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用于改善口服肌酸的骨骼吸收的肠溶包衣的可溶性肌酸和聚乙二醇组合物
    相关申请

    本申请要求2007年6月5日递交的美国临时申请第60/942,176号的优先权，并通过引用将该临时申请的全部内容并入本申请中。

    【技术领域】

    本发明涉及适合用作饮食肌酸的来源的肌酸制剂，以及其使用方法。

    背景技术

    已知饮食摄入的肌酸单水合物优先通过骨骼肌吸收。实际上，运动员大量使用肌酸作为饮食补充剂来提高成绩。这是因为，当肌酸存在于肌肉组织(在其中其以磷酸肌酸的形式储存)中时，肌酸会与二磷酸腺苷(ADP)反应而恢复三磷酸腺苷(ATP)水平并提供肌肉活动所需的能量。通过摄入肌酸，运动员能够使他们的肌肉组织负载更高水平的磷酸肌酸，并能够更好地维持肌肉活动。

    尽管许多形式的肌酸(包括肌酸单水合物和多种酯)在体外是稳定的，但已知肌酸和肌酸单水合物在体内(即在胃里存在的酸性环境中和在下消化道的碱性条件中)通常不稳定。例如，已知肌酸单水合物(其为肌酸的通常的摄入形式)在胃里很快分解而形成肌酸酐。而且，因为肌酸单水合物在冷水或室温的水中不容易完全溶解，因此常常将其溶解在果汁和其它酸性液体中，这也加速了肌酸分解为肌酸酐和排泄。由于这些原因，其它形式的肌酸，特别是肌酸乙基酯，已成为产品开发的焦点。然而，这些化合物也存在溶解度和分解的问题。

    在建立稳定形式的肌酸(其中当存在于胃里和小肠中时可以更好地防止肌酸分解)的工作中，进行了如下实验：其中在酸性催化剂(包括H₂SO₄、HCl和H₃PO₄)的存在下，将聚乙二醇与肌酸反应。尽管使用多种有机酸和无机酸催化剂，温度在20-100℃变化，但肌酸聚乙二醇酯没有以实质的量形成和/或快速分解为肌酸酐。另外，所得到的肌酸聚乙二醇酯在反应混合物的低pH环境中、在分析测试方法中或在与胃等效的酸性环境中没有表现出期望的稳定性水平。

    因此，首先用肌酸单水合物然后用肌酸HCl替代起始肌酸化合物，在产物结果上并没有改善。

    为了避免分解，选择不同的途径制备可接受的聚乙二醇酯。不使用肌酸作为起始原料，而是使用肌酸乙酯和肌酸乙酯HCl作为起始原料，并在酸性和碱性条件下与聚乙二醇反应以将乙酯酯交换为肌酸聚乙二醇酯和乙醇。该途径产生了类似的结果，即，肌酸聚乙二醇酯的产量低，且很快分解为肌酸酐。

    使用高效液相色谱(HPLC)法测定各种起始原料和期望的聚乙二醇酯的纯度。这些测试方法清楚地显示了肌酸化合物分解为肌酸酐。特别是酯类化合物比起始原料肌酸、肌酸单水合物和肌酸HCl分解得更快。测试方法本身也导致肌酸化合物在测试过程中的分解。使用碱性和酸性流动相两者进行薄层色谱(TLC)，显示出类似的结果。

    还测试了其它可商购的肌酸酯类例如肌酸乙酯和肌酸乙酯HCl在低pH环境中的稳定性。出人意料地，发现通常认为能够更好地抵抗分解的乙酯类也和肌酸、肌酸单水合物以及肌酸HCl一样很快地分解为肌酸酐。

    肌酸的溶解度和分解问题通常导致摄入肌酸的低吸收。当吸收低时，必须摄入高剂量以获得在血液和肌肉中的所需水平。为了实现此目的，通常采用每天摄入20-30g的肌酸补充剂的方案以补偿肌酸在溶解时分解和/或消化分解为肌酸酐的实质性的损失。不幸的是，由于肌酸酐的毒性，在消化道里存在实质性量的肌酸酐会导致消化问题例如严重的痉挛。

