1H，H-4′)，3.44(t，2H，OH-CH₂)，2.64(dd，1H，5′-CH₂)，2.35-2.49(m，3H，5′-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.18(s，3H，N-CH₃)，1.54和1.33(2s，6H，C(CH₃)₂)。

    实例28

    5′-脱氧-2′，3′-O-亚异丙基-5′-[(2-邻苯二甲酰亚胺基氧基乙基)甲氨基]-腺苷(11)。在氮气下，于室温下经3分钟向化合物10(989mg，2.714mmol)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺(1.107g，6.786mmol)和P(Ph)₃(1.780g，6.787mmol)于50mL无水THF中的溶液中添加DEAD(1.07mL，6.8mmol)之THF(10mL)溶液。5分钟后，将2％碳酸钠(75mL)添加到反应混合物中，随后添加二氯甲烷(100mL)。用2％Na₂CO₃(75mL)洗涤有机层，随后用饱和NaCl(2×75mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，并浓缩至干，得到泡沫状物。利用柱色谱分离法纯化残余物，并用1∶3的二氯甲烷∶丙酮洗脱柱。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量842mg(61％)；MS：m/z 510(M+H)⁺)⁺；¹HNMR(CDCl₃)δ8.36(s，1H，H-2)，8.07(s，1H，H-8)，7.79-7.83(m，2H，邻苯二甲酰亚胺基的芳香族H)，7.63-7.72(m，2H，邻苯二甲酰亚胺基的芳香族H)，6.12(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝2.2Hz)，5.87(bs，2H，6-NH₂)，5.49(dd，1H，H-2′，J_1′，2′＝2.2Hz，J_2′，3′＝6.4Hz)，5.05(dd，1H，H-3′，J_2′，3′＝6.4Hz，J_3′，4′＝3.3Hz)，4.40-4.45(m，1H，H-4′)，4.29(t，2H，NO-CH₂)，2.89(t，2H，NOCH₂-CH₂)，2.83-2.89(m，1H，5′-CH₂)，2.72-2.79(m，1H，5′-CH₂)，2.40(s，3H，N-CH₃)，1.62和1.40(2s，6H，C(CH₃)₂)。

    实例29

    5′-[(2-氨基氧基乙基)甲氨基]-5′-脱氧腺苷硫酸盐(1∶1的盐)(12)。60℃下，将11(373mg，0.73mmol)于1N H₂SO₄(5mL)中的溶液加热3小时。用NaHCO₃中和反应混合物，并冻干。用EtOH(2×20mL)萃取化合物，并浓缩至干。利用柱色谱分离法(用77∶20∶3的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化残余物。收集所需部分，浓缩并在真空中干燥。将产物溶解于10mL EtOH中，并在冷却下逐滴添加1N H₂SO₄以使盐沉淀，过滤并用EtOH洗涤，并且在真空中干燥：产量100mg；MS：m/z 340(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.42(s，1H，H-8)，8.25(s，1H，H-2)，7.68(bs，2H，6-NH₂)，5.99(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.3Hz)，5.67(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝4.6Hz)，4.33-4.39(bm，1H，H-4′)，4.22(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝4.7Hz)，4.06(bt，2H，NH₂O-CH₂)，3.63-3.71(dd，1H，5′-CH₂)，3.52-3.3.59(bdd，1H，5′-CH₂)，3.43(bm，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.84(s，3H，N-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，258.2(ε14,300)，pH 7，259(ε14,600)，pH 13，259(ε15,500)。分析(C₁₃H₂₁N₇O₄.1.0H₂SO₄.0.5C₂H₅OH.1.0H₂O)C，H，N。

    实例30

    5′-[(2-乙氧羰基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷(13a)。60℃下，将4a(500mg，1.69mmol)、3-氯丙酸乙酯(270mg，1.97mmol)、DIEA(109mg，0.14mL，0.84mmol)与DMF(5mL)的混合物加热2天。起始物质仍有剩余，但由于溶液开始变深，故停止加热。将反应混合物浓缩至干。利用柱色谱分离法(7∶1∶0.1的氯仿∶甲醇∶NH₄OH)纯化产物，得到粘性固体：产量210mg(31％)；MS m/z 395(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，6-NH₂)，5.74(d₅1H，H-1′，J_1′，2′＝5.6Hz)，5.33(bd，1H，OH-2′)，5.16(bd，1H，OH-3′)，5.12(bdd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.6Hz，J_2′，3′＝5.5Hz)，4.21(bdd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.5Hz，J_3′，4′＝4.3Hz)，4.01(q，2H，OCH₂CH₃)，3.914.00(m，1H，H-4′)，2.70-2.77(m，1H，5′-CH₂)，2.54-2.66(m，3H，5′-CH₂，CO-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.38(t，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.16(bs，3H，N-CH₃)，1.15(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例31

    5′-[(2-乙氧羰基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-乙基腺苷(13b)。利用与关于制备13a所报导相同的程序，使用4b(260mg，0.84mmol)、3-氯丙酸乙酯(138mg，1.0mmol)、DIEA(53mg，0.07mL，0.41mmol)和DMF(4mL)制备化合物13b。柱色谱分离法(用7∶1∶0.1的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)后，获得玻璃状粘性固体：产量153mg(44％)；MS：m/z 409(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.10(bs，2H，6-NH₂)，5.71(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.5Hz)，5.32(bd，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝5.0Hz)，5.16(bd，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝5.1Hz)，5.12(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.5Hz，J_2′，3′＝5.7Hz，J_2′-2′OH＝5.0Hz)，4.14(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.7Hz，J_3′，4′＝4.1Hz，J_3′-3′OH＝5.1Hz)，4.01(q，2H，OCH₂CH₃)，3.91-3.98(m，1H，H-4′)，2.87(q，2H，8-Et的CH₂)，2.71-2.79(m，1H，5′-CH₂)，2.51-2.65(m，3H，5′-CH₂，CO-CH₂)，2.38(t，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.16(bs，3H，N-CH₃)，1.30(t，3H，8-Et的CH₃)，1.15(t，3H，OCH₂CH₃)。

    实例32

    5′-[(乙氧羰基甲基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷(13c)。利用与关于制备13a所述相同的程序，使用4a(415mg，1.41mmol)、氯乙酸乙酯(207mg，0.18mL，1.68mmol)、DIEA(91mg，0.12mL，0.70mmol)和DMF(5mL)制备化合物13c：产量204mg(38％)；MS：m/z 381(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.06(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，6-NH₂)，5.73(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.33(bd，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝4.7Hz)，5.19(bd，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝4.9Hz)，5.03(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.4Hz，J_2′，3′＝5.7Hz，J_2′-2′OH＝4.7Hz)，4.17(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.7Hz，J_3′，4′＝4.4Hz，J_3′-3′OH＝4.9Hz)，4.02(q，2H，OCH₂CH₃)，3.92-3.99(m，1H，H4′)，3.27(bs，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.83-2.90(m，1H，5′-CH₂)，2.70-2.79(m，1H，5′-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.31(s，3H，N-CH₃)，1.13(t，3H，OCH₂CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，258.9(ε16,100)，pH 7，260(ε15,900)，pH 13，260.1(ε16,200)。分析(C₁₆H₂₄N₆O₅.0.5CHCl₃.0.3CH₃OH)C，H，N。

    实例33

    5′-[(2-甲酰胺基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷硫酸盐(1.5∶1的盐)(13d)。将化合物13a(89mg，0.22mmol)溶解于5mL甲醇氨溶液中，并在室温下搅拌溶液5天。将反应混合物浓缩至干，并利用柱色谱分离法(4∶1∶0.2的氯仿∶甲醇∶NH₄OH)纯化。收集所需部分，浓缩并在真空中干燥。将产物溶解于8mL EtOH中并逐滴添加2N H₂SO₄。过滤沉淀析出的盐，并用EtOH洗涤。将此具有吸湿性的产物溶解于水(2mL)中，并冻干，得到白色固体：产量65mg(55％)；MS：m/z 366(M+H)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.43(s，1H，H-2)，6.09(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.9Hz)，5.0-5.30(bm，1H，H-2′)，4.61-4.70(bm，1H，H-4′)，4.51-4.54(bm，1H，H-3′)，3.30-3.89(bm，5H，N-CH₃和N(CH₃)-CH₂)，2.96(bs，2H，5′-CH₂)，2.77(bs，2H，NH₂CO-CH₂)，2.70(s，3H，8-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，258.4(ε14,900)，pH 7，260.1(ε14,900)，pH 13，260.1(ε15,300)。分析(C₁₅H₂₃N₇O₄.1.5H₂SO₄.0.8H₂O)C，H，N，S。

    实例34

    5′-[(2-甲酰胺基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-乙基腺苷硫酸盐(1.1∶1的盐)(13e)。本程序与上文关于13d所报导相同，使用13b(149mg，0.36mmol)和甲醇氨溶液(5mL)进行：产量94mg(51％)；MS：m/z 380(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.31(bs，1H，CO-NH₂)，7.10(bs，2H，6-NH₂)，6.71(bs，1H，CO-NH₂)，5.72(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.31(d，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝6.2Hz)，5.16(d，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝5.5Hz)，5.09(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.4Hz，J_2′，3′＝5.7Hz，J_2′-2′OH＝6.2Hz)，4.17(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.7Hz，J_3′，4′＝4.3Hz，J_3′-3′OH＝5.5Hz)，3.92-3.99(m，1H，H-4′)，2.87(q，2H，8-CH₂CH₃)，2.69-2.75(m，1H，5′-CH₂)，2.52-2.60(m，3H，CO-CH₂，5′-CH₂)，2.18(bs，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.16(s，3H，N-CH₃)，1.30(t，3H，8-Et的CH₃)；¹HNMR(D₂O)δ8.38(s，1H，H-2)，6.09(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.2Hz)，5.33(bs，1H，H-2′)，4.56-4.62(m，1H，H-4′)，4.51-4.54(m，1H，H-3′)，3.87-3.96(bm，2H，NH₂CO-CH₂)，3.56(s，3H，N-CH₃)，2.98-3.80(bm，2H，8-C4₂CH₃)，2.96(bs，2H，5′-CH₂)，2.72-2.82(m，2H，N(CH₃)-CH₂)，1.39(s，3H，8-Et的CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，259.4(ε15,200)，pH 7，260.8(ε15,100)，pH 13，260.6(ε15,500)。分析(C₁₆H₂₅N₇O₄.1.1H₂SO₄.1.05H₂O)C，H，N，S。

    实例35

    5′-[(甲酰胺基甲基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷硫酸盐(1.45∶1的盐)(13f)。使用与用于制备13d相同的程序，使用13c(200mg，0.52mmol)和甲醇氨溶液(5mL)制备13f：产量105mg(39％)；MS：m/z 352(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，CO-NH₂)，7.07(bs，2H，6-NH₂)，5.74(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.2Hz)，5.34(d，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝5.9Hz)，5.21(d，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝5.7Hz)，4.97(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.2Hz，J_2′，3′＝5.5Hz，J_2′-2′OH＝5.9Hz)，4.21(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.5Hz，J_3′，4′＝5.2Hz，J_3′-3′OH＝5.7Hz)，3.94-4.01(m，1H，H-4′)，2.94(d，1H，N(CH₃)-CH₂，J＝15.7Hz)，2.88(d，1H，N(CH₃)-CH₂，J＝15.7Hz)，2.75-2.80(m，1H，5′-CH₂)，2.63-2.70(m，1H，5′-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.23(s，3H，N-CH₃)；¹HNMR(D₂O)δ8.40(s，1H，H-2)，6.08(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝4.8Hz)，5.01(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.2Hz)，4.60(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝4.9Hz)，4.50-4.59(m，1H，H-4′)，4.03-4.17(m，2H，NH₂CO-CH₂)，3.82-3.92(m，1H，5′-CH₂)，3.68-3.76(m，1H，5′-CH₂)，3.03(s，3H，N-CH₃)，2.70(s，3H，8-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，259(ε15,900)，pH 7，259.7(ε16,100)，pH 13，260.2(ε16,100)。分析(C₁₄H₂₁N₇O₄.1.45H₂SO₄.0.2C₂H₅OH.1.3H₂O)C，H，N，S。

    实例36

    5′-[(2-乙氧羰基乙基)甲氨基]-5′-脱氧腺苷(13g)。使用先前关于13a所述的通用程序，使用4h47(400mg，1.42mmol)、3-氯丙酸乙酯(214mg，1.56mmol)、DIEA(92mg，0.12mL，0.71mmol)和DMF(5mL)制备13g。在60℃下将反应混合物加热2天。利用柱色谱分离法(7∶1的氯仿∶甲醇)纯化产物，得到固体：产量102mg(19％)；MS m/z 381(M+H)⁺。

    实例37

    5′-脱氧-5′-[(乙氧羰基乙基)甲氨基]-2′，3′-O-亚异丙基腺苷(13h)。向无水CH₃CN(5mL)中的化合物4g(380mg，1.18mmol)中添加3-氯丙酸乙酯(195mg，0.18mL，1.42mmol)和二异丙基乙胺(153mg，0.2mL，1.18mmol)，并在氮气下，于75-80℃下将反应混合物搅拌72小时。将反应混合物蒸发至干，并利用柱色谱分离法(硅胶230-400目，用9∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱)纯化残余物。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量260mg(52％)；MS：m/z 421(M+H)⁺

    实例38

    5′-[(甲酰胺基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-2′，3′-O-亚异丙基腺苷(13i)。在室温下，将13h(80mg，0.19mmol)于饱和甲醇氨溶液(15mL)中的混合物搅拌12天。将所得溶液浓缩至干，并利用柱色谱分离法(用9∶1∶0.1的二氯甲烷∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化残余物。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量40mg(55％)；MS：m/z 392(M+H)⁺

    实例39

    5′-[(2-甲酰胺基乙基)甲氨基]-5′-脱氧腺苷硫酸盐(1.9∶1的盐)(13j)。将化合物13i(20mg)溶解于1N H₂SO₄(2mL)中，并在室温下将溶液搅拌36小时。将反应混合物浓缩到0.5mL，将无水乙醇(3mL)添加到溶液中，产生少量混浊，并在0℃下冷却混合物。过滤固体，用乙醇洗涤并在高真空下干燥：产量15mg(51％)；MS：m/z 352(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.64(s，1H，H-8)，8.43(s，1H，H-2)，7.59(bs，1H，NH₂)，7.17(bs，1H，NH₂)，6.02(bdd，1H，H-1′，J_1′，2′＝3.4Hz)，4.65(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝6.4Hz)，4.17-4.21(bm，1H，H-3′)，3.34-3.42(bm，1H，H-4′)，3.52-3.67(bm，4H，5′CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.80(bs，3H，N-CH₃)，2.54-2.60(bm，2H，CO-CH₂)；UV λ_max，nm，pH 1，256.3(ε15,200)，pH 7，258.5(ε15,400)，pH 13，259.6(ε16,100)。分析(C₁₄H₂₁N₇O₄.1.9H₂SO₄.1.6H₂O)C，H，N，S。

