表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用.pdf

上传人:r5 文档编号:1205015 上传时间:2018-04-05 格式:PDF 页数:24 大小:2.31MB
返回 下载 相关 举报
摘要
申请专利号:

CN200910038587.4

申请日:

2009.04.13

公开号:

CN101857854A

公开日:

2010.10.13

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 5/10申请公布日:20101013|||专利申请权的转移IPC(主分类):C12N 5/10变更事项:申请人变更前权利人:广州和竺生物科技有限公司变更后权利人:广州赛吉生物科技有限公司变更事项:地址变更前权利人:510663 广东省广州市广州经济技术开发区广州科学城国际企业孵化器内A区A502变更后权利人:510663 广东省广州市广州高新技术产业开发区科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器内A区A501之一号房登记生效日:20120116|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/10申请日:20090413|||公开

IPC分类号:

C12N5/10; C12N15/85; C12N5/08; A61K35/28; A61K35/48; A61P9/10; A61P25/00

主分类号:

C12N5/10

申请人:

广州和竺生物科技有限公司

发明人:

邹清雁; 王尚武; 陈文明; 李远友

地址:

510663 广东省广州市广州经济技术开发区广州科学城国际企业孵化器内A区A502

优先权:

专利代理机构:

广州三环专利代理有限公司 44202

代理人:

刘宇峰

PDF下载: PDF下载
内容摘要

本发明涉及一种骨髓、脐带或脐血间充质干细胞及其在细胞移植、干细胞培养、扩增与定向分化领域的用途。本发明所述的表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞,该间充质干细胞是按以下步骤制备的:从骨髓、脐带或脐血中提取间充质干细胞;采用腺相关病毒(AAV)为载体,将神经营养因子家族相关基因重组到AAV载体上;制备表达神经营养因子家族相关基因的AAV;将上述AAV颗粒感染分离、纯化的间充质干细胞,得到表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞。本发明将其作为饲养层细胞为干细胞培养、扩增和定向分化提供人工可控的微环境,促进干细胞增殖和定向分化,以达到为人类疾病提供一种新的治疗手段。

权利要求书

1: 一种能表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞, 其特征在于, 所述间充质 干细胞是按以下步骤制备的 : A) 从骨髓、 脐带或脐血中提取干细胞 ; B) 采用腺相关病毒或者其它病毒载体或非病毒载体为载体, 将神经营养因子家族相关 基因重组到 AAV 载体上 ; C) 制备表达神经营养因子家族相关基因的 AAV ; D) 将上述 AAV 颗粒感染分离、 纯化的间充质干细胞, 得到表达神经营养因子家族相关 基因的间充质干细胞。
2: 根据权利要求 1 所述的间充质干细胞, 其特征在于 : 所述间充质干细胞的提取分离 方法采用密度递度离心法、 免疫吸附法、 流式细胞分筛法和细胞贴壁生长法。
3: 根据权利要求 1 所述的间充质干细胞, 其特征在于 : 所述步骤 B 中, 所述的其它病毒 载体或非病毒载体包括 : 腺病毒载体、 疱疹病毒、 慢病毒、 逆转录病毒等现行常用病毒载体 或非病毒载体如转座子、 原核或真核表达载体。
4: 根据权利要求 1 所述的间充质干细胞, 其特征在于 : 所述步骤 C 中, 所述的所述神经 营养因子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营养因子即 GDNF 和脑细胞源性神经营养因 子即 BDNF。
5: 根据权利要求 1 所述的间充质干细胞, 其特征在于 : 所述步骤 B 中, 包括以下步骤 : a) 神经营养因子家族相关基因的克隆及其 N 未端的构建 ; b) 含神经营养因子家族相关基因表达盒的 AAV 载体的构建。
6: 根据权利要求 4 所述的间充质干细胞, 其特征在于 : 所述步骤 a 中, 所述神经营养因 子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营养因子即 GDNF 和 / 或脑细胞源性神经营养因子 即 BDNF。
7: 根据权利要求 4 所述的间充质干细胞, 其特征在于 : 所述步骤 b 中, 所述神经营养 因子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营养因子即 GDNF 和脑细胞源性神经营养因子即 BDNF, 所构建的 AAV 载体为 pAAV-MCS 载体。
8: 如权利要求 1 所述的间充质干细胞用于促进骨髓干细胞或神经干细胞的培养扩增 的饲养层细胞的用途。
9: 如权利要求 1 所述的间充质干细胞用于促进骨髓干细胞或神经干细胞的定向分化 的饲养层细胞的用途。
10: 如权利要求 1 所述的间充质干细胞用于制备治疗神经系统疾病如脑血管疾病、 运 动神经元病和脊髓损伤等的药物制剂的用途。