    因此仍需要开发其中肌酸的形式可以抵抗快速分解为肌酸酐(即在胃和肠的酸性和碱性环境中稳定)，但是最终被骨骼肌更高效地吸收的肌酸制剂。

    【发明内容】

    本发明的肌酸制剂的最优选的实施方案包括用肠溶衣包衣的肌酸盐酸盐(本文中的肌酸·HCl)和聚乙二醇。尽管PEG组分的平均分子量可以变化，并且实际上，PEG链长的范围可以有实质性的变化，但适合人类使用的PEG组分的平均分子量的优选范围为150-9000。PEG组分的平均分子量的更优选的范围为3015-4800。最优选的PEG的平均分子量为3150-3685。

    肌酸等同物与PEG的优选比例(重量百分比)为99∶1-50∶50。更优选的范围为95∶5-90∶10。

    肌酸制剂的肌酸等同物的优选的每日剂量为每天0.1-10克。用于保持之前的肌酸负载方案的保持剂量的可选剂量为每天0.5-2克的制剂的肌酸等同物成分。特别是对老年人而言，预期每天0.01-0.5克的制剂的肌酸等同物的更低剂量具有有益效果。对于肌肉萎缩性疾病或病症或对于患有肌骨骼紧张的患者的治疗剂量可以大于这些水平，并且可以高至每天10-20克。

    预期其它可溶性肌酸(即在室温水溶液中比肌酸单水合物(肌酸·H₂O)更易溶解的肌酸形式)可以与PEG结合以形成待用肠溶衣包衣的混合物或分散体。

    进一步预期本发明的肌酸制剂可以用于使帕金森氏症和肌肉萎缩性疾病的症状最小化。推荐较高的剂量例如每天2-20克以使帕金森氏症和肌肉萎缩性疾病和病症的症状最小化。

    【附图说明】

    将附图并入本申请并作为说明书的一部分，其例举了本发明的非限制性实施方式，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。

    图1图示说明了在本申请中描述的实验研究中与摄入本发明的制剂和对照补充剂相关的采血样的时间线。

    图2说明了与图1中提及的和本申请中描述的研究相关的循环肌酸浓度水平。

    图3说明了与图1中提及的和本申请中描述的研究相关的细胞ATP水平和肌酸水平。

    图4说明了与图1中提及的和本申请中描述的研究相关的磷酸肌酸与ATP的比例、游离肌酸与ATP的比例、以及总肌酸与ATP的比例。

    图5说明了与图1中提及的和本申请中描述的研究相关的血清肌酸酐水平。

    【具体实施方式】

    本发明的肌酸制剂包含用肠溶衣包衣的可溶性肌酸和聚乙二醇(PEG)。PEG组分的最优选形式的平均分子量为3015-3685并且以商品名PEG 3350出售，其在环境温度下是硬的不透明的白色粒状固体。可溶性肌酸的最优选形式是肌酸·HCl盐，其在室温下优选以粉末或晶体形式获得。本发明最优选的制剂是肌酸·HCl盐在PEG3350中的固体分散体，然后用肠溶衣将该分散体包衣。然而，可以用于本发明制剂中的其它形式的肌酸是可溶性肌酸，其在本文中定义为在室温水溶液中比肌酸单水合物(肌酸·H₂O)具有更好的溶解度的食品级质量的那些肌酸盐。

    其它优选的PEG是不透明的粒状固体，包括平均分子量为1305-1595的PEG(例如，PEG1450)、平均分子量为3600-4400的PEG(例如，PEG4000)、或平均分子量为4400-4800的PEG(例如，PEG4600)、和平均分子量为7000-9000的PEG(例如，PEG8000)。还优选平均分子量为6000-7500的PEG(例如，PEG6000)。