    实例40

    5′-脱氧-5′-[(2-肼基羰基乙基)甲氨基]-8-甲基腺苷硫酸盐(2∶1的盐)(13k)。将化合物13a(115mg，0.29mmol)溶解于10mL无水乙醇中，并将单水合肼(73mg，0.07mL，1.46mmol)添加到溶液中。将反应混合物加热到回流过夜。再添加单水合肼(0.07mL)，并继续加热过夜。将所得溶液蒸发至干。利用柱色谱分离法(4∶1∶0.5的氯仿∶甲醇∶NH₄OH)纯化粗产物。收集所需部分，浓缩并在真空中干燥，得到粘性固体。将产物溶解于8mLEtOH中并逐滴添加2N H₂SO₄。过滤沉淀析出的盐，并用EtOH洗涤。将此具有吸湿性的盐溶解于水(2mL)中，并冻干，得到白色固体：产量71mg(65％)；MS：m/z 381(M+H)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.44(s，1H，H-2)，6.09(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.6Hz)，5.10(dd，1H，H-2′，J_2′，3′＝4.5Hz)，4.53-4.62(bm，2H，H-3′，H-4′)，3.86-3.94(m，1H，5′-CH₂)，3.52-3.66(m，3H，5′-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.95(s，3H，N-CH₃)，2.86(t，2H，NHCO-CH₂)，2.70(s，3H，8-CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，258.4(ε15,000)，pH 7，259.3(ε15,200)，pH 13，260.4(ε15,700)。分析(C₁₅H₂₄N₈O₄.2.0H₂SO₄.2.7H₂O)C，H，N，S。

    实例41

    5′-脱氧-5′-[(2-肼基羰基乙基)甲氨基]-腺苷硫酸盐(2∶1的盐)(131)。本程序与上文关于13k所报导相同，使用13g(95mg，0.25mmol)和单水合肼(63mg，0.06mL，1.25mmol)进行：产量39mg(43％)；MS：m/z 367(M+H)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.47(s，1H，H-8)，8.45(s，1H，H-2)，6.17(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝4.7Hz)，4.90(dd，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.2Hz)，4.56-4.60(bm，1H，H-4′)，4.48(dd，1H，H-3′，J_3′，4′＝5.0Hz)，3.82(dd，1H，5′-CH₂)，3.66(dd，1H，5′-CH₂)，3.59(bt，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.97(s，3H，N-CH₃)，2.86(t，2H，NHCO-CH₂)；UVλ_max，nm，pH 1，256.8(ε16,600)，pH 7，258.5(ε16,800)，pH 13，259.5(ε17,600)。分析(C₁₄H₂₂N₈O₄.2.0H₂SO₄.2.0H₂O)C，H，N。

    实例42

    5′-脱氧-5′-[(肼基羰基甲基)甲氨基]-8-甲基腺苷(13m)。使用与用于制备13k相同的程序，使用13c(167mg，0.44mmol)和单水合肼(109mg，0.11mL，2.18mmol)制备13m。柱分离后，得到白色固体：产量154mg(96％)；MS：m/z 367(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.75(bs，1H，NH)，8.09(s，1H，H-2)，7.10(bs，2H，NH-NH₂)，5.74(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.2Hz)，5.31(d，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝6.0Hz)，5.18(d，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝5.6Hz)，5.0(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.2Hz，J_2′，3′＝5.7Hz，J_2′-2′OH＝6.0Hz)，4.19(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.7Hz，J_3′，4′＝4.9Hz，J_3′-3′OH＝5.6Hz)，3.94-3.99(m，1H，H-4′)，3.01(d，1H，CO-CHa Hb，J＝15.2Hz)，2.95(d，1H，CO-CHa Hb，J＝15.2Hz)，2.78(dd，1H，5′-CH₂)，2.66(dd，1H，5′-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.22(s，3H，N-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，258.9(ε15,300)，pH7，259.3(ε15,600)，pH 13，260.1(ε16,100)。分析(C₁₄H₂₂N₈O₄.0.2CH₃OH.0.4H₂O)C，H，N。

    实例43

    5′-[(3-氨基丙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-(甲氨基)腺苷硫酸盐(2.4∶1的盐)(14a)和5′-脱氧-8-(甲氨基)-5′-(3-甲氨基丙氨基)腺苷硫酸盐(2.4∶1的盐)(15a)。在环境温度下，将3c(175mg，0.55mmol)于2mLN-甲基-1，3-丙二胺中的溶液搅拌4天。将混合物倒入乙醚(20mL)中。倾析出乙醚层，留下油状物，利用柱色谱分离法纯化。用4∶1∶0.5的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱柱。收集所需部分，浓缩并在真空中干燥，得到两种异构体。将这些分离的异构体分别溶解于6mL EtOH和5mL EtOH中，并逐滴添加2N H₂SO₄。过滤沉淀析出的硫酸盐，并用EtOH洗涤。将这些具有吸湿性的盐溶解于水(2mL)中，并冻干，得到白色固体：14a产量50mg(15％)；MS：m/z 367(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.91(s，1H，H-2)，6.90(bs，1H，8CH₃-NH)，649(bs，2H，6-NH₂)，5.70(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝4.8Hz)，4.92(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.5Hz)，4.17(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝5.2Hz)，3.89-3.96(bm，1H，H-4′)，2.89(s，3H，8NH-CH₃)，2.53-2.70(m，4H，NH₂-CH₂，5′-CH₂)，2.38(t，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.17(s，3H，N-CH₃)，1.48-1.60(m，2H，NH₂CH₂-CH₂)；¹HNMR(D₂O)δ8.28(s，1H，H-2)，5.87(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.1Hz)，5.18(t，1H，H-2′，J_2′，3′.＝5.1Hz)，4.54(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝5.1Hz)，4.46-4.51(m，1H，H-4′)，3.01-3.82(bm，6H，5′-CH₂，NH₂-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，3.05(s，3H，8NH-CH₃)，2.94(s，3H，N-CH₃)，2.05-2.18(bm，2H，NH₂CH₂-CH₂)；UVλ_max，nm，pH 1，275.5(ε14,500)，pH 7，275(ε17,200)，pH 13，277(ε17,500)。分析(C₁₅H₂₆N₈O₃.2.4H₂SO₄.0.2C₂H₅OH)C，H，N；15a产量29mg(7％)；MS：m/z367(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.96(s，1H，H-2)，7.0(bs，1H，8CH₃-NH)，6.57(bs，2H，6-NH₂)，5.80(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.5Hz)，4.97(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.5Hz)，5.4(bs，2H，2′，3′-OH′s)，4.33(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝3.7Hz)，4.17-4.24(bm，1H，H-4′)，3.20-3.50(m，2H，5′-CH₂)，3.05-3.85(m，4H，NH-CH₂)，2.88(s，3H，8NH-CH₃)，2.49(s，3H，NH-CH₃)，1.85-2.0(bm，2H，NHCH₂-CH₂)；¹HNMR(D₂O)δ8.27(s，1H，H-2)，5.86(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.2Hz)，5.16(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.5Hz)，4.55(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝4.5Hz)，4.36-4.44(m，1H，H-4′)，3.47-3.69(m，2H，5′-CH₂)，3.22(t，2H，NH-CH₂)，3.10(t，2H，CH₃NH-CH₂)，3.05(s，3H，8NH-CH₃)，2.71(s，3H，NH-CH₃)，2.04-2.18(bm，2H，NHCH₂-CH₂)；UV λ_max，nm，pH 1，274.1(ε14,300)，pH 7，276(ε17,100)，pH 13，277.1(ε18,700)。分析(C₁₅H₂₆N₈O₃.2.4H₂SO₄.0.2C₂H₅OH)C，H，N。

    实例44

    5′-[(3-氨基丙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-苯基腺苷硫酸盐(2.2∶1的盐)(14b)和5′-脱氧-5′-(3-甲氨基丙氨基)-8-苯基腺苷硫酸盐(1.7∶1的盐)(15b)。使用与上文关于14a所述相同的程序，由3d(200mg，0.55mmol)和N-甲基-1，3-丙二胺(3mL)制备14b和15b，但在此情况下，在室温下搅拌1天后，将反应混合物在65℃下加热2天。用4∶1∶0.2的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱柱。进行相同处理后，获得两种异构体：14b产量124mg(34％)；MS：m/z 414(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.38(s，1H，H-2)，7.61-7.84(m，7H，8-苯基，6-NH₂)，5.88(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.3Hz)，5.17-5.30(bm，1H，H-2′)，4.34-4.38(bm，1H，H-3′)，4.25-4.31(bm，1H，H-4′)，3.10-3.85(bm，4H，N(CH₃)-CH₂，5′-CH₂)，2.80-2.94(m，2H，NH₂-CH₂)，2.78(s，3H，N-CH₃)，1.81-2.0(bm，2H，NH₂CH₂-CH₂)；UVλ_max，nm，pH 1，274.2(ε20,500)，pH 7，275.8(ε16,300)，pH 13，274.5(ε16,400)。分析(C₂₀H₂₇N₇O₃.2.2H₂SO₄.0.1C₂H₅OH.2.5H₂O)C，H，N，S；15b产量151mg(42％)；MS：m/z414(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.23(s，1H，H-2)，7.0-7.74(m，2H，8-苯基邻-H)，7.60-7.65(m，3H，8-苯基间-H和对-H)，7.46(bs，2H，6-NH₂)，5.80(d，1H，H-1′，J_1，2＝6.2Hz)，5.25(t，1H，H-2′，J_2，3＝4.9Hz)，5.5-6.0(m，2H，NH′s)，4.29-4.35(bm，1H，H-3′)，4.12-4.20(m，1H，H-4′)，3.40-3.47(m，1H，5′-CH₂)，3.19-3.25(m，1H，5′-CH₂)，2.94(m，4H，NH-CH₂，CH₃NH-CH₂)，2.54(s，3H，NH-CH₃)，1-80-1.95(bm，2H，NHCH₂-CH₂)；UV λ_max，nm，pH 1，275.5(ε20,600)，pH 7，274.9(ε16,200)，pH 13，274.9(ε16,300)。分析(C₂₀H₂₇N₇O₃.1.7H₂SO₄.0.05C₂H₅OH.3.3H₂O)C，H，N，S。

    实例45

    5′-[(3-氨基丙基)甲氨基]-5′-脱氧-2′，3′-O-亚异丙基腺苷(14c)。在氩气氛围下，将3h44(1.0g，2.60mmol)和N-甲基-1，3-丙二胺(1.35mL，13.0mmol)的混合物搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干，并利用柱色谱分离法，使用氯仿∶甲醇∶NH₄OH(6∶1∶0.1)作为洗脱剂来纯化粗物质。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥，得到半固体。将此物质溶解于3mL水中并冻干：产量361mg(37％)；MS：m/z 378(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.33(s，1H，H-8)，8.17(s，1H，H-2)，7.33(bs，2H，6-NH₂)，6.13(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝2.3Hz)，5.49(dd，1H，H-2′，J_2′，3′＝4.0Hz)，4.94(dd，1H，H-3′，J_3′，4′＝2.9Hz)，4.21-4.27(m，1H，H-4′)，2.52-2.58(m，2H，NH₂-CH₂)，2.26-2.38(m，4H，5′-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.12(s，3H，N-CH₃)，1.53和1.33(2s，6H，C(CH₃)₂)，1.37-1.47(m，2H，NH₂CH₂-CH₂)。

    实例46

    5′-[(3-氨基丙基)甲氨基]-5′-脱氧腺苷硫酸盐(2∶1的盐)(14d)。使用关于13j所述的程序，由14c(200mg，0.53mmol)制备14d：产量121mg(41％)；MS：m/z 338(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.47(bs，1H，H-8)，8.29(bs，1H，H-2)，7.0-10.0(宽峰，NH₂s+H₂SO₄)，5.97(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝4.7Hz)，5.70(bs，1H，2′-OH)，5.56(bs，1H，3′-OH)，4.72(bt，1H，H-2′)，4.30(bm，1H，H-4′)，4.21(bt，1H，H-3′)，3.30-3.70(bm，2H，5′-CH₂)，3.08(bs，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.83(bm，2H，NH₂-CH₂)，2.70(bs，3H，N-CH₃)，1.84-1.92(m，2H，NH₂CH₂-CH₂)；UVλ_max，nm，pH 1，257(ε14,700)，pH 7，259.2(ε15,000)，pH 13，260(ε15,300)。分析(C₁₄H₂₃N₇O₃.2.0H₂SO₄.0.25C₂H₅OH.0.7H₂O)C，H，N。

    实例47

    5′-[(2-氨基乙基)甲氨基]-5′-脱氧腺苷(14e)和5′-脱氧-5′-(2-甲氨基乙氨基)腺苷(15c)。在室温下，将3g⁴³(1.0g，3.5mmol)与N-甲基乙二胺(8mL)的混合物搅拌12天。将反应混合物倒入乙醚(50mL)中。倾析出乙醚层，并利用柱色谱分离法(硅胶230-400目，用4∶1∶0.5的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化所得浆液。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥，得到两种异构体：产量(14e)576mg(51％)；MS：m/z 324(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.35(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，7.27(bs，2H，6-NH₂)，5.85(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.3Hz)，4.64(dd，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.3Hz)，4.11(dd，1H，H-3′，J_3′，4′＝4.3Hz)，3.95-4.0(m，1H，H-4′)，2.90-3.60(bs，4H，2′，3′-OHs+NHs)，2.70(dd，1H，5′-CH₂)，2.50-2.60(bm，3H，5′-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.36(t，2H，NH₂-CH₂)，2.19(s，3H，N-CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，256.9(ε14,100)，pH 7，259.5(ε14,700)，pH 13，259.2(ε15,300)。分析(C₁₃H₂₁N₇O₃.0.25CHCl₃0.5H₂O)C，H，N；产量(15c)323mg(29％)；MS：m/z324(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.35(s，1H，H-8)，8.14(s，1H，H-2)，7.28(bs，2H，6-NH₂)，5.84(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.9Hz)，4.69(dd，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.3Hz)，4.12(dd，1H，H-3′，J_3′，4′＝3.5Hz)，3.94-3.99(m，1H，H-4′)，2.90-3.60(bs，4H，2′，3′-OHs+NHs)，2.80(dd，1H，5′-CH₂)，2.73(dd，1H，5′-CH₂)，2.50-2.62(bm，4H，NHCH₃-CH₂，NH-CH₂)，2.25(s，3H，NH-CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，256.4(ε13,900)，pH 7，259(ε13,900)，pH 13，259.8(ε14,000)。分析(C₁₃H₂₁N₇O₃.0.05CH₃OH.0.1H₂O)C，H，N。