说明书


表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用

    技术领域 本发明涉及一种间充质干细胞及其制备方法, 具体涉及骨髓、 脐带或脐血间充质 干细胞的分离、 培养和干细胞纯化及外源性基因如神经生长因子基因转移入间充质干细胞 的方法及其在细胞移植、 干细胞培养、 定向分化中的应用。
     背景技术 干细胞是正常人体内存在的细胞群体, 具有高度自我复制和高度的分化能力。近 年来随着干细胞研究的深入, 人们发现利用干细胞可再生各种组织器官, 如肝脏、 胰腺、 神 经组织、 骨骼、 肌腱等。
     因来源和分离的原因, 现阶段临床应用的干细胞主要有成人骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 和 造 血 干 细 胞 (hematopoietic stem cells, HSCs)、 人外周血干细胞、 人胚胎来源的干细胞和脐带血造血干细胞及胎盘或脐带间 充质干细胞。按 HSCs 来源分为 : 骨髓移植 (BMT)、 外周血造血干细胞移植 (PBSCT)、 脐带血 干细胞移植、 纯化的 CD34+ 细胞移植、 胎肝 HSCT。按免疫遗传学分为 : 异基因干细胞移植、 同基因干细胞移植、 自体干细胞移植。
     研究表明, BMSCs( 骨髓基质来源干细胞 ) 可以分化为成骨细胞、 成软骨细胞、 脂肪 细胞、 肌细胞、 神经细胞和腱细胞等, 是一种具有多向分化潜能干细胞, 在体外易分离和扩 增, 且便于细胞移植。此外, BMSCs 独特的增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达, 因此, BMSCs 在组织工程、 细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。
     干细胞领域研究最多和最清楚的仍是 HSCs, 它在基础与临床应用研究处干细胞的 最前沿, 并不断为其它干细胞研究提供理论和实践的指导和依据。
     干细胞可分为长期亚群和短期亚群, 长期亚群具有无限的自我更新能力, 在个体 中持续终生, 短期亚群自我更新能力有限, 如短期 HSCs 的自我更新能力仅维持 8 周左右 ; 根 据分化功能不同, 干细胞分为全能性干细胞、 多能性干细胞和单能性干细胞, 个体形成中最 早的干细胞为全能性干细胞, 包括受精卵及胚泡的内细胞团。全能性干细胞进一步形成原 始的生殖干细胞及体干 / 祖细胞, 并最终分化形成各种组织细胞。
     人类诸多疾病采用常规手段难以达到治疗效果, 基因治疗是将人的正常基因或有 治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷和发挥治疗作用, 从而达 到治疗疾病目的。基因治疗与常规治疗方法不同, 其针对的是疾病的根源 - 异常的基因本 身。基因治疗分体细胞基因治疗、 生殖细胞基因治疗和干细胞基因治疗。自从 1990 年美国 国立卫生研究院 (NIH) 和其下属重组 DNA 顾问委员会 (RAC) 批准了美国第一例临床基因治 疗申请以来, 基因治疗已从单基因遗传病扩展到多个病种范围, 主要有 : 恶性肿瘤, 心血管 疾病, 遗传病, AIDS, 类风湿等。
     理想的载体应具组织专一性, 甚至细胞专一性, 使其用常规方法注射到体内后即 可自动抵达目的细胞, 并把要移植的基因整合到染色体上。 由于用基因移植治疗的细胞, 必 须先从病人体内取出进行人工培养后, 再移植到病人体内, 因而基因治疗难度很大, 目前只
     有皮肤细胞和骨髓细胞可接受该处理, 而且能做到的治疗只是引入外源基因使其表达, 以 补充缺失的或失去正常功能的酶, 而不能做到用正常基因去替换突变基因。
     干细胞转基因治疗是继基因治疗的概念提出后, 用于遗传病治疗的新手段。主要 通过自体细胞核移植得到的胚胎来获取干细胞, 然后进行基因纠正和定向分化, 有望在遗 传病的治疗上获得突破, 并解决移植排斥问题。
     脑细胞源性神经营养因子 (BDNF) 是由脑细胞产生、 分泌的一种有着重要生物功 能的神经细胞营养因子。BDNF 对中枢和外周的多种神经细胞具有较为广泛的神经营养作 用, 如促进某些神经群的生存和分化, 调控神经突轴的轫力, 并与海马的学习、 记忆以及脊 髓疼痛机制有关等。BDNF 除了其神经生长作用之外, 还有促进内皮细胞生成和缺血组织新 生血管的生成, 促进累及早老性痴呆的主要神经元的功能恢复和成活。
     BDNF 对多巴胺神经元的生存和生长也有重要作用。它具有阻止凋亡细胞的死亡, 增加酪氨酸水解酶阳性神经元的生存和神经元纤维的生长。 研究证明数种中枢神经系统疾 病与此 BDNF 支持减少相关连。因此, BDNF 作为一种强效神经保护因子, 被认为是治疗某些 中枢神经系统疾病的一个好的候选因子。
     胶质细胞系来源的神经营养因子 (GDNF) 具有促进多巴胺能神经元和运动神经元 存活的作用, 能减少脑缺血时迟发性神经元的死亡和减轻脑缺血损伤后脑水肿和缩小梗死 体积。自从 GDNF 被克隆后, 其对神经损伤的保护作用已被众多的研究所证实, 外源性的 GDNF 转基因治疗可改善脑缺血的症状和病理改变。 发明内容 本发明的目的在于提供了一种可表达外源的神经营养因子家族基因的间充质干 细胞 (MSCs) 及其制备方法, 并提供了将该 MSCs 用于干细胞的体外培养、 扩增和定向分化的 用途。
     发明人在研究中发现, 年龄大 (60 周以上 ) 的大鼠骨髓干细胞和老年人 ( 大于 50 岁以上 ) 的骨髓干细胞, 在体外扩增时, 尽管有白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF)、 内皮生长因子 (epithelial growth factor, EGF) 和神经生长因子 (nerve growth factor, NGF) 存在的条件下, MSCs 仍不能有效和活跃的扩增。因此, 本发明用年轻 的胎大鼠 MSCs 作为 MSCs 培养的饲养层细胞扩增大龄鼠的 MSCs, 取得了较满意的结果。继 而本发明提出了 MSCs 和转基因 MSCs 用于骨髓干细胞培养、 扩增与分化的研究思路, 旨在促 进大龄动物或老年人或体外难扩增的 MSCs 的体外扩增和定向分化。
     本发明从骨髓、 脐带和脐血中提取培养 MSCs。 为了使干细胞能表达外源基因, 采用 重组腺相关病毒 (recombinant Adeno-Associated Virus, rAAV) 为载体将治疗用基因 - 脑 细胞源性神经营养因子 (BDNF) 基因 ( 人大脑来源 ) 转移入 MSCs, 从而实现 MSCs 和基因治 疗相结合。
     本发明所述的一种表达神经营养因子家族相关基因的 MSCs, 是按以下步骤制备 的:
     A) 从骨髓、 脐带和脐血中提取、 培养干细胞 ; 因它们均具有 MSCs 的生物学特征, 在形态上呈均质性, 高表达 CD166、 CD54、 CD29, 低表达 CD13、 CD34、 CD45, 因此以下均称为 MSCs ;
     B) 采用腺相关病毒 (Adeno-Associated Virus, AAV) 为载体, 将神经营养因子家 族相关基因重组到 AAV 载体上 ;
     C) 制备表达神经营养因子家族相关基因的 AAV ;
     D) 将上述表达神经营养因子家族相关基因的 AAV 颗粒感染分离、 纯化的干细胞, 得到表达神经营养因子家族相关基因的 MSCs。
     所述步骤 C 中, 所述的所述神经营养因子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营 养因子即 GDNF 和脑细胞源性神经营养因子即 BDNF。