    肌酸制剂的肌酸负载优选的每日剂量为在本发明制剂中含有每天0.1-10克的肌酸等同物。在最优的选实施方式中，这是指每天摄入0.1-10克的肌酸·HCl形式的肌酸等同物。在本发明制剂中，可适于保持之前的肌酸负载方案的维持剂量的可选剂量为每天0.5-2克的肌酸等同物。在本发明制剂中，预期每天0.01-0.5克的肌酸等同物的更低剂量仍具有有益效果，并且特别地可以适用于用于老年人的口服补充剂。相反，在本发明制剂中也可以预期每天10-20克的肌酸等同物的更高剂量。

    为了比较常规的肌酸·H₂O补充剂与本发明的最优选的可溶性肌酸(其是肠溶衣包衣的肌酸·HCl/PEG组合物)的吸收效力，对17名健康男性研究参与者进行了测试。所选的参与者具有以下特征：

    年龄                    23.5岁±1.0岁

    身高                    176.1厘米(cm)±2.2cm

    体重                    84.8千克(kg)±4.0kg

    脂肪百分数(重量)        17.4％±2.5％

    将研究参与者随机分为对照组9名和实验组8名。在补充期间之前和之后静止、禁食采血样以监测与健康相关的变量。在补充期间之前和之后还进行肌肉活组织检查。

    在5天的补充期间，对照组每天摄入20克(gm/天)的肌酸·H₂O。实验组在5天中每天摄入10g的肌酸等同物，该肌酸等同物为肌酸HCl/PEG的形式，按如下重量百分比配制：约93％的肌酸HCl和7％的PEG，其用肠溶衣包衣，所述肠溶衣包含纤维素、藻酸钠、中链的甘油三酸酯和油酸和硬脂酸，然后制成片剂。在第一天补充后通过留置导管测定在摄入后的5个小时期间肌酸从消化道到血液循环的吸收。使用补充期间之前和之后的肌肉活组织检查来确定相关肌球蛋白重链(MHC)含量、细胞三磷酸腺苷(ATP)、磷酸肌酸、游离肌酸和总肌酸浓度。

    表1

    

    在研究最后，对照组和实验组都表现出显著的游离肌酸和总肌酸浓度升高。当将数值校正至ATP(摩尔比)时，这些差异仍是明显的。

    尽管在统计学上没有差异，但如按照下式计算的中等大小的效应值(effect size)所示，与肌酸·H₂O相比，肌酸HCl/PEG的肌酸吸收效率相当地大：

    

    显著地，在对照组和实验之间，肌酸的血液循环吸收明显不同，对照组的血液浓度(毫克每升每天-mg g·dL^-1)在摄入后2小时达到峰值(25.99±2.96mg g·dL^-1)，实验组的血液浓度似乎在摄入后5小时达到峰值(4.05±0.87mg g·dL^-1)。然而，非常有可能实验组没有完全达到峰值，这暗示了对于实验组，血液浓度可以在摄入5小时之后相当长的时间内很好地保持在升高的状况下，因此，实验组的曲线下的总积分面积在这里被低估了。但是，在5小时期间的曲线下的积分面积是对照组的7倍。

    对照组和实验组都表现出相似的相关肌球蛋白重链表达，这表示吸收似乎没有受到纤维特性的影响。

    尽管在补充期间摄入肌酸HCl/PEG的实验组(总共50g肌酸等同物)比摄入肌酸·H₂O(总共100g等同物)的对照组摄入的总肌酸少，但骨骼肌对肌酸HCl/PEG和肌酸·H₂O的吸收相似。