    实例48

    5′-[(2-氨基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷(14f)和5′-脱氧-8-甲基-5′-(2-甲氨基乙氨基)腺苷(15d)。使用上文关于14e/15c所述的程序，由3a(300mg，1.0mmol)和N-甲基乙二胺(3mL)制备14f/15d：产量(14f)69mg(18.3％)；MS：m/z 338(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，6-NH₂)，5.74(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.31(bs，1H，2′-OH)，5.04(dd，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.6Hz)，4.17(dd，1H，H-3′，J_3′，4′＝4.5Hz)，4.08(bs，1H，3′-OH)，3.93-3.98(m，1H，H-4′)，2.70(dd，1H，5′-CH₂)，2.53-2.57(bm，3H，5′-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.30-2.35(m，2H，NH₂-CH₂)，2.16(s，3H，N-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，258.5(ε15,600)，pH 7，259.1(ε16,000)，pH 13，260(ε16,200)。分析(C₁₄H₂₃N₇O₃.0.5CH₃OH.0.3H₂O)C，H，N；产量(15d)58mg(15.4％)；MS：m/z 338(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.07(s，1H，H-2)，7.12(bs，2H，6-NH₂)，5.72(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.4Hz)，5.27(bs，1H，2′-OH)，5.02(dd，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.4Hz)，4.17(dd，1H，H-3′，J_3′，4′＝3.1Hz)，3.94-3.99(m，1H，H-4′)，2.80(dd，1H，5′-CH₂)，2.74(dd，1H，5′-CH₂)，2.54-2.63(bm，4H NHCH₃-CH₂，NH-CH₂)，2.54(s，3H，8-CH₃)，2.24(s，3H，NH-CH₃)；UVλ_max.nm，pH 1，258.4(ε15,400)，pH 7，259.5(ε15,400)，pH 13，260(ε15,900)。分析(C₁₄H₂₃N₇O₃.0.4CH₃OH.0.7H₂O)C，H，N。

    实例49

    5′-脱氧-2′，3′-O-亚异丙基-5′-[(3-邻苯二甲酰亚胺基丙基)甲氨基]-8-甲基腺苷(16a)。向化合物2e(500mg，1.5mmol)于无水吡啶(2m)中的冷溶液中添加甲磺酰氯(196mg，0.13mL，1.7mmol)，并在0℃下将溶液搅拌2小时。将反应混合物浓缩至干，得到粗物质3e。将甲胺(33％的EtOH溶液，12mL)添加到此粗混合物中，并在室温下将溶液搅拌3天。将反应混合物蒸发至干。将所得粗物质4e溶解于无水DMF(3mL)中，添加DIEA(0.07mL)和N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(502mg，1.87mmol)，并在60℃下将反应混合物加热过夜。将溶液蒸发至干，并将残余物溶解于CHCl₃(10mL)中，用水洗涤，用Na₂SO₄干燥，并浓缩至干。利用柱色谱分离法纯化所得浆液。用97∶3的氯仿∶甲醇洗脱柱。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量108mg(13％)；MS m/z522(M+H)⁺；¹HNMR(CDCl₃)δ8.26(s，1H，H-2)，7.82-7.86(m，2H，邻苯二甲酰亚胺的芳香族H)，7.69-7.73(m，2H，邻苯二甲酰亚胺的芳香族H)，5.98(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝1.8Hz)，5.76(dd，1H，H-2′，J_1′，2′＝1.8Hz，J_2′，3′＝6.5Hz)，5.38(bs，2H，6-NH₂)，5.10(dd，1H，H-3′，J_2′，3′＝6.5Hz，J_3′，4′＝3.5Hz)，4.26-4.32(m，1H，H-4′)，3.60-3.76(m，2H，N-CH₂)，2.64(s，3H，8-CH₃)，2.58-2.63(m，1H，5′-CH₂)，241-2.48(m，1H，5′CH₂)，2.38(t，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.21(s，3H，N-CH₃)，1.68-1.80(m，2H，NCH₂-CH₂)，1.61和1.40(2s，6H，C(CH₃)₂)。

    实例50

    5′-脱氧-2′，3′-O-亚异丙基-5′-[(3-邻苯二甲酰亚胺基丙基)甲氨基]-8-乙基腺苷(16b)。使用与关于16a所述相同的程序，由2f(600mg，1.78mmol)、MsCl(225mg，0.15mL，1.96mmol)、甲胺(12mL)和N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(553mg，2.06mmol)制备16b：产量81mg(8.5％)；MS：m/z 536(M+H)⁺；¹HNMR(CDCl₃)δ8.26(s，1H，H-2)，7.81-7.86(m，2H，邻苯二甲酰亚胺的芳香族H)，7.67-7.72(m，2H，邻苯二甲酰亚胺的芳香族H)，5.98(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝2.0Hz)，5.75(dd，1H，H-2′，J_1′，2′＝2.0Hz，J_2′，3′＝6.5Hz)，5.37(bs，2H，6-NH₂)，5.12(dd，1H，H-3′，J_2′，3′＝6.5Hz，J_3′，4′＝3.5Hz)，4.25-4.33(m，1H，H-4′)，3.61-3.75(m，2H，N-CH₂)，2.94(q，2H，8-Et的CH₂)，2.62-2.68(m，1H，5′-CH₂)，243-2.49(m，1H，5′CH₂)，2.38(bt，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.22(s，3H，N-CH₃)，1.70-1.80(m，2H，NCH₂-CH₂)，1.60和1.40(2s，6H，C(CH₃)₂)，1.42(t，3H，8-Et的CH₃)。

    实例51

    5′-脱氧-2′，3′-O-亚异丙基-5′-[(3-氨基丙基)甲氨基]-8-甲基腺苷(17a)。向沸腾的16a(100mg，0.19mmol)于3mL乙醇中的溶液中添加单水合肼(50mg，.048mL，0.99mmol)并将溶液加热到回流，持续1小时。将反应混合物冷却到室温，并过滤固体，并用乙醇洗涤。将滤液蒸发至干。利用柱色谱分离法，使用氯仿∶甲醇∶NH₄OH(7∶1∶0.2)进行洗脱，来纯化粗产物：产量69mg(92％)；MS：m/z 392(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.12(s，1H，H-2)，7.18(bs，2H，6-NH₂)，6.06(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝1.9Hz)，5.79(dd，1H，H-2′，J_1′，2′＝1.9Hz，J_2′，3′＝6.3Hz)，5.0(dd，1H，H-3′，J_2′，3′＝6.3Hz，J_3′，4′＝3.1Hz)，4.15-4.21(m，1H，H-4′)，2.56(s，3H，8-CH₃)，2.40-2.50(m，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.13-2.31(bm，4H，NH₂-CH₂，5′-CH₂)，2.07(s，3H，N-CH₃)，1.53和1.33(2s，6H，C(CH₃)₂)，1.22-1.32(m，2H，NH₂CH₂-CH₂)。

    实例52

    5′-脱氧-2′，3′-O-亚异丙基-5′-[(3-氨基丙基)甲氨基]-8-乙基腺苷(17b)。利用与关于17a所报导相同的程序，使用16b(76mg，0.14mmol)和单水合肼(38mg，.036mL，0.76mmol)制备化合物17b：产量47mg(82％)；MS：m/z 406(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.12(s，1H，H-2)，7.16(bs，2H，6-NH₂)，6.03(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝2.0Hz)，5.76(dd，1H，H-2′，J_1′，2′＝2.0Hz，J_2′，3′＝6.4Hz)，5.01(dd，1H，H-3′，J_2′，3′＝6.4Hz，J_3′，4′＝3.0Hz)，4.15-4.22(m，1H，H-4′)，2.87-2.94(bm，2H，5′-CH₂)，2.38-2.53(m，2H，8-Et的CH₂)，2.13-2.34(m，4H，N(CH₃)-CH₂，NH₂-CH₂)，2.08(s，3H，N-CH₃)，1.53和1.33(2s，6H，C(CH₃)₂)，1.22-1.39(m，2H，NH₂CH₂-CH₂)，1.31(t，3H，8-Et的CH₃)。

    实例53

    5′-[(3-氨基丙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷硫酸盐(2∶1的盐)(17c)。将化合物17a(66mg，0.168mmol)溶解于2mL 1N H₂SO₄中，并搅拌过夜。向此溶液中添加乙醇(10mL)，使微细固体分离。倾析出溶剂，将化合物溶解于水(1mL)中，并添加15mL乙醇。将所得固体溶解于水(2mL)中，并冻干，得到白色固体：产量66mg(61％)；MS：m/z 352(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.16(s，1H，H-2)，7.74(bs，2H，CH₂-NH₂)，7.24(bs，2H，6-NH₂)，5.84(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.0Hz)，5.62(bs，2H，2′，3′-OH′s)，4.98(t，1H，H-2′，J_2，3＝4.4Hz)，4.29-4.36(bm，1H，H-4′)，4.23(t，1H，H-3′)，3.40-3.68(bm，2H，5′-CH₂)，2.99-3.19(bm，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.83(t，2H，NH₂-CH₂)，2.70(bs，3H，N-CH₃)，2.55(s，3H，8-CH₃)，1.80-1.93(m，2H，NH₂CH₂-CH₂)；UV λ_max，nm，pH 1，258.7(ε14,900)，pH 7，259.5(ε15,100)，pH 13，260.7(ε15,300)。分析(C₁₅H₂₅N₇O₃.2.0H₂SO₄.2.5H₂O)C，H，N，S。

    实例54

    5′-[(3-氨基丙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-乙基腺苷硫酸盐(2.5∶1的盐)(17d)。使用关于17c所述的程序，由17b(44mg，0.108mmol)制备17d。在此情况下，在添加EtOH后，析出微细固体，利用离心收集。随后将其溶解于水(2mL)中并冻干：产量30mg(69％)；MS：m/z 366(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.15(s，1H，H-2)，7.68(bs，2H，CH₂-NH₂)，7.21(bs，2H，6-NH₂)，5.82(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.0Hz)，5.61(bs，2H，2′，3′-OH′s)，5.04(t，1H，H-2′)，4.19-4.27(bm，2H，H-3′，4′)，3.22-3.43(bm，4H，5′-CH₂，N(CH₃)-CH₂)，2.90(q，2H，8CH₂CH₃)，2.81(t，2H，NH₂-CH₂)，2.50(bs，3H，N-CH₃)，1.73-1.88(bm，2H，NH₂CH₂-CH₂)，1.32(t，3H，8CH₂CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，259.3(ε15,100)，pH 7，260.5(ε15,100)，pH 13，260.3(ε15,100)。分析(C₁₆H₂₇N₇O₃.2.5H₂SO₄.2.5H₂O)C，H，N。

    实例55

    5′-脱氧5′-[(2-胍基乙基)甲氨基]腺苷(18a)。在氮气下，于5℃下向经搅拌的14e(218mg，0.67mmol)和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐50(196mg，1.34mmol)的无水THF(5mL)溶液中添加DIEA(479mg，0.65mL，3.7mmol)。在室温下持续搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干，并利用柱色谱分离法(硅胶230-400目，用4∶1∶0.3的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化产物。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥，得到白色固体：产量219mg(89％)；MS：m/z 366(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.34(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，7.48，7.37，7.28(bs，NHs)，5.87(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.2Hz)，5.50(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝5.7Hz)，5.28(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝4.5Hz)，4.65(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.2Hz，J_2′，3′＝5.1Hz，J_2′-2′OH＝5.7Hz)，4.12(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.1Hz，J_3′，4′＝4.6Hz，J_3′-3′OH＝4.5Hz)，4.0-4.10(bm，1H，H-4′)，3.30-3.50(bm，2H，5′-CH₂)，3.12-3.28(bm，2H，NH-CH₂)，2.55-2.65(bm，2H，N(CH₃)-CH₂)，2.25(bs，3H，N-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，256.3(ε10,900)，pH 7，259(ε11,300)，pH 13，259(ε11,000)。分析(C₁₄H₂₃N₉O₃.0.05CHCl₃.3.5H₂O)C，H，N。

    实例56

    5′-[(2-氰基乙基)甲氨基]-5′-脱氧腺苷(18b)。在室温下，将3j⁴⁶(1.0g，2.37mmol)于10mL 3-(甲氨基)丙腈中的溶液搅拌5天。将反应混合物倒入乙醚(50mL)中。倾析出乙醚层，并利用柱色谱分离法(硅胶，用7∶1∶0.1的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化所得浆液。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量685mg(87％)；MS：m/z 324(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.34(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，7.29(bs，2H，6-NH₂)，5.87(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.46(bd，1H，2′-OH)，5.22(bd，1H，3′-OH)，4.65(m，1H，H-2′)，4.13(m，1H，H-3′)，3.97-4.03(m，1H，H-4′)，2.78(dd，1H，5′-CH₂)，2.58-2.68(bm，5H，5′-CH₂，NC-CH₂CH₂)，2.24(s，3H，N-CH₃)。