     所述步骤 A 中, 采用离心法分离骨髓干细胞和脐血干细胞, 用免疫磁珠法纯化 CD34+ 细胞。具体方法如下 :
     1、 按 临床 常规骨髓 穿刺操 作每次取得 红骨 髓 200ml 或取 自脐 带血 库的脐 血 100ml。
     2、 将骨髓血或脐血加入到磷酸盐缓冲液 (PBS) 中轻匀, 常温离心机中以 1500r/ min 进行离心 15 分钟, 弃上清, 将沉淀物用磷酸盐缓冲液 (PBS) 轻轻悬浮, 细胞悬液按 2 ∶ 1 比例缓慢加入到比重为 1.089 的干细胞分离液和淋巴细胞分离液中, 20℃以 2500r/min 离 心 10 分钟。
     3、 离心管中液体分为四层, 小心吸取富含有核细胞的中间细胞层, 以 PBS 洗涤, 800r/min 常温离心 4 分钟。细胞计数。胎盘蓝染色, 活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分 析。
     4、 获得单个核细胞悬液后进行 CD34+ 细胞纯化 (MACS 磁性分离试剂盒, 购自 Miltenyi Biotech 公司, 德国 )。
     5、 纯化后的细胞悬液取样计数, 以 PE 标记的鼠抗人 CD34 单克隆抗体 ( 购自 Becton Dickinson 公司, 美国 ) 标记细胞, 流式细胞术测定 CD34+ 细胞纯度。
     6、 将纯化后的 CD34 阳性细胞用含 10%小牛血清的 DMEM/F12(Hyclone 公司 ) 培 养, 内含 LIF 1.0IU/ml, CSF 1.0ng/ml, bFGF 2ng/ml。 培养 24 小时后进行转基因技术操作。
     所述步骤 A 中, 采用胶原酶和胰酶消化法分离脐带 MSCs, 具体方法如下 :
     1、 将 产 后 脐 带 立 即 浸 入 4 ℃ 罕 氏 平 衡 盐 溶 液 (Hanks ′ Balanced Salt Solution(HBSS)(Gibco, 14185-052, USA) 中 ;
     2、 75 %乙醇消毒 30 秒, 清除脐带血管, 间质 (Wharton ′ s 胶 ) 于试管中切成 3 0.5cm 大小 ;
     3、 250g 离心 5 分钟, 去上清, 沉淀用 0.1M/L 的 PBS 洗三次 ;
     4、 250g 离心 5 分钟, 沉淀用 0.1%的胶原酶 37℃消化 18 小时 ;
     5、 洗涤, 再用 2.5%的胰酶 37℃消化 30 分钟 ;
     6、 收集消化后游离的 MSCs, 用含 10%小牛血清的 DMEM/F12(Hyclone 公司 ) 培养, 内含 LIF 1.0IU/ml, CSF 1.0ng/ml, bFGF 2ng/ml。培养 24 小时后进行转基因技术操作。
     所述步骤 B 中, 包括以下步骤 :
     a) 人神经营养因子家族相关基因克隆及其 N 未端的构建 ;
     b) 含神经营养因子家族相关基因表达盒的 AAV 载体的构建。
     上述步骤 a 中, 所述神经营养因子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营养因子 即 GDNF 和 / 或脑细胞源性神经营养因子即 BDNF。本发明经动物脑内移植实验证实骨髓或脐血 MSCs 在体内能分化形成神经元或神 经胶质细胞, 并且能稳定表达 GDNF。
     本发明从人骨髓中提取纯化骨髓 MSCs 的方法并不限于以上典型方法, 也可用如 下方法 : 物理方法如穿剌、 引流等从骨髓中获取骨髓血细胞。
     分离骨髓或脐血 MSCs 的方法可包括 :
     1、 贴壁分离法。 该法主要利用干细胞具有在塑料培养瓶中贴壁生长的特性将干细 胞与其它细胞相分离。
     2、 流式细胞分选法。该法是根据干细胞体积小、 相对缺少颗粒和独特的表面标志 等特性对其加以分离。
     3、 免疫磁珠法。该法是根据免疫学原理, 利用包备有抗体的磁珠与干细胞表面的 一些特殊标志如 CD34 特异结合, 通过一定强度磁场时被滞留而分选。
     4、 密度梯度离心法。该法是根据干细胞与其它细胞的密度不同, 实验证明间质 干细胞位于低密度细胞层。所采用的常用梯度分离液有 Percoll 和 Ficoll, Ficoll 法或 Peroll 法可有效地将造血干细胞从骨髓或脐血中分离出来, 且纯度较高, 细胞存活好。
     本发明将外源基因转入人骨髓或脐血 MSCs 的方法并不限于以上典型的 AAV 载体 的方法, 也可用如下的方法 : 1、 电穿孔法 ; 2、 脂质体法 ; 3、 钙磷法 ; 4、 病毒载体法如疱疹病毒载体、 巨细胞病毒 载体、 慢病毒载体、 逆转录病毒载体、 腺病毒载体 (ADV)、 腺相关病毒载体 (AAV) 等 ; 5、 非病 毒载体法如转座子法 (Transposon systems)、 原核 / 真核表达载体等。
     本发明所转入外源基因是与疾病发生、 预防和治疗相关的基因, 例如生长因子基 因 ( 表皮生长因子 (EGF)、 成纤维细胞生长因子 (FGF)、 血小板来源生长因子 (PDGF)、 脑源性 神经因子 (BDNF)、 神经生长因子 (NGF) 等 ), 营养不良蛋白 (dystrophin) 与假性肥大性肌 营养不良基因, 囊性纤维化与人 CFTR 基因, 粘多糖病与 β- 葡糖苷酸酶基因, 镰状细胞性贫 血与血红蛋白 S 基因, 侏儒症与生长激素基因和苯丙酮尿症与苯丙氨酸羟化酶基因, 白介 素 IL1-28, 干扰素和细胞趋化因子等基因, 转入病症相关外源基因的骨髓或脐血 MSCs 可用 于转入基因相关疾病的诊断和治疗。
     本发明将人源正常目的基因转入骨髓或脐血 MSCs, 在骨髓或脐血 MSCs 内表达、 分 泌有治疗功效目的基因产物蛋白质, 而构成的一种结合基因治疗、 达到对治疗相关疾病治 疗更有针对性、 疗效更显著的骨髓或脐血 MSCs。
     本发明将转入神经营养因子 ( 如 BDNF 和 GDNF) 基因的 MSCs, 用做饲养层细胞用于 某些特定个体 ( 如老年动物、 老年人、 患萎缩性疾病 ( 再障、 肿瘤化疗后和脑萎缩等 ) 和体 质差的患者 ) 的骨髓干细胞或神经干细胞培养扩增和维持未分化状态。
     本发明将转入神经营养因子 ( 如 BDNF 和 GDNF) 基因的 MSCs, 同骨髓干细胞或神经 干细胞共培养, 以促进骨髓干细胞向神经细胞方向定向分化, 而神经干细胞又可定向分化 成特定的神经细胞如多巴胺能神经元等。
     附图说明
     图1: 用干细胞分离液分离和免疫磁珠法纯化的的 CD34+ 骨髓干细胞, 干细胞特征 显示为细胞小, 核染色深, 胞质很少。图2: 培养中的骨髓 MSCs : 经过数代培养后, 骨髓 MSCs 扩增明显。
     图3 : 绿色荧光蛋白基因转染的人骨髓 MSCs 及其表达 : 应用基因转染技术, 将脂质 体包被绿色荧光蛋白基因表达质粒转染人骨髓 MSCs, 48 小时后, 用荧光倒置显微镜观察绿 色荧光蛋白基因在人骨髓 MSCs 的表达, 结果如箭头所示人骨髓 MSCs 表达绿色荧光蛋白基 因, 表达荧光强度达中度, 转染率达 20%以上。
     图4: 人神经营养因子 (BDNF) 基因 cDNA 片段 (RT-PCR) 产物 . 第一泳道为 DNA 分 子量标准 ; 第二和第三泳道为该基因反向转录酶 - 聚合酶链反应 (RT-PCR) 产物。箭头所指 为该基因 cDNA 片段在琼脂糖电泳上的位置。
     图5: 重组人神经营养因子 (BDNF) 的表达。此图为转化细菌后的表达产物在 SDS-PAGE 胶经卡马氏亮兰染色后的结果。从左向右起, 第一泳道为标准蛋白质分子量标记 物; 第二泳道为未诱导的细菌产物 ; 第三和第四泳道为诱导的产物。箭头所示为表达产物。