    以上总结的和当前描述的研究的详细信息包括在标题为“THEEFFECTS OF TWO CREATINE FORMULATIONS ON MUSCLE AND SERUMCREATINE LEVELS”的美国临时序列号No.60/942,176中，通过引用将该申请援引加入。该研究中的对照组在5天中摄入20g/天的粉状的肌酸·H₂O形式的肌酸等同物。该研究中的实验组在5天中摄入10g/天的片剂形式的肌酸HCl/PEG形式的肌酸等同物。对于所有完成该研究的参与者，对补充方案的依从性为100％。由于在补充之后5小时的采血样过程中不能将留置导管置于肘前浅静脉中，两名对象退出了该研究。这些对象均在实验组中。另外，对照组的一名对象的活组织检查样品在提取过程的离心步骤中损失。样品大小的最终结果是对照组n＝9，实验组n＝8。

    每天，在摄入肌酸之前，将带有盐水吊瓶的留置导管插入到每个参与者的肘前浅静脉中。用在摄入后5个小时的时间内取的样品测定肌酸和其它血液组成和成分的循环浓度。用内嵌活栓(inline stopcock)装置获得血液样品，因此可以得到多个样品。这些样品立即被冷冻并送至商业临床实验室分析。图1说明了在摄入后采血样的时间线。

    从股外肌获得之前和之后的肌肉活组织检查样品。立即将样品在液氮中冷冻并在-80℃下存储，用于随后的分析。冷冻样品称重至接近0.1mg，冷冻干燥8小时并再称重。提取组织样品，然后通过荧光检查分析肌酸、磷酸肌酸和ATP含量。

    在研究中使用如下的相关变量：

    ·说明-年龄、身高、体重、相对肥胖

    ·血液化学-葡萄糖、尿酸、BUN、肌酸酐、BUN/肌酸酐、钠、钾、氯化物、二氧化碳、钙、磷、总蛋白、白蛋白、球蛋白、A/G比例、胆红素、碱性磷酸酶、LDH、AST(SGOT)、ALT(SGPT)、铁。

    ·血液CBCw/分类/血小板-WBC计数、RBC计数、血红蛋白、血细胞比容、MCV、MCH、MCHC、RDW、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱细胞、嗜中性粒细胞(绝对值)、淋巴细胞(绝对值)、单核细胞(绝对值)、嗜酸性细胞(绝对值)、嗜碱细胞(绝对值)。

    ·尿液分析-pH、尿液颜色、外观、WBC酯酶、蛋白、葡萄糖、酮、潜隐血、胆红素、尿胆素原、半-Qn、亚硝酸盐、微观检验。

    ·血液循环肌酸吸收-摄入之前和之后的血液肌酸浓度(之前、15min、30min、1小时、3小时、4小时、5小时)。

    ·肌肉肌酸相关浓度-ATP浓度、CP浓度、游离肌酸(fCr)浓度、总肌酸(tCr)浓度、CP/ATP、fCr/ATP、和tCr/ATP。

    ·饮食记录-千卡、蛋白、碳水化合物、脂肪。

    下表2列出了摄入后的肌酸的血液浓度。对照组的浓度在15min显著升高，而实验组直至2小时仍没有显著升高。在摄入后的所有时间内两个组之间有明显的不同。曲线下的积分面积表明在5小时的采样期间内对照组具有大约7倍的较大血液浓度。但是，似乎5小时的采样期间可能不够长，因为实验组的值没有到峰值，这从图2下方的曲线可以明显地看出。

    表2-肌酸的血液循环浓度(mg·dL^-1±SE)

    

    下表3列出了总结数据，该数据在图3和4中示出，其显示了游离肌酸和总肌酸的肌肉浓度。对照组和实验组都表现出显著的游离肌酸和总肌酸升高。对于总肌酸的绝对值而言，显示出对照组约33％的升高以及实验组约26％的升高。在将这些值校正至ATP浓度后，这些升高仍很明显。在各组之间没有显示出差异。分析内(intra-assay)可靠度对于ATP和CP分析为CV＝2.8％，对于肌酸分析为CV＝1.2％。

    表3-ATP和肌酸浓度(X±SE)

    

    表4列出了与该研究有关的血液化学测试的结果。

    表4-血液化学(±SE)

    