    实例57

    5′-脱氧-5′-[(2-羟基脒基乙基)甲氨基]腺苷(18c)。在氮气下，向18b(470mg，1.4mmol)于20mL无水MeOH和4mL无水DMF中的溶液中添加羟胺盐酸盐(258mg，3.7mmol)和氢氧化钾(206mg，3.7mmol)，并在室温下将所得悬浮液搅拌2天。将反应混合物浓缩至干，并用EtOAc(2×40mL)萃取粗产物，并用盐水溶液(20mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，用EtOAc洗涤并浓缩至干。利用柱色谱分离法纯化产物。用4∶1∶0.5的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱柱，合并所需部分，浓缩并在真空中干燥，得到固体：产量165mg(32％)；MS：m/z 367(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.70(bs，1H，NOH)，8.33(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，7.27(bs，2H，6-NH₂)，5.86(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.3Hz)，5.43(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝6.0Hz)，5.35(bs，2H，C-NH₂)，5.20(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝5.2Hz)，4.63(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.3Hz，J_2′，3′＝4.9Hz，J_2′-2′OH＝6.0Hz)，4.10(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝4.9Hz，J_3′，4′＝3.5Hz，J_3′-3′OH＝5.2Hz)，3.96-4.0(m，1H，H-4′)，2.64-2.75(bm，2H，5′-CH₂)，2.56(t，2H N(CH₃)-CH₂)，2.20(s，3H，N-CH₃)，2.09(t，2H C-CH₂)。分析(C₁₄H₂₂N₈O₄.1.2C₂H₅OH.0.2CH₃OH)C，H，N。

    实例58

    5′-脱氧-5′-(N，N-二甲氨基)-8-甲基腺苷(19a)。在钢制反应釜中，将3a(150mg，0.50mmol)与2M二甲胺的甲醇溶液(10mL)的混合物在90℃下加热2天。将反应混合物浓缩至干，并利用柱色谱分离法(用4∶1∶0.15的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)纯化。合并所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量38mg(25％)；MS m/z 309(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，6-NH₂)，5.74(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.5Hz)，5.31(d，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝5.9Hz)，5.18(d，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝5.4Hz)，5.03(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.5Hz，J_2′，3′＝4.6Hz，J_2′-2′OH＝5.9Hz)，4.15(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝4.6Hz，J_3′，4′＝5.5Hz，J_3′-3′OH＝5.4Hz)，3.91-3.96(m，1H，H-4′)，2.55-2.61(m，1H，5′-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.42-2.48(m，1H，5′-CH₂)，2.14(bs，6H，N-(CH₃)₂)；UV λ_max，nm，pH 1，258.5(ε15,300)，pH7，259.3(ε15,300)，pH 13，260.1(ε15,500)。分析(C₁₃H₂₀N₆O₃.0.35CHCl₃.0.5C₂H₅OH)C，H，N。

    实例59

    5′-脱氧-5′-(N，N-二甲氨基)-腺苷(19b)。利用与关于制备19a所述相同的程序，使用3g(500mg，1.75mmol)和2M二甲胺的甲醇溶液(20mL)制备化合物19b：产量238mg(46％)；MS m/z 295(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.33(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，7.29(bs，2H，6-NH₂)，5.86(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.45(d，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝5.9Hz)，5.22(bd，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝3.9Hz)，4.65(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.4Hz，J_2′，3′＝5.5Hz，J_2′-2′OH＝5.9Hz)，4.10(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.5Hz，J_3′，4′＝4.5Hz，J_3′-3′OH＝3.9Hz)，3.94-4.0(m，1H，H-4′)，2.62(dd，1H，5′CH₂)，2.48(dd，1H，5′-CH₂)，2.18(bs，6H，N-(CH₃)₂)；UVλ_max，nm，pH 1，256.3(ε15,100)，pH 7，259.2(ε15,500)，pH 13，259.7(ε15,600)。分析(C₁₂H₁₈N₆O₃.0.35CH₃OH)C，H，N。

    实例60

    5′-脱氧-5′-甲基硫基-8-甲基腺苷(20a)。在室温下，将3a(200mg，0.66mmol)和硫代甲醇钠(47mg，0.67mmol)于2mL无水DMF中的溶液搅拌2天，随后浓缩至干。利用柱色谱分离法，使用氯仿∶甲醇(7∶1)作为洗脱剂，来纯化粗产物。收集所需部分，浓缩并在真空中干燥：产量102mg(49％)；MS m/z 312(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.09(s，1H，H-2)，7.12(bs，2H，6-NH₂)，5.77(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.7Hz)，5.38(bd，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝4.4Hz)，5.31(d，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝4.2Hz)，5.15(bddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.7Hz，J_2′，3′＝5.7Hz，J_2′-2′OH＝4.4Hz)，4.20(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.7Hz，J_3′，4′＝3.6Hz，J_3′-3′OH＝4.2Hz)，3.97-4.05(m，1H，H-4′)，2.74-2.92(m，2H，5′CH₂)，2.54(s，3H，8-CH₃)，2.03(s，3H，S-CH₃)。

    实例61

    5′-脱氧-5′-二甲基锍基-8-甲基腺苷溴化物(21a)。用2M溴甲烷的乙醚溶液(5mL)处理2∶1的甲酸与乙酸的混合物(4mL)中的化合物20a(78mg，0.25mmol)，并在室温下于暗处搅拌6天。在真空中去除溶剂，并用(3×10mL)乙醚萃取残余物的水(10mL)溶液。将水层浓缩至干。将所得产物溶解于MeOH(10mL)中，过滤并用乙醚处理，沉淀析出盐。过滤盐，用乙醚洗涤，并在真空中干燥，得到白色固体：产量79mg(78％)；MS m/z 326(M)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.24(s，1H，H-2)，6.03(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.29(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.7Hz)，4.80(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝4.8Hz)，4.52-4.60(m，1H，H-4′)，4.11-4.20(m，1H，5′CH₂)，3.81-3.90(m，1H，5′CH₂)，2.92和2.89(2s，6H，S-(CH₃)₂)，2.67(s，3H，8-CH₃)。

    实例62

    5′-脱氧-5′-二甲基锍基-8-甲基腺苷氯化物(21b)。用水反复洗涤离子交换树脂(IRA-400，Cl^-形式)，并装入柱中。使柱静置过夜，并再次用水反复洗涤。将溴化物盐21a(50mg)溶解于水(1mL)中，并放于柱上。在暗处，用水极慢地洗脱柱。合并所需部分并冻干得到30mg(68％)；MS m/z 326(M)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.24(s，1H，H-2)，6.03(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.29(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.6Hz)，4.80(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝4.9Hz)，4.52-4.60(m，1H，H-4′)，3.82-4.11(m，1H，5′-CH₂)，3.75-3.83(m，1H，5′-CH₂)，2.95和2.92(2s，6H，S-(CH₃)₂)，2.69(s，3H，8-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，258.8(ε15,000)，pH 7，259.1(ε14,700)，pH 13，263.5(ε13,000)。分析(C₁₃H₂₀ClN₅O₃S.2H₂O)C，H，N。

    实例63

    5′-脱氧-5′-二甲基锍基腺苷溴化物(21c)。使用关于21a所述的程序，由20b(58mg，0.19mmol)制备21c：产量49mg(65％)；MS m/z 312(M)⁺。

    5′-脱氧-5′-二甲基锍基腺苷氯化物(21d)。用水洗涤离子交换树脂(IRA-400，Cl^-形式)，并装入柱中。使柱静置过夜，并再次用水反复洗涤。将盐21c(48mg)溶解于水(1mL)中，并放于柱上。在暗处，用水极慢地洗脱柱。将所需部分合并在一起并冻干得到30mg(44％)；MS m/z 312(M)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.29(s，1H，H-8)，8.27(s，1H，H-2)，6.12(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝4.4Hz)，4.99(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.1Hz)，4.55-4.62(m，2H，H-3′，H-4′)，3.84-4.0(m，2H，5′-CH₂)，2.95和2.93(2s，6H，S-(CH₃)₂)；UV λ_max，nm，pH 1，256.4(ε14,300)，pH 7，259.6(ε14,400)，pH 13，266(ε12,300)。分析(C₁₂H₁₈ClN₅O₃S.1.5H₂O.0.1C₂H₅OH)C，H，N，S。

    实例64

    5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-5′-脱氧-8-羟基腺苷(23a)。使用关于6a所述的程序，由4e(500mg，1.68mm)、13(481mg，2.01mm)、DIEA(109mg，0.14ml，0.84mm)和DMF(5ml)制备23a。柱色谱分离法(用4∶1∶0.2的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)后，获得玻璃状黄色粘性固体：产量200mg(26％)；MS：m/z 454(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ10.34(bs，1H，8-OH)，8.02(s，1H，H-2)，6.49(bs，2H，6-NH₂)，5.62(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.0Hz)，4.99(bs，1H，3′-OH)，5.19(bs，1H，2′-OH)，4.90(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.4Hz)，4.16-4.24(bm，1H，H-3′)，3.83-3.89(m，1H，H-4′)，3.92(q，2H，CH₃-CH₂)，3.77(t，2H，NH₂O-CH₂)，2.62-3.68(m，1H，5′-CH₂)，2.40-2.46(m，1H，5′-CH₂)，2.30(t，2H，NCH₃-CH₂)，2.13(s，3H，N-CH₃)，1.84(s，3H，C-CH₃)，1.35-1.60(bm，4H，NOCH₂-CH₂CH₂)，1.21(t，3H，OCH₂-CH₃)。

    实例65

    5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-5′-脱氧-8-羟基腺苷(23b)。利用与关于6a所报导相同的程序，使用4c(1.00g，3.23mm)、13(924mg，3.87mm)和DIEA(209mg，0.28ml，1.6mm)制备化合物23b：产量635mg(42％)；MS：m/z 467(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.89(s，1H，H-2)，6.87(q，1H，8CH₃-NH)，6.46(bs，2H，6-NH₂)，5.69(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝4.8Hz)，5.25(d，1H，2′-OH，J_2′-2′OH＝5.6Hz)，5.06(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH H＝5.4Hz)，4.91(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝4.8Hz，J_2′，3′＝5.4Hz，J_2′-2′OH＝5.6Hz)，4.16(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.4Hz，J_3′，4′＝4.9Hz，J_3′-3′OH＝5.4Hz)，3.85-3.94(m，1H，H-4′)，3.92(q，2H，CH₃-CH₂)，3.80(t，2H，NO-CH₂)，2.88(d，3H，8NH-CH₃，J＝4.6Hz)，2.65-2.74(m，1H，5′-CH₂)，2.46-2.58(m，1H，5′-CH₂)，2.34(t，2H，NCH₃-CH₂)，2.17(s，3H，N-CH₃)，1.83(s，3H，C-CH₃)，1.37-1.61(bm，4H，NOCH₂-CH₂CH₂)，1.19(t，3H，OCH₂-CH₃)。

    实例66

    5′-[[4-[[(1-乙氧基亚乙基)氨基]氧基]丁基]甲氨基]-5′-脱氧-8-(甲氨基)腺苷(23c)。使用与关于6a所述相同的程序，由4d(450mg，1.26mm)、13(360mg，1.51mm)和DIEA(81mg，0.10ml，0.62mm)制备23c。柱色谱分离法(用7∶1的氯仿∶甲醇洗脱)后，获得玻璃状黄色粘性固体：产量312mg(48％)；MS：m/z 514(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.17(s，1H，H-2)，7.71-7.78(m，2H，8C₆H₅-邻H)，7.58-7.64(m，3H，8C₆H₅-间H和对H)，7.36(bs，2H，6-NH₂)，5.67(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.7Hz)，5.32(bs，1H，2′-OH)，5.31(t，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.7Hz，J_2，3＝5.4Hz)，5.11(d，1H，3′-OH，J_3′-3′OH＝4.8Hz)，4.16(bddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.4Hz，J_3′，4′＝4.0Hz)，3.92-3.97(m，1H，H-4′)，3.91(q，2H，CH₃-CH₂)，3.79(t，2H，NO-CH₂)，2.72-2.80(m，1H，5′-CH₂)，2.54-2.59(m，1H，5′-CH₂)，2.34(bt，2H，NCH₃-CH₂)，2.17(bs，3H，N-CH₃)，1.83(s，3H，C-CH₃)，1.39-1.60(bm，4H，NOCH₂-CH₂CH₂)，1.18(t，3H，OCH₂-CH₃)。

    实例67

    5′-[(乙氧羰基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷(33a)。使用先前关于6a所述的通用程序，由4a(500mg，1.69mm)、3-氯丙酸乙酯(270mg，1.97mm)、DIEA(109mg，0.14ml，0.84mm)和DMF(5ml)制备33a。在60℃下将反应混合物加热2天。起始物质仍有剩余，但由于溶液开始变深，故停止加热。利用柱色谱分离法(6∶1∶0.1的氯仿∶甲醇∶NH₄OH)纯化产物，得到粘性固体：产量210mg(31％)；MS m/z 395(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，6-NH₂)，5.74(d，1H，H-1′，J_1′2′＝5.6Hz)，5.33(bd，1H，OH-2′)，5.16(bd，1H，OH-3′)，5.12(bddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.6Hz，J_2′，3′＝5.5Hz)，4.21(bddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.5Hz，J_3′，4′＝4.3Hz)，4.01(q，2H，CH₃-CH₂)，3.91-4.00(m，1H，H-4′)，2.70-2.77(m，1H，5′-CH₂)，2.54-2.66(m，3H，5′-CH₂，CO-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.38(t，2H，NCH₃-CH₂)，2.16(bs，3H，N-CH₃)，1.15(t，3H，OCH₂-CH₃)。

    实例68

    5′-[(乙氧羰基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-乙基腺苷(33b)。利用与关于制备6a和33a所述相同的程序，使用4b(260mg，0.84mm)、3-氯丙酸乙酯(138mg，1.0mm)、DIEA(53mg，0.07mL，0.41mm)和DMF(4ml)制备化合物33b。柱色谱分离法(用7∶1∶0.1的氯仿∶甲醇∶NH₄OH洗脱)后，获得玻璃状粘性固体：产量153mg(44％)；MS：m/z 409(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.10(bs，2H，6-NH₂)，5.71(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.5Hz)，5.32(bd，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝5.0Hz)，5.16(bd，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝5.1Hz)，5.12(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.5Hz，J_2′，3′＝5.7Hz，J_2′-2′OH＝5.0Hz)，4.14(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.7Hz，J_3′，4′＝4.1Hz，J_3′-3′OH＝5.1Hz)，4.01(q，2H，CH₃-CH₂)，3.91-3.98(m，1H，H-4′)，2.87(q，2H，8-Et的CH₂)，2.71-2.79(m，1H，5′-CH₂)，2.51-2.65(m，3H，5′-CH₂，CO-CH₂)，2.38(t，2H，NCH₃-CH₂)，2.16(bs，3H，N-CH₃)，1.30(t，3H，8-Et的CH₃)，1.15(t，3H，OCH₂-CH₃)。