     图6: 该基因 BDNF 在表达产物的 Western Blot 分析结果。第一泳道为标准蛋白 质分子量标记物 ; 第二泳道为末诱导细菌产物 ; 第三、 第四和第五泳道分别为不同诱导时 间的产物。显示表达产物为符合预期的 BDNF 基因产物。
     图7: 转基因 MSCs 的上清能诱导 PC12 细胞的神经元样分化, 细胞轴突生长明显, 其末端膨大, 并可与周围神经细胞形成连接。 图8: 未转基因的 MSC 细胞上清共培养的细胞也有小量的神经突起形成, 而对照组 的 PC12 细胞仍为单个园型或多角型细胞呈集落生长。
     图9 : 共表达人源 GDNF 和 BDNF 基因表达盒结构图 : 从左到右, 分别是 pCMV 启动子、 β- 珠蛋白内含子、 人 GDNF、 IRES、 人 BDNF 和人生长激素多聚腺嘌呤组成。
     图 10 : 含共表达人源 GDNF 和人源 BDNF 基因表达盒的重组 AAV 基因组结构图 : 从 左到右, 分别为反转末端重复子 (ITR)、 共表达人源 GDNF 和 BDNF 基因的表达盒和反转末端 重复子 (ITR)。
     图 11 : 转 BDNF 基因的脐血 MSCs 与骨髓 MSCs 共培养, 细胞呈现梭形、 多角形、 锥形 或星形, 与神经细胞类似, 相互交织成网。
     具体实施方式
     实施例一 : 骨髓 MSCs 分离培养和绿色荧光蛋白基因转染人骨髓 MSCs
     绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 基因是目前发现的唯一能在细 胞内表达, 且不需要其他外源底物参与的全新报告基因。本研究利用 CMV-GFP 基因转染人 骨髓干细胞, 观察 GFP 在人骨髓干细胞内的表达情况。
     一、 材料
     1、 设备 : 超净工作台, 水平离心机, 倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天 平, 骨髓穿剌针和采血袋。流式细胞仪, 干燥箱, 手套和手术衣。比重计 (1.000-1.100、 1.100-1.200)
     2、 试剂 : 泛影葡胺 (Sigma 公司 ), 羟甲基纤维素 (Sigma 公司 ), 氯化铯 (Sigma 公 司 ), 聚蔗糖 (Ficoll-400, Phamacia 公司 ), 磷酸二氢钾、 氢氧化钠 ( 均为广州化学试剂 厂 )。
     3、 细胞培养基 : 含 10%小牛血清的高糖 DMEM 培养基 (Gibco 公司 )。4、 淋巴细胞分离液 ( 上海试剂二厂 )。
     5、 CD34 免疫磁珠试剂, 购自 premega 公司。
     6、 BD Procount progenitor Cell Enumeration Kit(BD 公司, 干细胞计数试剂盒, 批号 : NO.340498)
     7、 pGFP10II : 3192kb, 为含有野生型 GFP 基因 cDNA EcoR I 片段 ( 包括 ORF 和 3′ 端非编码区 ) 的 pBS 质粒 (invitrogen 公司 )。
     二、 方法
     1、 干细胞分离液的制备 :
     称取泛影葡胺 3g、 羟甲基纤维素 2g、 氯化铯 0.2g、 聚蔗糖 3g。将上述组分依次加 入 100ml 的量筒中, 加 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液至 100ml, 即得干细胞分离液的浓缩液。用 比重计测得其比重为 1.123g/ml。 使用时, 将上述干细胞分离液的浓缩液用 0.01mol/L 磷酸 盐缓冲液稀释至所需的比重, 即为工作液。
     2、 采集临床志愿者髂骨内骨髓
     按临床常规骨髓穿刺操作每次取得红骨髓 200ml。 将 20ml 骨髓加入到磷酸盐缓冲 液 (PBS) 中轻匀, 常温离心机中以 1500r/min 进行离心 15 分钟, 弃上清, 将沉淀物用磷酸盐 缓冲液 (PBS) 轻轻悬浮, 细胞悬液按 2 ∶ 1 比例缓慢加入到比重为 1.089 的干细胞分离液 和淋巴细胞分离液中, 20℃以 2500r/min 离心 10 分钟。离心管中液体分为四层, 小心吸取 富含有核细胞的中间细胞层, 以 PBS 洗涤, 800r/min 常温离心 4 分钟。细胞计数。胎盘蓝染 色, 活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。 3、 用免疫磁珠法纯化人骨髓干细胞
     CD34+ 造血干 / 祖细胞分离采用免疫磁珠法, 从骨髓血中分离的单个核细胞, 以 7 DMEM 调整细胞浓度至 10 /ml, 洗涤后加磁珠标记的单抗, 于 10℃, 孵育 15min, 过 Mini MACS 细胞分离柱, 脱离磁场, 加压洗脱结合的 CD34 阳性细胞即为纯化的骨髓干细胞。
     4、 免疫细胞化学和流式细胞检测。
     试剂盒操作详见说明书。将新鲜分离的细胞加入 Eppendoff 管 (106 细胞 / 管 ), 以 1500rpm 转速离心 5min, PBS 洗 1 次, 加入冷丙酮 1ml, 4℃固定 8min ; 离心弃上清后加入 一抗 (CD34、 CD45), 混匀后 37℃反应 45min, 1500rpm 转速离心 10min, PBS 洗 3 次, 离心弃上 清后加入带二抗标记的 IgG, 混匀后 37℃反应 30min, PBS 洗涤两次, 离心后的沉淀物视量加 入 PBS 制备成细胞悬液, 流式细胞仪进行检测。
     5、 人骨髓干细胞的培养与扩增
     取 2×106ml-1CD34+ 细胞种入培养瓶中, 加 DMEM 培养液含 20% FCS 和 LIF(1U/ml, GIBCO)、 SCF(50ng/ml, GLBCO)、 IL-3(200U/ml, GLBCO)、 GM-CSF(200U/ml, GIBCO)37℃、 5% CO240 小时后半量换液, 再培养 48 小时后分瓶培养扩增。以下所用细胞均为培养扩增的人 骨髓 MSCs。
     6、 进行 pEGFP-N1 质粒细胞转染, 用 Lipofectamine2000 脂质体转染法。
     三、 结果
     1、 各种分离液所得细胞经胎盘蓝染色显示, 细胞存活率均达 90%以上, 均未显示 对骨髓细胞有毒性作用。
     2、 用瑞氏染色法鉴定, 用干细胞分离液分离所得细胞主要为干细胞, 细胞小, 如红
     细胞大小, 核染色深, 胞质很少 ( 图 1)。
     3、 干细胞标志试剂盒和流式细胞仪鉴定骨髓干细胞干细胞标志试剂盒主要用于 鉴定骨髓造血干细胞, 其中 CD34 用于标志造血干细胞, CD45 用于标志淋巴细胞, PI 主要用 于标志有核细胞。经流式细胞仪测定, 干细胞分离液所得细胞悬液中 CD34、 CD45 和有核细 胞比例见表 1。结果提示 : 用 1.086 比重的干细胞分离液所得的 CD34 阳性细胞数比淋巴细 胞分离液所得的 CD34+ 细胞数多 12 倍。
     表 1, 不同比重干细胞分离液分离猪骨髓细胞各种标志的细胞比例
     4、 用免疫磁珠法纯化人骨髓干细胞, CD34 阳性细胞占 96.4%。
     5、 分离的骨髓 MSCs 经 4-5 代转代后, 细胞扩增明显, 大部分细胞呈梭型, 同心园状 分布, 少量细胞呈小圆型 ( 图 2)。
     6、 用 pEGFP-N1 质粒进行骨髓 MSCs 转染, 转染细胞荧光强度为中度以上, 绿色荧光 信号主要从胞体中发出 ( 图 3), 转染效果达 20%以上。
     实施例二 : 人 GDNF 和 BDNF 基因克隆及其 N 未端的构建