    图5显示了血清肌酸酐浓度，其表明表示各组之间的差异。然而，尽管对于实验组的之后的平均值在正常范围的高的一端，但这些差异仍然处于健康个体的正常范围内。

    或许产生的最关键数据与肌肉的肌酸吸收有关。在研究开始时，对照组和实验组都表现出相似的ATP、磷酸肌酸、游离肌酸、和总肌酸。尽管剂量不同，但两个组在测试后都表现出类似的游离肌酸和总肌酸的升高。这表明了实验组对肌酸的吸收提高。如果活组织检查样品可能包含会影响结果的过量的血液或者结缔组织，则将肌酸水平校正到ATP水平，尽管该校正仍然导致游离肌酸和总肌酸的升高。似乎在本研究中，活组织检查样品比较相似，因为它们不含有过量的血液或结缔组织。在本研究中观察到的肌酸值与先前在肌酸科技文献中报道的值相似，尽管两个组在补充之后的总肌酸浓度都低于先前报道的值。

    应当注意到，尽管所有血清肌酸酐水平都在正常范围内，但在两个组的之后测试中有显著差异。尽管这可能仅仅是由于该变量的正常波动，但也可能实验组明显提高的细胞吸收使得更多的肌酸被细胞吸收并且最终分解为肌酸酐。

    实际操作中，尽管所有对象主观上都报告在吞咽该片剂的时候没有问题，但实验组使用的片剂的大小对于一些个体来说可能是成问题的。摄入10g剂量需要的片剂的数量(16)对一些人来说可能会觉得很大。如果一些片剂确实不能完全在消化道中溶解，可能导致较少的肌酸被吸收到血液中。然而，应该注意的是，仅有一位对象对此进行了报告，且其不能被任何研究小组所证实。

    总的来说，尽管在摄入之后5小时在血液中非常低的血液循环肌酸浓度，但自本研究获得的数据表明聚乙二醇(PEG)与肌酸分子的结合使得肌酸能更有效地被肌肉细胞吸收。尽管还不能完全理解在摄入后本发明的作用机制，但基于所测量的血液循环肌酸浓度，看起来实验组摄入的肌酸聚乙二醇从消化道中的清除更慢，并因此可以在更长的时间段内被个体所利用，这可能导致提高的肌肉吸收。因此，推测使用本发明的组合物可以摄入较低剂量的肌酸，同时保持最佳的负载动力学。

    本发明的肠溶衣包衣的PEG和可溶性肌酸混合物，特别是包括肠溶衣包衣的肌酸HCl分散在PEG中的的分散体的最优选的实施方式预期可以用于使帕金森氏症和肌肉萎缩性疾病的症状最小化。优选的剂量预期为每天0.1-10克的肌酸等同物。然而，还预期一旦已经出现了肌酸负载，则可以优选每天0.5-2克的肌酸等同物的较低剂量。预期每天0.01-0.5克的肌酸等同物的更低剂量仍具有有益效果，且当被老年人吸收时特别有利。相反，预期每天10-20克的肌酸等同物的剂量具有重要的治疗效果。

    在另一实施方式中，可以使用在液体PEG中的液体制剂，所述液体PEG例如平均分子量为190-210的PEG(例如，PEG200)、平均分子量为285-315的PEG(例如，PEG300)、平均分子量为380-420的PEG(例如，PEG400)、平均分子量为570-63的PEG(例如，PEG600)。

    而且，除了本发明的肌酸制剂的肠溶衣包衣的丸剂形式以外，可以预期其它常用的肠溶衣，例如其它形式如胶囊剂和其它剂型。

    预期本发明的肌酸制剂和其它实施方式可以特别地用于使帕金森氏症和肌肉萎缩性疾病和病症的症状最小化，包括但不限于多肌炎、由代谢疾病引起的恶病质、癌症引起的恶病质、神经性厌食、重症肌无力和横纹肌溶解。当本发明的肌酸制剂和其它实施方式用于使帕金森氏症和肌肉萎缩性疾病和病症的症状最小化时，预期每天2-20克的肌酸等同物的方案。