    实例69

    5′-[(甲酰胺基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷硫酸盐(1.5∶1的盐)(34a)。将化合物33a(89mg，0.22mm)溶解于5mL甲醇氨溶液中，并在室温下搅拌溶液5天。将反应混合物浓缩至干，并利用柱色谱分离法(4∶1∶0.2的氯仿∶甲醇∶NH₄OH)纯化。收集所需部分，浓缩并在真空中干燥。将产物溶解于8ml EtOH中并逐滴添加2NH₂SO₄。化合物沉淀析出，过滤，并用EtOH洗涤。将此具有吸湿性的产物溶解于水(2ml)中，并冻干，得到白色固体：产量65mg(55％)；MS：m/z 366(M+H)⁺；¹HNMR(D₂O)δ8.43(s，1H，H-2)，6.09(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.9Hz)，5.0-5.30(bm，1H，H-2′)，4.61-4.70(bm，1H，H-4′)，4.514.54(bm，1H，H-3′)，3.30-3.89(bm，5H，N-CH₃CH₂)，2.96(bs，2H，5′-CH₂)，2.77(bs，2H，NH₂CO-CH₂)，2.70(s，3H，8-CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，258.4(ε14,900)，pH 7，260.1(ε14,900)，pH 13，260.1(ε15,300)。

    实例70

    5′-[(甲酰胺基乙基)甲氨基]-5′-脱氧-8-乙基腺苷硫酸盐(1.1∶1的盐)(34b)。本程序与上文关于34a所述相同，使用33b(149mg，0.36mm)和甲醇氨溶液(5ml)进行：产量94mg(51％)；MS：m/z 380(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.31(bs，1H，CO-NH₂)，7.10(bs，2H，6-NH₂)，6.71(bs，1H，CO-NH₂)，5.72(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.31(d，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝6.2Hz)，5.16(d，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝5.5Hz)，5.09(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.4Hz，J_2′，3′＝5.7Hz，J_2′-2′OH＝6.2Hz)，4.17(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.7Hz，J_3′，4′＝4.3Hz，J_3′-3′OH＝5.5Hz)，3.92-3.99(m，1H，H-4′)，2.87(q，2H，CH₃-CH₂)，2.69-2.75(m，1H，5′-CH₂)，2.52-2.60(m，3H，CO-CH₂，5′-CH₂)，2.18(bs，2H，NCH₃-CH₂)，2.16(s，3H，N-CH₃)，1.30(t，3H，8-Et的CH₃)；¹HNMR(D₂O)δ8.38(s，1H，H-2)，6.09(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝6.2Hz)，5.33(bs，1H，H-2′)，4.56-4.62(m，1H，H-4′)，4.51-4.54(m，1H，H-3′)，3.87-3.96(bm，2H，NH₂CO-CH₂)，3.56(s，3H，N-CH₃)，2.98-3.80(bm，2H，CH₃-CH₂)，2.96(bs，2H，5′-CH₂)，2.72-2.82(m，2H，NCH₃-CH₂)，1.39(s，3H，8-Et的CH₃)；UV λ_max，nm，pH1，259.4(ε15,200)，pH 7，260.8(ε15,100)，pH 13，260.6(ε15,500)。

    实例71

    5′-[(乙氧羰基甲基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷(35)。利用与关于制备6a所述相同的程序，使用4a(415mg，1.41mm)、氯乙酸乙酯(207mg，0.18ml，1.68mm)、DIEA(91mg，0.12mL，0.70mm)和DMF(5ml)制备化合物35：产量204mg(38％)；MS：m/z 381(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.06(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，6-NH₂)，5.73(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.4Hz)，5.33(bd，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝4.7Hz)，5.19(bd，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝4.9Hz)，5.03(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.4Hz，J_2′，3′＝5.7Hz，J_2′-2′OH＝4.7Hz)，4.17(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.7Hz，J_3′，4′＝4.4Hz，J_3′-3′OH＝4.9Hz)，4.02(q，2H，CH₃-CH₂)，3.92-3.99(m，1H，H-4′)，3.27(bs，2H，NCH₃-CH₂)，2.83-2.90(m，1H，5′-CH₂)，2.70-2.79(m，1H，5′-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.31(s，3H，N-CH₃)，1.13(t，3H，OCH₂-CH₃)；UVλ_max，nm，pH 1，258.9(ε16,100)，pH 7，260(ε15,900)，pH 13，260.1(ε16,200)。

    实例72

    5′-[(甲酰胺基甲基)甲氨基]-5′-脱氧-8-甲基腺苷硫酸盐(1.45∶1的盐)(36)。使用与用于制备34a相同的程序，使用35(200mg，0.52mm)和甲醇氨溶液(5ml)制备36：产量105mg(39％)；MS：m/z 352(M+H)⁺；¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.08(s，1H，H-2)，7.11(bs，2H，CO-NH₂)，7.07(bs，2H，6-NH₂)，5.74(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝5.2Hz)，5.34(d，1H，OH-2′，J_2′-2′OH＝5.9Hz)，5.21(d，1H，OH-3′，J_3′-3′OH＝5.7Hz)，4.97(ddd，1H，H-2′，J_1′，2′＝5.2Hz，J_2′，3′＝5.5Hz，J_2′-2′OH＝5.9Hz)，4.21(ddd，1H，H-3′，J_2′，3′＝5.5Hz，J_3′，4′＝5.2Hz，J_3′-3′OH＝5.7Hz)，3.94-4.01(m，1H，H-4′)，2.94(d，1H，NCH₃-CH₂，J＝15.7Hz)，2.88(d，1H，NCH₃-CH₂，J＝15.7Hz)，2.75-2.80(m，1H，5′-CH₂)，2.63-2.70(m，1H，5′-CH₂)，2.53(s，3H，8-CH₃)，2.23(s，3H，N-CH₃)；¹HNMR(D₂O)δ8.40(s，1H，H-2)，6.08(d，1H，H-1′，J_1′，2′＝4.8Hz)，5.01(t，1H，H-2′，J_2′，3′＝5.2Hz)，4.60(t，1H，H-3′，J_3′，4′＝4.9Hz)，4.50-4.59(m，1H，H-4′)，4.03-4.17(m，2H，NH₂CO-CH₂)，3.82-3.92(m，1H，5′-CH₂)，3.68-3.76(m，1H，5′-CH₂)，3.03(s，3H，N-CH₃)，2.70(s，3H，8-CH₃)；UV λ_max，nm，pH 1，259(ε15,900)，pH 7，259.7(ε16,100)，pH 13，260.2(ε16,100)。

    诱变和质粒构建

    如先前所述，制造基于pQE30载体的质粒，以在大肠杆菌中产生重组野生型和F223A突变体hAdoMetDC，用于结晶学研究(23)。这一构建体利用MRGS(H)₆GS-或通过固定金属亲和色谱法(immobilized metal affinity chromatography)纯化来替换N末端甲硫氨酸。使用一种也基于pQE30载体的不同质粒产生蛋白质以用于hAdoMetDC酶分析。在此质粒中，(H)₆标签位于羧基端，代替了末端的-QQQQQS。(H)₆标签的位置不会改变纯化酶的活性。

    蛋白质表达和纯化

    根据埃克斯托姆(Ekstrom)等人所述的方案，纯化野生型hAdoMetDC(20)。编码所述酶的质粒在pQE30载体中，并转化到大肠杆菌JM109菌株的细胞中。在37℃下，使细胞在LB培养基中生长，得到过夜培养物，随后将其引入较大细胞培养物中，其中两种培养物都含有100mg/mL氨苄西林(ampicillin)。使细胞生长，直到其O.D₆₀₀值达到0.6，随后用100mg/L异丙基-1-硫基-β-D吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。使细胞在15℃下生长过夜，随后通过离心收集，使用含有20mM Na₂HPO₄(pH 7.0)、500mM NaCl、2.5mM腐胺、0.02％布里杰-35(Brij-35)和10mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤，并在-80℃下存储。将冷冻的细胞小球解冻，悬浮于洗涤缓冲液中，并使用法式滤压壶(French press)在1500psi下进行溶解。借助离心，在12000g下分离细胞碎片与溶解产物。用洗涤缓冲液平衡塔隆金属亲和色谱树脂(Talon metal affinity resin)，随后小心地将溶解产物与树脂旋转在一起，历时1.5小时。将树脂装载到柱上，并用体积相当于柱体积的15-20倍的洗涤缓冲液洗涤。接下来，以相同方式，用含有25mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤柱。随后，用含有100-200mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。将洗脱的蛋白质浓缩到约10ml，并使其通过经10mM Hepes(pH 7.5)、2.5mM腐胺、5mM DTT、0.1mM EDTA、0.02％布里杰-35和300mM NaCl预平衡的葡聚糖凝胶G-75(Sephadex G-75)柱。使缓冲液通过柱，并利用UV在280nm下鉴别含有蛋白质的部分。将蛋白质浓缩到约10mg/mL，并在-80℃下存储。F223A突变体的纯化与原生酶类似。

    结晶

    在冰上解冻蛋白质，并使用伯乐公司的缓冲液更换色谱柱(伯乐生命医学产品有限公司(Bio-rad Laboratories)，加州海克里斯(Hercules，CA)94547)，将缓冲液更换成10mM Hepes(pH 7.5)、200mM NaCl和1mM DTT。将原生蛋白质与4-6倍摩尔过量的MAOBEA和MAOEMA一起培育24小时，然后结晶。将F223A突变体稀释到约6mg/mL，并且与4-6倍摩尔过量的MeAdoMet一起培育24小时，然后结晶。使用悬滴法(hanging drop method)，在22℃下使原生复合物和突变体复合物的晶体在13-16％PEG8000、100mM Tris(pH 8.0-9.0)和10mM DTT中生长。一夜间出现晶体，并稳定1-2周。

    数据收集和处理

    在利用理学RU-300旋转阳极式发生器(Rigaku RU-300 rotating anode generator)产生的Cu Kα辐射的理学R-axis IV+检测器上的源代码(home source)处收集MAOEMA复合物的数据。使用ADSC奎腾315检测器(ADSC quantum 315 detector)，在先进光子源(Advanced Photon Source，APS)NE-CAT束线的8BM基站，收集MAOBEA复合物的数据。使用ADSC奎腾4检测器，在CHESS的F2基站收集AdoMetDC F223A突变体与MeAdoMet所形成的复合物的数据。在液氮或液氮流下快速冷冻所有晶体。晶体的衍射质量与晶体的冷冻保护密切相关。将晶体依序转移到含有孔溶液的溶液中，其中所述孔溶液含2％、5％、8％、15％和18％甘油，其中在各步骤间平衡1-2分钟。

    将所有复合物的数据编入索引中，积分并使用HKL2000(24)程序套件按比例绘图。数据收集统计概述于表1中。

    结构测定和精修

    使用结合MeAdoMet的原生AdoMetDC的结构(PDB 1I7B)作为搜索模型，并且使用CNS程序套件，利用分子置换法测定所有复合物的结构(25)。使用程序O建立MAOEMA和MAOBEA复合物的模型(26)。使用程序coot建立AdoMetDC F223A突变体与MeAdoMet的复合物的模型(27)。利用fo-fc差异图和合成省略图(composite omitmap)测定配体分子的构象。使用hic-up服务器(hic-up server)产生配体的参数和拓扑文件(28)。差异图还显示在所有三种结构中结合腐胺的分子的密度。复合物的精修统计提供于表2中。

    MeAdoMet在AdoMetDC活性位点中的分子模型

    利用程序Macromodel 7.2版测定配体在AdoMetDC活性位点的优势构象(29)。碱基原子的壳层包括在活性位点的20.0埃内的任何残基(来自pdb 1I7B)，并用作构象搜索和能量最小化的起始模型。将配体添加到活性位点，随后去除水分子并进行适当的氢处理。配体的氨基末端与丙酮酰基之间形成共价键。

    使所得结构经历50,000个混合蒙特卡洛MCMM/低模式构象搜索步骤(mixed MonteCarlo MCMM/lowmode conformational search step)(30)(31)，使活性位点周围5埃壳层中的残基移动。然而，残基H5、E67、C226和E247固定不动。使用AMBER*力场(介电常数为4的距离依赖性电介质(distance dependent dielectric))(32，33)和TNCG最小化技术(TNCG minimization technique)(34)，将所产生的结构能量最小化成0.05kJ/mol的梯度。采用此搜索的全局最小值(收敛后)并以0.01kJ/mol的梯度(刚好使配体能移动)进行微调。出于完全性考虑，碱基分别以顺式和反式构象开始，执行所述工作。锍离子的AMBER*参数是由马克汉姆博士(Dr.Markham)等人所进行的工作改编得到(35)。

    MAOBEA在AdoMetDC活性位点中的模型

    通过使用构象搜索和分子力学，使用程序Macromode 7.2版，建立MAOBEA末端三个原子的模型。由于已通过电子密度以高精确度确定配体与蛋白质的剩余部分的位置，故在构象搜索期间，蛋白质和配体中除最后三个原子外的所有原子都固定不动。在构象搜索期间，围绕C5-C4和C4-O1键进行扭转。使用AMBER*力场(介电常数为4的距离依赖性电介质)和TNCG最小化技术，将由蒙特卡洛搜索产生的结构最小化成0.01kJ/mol的梯度。快速预览前5种能量最小的结构显示，其极为相似并且研究所述搜索的全局最小值，以获得MAOBEA中无序的末端原子的坐标。

    AdoMetDC活性分析和抑制剂IC₅₀值测定

    通过测量¹⁴CO₂从S-腺苷酰基-L-[羧基-¹⁴C]甲硫氨酸(安发玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)，约60mCi/mmol)中的释放，来分析AdoMetDC(36)。在这些条件下分析30ng C末端经his标记的AdoMetDC，在背景值为30和每纳克蛋白质每分钟活性为约1.5pmol下，得到约7000cpm。为了测定化合物抑制AdoMetDC的能力，在无抑制剂的情况下以及在至少5种浓度的各可能抑制剂存在下，测定酶活性。通过曲线拟合抑制剂浓度对AdoMetDC的抑制％的图，测定IC₅₀值。