     1、 人 GDNF 基因克隆及其 N 未端的构建 :
     以人脑组织信息核糖核苷酸 (mRNA) 为模板, 用 Poly(T) 引物在反向转录酶作用 下, 合成人脑组织的互补脱氧核糖核苷酸 (cDNA), 然后以人脑组织 cDNA 作为模板, 用人工 合成的, 含有编码人白细胞介素 -2 分泌先导多肽核苷酸和人成熟 GDNF 基因 N- 末端序列核 苷酸的正向引物和人 GDNF 基因 C- 末端序列核苷酸的反向引物进行 PCR 扩增, 进行人 GDNF 基因克隆及其 N 未端的改建, 并在其 N- 末端引入内切酶 NheI 和 NdeI 位点, 在其 C- 末端 引入内切酶 BamHI 和 HindIII 位点。引物 1C- 末端部份序列与引物 2N- 末端部份序列相同 ( 见下划线 ) ; 引物 3C- 末端含 GDNF 的 C- 末端序列。
     由于人白细胞介素 -2 分泌先导多肽核苷酸较长, 故采用分步克隆法。即以人脑组 织 cDNA 作为模板, 先用引物 2 和引物 3 进行第一次 PCR 反应, 再以此 PCR 产物为模板, 用引 物 1 和引物 3 进行第二次 PCR 反应。
     PCR 引物设计如下 :
     引物 1(61mer) :
     5’ -gttacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt-3’引物 2(52mer) : 5’ -actaagtcttgcacttgtcacaaacagttctgagaagaagcgccggggatca-3’ 引物 3(34mer) : 5’ -tcaagcttggatcctcagatacatccacaccttt-3’PCR 扩增产物经加尾 (tailing) 加上腺嘌呤后, 连接至 T-easy 载体, 转化细菌后, 扩增、 抽提、 纯化, 经 DNA 测序确定。
     测 序 正 确 后,构 建 含 人 GDNF 基 因 原 核 细 胞 表 达 质 粒,进 行 表 达 和 westernblotting 检测。
     2、 人 BDNF 基因克隆及其 N 未端的构建 :
     以人脑组织信息核糖核苷酸 (mRNA) 为模板, 用 Poly(T) 引物在反向转录酶作用 下, 合成人脑组织的互补脱氧核糖核苷酸 (cDNA)。然后以人脑组织 cDNA 作为模板, 用人工 合成的, 含有编码人白细胞介素 -2 分泌先导多肽核苷酸和人 BDNF 基因 N- 末端序列核苷酸 的正向引物和人 BDNF 基因 C- 末端序列核苷酸的反向引物进行 PCR 扩增, 进行人 BDNF 基因 克隆及其 N 未端的改建。并在其 N- 末端引入内切酶 NcoI 和 SmaI 位点, 在其 C- 末端引入 内切酶 Xba1 和 HindIII 位点。引物 4C- 末端部份序列与引物 5N- 末端部份序列相同 ( 见 下划线 ) ; 引物 6C- 末端含 GDNF 的 N- 末端序列。
     由于人白细胞介素 -2 分泌先导多肽核苷酸较长, 故采用分步克隆法。即以人脑组 织 cDNA 作为模板, 先用引物 5 和引物 6 进行第一次 PCR 反应, 再以此 PCR 产物为模板, 用引 物 4 和引物 6 进行第二次 PCR 反应。 PCR 引物设计如下 :
     引物 4(63mer) :
     5’ -gtccatggcccgggatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt-3’
     引物 5(55mer) :
     5’ -actaagtcttggcacttgtcacaaacagtcactctgaccctgcccgccgaggggag-3’
     引物 6(41mer) :
     5’ -gcctctagaaagcttctatcttccccttttaatggtcaatg-3’
     PCR 扩增产物经加尾 (tailing) 加上腺嘌呤后, 连接至 T-easy 载体, 转化细菌后, 扩增、 抽提、 纯化, 经 DNA 测序确定。
     测序正确后, 构建含人 BDNF 基因原核细胞表达质粒, 进行表达检测。
     实施例三、 共表达 GDNF 和 BDNF 表达盒 pAAV-MCS 载体的构建
     共表达 GDNF 和 BDNF 表达盒 pAAV-MCS 载体的构建方法 ( 图 9, 10) 包括以下步骤 :
     1) 应用 AAV helper-free 表达系统中 pAAV-MCS 载体的多克隆位点, 将 GDNF 基 因以内切酶 BamHI 和 Xbal1 核苷酸片段、 经纯化、 并与 BamHI 和 Xbal1 酶切消化、 纯化的 pAAV-MCS 载体进行连接反应后, 转化感受态细菌, 进行扩增, 并涂布在含适当抗生素的培养 皿上, 37℃培养箱过夜生长 ;
     2) 筛选多个克隆菌落于含适当抗生素的培养液中, 37℃震荡培养过夜, 于第二天 抽取、 纯化 pAAV-MCS 质粒 DNA, 并用 BamHI 和 Xbal1 酶切消化, 以确定含有 BamHI 和 Xbal1 的 GDNF 基因片段的 pAAV-MCS 载体的质粒 DNA 和克隆菌株 ;
     3) 确定含有 GDNF 基因片段的 pAAV-MCS 之后, 以内切酶 HindIII 和 BglII 完全消 化含有 GDNF 基因的 pAAV-MCS 质粒 DNA, 1%琼脂糖分离、 纯化备用 ;
     4) 为获得 IRES 片段, 用内切酶 HindIII 和 Smal1 完全消化 pIRESneo3 载体 DNA, 1%琼脂糖分离、 纯化 IRES 片段备用 ;
     5) 用内切酶 Smal1 和 BglII 完全消化含有 BDNF 基因片段的 T-easy 载体 DNA, 1%
     琼脂糖分离、 纯化 BDNF 基因片段备用 ;
     6) 将上述内切酶 HindIII 和 Smal1 消化的 IRES 片段和内切酶 Smal1 和 BglII 消 化的 BDNF 基因片段经连结酶反应, 拼接到上述内切酶 HindIII 和 BglII 完全消化的含 GDNF 基因的 pAAV-MCS 载体质粒 DNA 上, 转化感受态细菌, 370C 培养扩增, 并涂布在含适当抗生素 的培养皿上, 37℃培养箱过夜生长 ;
     7) 筛选多个克隆菌落于含适当抗生素的培养液中, 37℃震荡培养过夜, 于第二天 抽取、 纯化 pAAV-MCS 质粒 DNA, 并用上述内切酶消化 pAAV-MCS 质粒 DNA, 确定含 GDNF 基因、 IRES 片段和 BDNF 因的 pAAV-GDNF/IRES/BDNF 质粒 ; 将此 pAAV-GDNF/IRES/BDNF 表达质粒 用脂质体导入真核细胞, 应用蛋白质印迹法, 观察由 CMV 启动子驱动共表达 GDNF 和 BDNF 的 状况。
     实施例四、 GDNF-AAV 的表达
     GDNF-AAV 的表达, 包括以下步骤 :
     1、 在转染前 48 小时, 在加入 10ml DMEM 生长培养液的 100 毫米培养皿中接种约 3 百万个 AAV-293 细胞, 2 天后细胞密度应为 70-80% ;
     2、 解冻含上述表达盒的 pAAV-MCS、 pAAV-RCH 和 pHelper 质粒 DNA, 用 pH 7.5 的 TE 缓冲液调整每种质粒 DNA 为 1mg/ml ; 3、 在 15 毫升培养管中从上述 3 种质粒溶液中各取 10 微升 DNA 溶液, 再加入 1 毫 升 0.4M CaCl2, 轻轻混匀 ;
     4、 在另一支 15 毫升培养管中加入 1 毫升 2x HBS 溶液, 再将上述 3) 中的 1.03 毫 升的 DNA/CaCl2 滴入 1 毫升 2x HBS 溶液中, 倒转培养管多次, 混匀 ;
     5、 立即将 DNA/CaCl2/HBS 混悬液滴入 AAV-293 细胞培养皿中, 并使其均匀分布在 培养液中 ;
     6、 将 AAV-293 细胞培养皿放入 37℃培养箱中 6 小时, 随后去除 AAV-293 细胞培养 皿中的培养液, 加入 10 毫升新鲜 DMEM 生长培养液, 在 37℃培养箱中培养 72 小时 ;
     7、 3 天后观察, 如观察到培养液颜色变化、 或看到有细胞形态变园, 脱离板面或漂 浮在培养液中, 则表明有重组 AAV 病毒颗粒产生 ;
     8、 此时收集细胞培养液、 并收集细胞, 通过 4 次冻 / 融法, 裂解细胞, 使其胞内重组 AAV 病毒释放出来, 最后在室温下以 10,000Xg 离心 10 分钟, 将上清液转移至另一新管中, 贮 存于 -80℃冰箱保存。此即为表达人源 GAD65 和 GDNF 基因的重组 AAV 母液, 下一步可进行 病毒扩增、 病毒滴定度检测及 GDNF 基因表达产物的检测。
     为了使骨髓或脐血 MSCs 能表达外源基因, 发明人采用 AAV 为载体, 以 CMV 为启动 子, 将 GDNF 基因转移入骨髓或脐血 MSCs。rAAV 载体由 AAV-293 细胞哺育生产, AAV 载体病 毒的纯化采用两次氯化铯离心法。
     1×106 细胞 /ml 的浓度加入培养瓶中进行培养 6-12 小时后, 换新的培养液。GDNF 在培养上清中的表达用抗 GDNF 单克隆抗体进行 ELASA 测定。
     实施例五、 脑细胞源性神经营养因子 (BDNF) 转基因骨髓 MSCs 的制备
     1、 材料
     1.1 主要试剂 : Trizol Reagent, LipofectamineTM2000( 美国 Invitrogen 公司 )。 逆转录酶 DNA 合成试剂盒 ( 美国 Fermentas 公司 )。T4DNA 连接酶 ( 美国 MBI 公司 )。PCR
     Kit(Qiagen 公司 ) ; BamHI 和 Xho I 限制性内切酶 (Promega 公司 ) ; 引物合成、 核苷酸序列 测定 (Qiagen 公司 ) ; Endofree Plasmid Maxi Kit(Qiagen 公司 ) ; 原位 - 半乳糖苷酶染色 试剂盒 (Stratagene 公司 ), DMEM 培养基 (Gibco 公司 )、 胎牛血清 ( 杭州四季青公司 ) ; 喜 树碱 (Sigma 公司 )。
     1.2 病 毒 载 体、 细 胞 株 及 菌 种 pAAV 系 列 质 粒 及 AAV-293、 AAV-HT1080 细 胞 (Stratagene 公司 ), DH5 宿主菌由本室制备保存。
     2、 方法
     2.1pAAV-BDNF 重组 AAV 载体的构建
     从胎脑组织中提取总 RNA, 利用 M-MLV 逆转录酶及 Oligo-dT 引物合成第一条 cDNA 链, 然后在 PCR 管中加入 ExTaqTM ; 利用 PCR 法扩增 BDNF 目的基因, 上游引物为 :
     5’ -GCTCTAGAGCCACCATGACCATCCTTTTCCTTACTATG-3’ ,
     其中 TCTAGA 为 Xbal I 识别位点,
     下游引物为 : 5’ -GCGGTACCCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAAT-3’ 。
     上、 下游引物经 5’ 端修饰分别引入限制性内切酶 BamHI 和 XhoI 位点。扩增产物 经 BamHI 和 XhoI 酶切后定向克隆入 pAAV-MCS 载体多克隆位点。重组质粒 pAAV-BDNF 经双 酶切鉴定正确后, 进行 DNA 测序。 2.2 重组 AAV(AAV-BDNF) 的包装
     采用 Qiagen 试剂盒大量提取超纯质粒 pAAV-BDNF、 pHelper 和 pAAV-RC 质粒, 分别 测定 OD 值, 并用 TE 溶液调整质粒浓度为 1g/L。DMEM 高糖培养基培养 AAV-293, 细胞融合至 70%~ 80%时, 用磷酸钙转染法将 pAAV-BDNF 质粒与 AAV 包装质粒 pAAV-RC、 AAV 辅助质粒 pHelper 三质粒共转染 AAV-293 细胞, 构建带有 BDNF 全长 ORF 的重组 AAV-BDNF。 pAAV-LacZ 作为报告基因同 pAAV-BDNF 一样共转染 AAV-293 细胞。转染后于培养箱中培养 6h 后换新 鲜培养基, 再培养 66 ~ 72h 后回收病毒。显微镜下观察细胞形态变化。
     2.3 病毒颗粒的收集
     用细胞刮子将细胞悬浮, 收集细胞悬液, 进行 4 轮冷冻 ( 液氮 )- 复温 (37℃水浴 ) 循环, 每次冷冻、 复温均 10min。 10,000r/min 离心 10min 收集上清液 - 初级病毒液, 于 -80℃ 保存。
     2.4 重组 pAAV-BDNF 病毒滴度检测
     培养 AAV-HT1080 细胞, 以每孔 3×105 个接种 12 孔培养板, 培养过夜, 使细胞达到 80%融合。 每孔加入 0.2mL AAV 容纳培养基 ( 使培养基中喜树碱终浓度达 0.8μmol/L), 混 匀后培养 4h。吸出培养基, 病毒原液稀释 100 倍后, 再进行体积为 2.5mL 的 5 倍系列稀释, -3 -5 稀释度从 2×10 到 8×10 。取 0.5mL 分别加入 3 个培养孔, 同时以无病毒原液作为阴性 滴度对照。培养 2h, 每孔再加入 0.5mLDMEM, 培养 48h, 弃上清, 使用 Stratagene 公司的原 位 β- 半乳糖苷酶染色试剂盒对细胞进行固定和染色, 在细胞密度适当的培养孔中计数蓝 染的细胞, 计算每 mL 贮存物中病毒颗粒 ( 染色细胞数 )。
     2.5BDNF 基因重组的 pAAV 的纯化及其体外表达目的基因的检测
     用病毒接种于大约 10 瓶 75cm2 培养瓶的 HT1080 细胞, 待出现细胞病变时如上收 集病毒, 用 CsCl 密度梯度离心法纯化 pAAV, -70℃保存备用。将纯化的 pAAV 的转染 HT1080 细胞, 取其培养基配制电泳样品, 用未接种的同时传代的 HT1080 细胞培养基配制样品做为
     阴性对照, 分别取第 1 天, 第 2 天, 第 3 天的培养基用于样品制备, 蛋白电泳及 Western blot 法检测 BDNF 基因在 HT1080 细胞中的表达, 其中在 Western blot 过程中使用羊抗大 BDNF 多 克隆抗体 (1 ∶ 1000) 与 PVDF( 聚偏氟乙稀 ) 膜上的 BDNF 蛋白质进行结合。2.6BDNF-pAAV 转染大鼠骨髓 MSCs 和体外细胞培养活性测定
     大鼠骨髓基质细胞 (MSCs) 的分离、 原代和传代培养 : 在无菌条件下取出大鼠股骨 和胫骨。 剪掉骨头两端, 露出骨髓腔, 用无血清的 DMEM 培养液冲洗骨髓腔, 反复 2 次或 3 次, 以 1000r/min 离心 5min。离心后弃上清, 用含 100mL/L 胎牛血清的 DMEM 培养液重悬细胞, 接种于培养瓶中。培养 24h 后换液, 后每 3d 全量换液 1 次, 细胞基本铺满瓶壁后, 以胰酶消 化传代。
     在 MSCs 培养基中加入适量病毒液。37℃ CO2 孵箱中孵育, 培养 3, 10 天, 取培养上 清, 进行 BDNF 的 Western blot 检测和对 PC12 细胞 ( 源于大鼠肾上腺髓质瘤 / 嗜铬细胞瘤, 是一种单胺能细胞株 ) 的神经营养活性测定。以未转染 BDNF-pAAV 的 MSCs 培养上清做阴 性对照。
     3、 结果