    结果

    MeAdoMet在AdoMetDC活性位点中的模型

    AdoMetDC与MeAdoMet或抑制剂MHZPA和MAOEA的复合物的晶体结构显示，配体以不常见的顺式构象结合腺嘌呤碱基。²³AdoMetDC中结合MeAdoMet的活性位点残基显示于图1中。然而，NMR数据结合分子模型研究表明，在溶液中，AdoMet根据能量最低原则呈现反式构象。³⁵关于结合AdoMet的晶体结构的研究显示所述底物呈具有一定范围的糖苷扭转角(glycosidic torsion angle)的位置，并且揭示出，在大部分结构中，优选反式构象，但在一些结构中观察到顺式构象。³⁵为了说明配体结合AdoMetDC的优势构象和相关能量学，建立MeAdoMet在AdoMetDC活性位点中的模型。由于MeAdoMet通过与丙酮酰基共价键结而限制在AdoMetDC的活性位点，故并未进行涉及位置和定向采样(orientational sampling)的对接(docking)。而是使用混合蒙特卡洛/低模式构象搜索法，在MacroModel程序内进行构象搜索，以确定AdoMet在AdoMetDC活性位点中的密集低能量构象。^29-31构象搜索是以呈反式或顺式构象的AdoMet开始，并且在各情况下，关于腺嘌呤核苷，搜索得到的5种能量最低的结构均展现顺式构象。模型结构与晶体结构的叠加(图1B)表明，构象搜索的结果与以结晶学方法观察到的结果完全相符。同样对结合AdoMetDC的AdoMet、5′-脱氧-5′-(二甲基锍基)腺苷(MMTA)、MHZPA和MAOEA进行构象搜索，并且其各自得到所述碱基的顺式构象(资料未图示)。核糖与E247形成关键的氢键，而腺嘌呤碱基堆积于F7与F223之间，并且与E67主链的酰胺和C末端羧基形成氢键。迫使碱基呈顺式构象的主要相互作用为碱基与F223和F7的π-π堆积效应，以及碱基与E67主链之间的两个氢键。

    AdoMetDC活性位点中的虚拟突变

    进行虚拟突变以研究各个残基对经结合核苷构象的影响。使用MeAdoMet在活性位点中的AdoMetDC F223A和F7A单氨基酸突变体，利用MacroModel程序进行构象搜索，在低能量集合中得到顺式和反式构象的混合物。在各突变存在下，全局最小值为腺嘌呤碱基的反式构象后紧跟着顺式构象，其中能量差为约0.5kcal/mol。在F223A突变体中，以反式构象结合的配体的全局最小能量构象展现出相对于采用顺式构象的第二最小能量构象异构体的主要变化。在F223A结合位点中，具有全局最小能量结构的核糖移位，并与E247和C226而非单独E247形成氢键(图2A)。这一变化使配体自身弯曲，锍堆积于腺嘌呤碱基上，并且腺嘌呤碱基与S66形成三个氢键。在F7A结合位点中，配体采用与利用F223A突变体类似的构象。F223残基经历扭转变化，以容纳配体的构象变化，并且还堆积有腺嘌呤碱基(图2B)。在进行虚拟突变的酶活性位点中，配体低能量结构中反式构象的存在显示苯基对于维持野生型酶结合位点内配体的顺式构象的重要性。还获得F223A突变体与MeAdoMet的复合物的晶体结构。

    AdoMetDC和F223A突变体的三级结构

    人AdoMetDC(hAdoMetDC)二聚体为四层的αββα夹心型结构。酶原是由334个氨基酸残基组成，并且酶自加工得到α和β亚基。²⁰自加工得到具有丙酮酰基辅助因子的活性酶。丙酮酰基位于N末端β折叠(β-sheet)的末端，而且活性位点涉及两个β折叠的残基。腐胺(活化hAdoMetDC的自加工和脱羧反应)的结合位点位于野生型酶内远离配体结合位点处。酶纯化的实验条件包括浓度足以确保腐胺结合位点的高占有率的腐胺。在晶体结构中，残基1-4、21-27、165-173、288-299、329-334之间的环是无序的。AdoMetDC F223A突变体的结构类似于野生型蛋白。

    AdoMetDC F223A突变体与MeAdoMet的复合物的晶体结构

    使用分子置换法解析hAdoMetDC F223A与MeAdoMet的复合物的晶体结构。fo-fc密度差异显示，MeAdoMet与酶共价结合，并且腺嘌呤碱基采用清晰的顺式构象(图3)。与所预期的一样，合成省略密度图未显示F223的密度。核糖与E247形成两个氢键，由此将配体锚定，并且碱基通过与F7的堆积相互作用以及与E67形成的氢键而保持顺式构象。在突变蛋白质中，腐胺结合位点中每个单体存在一分子腐胺。MeAdoMet在F223A结构中与在原生结构中的叠加显示，配体的位置或构象都没出现明显变化。在野生型蛋白质中无序的环在突变体中同样无序。

    可能的hAdoMetDC抑制剂的合成和生物化学分析

    通过在腺嘌呤8位用甲基到苯基进行取代，合成数种AdoMet结构类似物。随后分析所述各化合物抑制hAdoMetDC的能力，并测定抑制的IC₅₀值(表3)。

    如化学合成部分中所述，所测试的抑制剂分为四组。第1组(7a-c、9a-f、12)在C-5′具有氨基氧基烷基侧链，其可与AdoMetDC的丙酮酸形成希夫碱。^18，41，42这一组化合物为有效灭活剂，其中4-氨基氧基丁基略优于添加2-氨基氧基乙基。第2组化合物(13d、e、f、j、k、l、m)在C-5′具有酰胺或酰肼侧链，而第3组抑制剂(14a、b、d、e、f；15a、b、c、d；17c、d)在C-5′具有氨基烷基氨基侧链。18a和18c也与第3组的合成方法有关，其分别在C-5′侧链的末端具有胍和酰胺肟。第2组和第3组的化合物不太有效(尤其具有氨基烷基氨基、胍或酰胺肟侧链者)，但很可能在体内条件下稳定。最后一组化合物是由5′-二甲基氨基(19a、b)或5′-二甲基锍基(21b、d)化合物组成。先前曾报导，化合物21d为K_i值在微摩尔浓度(μM)范围内的AdoMetDC抑制剂。⁴³如表3所示，用氮置换硫将使AdoMetDC的失活略有改良。

    在所述各组内，当将8-甲基取代基添加到腺嘌呤环中时，出现了一致的抑制剂活性改良。IC₅₀值降低在化合物9d的3.4倍到化合物19a和13d的15-17倍间变化。当将腺嘌呤8-甲基取代基添加到化合物12(MAOEA)中，形成化合物7a时，效力增加8倍。这与以下观念一致：腺嘌呤上8-甲基取代使相应核苷偏向于顺式构象，并且此为在活性位点结合的形式。腺嘌呤的8-羟基取代基使效力相对于无取代基情形略有增加，但不如8-甲基取代基有效(比较9c与9e和9e)。较大的8位取代基不会改良功效。将8-苯基加到化合物12、9f和14d中会消除抑制活性。例如8-乙基(比较9d与9e、13d与13e以及17c与17d)或8-甲基氨基(比较7a与7b以及17c与14a)等较小基团添加为可接受的，但不如8-甲基。

    7a的晶体结构

    使用分子置换法解析利用7a的原生hAdoMetDC的晶体结构。如上文所述，7a的结构类似于先前研究的抑制剂MAOEA，但其在腺嘌呤碱基的8位具有甲基取代。电子密度显示，7a的氨基末端与酶的丙酮酰基形成希夫碱。与所预期的一样，7a的腺嘌呤碱基在晶体结构中采用顺式构象。7a的复合物的电子密度显示于图4A(5A)中。在腐胺结合位点中结合有1分子腐胺。

    9e的晶体结构

    使用分子置换法解析利用9e的原生hAdoMetDC的晶体结构。9e与MAOEA类似，但腺嘌呤碱基8位上为乙基取代基，并且叔氮(靠近核糖)与末端氮之间具有两个额外碳原子。核糖与氨基末端之间长键联基团的存在使此配体特别值得进行研究。电子密度图显示并无有关丙酮酰基与配体氨基末端之间形成的希夫碱的密度。不存在配体末端三个原子的密度，并且配体剩余部分的密度明显(图4B)。通过使用分子模型，建立呈现能量最有利构象的最后三个原子的模型，来获得所述原子的位置。丙酮酰基周围的密度对其极为适合，并且并无任何证据显示希夫碱形成。核糖与E247形成关键的氢键并锚定配体。碱基保持顺式构象，并通过π-π堆积稳定。碱基上乙基取代基的密度得到完全确定，并且指示末端乙基并非无序的。

    讨论

    通过丙酮酰基界定AdoMetDC的活性位点。利用由酶与先前报导的抑制剂MHZPA、MAOEA、MeAdoMet、MGBG和CGP48664A的复合物获得的晶体结构，阐明各种配体在活性位点的相互作用²³。共价结合至酶的MeAdoMet的晶体结构与在活性位点中的底物AdoMet极为相似。晶体结构显示出MeAdoMet与酶的关键相互作用包括：1.核糖氧与E247的氢键结；2.腺嘌呤环与F223和F7的堆积相互作用；3.腺嘌呤环6-氨基取代基与E67末端羧基的氢键结；和4.腺嘌呤环N¹与E67酰胺N-H的氢键结(图1A)。在MHZPA和MAOEA与hAdoMetDC的复合物的结构中也存在类似相互作用。在这三种结构中，腺嘌呤碱基的糖苷角在128°到139°的范围内，这表明衍生自腺嘌呤的核苷特别偏好顺式构象。顺式构象是通过腺嘌呤碱基与F223和F7的π-π堆积以及与蛋白质主链的氢键结稳定。MGBG和CGP48664A与酶的复合物的晶体结构显示，其堆积于两个苯环之间，并与E247和蛋白质的其它残基形成氢键。

    如先前所述，通过使用混合蒙特卡洛/低模式构象搜索，实施MeAdoMet在hAdoMetDC活性位点中的分子模型化。在构象搜索期间，糖苷扭转角自由旋转，这将在能量最小化之前产生多种可与活性位点的空间限制相容的旋转异构体。低能量结构显示，衍生自腺嘌呤的核苷更倾向于在hAdoMetDC的活性位点中呈现顺式构象。马克海姆(Markham)等人已研究出AdoMet在溶液中和在真空中的构象偏好³⁵。基于¹H NMR的研究以及基于NMR限制的计算显示，AdoMet在溶液中偏好反式构象，并且在真空中偏好顺式构象。在溶液中，反式构象与相应顺式构象之间的能量差(包括空间、静电和溶剂化的贡献)为约-34kJ/mol。晶体结构和模型化结果显示，酶更倾向于以能量不利的顺式构象结合配体，而且与蛋白质中含有芳香族环的残基的π-π相互作用将帮助维持此构象。平行几何结构中的典型π-π相互作用产生2-3kcal/mol的稳定化作用⁴⁴。存在多种稳定化因素来帮助配体在结合至酶期间克服糖苷扭转能障。可有助于使核苷的顺式构象稳定的其它因素涉及锍离子与腺嘌呤碱基的相互作用。在哈特里-福克(Hartree Fock)6-31G**水平下，对F223和F7位于AdoMet附近(基于晶体结构pdb id 1I7B)的AdoMet进行从头计算(Ab initio calculation)，以获得单点能量和原子上的相应电荷。这些计算值显示，腺嘌呤碱基N³的电荷为-0.79，并且与携带+0.39电荷的锍离子的距离为3.4埃(数据未图示)。因此，这两个原子间存在可使顺式构象稳定的有利的静电相互作用。

    先前已通过晶体结构和动力学实验研究F223和F7在AdoMetDC中的作用²³。AdoMetDC与如MGBG和CGP48664A等抑制剂所形成的晶体结构显示，苯环产生涵盖MGBG整个长度和CGP48664A双环的堆积结构。由hAdoMetDC F223A和F7A突变体与底物AdoMet的反应得到的动力学数据显示，F7A突变体的特异性常数(k_cat/k_m)降低45倍，并且F223A突变体降低1400倍。有关如MGBG和CGP48664A等抑制剂进行抑制的动力学数据显示，当与野生型酶相比较时，两种突变体的IC₅₀值明显增加。F223A突变体的活性降低高于F7A突变体。相比F7环，腺嘌呤碱基更接近F223环的事实也支持这些发现。已对MeAdoMet在hAdoMetDC F223A突变体活性位点中的结构和构象特性进行研究。

    进行利用虚拟突变的构象搜索，以便了解F223和F7对于稳定顺式构象的作用。与利用野生型酶的结构(其中在低能量结构集合中仅观察到顺式构象)进行的计算相比，由两种突变体得到的全局最小值具有呈反式构象的碱基，并且次高能量结构具有呈顺式构象的碱基。这些构象之间的能量差为约0.5kJ/mol，在基于分子力学的计算的误差限度内。两种结构的顺式与反式构象之间的能量差较低，并且如从活性位点中结合有MeAdoMet的hAdoMetDC F223A的X射线结构可看出，酶实际上更倾向于以顺式构象结合配体。因此，尽管模型研究无法准确预测到F223A突变体中将维持核苷的顺式构象，但可能从这些研究推断出，核苷与酶的结合亲和力将降低。

    由hAdoMetDC F223A与MeAdoMet所形成的晶体结构的数据显示出清晰的呈顺式构象的腺嘌呤碱基的密度。腺嘌呤碱基与F7残基仍保持有利的π-π相互作用，而且核糖与E247形成两个关键氢键。这些发现显示，一对π-π相互作用与静电相互作用可使碱基保持顺式构象，而且F7残基有助于维持MeAdoMet和其它配体在活性位点的构象。

    AdoMetDC与MHZPA、MAOEA、MeAdoMet、MGBG和CGP48664A所形成的结构显示，E247有助于与配体形成关键氢键，从而使配体保持适合于活性位点的适当构象。²³大部分核苷的核糖氧常常会与酶的天冬氨酸、谷氨酸或羰基形成关键氢键，从而使其保持提供催化活性的适当构象。在AdoMetDC中，AdoMet类似物中的核糖与E247通过形成两个氢键而保持在适当位置，这便利在末端氮与丙酮酰基之间形成希夫碱，而且可使腺嘌呤碱基处于一定位置以堆积于苯环之间。hAdoMetDC F223A的晶体结构显示，MeAdoMet的核糖仍与E247形成两个氢键，这些氢键将其限制在使腺嘌呤碱基有利地与F7π-π相互作用并获得顺式构象的构象。