     3.1 重组 pAAV-BDNF 的鉴定
     体积分数 1.5%琼脂糖凝胶电泳显示约 860bp 处有扩增条带, 片段大小与预期值 一致 ( 图 4)。重组质粒 pAAV-BDNF 经双酶切后, 电泳显示出现大小为 4.6kb 和 861bp 的载 体片段和目的基因片段, 结果与预期相符 ( 图 4)。重组质粒 pAAV-BDNF 测序亦证实插入片 段 BDNF 与 Genbank 序列完全一致, 全长编码区无碱基突变。
     3.2 三种载体共转染 AAV-293 细胞及病毒粗提物的制备
     3 种载体共转染 AAV-293 细胞 6h 后, 显微镜下观察到培养基底部出现无数小黑色 颗粒, 细胞无明显变化。24h 后观察到 AAV-293 细胞部分变圆, 随着病毒增殖, 细胞成串浮 起, 出现细胞病理效应 ; 48h 后细胞逐渐从壁上脱落 ; 而阴性对照组细胞则贴壁完整, 无明 显形态变化。
     3.3 病毒滴度测定
     不同稀释度的 AAV-LacZ 病毒感染 AAV-HT1080 细胞后, 细胞经固定及 X-gal 染色 后, 在显微镜下可明显观察到蓝染的细胞。在蓝染细胞密度合适的细胞孔中记数全部的蓝 染细胞数, 计算重组病毒的滴度约为 1.0×1010pfu。
     3.4 蛋白电泳及 Western blot 检测结果 ( 图 5, 6)
     对照组 3、 10dMSCs 培养基均未见明显特异性条带, 而实验组, 转染后 3、 10d 取其培 养基进行检测, 可见 BDNF 的表达逐渐增强, 并较对照组有显著性增强, 图中的黑色条带即 为检测到的 BDNF 蛋白 ( 图 5, 6)。
     3.5 对 PC12 细胞的神经营养活性
     转基因 MSCs 的上清能诱导 PC12 细胞的神经元样分化, 细胞轴突生长明显, 其末端 膨大, 并可与周围神经细胞形成连接 ( 图 7)。未转基因的 MSC 细胞上清共培养的细胞也有 小量的神经突起形成, 而对照组的 PC12 细胞仍为单个园型或多角型细胞呈集落生长 ( 图 8)。
     实施例六、 脑细胞源性神经营养因子 (BDNF) 转基因骨髓 MSCs 对脑缺血性动物模 型的脑损伤保护作用一、 材料与方法
     1、 BDNF 转基因骨髓 MSCs 按实施例二所述方法由本室自制。
     2、 实验动物与分组健康 Wistar 大鼠 80 只 ( 购自中山医科大学实验动物中心 ), 体 重 180g ~ 220g。 大鼠脑缺血再灌流模型的建立, 根据 Honma 等 (Honma T, Honmou O, Iihoshi S, et al.Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat.Exp Neurol, 2006, 199 : 56-66.) 的方法, 大鼠麻醉后取颈正中切口, 结扎颈总动脉、 颈外动脉, 于颈总动 脉分叉下方剪一切口, 将一末端用酒精灯烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉 17-18mm, 结扎颈 内动脉。2 小时后拔线, 实现再灌注。脑缺血再灌注后 1 天进行神经缺损评分, 方法为 6 级 评分法 : 0 级, 无功能障碍 ; 1 级, 不能伸展左侧前肢 ; 2 级, 向左侧旋转 ; 3 级, 向左侧倾倒 ; 4 级, 无自主活动伴意识障碍 ; 5 级, 死亡。评分 2 ~ 3 级者为模型制备成功, 进入本实验。假 手术组除不插尼龙线外, 其余步骤同手术组。
     实验分 4 组 : 假手术组 (8 只 )、 缺血对照组 (8 只 )、 MSCs 组 (8 只 )、 转基因 MSCs 组 (8 只 )。
     3、 大鼠骨髓 MSCs 的分离、 原代和传代培养 : 在无菌条件下取出大鼠股骨和胫 骨。剪掉骨头两端, 露出骨髓腔, 用无血清的 DMEM 培养液冲洗骨髓腔, 反复 2 次或 3 次, 以 1000r/min 离心 5min。离心后弃上清, 用含 100mL/L 胎牛血清的 DMEM 培养液重悬细胞, 接 种于培养瓶中。 24h 后换液, 后每 3d 全量换液 1 次, 细胞基本铺满瓶壁后, 以胰酶消化传代。
     4、 大鼠 MSCs 转基因 : 在 MSCs 细胞培养基中加入适量病毒液。37℃ CO2 孵箱中孵 育 10 天, 经 Western blot 检测能表达 BDNF。
     5、 尾静脉注射 MSCs : 脑缺血再灌注 24 小时后, 将 1mL 转基因 MSCs(1×106 个细胞 /ml) 经尾静脉注射入转基因 MSCs 组大鼠体内, 将未进行转基因 MSCs(1×106 个细胞 /ml) 经尾静脉注入 MSCs 组大鼠体内, 缺血对照组和假手术组大鼠体内分别注入 1mL 生理盐水。
     6、 功能评估 : 大鼠模型制备前后每 3 天均采用 Combs 和 D ′ Alecy(Combs DJ, D′ Alecy L G.Motor performance in rat s exposed to severe forebrain ischemia : effect of fasting and 1, 3-butanediol.Stroke, 1987, 18 : 503-511.) 的方法进行网屏测 验、 平衡木测验、 抓握牵引测验, 观察大鼠在行为学方面的差异。 每项试验进行两次, 取较高 的分数值作为大鼠的该项得分。
     7、 各组大鼠于 MSCs 治疗后 28 天以 4%多聚甲醛灌注取脑。取脑组织冠状面均匀 切 2mm 厚脑片, 2% TTC 染色, 数码相机拍照, 以图像处理软件测量梗死面积, 计算梗死面积 与损伤侧脑半球的面积比。
     8、 统计学处理 : 采用 SPSS 13.0 统计软件, 各组数据均以均数 ± 标准差 (x±s) 表 示。采用方差分析或 t 检验进行组间比较, P < 0.05 为差异有统计学意义。
     二、 结果
     1、 神经功能评分 : MSCs 组大鼠神经功能恢复较缺血对照组明显提前, MSCs 治疗后 第 4 天即出现明显的神经功能改善, MSCs 治疗 21 天以后与缺血对照组比较无显著差异。 而转基因 MSCs 组在治疗后第 4 天大鼠神经功能评分即与 MSCs 组、 对照组比较均有显著 差异 (p < 0.01), 至治疗后 21 天效果更加明显 (p < 0.001), 到 28 天时仍有显著差异 (p < 0.01)。2、 脑梗死面积比较 : MSCs 治疗后 28 天, 脑组织 TTC 染色显示, 梗死区与损伤侧脑 半球面积比值与缺血对照组比较无显著差异 (P > 0.05), 而转基因 MSCs 组脑梗死区面积明 显缩小, 梗死区与损伤侧脑半球面积比值与缺血对照组比较有显著差异 (P < 0.05)。
     三、 结论 :
     转 BDNF 基因 MSCs 对大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤有明显的治疗作用, 效果优 于单用 MSCs。
     实施例七、 共表达神经营养因子 GDNF 和 BDNF 基因的自体骨髓 MSCs 的构建构建 本发明的共表达神经营养因子 GDNF 和 BDNF 的转基因骨髓 MSCs, 首先克隆人 GDNF 和 BDNF 基因, 构建共表达人 GDNF 和 BDNF 基因的重组 AAV ; 用此重组 AAV 转染人自体骨髓 MSCs, 完成共表达 GDNF 和 BDNF 的转基因修饰自体骨髓 MSCs 的构建。本发明采用的 AAV 系统为 Stratagene 公司的 AAV helper-free 系统。
     1、 人 GDNF 和人 BDNF 基因克隆及其 N 未端的构建 ( 见实施例二 ) ;