    本发明确定，将甲基加到腺嘌呤C⁸中将产生对于酶的抑制活性为未经取代的母体化合物的8到18倍的化合物，因此，此为本发明的一个优选方面。然而，如上文所提及，本发明范围内的各个方面也涵盖未经取代的母体化合物。具有较大取代基(例如超过3个碳原子)的某些化合物并未提供优于未经取代母体化合物的益处，因此，其并非本发明的优选方面。实际上，8-苯基取代基使化合物抑制hAdoMetDC的能力低得多。活性位点的模型研究表明，在腺嘌呤呈顺式构象的情况下，应存在足够的空间以容纳较大基团。对于腺嘌呤C⁸取代基所占区域进行的较为详细的观察表明，此区域接近溶剂界面。因此，尽管空间上存在足够的地方容纳较大取代基，但所选取代基都为不与邻近溶剂界面相容的疏水性基团。根据生物化学结果，疏水性基团不完全包埋于蛋白质疏水腔内的代价随取代基尺寸变大而增加，这一代价明显高于使抑制剂偏向于顺式构象所得到的增益。

    化合物7a的结构类似于先前研究的MAOEA，并且在腺嘌呤碱基的8位上具有甲基取代。7a与hAdoMetDc的复合物的晶体结构显示出清晰的与丙酮酰基形成的希夫碱的密度，表明其作为AdoMetDC抑制剂所起作用类似于MAOEA。核糖与E247形成氢键，腺嘌呤碱基以顺式构象堆积，腺嘌呤碱基的6-氨基取代基与E67主链的羧基形成氢键，并且E67的酰胺氢与腺嘌呤环N³形成氢键。带明显负电荷的N³氮与在生理相关质子化状态下具有形式正电荷的叔氮之间的距离为2.94埃，小于在相应位置具有硫原子的MeAdoMet中所见的距离。腺嘌呤环上的甲基取代基也迫使碱基呈顺式构象，并使静电效应增强，由此解释了当与在腺嘌呤C⁸处无取代基的MHZPA和MAOEA相比时，N³氮与叔氮之间的距离有所降低的原因。

    结合AdoMetDC的多种AdoMet类似物的结构显示，其通过与酶的丙酮酰基形成希夫碱来抑制酶。这些抑制剂中叔铵/硫与末端氮之间的键联基团的长度为3-4个原子，这使得希夫碱的形成在几何学上和空间上都是可行的。9e的键联基团长度为5个原子。9e复合物的电子密度图显示在丙酮酰基后密度降低，表明未形成希夫碱。配体存在良好密度，但三个末端原子除外，其为无序的并且没有密度。使用分子力学将最后三个原子的位置固定在能量有利的构象。键联基团区中的5个原子似乎会使希夫碱的形成处于空间上不利的状态。配体通过与E247形成氢键以及与F7和F223的π堆积相互作用而牢固地保持在活性位点中，由此允许极小移动以容纳调节到较长键联基团区和形成希夫碱可能需要者。

    AdoMetDC可通过最初在溶液中与高度密集的反式构象相互作用，随后诱导腺嘌呤碱基旋转成顺式构象，或可通过结合已呈顺式构象的底物/配体来结合底物/配体，所述底物/配体的溶液平衡浓度较小，并且只需极少量构象变化。结果表明，8位取代将增加呈顺式构象的抑制剂分子群体，由此增加对AdoMetDC的抑制。然而，AdoMetDC结合配体的确切机制尚不明了。

    实验部分

    诱变和质粒构建

    如先前所述，制造基于pQE30载体的质粒，以在大肠杆菌中产生重组野生型和F223A突变体hAdoMetDC，用于结晶学研究。²³这一构建体利用MRGS(H)₆GS-替换N末端甲硫氨酸以便通过固定金属亲和色谱法进行纯化。使用一种也基于pQE30载体的不同质粒产生蛋白质以用于hAdoMetDC酶分析。在此质粒中，(H)₆标签位于羧基端，代替了末端的-QQQQQS。(H)₆标签的位置不会改变纯化酶的活性。

    蛋白质表达和纯化

    根据埃克斯托姆(Ekstrom)等人所述的方案，纯化野生型hAdoMetDC。²⁰编码所述酶的质粒在pQE30载体中，并转化到大肠杆菌JM109菌株的细胞中。在37℃下，使细胞在LB培养基中生长，得到过夜培养物，随后将其引入较大细胞培养物中，其中两种培养物都含有100mg/mL氨苄西林。使细胞生长，直到其O.D₆₀₀值达到0.6，随后用100mg/L异丙基1-硫基-β-D吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。使细胞在15℃下生长过夜，随后通过离心收集，使用含有20mM Na₂HPO₄(pH 7.0)、500mM NaCl、2.5mM腐胺、0.02％布里杰-35和10mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤，并在-80℃下存储。将冷冻的细胞小球解冻，悬浮于洗涤缓冲液中，并使用法式滤压壶在1500psi下进行溶解。借助离心，在12000g下分离细胞碎片与溶解产物。用洗涤缓冲液平衡塔隆金属亲和色谱树脂，随后小心地将溶解产物与树脂旋转在一起，历时1.5小时。将树脂装载到柱上，并用体积相当于柱体积的15-20倍的洗涤缓冲液洗涤。接下来，以相同方式，用含有25mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤柱。随后，用含有100-200mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。将洗脱的蛋白质浓缩到约10ml，并使其通过经10mM Hepes(pH 7.5)、2.5mM腐胺、5mM DTT、0.1mM EDTA、0.02％布里杰-35和300mM NaCl预平衡的葡聚糖凝胶G-75柱。使缓冲液通过柱，并利用UV在280nm下鉴别含有蛋白质的部分。将蛋白质浓缩到约10mg/mL，并在-80℃下存储。F223A突变体的纯化与原生酶类似。

    结晶

    在冰上解冻蛋白质，并使用伯乐公司的缓冲液更换色谱柱(伯乐生命医学产品有限公司，加州海克里斯94547)，将缓冲液更换成10mM Hepes(pH 7.5)、200mM NaCl和1mM DTT。将原生蛋白质与4-6倍摩尔过量的9e和7a一起培育24小时，然后结晶。将F223A突变体稀释到约6mg/mL，并且与4-6倍摩尔过量的MeAdoMet一起培育24小时，然后结晶。使用悬滴法，在22℃下使原生复合物和突变体复合物的晶体在13-16％PEG 8000、100mM Tris(pH 8.0-9.0)和10mM DTT中生长。一夜间出现晶体并稳定1-2周。

    数据收集和处理

    在利用理学RU-300旋转阳极式发生器产生的Cu Kα辐射的布鲁克CCD检测器(Bruker CCD detector)上的源代码处收集7a复合物的数据。使用ADSC奎腾315检测器，在先进光子源(APS)NE-CAT束线的8BM基站，收集9e复合物的数据。使用ADSC奎腾4检测器，在CHESS的F2基站收集利用AdoMetDC F223A与MeAdoMet所形成的复合物的数据。在液氮或液氮流下快速冷冻所有晶体。晶体的衍射质量与晶体的冷冻保护密切相关。将晶体依序转移到含有孔溶液的溶液中，其中所述孔溶液含2％、5％、8％、15％和18％甘油，其中在各步骤间平衡1-2分钟。

    将所有复合物的数据编入索引中，积分并使用HKL2000(24)程序套件按比例绘图。数据收集统计概述于表1中。

    结构测定和精修

    使用结合MeAdoMet的原生AdoMetDC的结构(PDB 1I7B)作为搜索模型，并且使用CNS程序套件，利用分子置换法测定所有复合物的结构。²⁵使用程序O建立7a和9e复合物的模型。²⁶使用程序coot建立AdoMetDC F223A与MeAdoMet的复合物的模型。²⁷利用fo-fc差异图和合成省略图测定配体分子的构象。使用hic-up服务器产生配体的参数和拓扑文件。²⁸差异图还显示在所有三种结构中结合腐胺的分子的密度。复合物的精修统计提供于表2中。

    MeAdoMet在AdoMetDC活性位点中的分子模型

    利用购自薛丁格公司(L.L.C)的Macromodel 7.2版²⁹测定配体在AdoMetDC活性位点的优势构象。将蛋白质截短至原子壳层，其包括含有在位于AdoMetDC活性位点中的MeAdoMet的20.0埃内的原子的任何残基(来自pdb 1I7B)，并用作构象搜索/能量最小化的起始模型。从所述“对接壳层(docking shell)”中去除水分子，随后在薛丁格公司蛋白质制剂效用的帮助下进行适当氢处理，所述蛋白质制剂效用有助于使活性位点氨基酸产生适当离子状态和组氨酸互变异构体，并通过一系列限制能量最小化法使蛋白质的潜在能量梯度减到最小。为进行构象搜索，将适当配体加到活性位点中，并且在适当时，使配体氨基末端与丙酮酰基之间形成共价键。

    使所得结构经历50,000个混合蒙特卡洛MCMM/低模式构象搜索步骤^30，31，使在活性位点周围5埃壳层内的残基能够在所述搜索的各蒙特卡洛/低模式步骤以及随后的能量最小化步骤期间自由移动。所有其它蛋白质原子都被限制在其初始位置。残基H5、E67、C226和E247也被限制在其初始位置。当能量梯度低于0.05kJ/mol时，考虑收敛能量最小化步骤。使用距离依赖性介电“常数”进一步减小到1/4的AMBER*力场^32，33进行计算，而且能量最小化依赖于TNCG最小化技术。³⁴利用能量最小化法进一步精修全局最小值和(收敛后)全局最小值在15kJ/mol内的低能量结构集合，直到梯度小于0.01kJ/mol，此时配体刚好能在此后续能量最小化程序期间移动。所有蛋白质原子在此过程中都被限制在其初始位置。出于完全性考虑，核苷分别以顺式和反式构象开始，执行所述工作。锍离子的AMBER*参数是由马克汉姆博士等人所进行的工作改编得到。³⁵9e在AdoMetDC活性位点中的模型

    如上文所述，通过使用利用Macromodel 7.2版进行的构象搜索，建立9e末端三个原子的模型。由于已通过拟合由X射线衍射法测定的电子密度，以高精确度确定配体与蛋白质的剩余部分的位置，故在构象搜索期间，蛋白质和配体原子中除最后三个非氢原子和其所连接的氢外的所有原子都固定不动。在构象搜索期间，围绕C5-C4和C4-O1键进行扭转。快速预览前5种能量最小的结构显示，其极为相似并且利用所述搜索的全局最小值，以获得9e中无序的末端原子的坐标。

    AdoMetDC活性分析和抑制剂IC₅₀值测定

    通过测量¹⁴CO₂从S-腺苷酰基-L-[羧基-¹⁴C]甲硫氨酸(安发玛西亚生物技术公司，约60mCi/mmol)中的释放，来分析AdoMetDC(36)。在这些条件下分析30ng C末端经his标记的AdoMetDC，在背景值为30和每纳克蛋白质每分钟活性为约1.5pmol下，得到约7000cpm。为了测定化合物抑制AdoMetDC的能力，在无抑制剂的情况下以及在至少5种浓度的各可能抑制剂存在下，测定酶活性。通过曲线拟合抑制剂浓度对AdoMetDC的抑制％的图，测定IC₅₀值。

    目标合成

    在安莱尔科技公司(Analtech)的预涂(250μm)硅胶的GF板上进行TLC分析。在Mel-Temp型数字式熔点仪(Mel-Temp apparatus)上测定熔点并且未经校正。在墨克(Merck)硅胶(230-400目)上进行快速色谱法纯化。利用旋转蒸发器进行蒸发，在真空(＜1mm，浴温为35℃)中去除沸点较高的溶剂(DMF、吡啶)。在真空(＜1mm)中，在22-25℃下经P₂O₅干燥产物。利用瓦里安-MAT 311A质谱仪(Varian-MAT 311A massspectrometer)以快原子轰击(FAB)模式，或使用利用电喷雾电离(ESI)的布鲁克BIOTOFII(Bruker BIOTOF II)，获得质谱数据。¹HNMR质谱记录于以300.635MHz操作的尼克莱NT-300NB质谱仪(Nicolet NT-300NB spectrometer)上。在CDCl₃和Me₂SO-d₆中的化学位移是从四甲基硅烷(TMS)往低磁场移动以百万分率表示，并且在D₂O中的化学位移是从3-(三甲基硅烷基)丙酸-2，2，3.3-d₄钠(TMSP)往低磁场移动以百万分率表示。所列多重峰的化学位移(δ)是由近似中心开始测量，并且峰面积的相对积分与所预期的指定结构的积分值一致。UV吸收光谱是通过将各化合物溶解于MeOH或EtOH中，并用0.1N HCl、pH 7缓冲液或0.1N NaOH稀释10倍，在珀金埃尔默λ19光谱仪(Perkin-Elmer Lambda 19 spectrometer)上测定。括号里的数字为消光系数(ε×10^-3)。显微分析是由亚特兰大麦博公司(Atlantic Microlab，Inc.)(佐治亚州亚特兰大(Atlanta，GA))或南方调查研究所(Southern Research Institute)的光谱和分析部门(Spectroscopicand Analytical Department)进行。利用元素符号表示的分析结果都在理论值的±0.4％内，并且其中溶剂是以化学式表示，其存在是通过¹HNMR确定。

    在溶液中，AdoMet维持顺式到反式和介于其间的一系列构象。AdoMetDC可通过获得高度密集的反式构象，随后使腺嘌呤碱基旋转成顺式构象，或通过直接从溶液中获得呈顺式构象的配体而无需构象变化，来结合底物/配体。上述结果显示，顺式构象密集的配体的存在将增加对AdoMetDC的抑制。AdoMetDC结合配体的确切机制尚不明了。

    表1：AdoMetDC复合物的数据收集统计

    

    括号里的值是关于最高分辨率壳层。

    表2：AdoMetDC复合物的精修统计学

    

    表3.蛋白质抑制剂抑制hAdoMetDC的能力。

    如“材料和方法”中所述，分析各可能抑制剂抑制hAdoMetDC的能力。使用至少5种浓度的各化合物，并通过曲线拟合抑制剂浓度对hAdoMetDC抑制％的图，来计算IC₅₀值。

       化合物  IC₅₀  7a  7nM  7b  86nM  7c  在100μM下＜5％抑制  9a  49nM  9b  在100μM下＜5％抑制  9c  11nM  9d  5nM  9e  15nM

       化合物  IC₅₀  9f  18nM  12(MAOEA)  55nM  13d  400nM  13e  4μM  13f  在100μM下＜5％抑制  13j  7μM  13k  170nM  13l  1.5μM  13m  31μM  14a  440μM  14b  在100μM下＜5％抑制  14d  500μM  14e  在100μM下＜5％抑制  14f  88μM  15a  在100μM下＜5％抑制  15b  在100μM下＜5％抑制  15c  在100μM下＜5％抑制  15d  在100μM下＜5％抑制  17c  70μM  17d  420μM  18a  在100μM下＜5％抑制  18c  157μM

       化合物  IC₅₀  19a  600nM  19b  9μM  21b  3μM  21d  15μM

    图注

    下表显示本发明各化合物的化学式。

    

    

    已发现，本申请案中所揭示的化合物可抑制S-腺苷甲硫氨酸羧酶，因此潜在适用于治疗哺乳动物且尤其人类的肿瘤和癌症。此外，本申请案中的化合物适用于治疗寄生虫感染，例如原虫感染，包括锥虫病、疟疾，或由卡氏肺孢子虫引起的感染肺部炎症，例如肺部炎症。

    图式说明

    图1：hAdoMetDC的晶体结构以及与由模型得到的结构的比较。A.绘示hAdoMetDC在活性位点中与MeAdoMet所形成的实际晶体结构。活性位点的丙酮酰基以绛红色显示。配体碳原子以绿色显示。MeAdoMet与丙酮酰基形成希夫碱。核糖与E247形成两个氢键(以红色显示)。腺嘌呤碱基以不常见顺式构象堆积于F223与F7之间。腺嘌呤碱基与Glu67主链之间的氢键使顺式构象稳定。

    B.将由MeAdoMet在AdoMetDC活性位点中的模型(以较深的阴影显示)得到的结构叠加到所述实际晶体结构(以较浅的形状显示)上。模型建立的结果与实验测定出的晶体结构一致。

    图2：hAdoMetDC F223A和hAdoMetDC F7A与MeAdoMet所形成的复合物的模型。

    MeAdoMet在hAdoMetDC的F223A突变体(A)和F7A突变体(B)活性位点中的模型的全局最小值(有关细节，参看材料和方法)。丙酮酰基以仅次于最深阴影显示，并且配体碳原子以仅次于最浅阴影显示。在这些复合物中，腺嘌呤碱基呈反式构象。核糖与E247形成一个氢键，并且与C226主链羰基形成另一个氢键。腺嘌呤碱基与S66形成3个氢键。在F7A模型(B.)中，F223残基改变其构象以与呈反式构象的MeAdoMet腺嘌呤碱基堆积。

    图3：MeAdoMet在AdoMetDC F223A突变体活性位点中的晶体结构。

    显示实验测定出(参看“材料和方法”)的MeAdoMet与AdoMetDC F223A的复合物的结构。配体与连接链的碳原子以仅次于最浅阴影显示。轮廓在2.5巧的1fo-fc密度显示腺嘌呤碱基呈顺式构象，以及末端氮与丙酮酰基之间形成希夫碱。在所述图的计算中，省略丙酮酰基与S69残基。核糖与E247形成两个关键氢键。腺嘌呤环与F7堆积，并与E67主链形成两个氢键。

    图4：hAdoMetDC的可能抑制剂的结构。如“材料和方法”中所述，合成所有化合物。

    图5：hAdoMetDC与酶的两种抑制剂的相互作用。A.显示实验测定出的hAdoMetDC与MAOEMA的复合物结构(有关细节，参看材料和方法)。配体与连接链的碳原子以仅次于最浅阴影显示。

    轮廓在1.0巧的合成省略图的密度显示以顺式构象堆积的腺嘌呤碱基以及希夫碱的形成。出于清楚起见已省略E67。B.显示实验测定出的MAOBEA在活性位点中的hAdoMetDC的结构。配体碳原子以仅次于最浅阴影显示。轮廓在3.0σ的1fo-fc密度显示，腺嘌呤碱基以顺式构象堆积。电子密度中不存在希夫碱形成的证据，并且不存在配体末端3个原子的密度。在所述图的计算中，省略丙酮酰基。最后三个原子的位置是通过建立模型测定。

    调配物

    本发明的化合物可以独立治疗剂或治疗剂组合的形式通过可供与医药剂联合使用的任何常规方式投予。其可单独投予，但通常与根据所选投药途径和标准医药实践选择的医药载剂一起投予。化合物还可与其它治疗剂联合投予，所述其它治疗剂例如干扰素(IFN)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、复合干扰素(CIFN)、利巴韦林(ribavirin)、金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(remantadine)、白细胞介素-12、熊去氧胆酸(UDCA)和甘草甜素(glycyrrhizin)。

    所属领域技术人员众所周知本文所述的医药学上可接受的载剂，例如媒剂、佐剂、赋形剂或稀释剂。通常，医药学上可接受的载剂在化学性质上对活性化合物呈惰性，而且在使用条件下无有害副作用或毒性。医药学上可接受的载剂可包括聚合物和聚合物基质。

    本发明化合物可以个别治疗剂或治疗剂组合的形式通过可供与医药剂联合使用的任何常规方法投予。

    所投予的剂量当然将视已知因素而变化，例如特定药剂的药物动力学特征以及其投药模式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度；同时治疗的种类；治疗频率；和所需作用。预期活性成分的每日剂量可为每公斤(kg)体重约0.001到1000毫克(mg)，其中优选剂量为0.1到约30mg/kg。

    剂型(适于投药的组合物)含有每单位约1mg到约500mg活性成分。在这些医药组合物中，活性成分通常以组合物总重量计以约0.5-95重量％的量存在。

    活性成分可以例如胶囊、片剂和散剂等固体剂型或者例如酏剂、糖浆和悬浮液等液体剂型经口投予。其也可以无菌液体剂型不经肠投予。活性成分还可经鼻内(鼻滴液)或通过吸入药粉雾投予。其它剂型也有可能，例如经由贴片机制或油膏透皮投予。

    适于经口投予的调配物可含有：(a)液体溶液，例如有效量的化合物溶解于例如水、生理盐水或橙汁等稀释剂中；(b)胶囊、药包、片剂、锭剂和药片，其各自含有预定量的固体或颗粒形式的活性成分；(c)散剂；(d)于适当液体中的悬浮液；和(e)适当乳液。液体调配物可包括稀释剂，例如水和醇类，例如乙醇、苯甲醇、丙二醇、甘油和聚乙二醇，其中添加或未添加有医药学上可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。胶囊形式可为含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂(例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉)的常见硬壳或软壳明胶型胶囊。片剂形式可包括一种或多种以下物质：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶状二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学可相容载剂。锭剂形式可包含于调味剂、通常蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中的活性成分，并且口含锭包含于例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶等惰性基质中的活性成分，乳液和凝胶除含有活性成分外，还含有例如所属领域中已知的载剂。

    可将单独或与其它适当组分组合的本发明化合物制成气雾剂调配物以经由吸入投予。可将这些气雾剂调配物放入例如二氯二氟甲烷、丙烷和氮气等加压可接受推进剂中。对于非加压制剂，其也可调配成例如喷雾器或雾化器中的医药剂。

    适于不经肠投予的调配物包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预定接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。化合物可以添加或未添加医药学上可接受的表面活性剂(例如肥皂或清洁剂)、悬浮剂(例如果胶、卡波姆(carbomer)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其它医药佐剂的医药载剂中的生理学上可接受的稀释剂投予，所述载剂例如无菌液体或液体混合物，包括水、生理盐水、右旋糖水溶液和相关糖溶液、醇类(例如乙醇、异丙醇或十六烷醇)、二醇类(例如丙二醇，或聚乙二醇，例如聚(乙二醇)400)、甘油缩酮(例如2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇)、醚类、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或者乙酰化脂肪酸甘油酯。

    可用于不经肠调配物中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、石蜡油和矿物油。适用于不经肠调配物中的适当脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和豆蔻酸异丙酯为适当脂肪酸酯的实例。适用于不经肠调配物中的适当肥皂包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，并且适当清洁剂包括(a)阳离子清洁剂，例如二甲基二烷基卤化铵和卤化烷基吡啶鎓盐；(b)阴离子清洁剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸酯，烷基、烯烃、醚以及单甘油酯硫酸酯和磺基琥珀酸酯；(c)非离子清洁剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d)两性清洁剂，例如β-氨基丙酸烷酯和2-烷基咪唑啉季铵盐；和(e)其混合物。

    不经肠调配物通常在溶液中含有约0.5重量％到约25重量％活性成分。所述调配物中可使用适当防腐剂和缓冲剂。为使注射部位的刺激最小或消除注射部位的刺激，所述组合物可含有一种或多种亲水-亲脂平衡值(HLB)为约12到约17的非离子表面活性剂。所述调配物中表面活性剂的量在约5重量％到约15重量％的范围内。适当表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及环氧乙烷与由环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水性基质的高分子量加合物。

    所属领域技术人员还熟知医药学上可接受的赋形剂。赋形剂的选择将部分由特定化合物以及用于投予组合物的特定方法决定。因此，有多种适当的本发明医药组合物的调配物。以下方法和赋形剂仅为例示性的，而并非限制。医药学上可接受的赋形剂优选不会妨碍活性成分的作用并且不会引起不利副作用。适当载剂和赋形剂包括例如水、乙醇和丙二醇等溶剂、固体吸收剂和稀释剂、表面活性剂、悬浮剂、片剂粘合剂、润滑剂、调味剂和着色剂。

    调配物可存在于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中，并且可在冷冻-干燥(冻干)条件下存储，只需要在即将使用前添加例如注射用水等无菌液体赋形剂即可。即时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。所属领域技术人员众所周知关于用于可注射组合物的有效医药载剂的要求。参看制药学和药剂实践(Pharmaceutics and Pharmacy Practice)，利平科特公司(J.B.Lippincott Co.)，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)，班克(Banker)和查尔姆斯(Chalmers)编，238-250(1982)；和美国卫生系统药师杂志-可注射药物手册(ASHP Handbook on Injectable Drugs)，托伊西尔(Toissel)，第4版，622-630(1986)。

    适于局部投予的调配物包括锭剂，其包含于调味剂、通常蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中的活性成分；口含锭，其包含于例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶等惰性基质中的活性成分；和漱口液，其包含于适当液体载剂中的活性成分；以及乳膏、乳液和凝胶，其除含有活性成分外，还含有例如所属领域中已知的载剂。

    另外，适于直肠投予的调配物可通过与例如乳化基质或水溶性基质等多种基质混合而呈栓剂形式。适于阴道投予的调配物可呈子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾配方的形式，其除含有活性成分外，还含有例如所属领域已知适当的载剂。

    适当的医药载剂描述于雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，麦克出版公司(Mack Publishing Company)(此领域的标准参考书)中。

    在本发明的情况下，投予动物、尤其人类的剂量应足以在合理时间段内影响动物的治疗反应。所属领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包括动物的病状、动物的体重以及所治疗的病状的严重程度和阶段。

    适当剂量为将在患者体内产生已知影响所需反应的活性剂浓度的剂量。优选剂量为引起对所治疗的病状的最大抑制并且无难以处理的副作用的量。

    剂量大小也将由投药途径、时程和频率以及可能伴随化合物的投予和所需生理学作用的任何不利副作用的存在、特性和扩展确定。

    投予本发明化合物的有用医药剂型可说明如下：

    硬壳胶囊

    通过用100mg粉末状活性成分、150mg乳糖、50mg纤维素和6mg硬质酸镁分别填充标准两件式硬质明胶胶囊，来制备大量单位胶囊。

    软质明胶胶囊

    制备活性成分于例如大豆油、棉籽油或橄榄油等可消化油中的混合物，并借助于正排量泵(positive displacement pump)将其注入熔融明胶中以形成含有100mg活性成分的软质明胶胶囊。洗涤胶囊并干燥。可将活性成分溶解于聚乙二醇、甘油与山梨糖醇的混合物中以制备与水混溶的药剂混合物。

    片剂

    通过常规程序制备大量片剂，以致剂量单位为100mg活性成分、0.2mg胶状二氧化硅、5mg硬质酸镁、275mg微晶纤维素、11mg淀粉和98.8mg乳糖。可涂覆适当水性和非水性涂层以增加可口性、改良外观和稳定性或延缓吸收。

    立即释放片剂/胶囊

    立即释放片剂/胶囊为通过常规和新颖方法制成的固体口服剂型。这些单位是经口服用，无需水来使药物立即溶解和递送。将活性成分混入含有例如糖、明胶、果胶和甜味剂等成分的液体中。通过冷冻干燥和固态提取技术使这些液体凝固成固体片剂或囊片。可将药物化合物与粘弹性和热弹性糖和聚合物或起泡组分一起压制，以产生预期在无需水的情况下立即释放的多孔基质。

    此外，本发明化合物可以鼻滴液或定剂量和鼻或口腔吸入剂的形式投予。所述药物是由经鼻溶液以薄雾形式或由散剂以气雾剂形式递送。

    关于这些申请案，本发明方法包括对动物、尤其哺乳动物并且更具体地说人类投予治疗有效量的有效抑制S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶，或抑制寄生虫感染，或抑制由卡氏肺孢子虫引起的感染或瘤形成和肿瘤生长的化合物。

    前述描述说明和描述了本发明。此外，本发明仅展示和描述优选实施例，但如上文所述，应了解本发明能用于各种其它组合、修改和环境中，并且能在如本文所表述、与上述教示和/或相关技术的技能或知识相符的概念范围内加以改变或修改。另外，预期本文所述的实施例将说明申请人所知的最佳模式，而且使所属领域其他技术人员能够利用所述或其它实施例中的揭示内容，和其特定应用或用途所需的各种修改。因此，预期所述描述将不会局限于本文所述的形式。另外，预期随附权利要求书应解释为包括替代性实施例。

    所属领域技术人员将易于从以上实施方式而对本发明的其它目的和优势显而易见，在以上实施方式中，仅简单地借助于最佳模式的说明展现和描述优选实施例。如将意识到的，本发明能够具有其它和不同实施例，并且在不偏离本发明的情况下，可对各个明显方面的多个细节加以修改。因此，所述描述应实际上视为说明而非限制。

    本说明书中所引用的所有公开案、专利和专利申请案都是以引用的方式并入本文中，并用于任何和所有目的，其引用程度就如同将各个别公开案或专利申请案具体而个别地以引用的方式并入一般。

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