     2、 含共表达 GDNF 和 BDNF 表达盒的 pAAV-MCS 载体的构建 ( 见实施例三 ) ;
     3、 共表达 GDNF 和 BDNF 的 AAV 的制备, 具体操作过程如下 :
     1) 在转染前 48 小时, 在加入 10ml DMEM 生长培养液的 100 毫米培养皿中接种约 3 百万个 AAV-293 细胞, 2 天后细胞密度应为 70-80% ; 2) 解冻含上述表达盒的 pAAV-MCS、 pAAV-RCH 和 pHelper 质粒 DNA, 用 pH 7.5 的 TE 缓冲液调整每种质粒 DNA 为 1mg/ml ;
     3) 在 15 毫升培养管中从上述 3 种质粒溶液中各取 10 微升 DNA 溶液, 再加入 1 毫 升 0.4M CaCl2, 轻轻混匀 ;
     4) 在另一支 15 毫升培养管中加入 1 毫升 2x HBS 溶液, 再将上述 3) 中的 1.03 毫 升的 DNA/CaCl2 滴入 1 毫升 2x HBS 溶液中, 倒转培养管多次, 混匀 ;
     5) 立即将 DNA/CaCl2/HBS 混悬液滴入 AAV-293 细胞培养皿中, 并使其均匀分布在 培养液中 ;
     6) 将 AAV-293 细胞培养皿放入 37℃培养箱中 6 小时, 随后去除 AAV-293 细胞培养 皿中的培养液, 加入 10 毫升新鲜 DMEM 生长培养液, 在 37℃培养箱中培养 72 小时 ;
     7)3 天后观察, 如观察到培养液颜色变化、 或看到有细胞形态变园, 脱离板面或漂 浮在培养液中, 则表明有重组 AAV 病毒颗粒产生 ;
     8) 此时收集细胞培养液、 并收集细胞, 通过 4 次冻 / 融法, 裂解细胞, 使其胞内重组 AAV 病毒释放出来, 最后在室温下以 10,000g 离心 10 分钟, 将上清液转移至另一新管中, 贮 存于 -80℃冰箱保存。此即为表达人源 GAD65、 BDNF 和 GDNF 基因的重组 AAV 母液, 下一步 可进行病毒扩增、 病毒滴定度检测及 GDNF 和 BDNF 基因表达产物的检测。
     4、 骨髓 MSCs 的分离和培养 : ( 参见实施例一 ) ;
     5、 转基因骨髓 MSCs 的构建 :
     在 75cm2 的培养瓶中培养约 3 ~ 5 百万个 MSCs, 将 4 毫升含约 5 百万个 pAAV-GDNF/ BDNF 重组 AAV 颗粒转染骨髓 MSCs 约 4 小时, 然后加入适量的骨髓 MSCs 培养液, 置 37℃二 氧化碳培养箱过夜。
     6、 共表达 GDNF 和 BDNF 的转基因骨髓 MSCs 的鉴定 :
     待转基因骨髓 MSCs 培养 24 ~ 48 小时后, 收集部分培养的转基因骨髓 MSCs 和培
     养上清液, 进行 PT-PCR 反应和 western blotting 反应, 确定转基因的骨髓 MSCs 是否共表 达 GDNF 和 BDNF 及其表达水平。
     7、 共表达 GDNF 和 BDNF 的转基因骨髓 MSCs 的应用 :
     应用外科神经核定位技术及微管输送系统, 将共表达 GDNF 和 BDNF 的转基因骨髓 干细胞定点移植至中枢神经系统相关部位, 观察对中枢神经系统相关疾病, 如脑血管疾病、 脑缺氧和脑外伤导致的脑功能损伤以及早老性痴呆疾病 ; 以及移植至中枢神经核如绞状 体、 豆状核和黑质等, 观察对中枢神经系统退行性疾病帕金森氏病的治疗效应。
     实施例八、 转 BDNF 基因脐血 MSCs 对体外培养人骨髓 MSCs 增殖的影响。
     一、 材料与方法
     1、 主要试剂见实施例一和实施例五。
     2、 脐血间充质干细胞 (umbilical cord blood-derived MSCs, UBMSCs) 的分离培 6 养 ( 参见实施例一 ), 细胞培养扩增至 3×10 左右进行冻存, 共三管, 每管 1×106 左右。
     3、 转 BDNF 基因的 UBMSCs(transgene UBMSCs, TUBMSCs) 的制备 : 在 UMSCs 细胞培 养基中加入适量转 BDNF 基因的 AAV 病毒液, 37℃ 5% CO2 中孵育 2 天, 经 Western blot 检 6 测能表达 BDNF。细胞培养扩增至 3×10 左右进行冻存, 共三管, 每管 1×106 左右。 4、 人骨髓单个核细胞的制备 : 53 岁成人, 参照实施例一的方法制备骨髓单个核细 8 胞, 细胞总数为 2.6×10 。
     5、 UBMSCs 和 TUBMSCs 作为饲养层细胞的制备 : 收集第 3 代的 UBMSCs 和 TUBMSCs, 分 别加入丝裂霉素 C( 浙江海正药业, 国药准字 H33020786, 100μg/ml, 用 DMEM 培养基配制 ) 处理 1h, 用 DMEM 培养液洗涤 4 次, 用骨髓 MSCs 培养基稀释成 0.5×105/ml 细胞浓度待用。
     6、 分组试验 :
     1) 对照组 : 成人骨髓单个核细胞, 用骨髓 MSCs 培养基稀释成 1×106/ml 加入 24 孔 板中, 每孔 0.5ml, 每组 4 孔。
     2)UBMSCs 饲养层细胞对照组 ( 对照 U) : 丝裂霉素处理后的 UBMSCs, 0.25×105/ml 细胞浓度加入以 24 孔板内, 每孔 0.5ml, 每组 4 孔。
     3)TUBMSCs 饲养层细胞对照组 ( 对照 T) : 丝裂霉素处理后的 TUBMSCs, 0.25×105/ ml 细胞浓度加入以 24 孔板内, 每孔 0.5ml, 每组 4 孔。
     4)UBMSCs 饲养层细胞 + 成人骨髓单个核细胞培养实验组 ( 实验 U) : 用骨髓 MSCs 5 培养基调整细胞终浓度为 : 丝裂霉素处理后的 UMSCs, 0.25×10 /ml 细胞浓度 ; 骨髓小单核 6 细胞, 1×10 /ml 细胞浓度 ; 加入 24 孔板中, 每孔 0.5ml, 每组 4 孔。
     5)TUBMSCs 饲养层细胞 + 成人骨髓单个核细胞培养实验组 ( 实验 T) : 用骨髓 MSCs 5 培养基调整细胞终浓度为 : 丝裂霉素处理后的 TUBMSCs, 0.25×10 /ml 细胞浓度 ; 骨髓小单 6 核细胞, 1×10 /ml 细胞浓度 ; 加入 24 孔板中, 每孔 0.5ml, 每组 4 孔。
     7、 上述细胞于培养后第三天第一次全部换液, 以后每二天换液一半, 维持二周, 其 间在倒置显微镜下观察细胞生长情况, 待有细胞生长到融合时用胰酶消化和进行细胞计 数。
     8、 统计学处理采用 t 检验和分组方差分析, p < 0.01 显示有显著性差异。
     二、 结果
     1、 形态学观察
     对照组 : 第一次细胞培养换液后, 可见少量细胞贴壁生长, 细胞形态呈多样性, 可 见少量梭形细胞生长。培养二周后梭形细胞呈增多趋势。
     对照 U 组和对照 T 组 : 细胞形态相似, 第一次细胞换液后, 细胞呈梭形, 排列有一定 方向性, 细胞生长密度约为 30%, 10 天后细胞密度未见明显增加。
     实验 U 组 : 在第一次换液后细胞呈梭形生长, 至第 8 天细胞多呈长梭形, 排列有方 向性, 呈螺旋状生长, 至第 10 天细胞密度已达约 70-80%。
     实验 T 组 : 在第一次换液后细胞呈梭形生长, 至第 8 天细胞多呈长梭形, 排列有方 向性, 呈螺旋状生长, 至第 10 天细胞密度已达约 90-95%。
     2、 细胞计数, 各组细胞计数结果见表 2。
     表 2, 各组细胞培养至第 10 天时的计数结果 (X±SD, n = 4)
     结果提示 : 用脐血 MSCs 做饲养层细胞, 可使细胞扩增数量增加约 6 倍 (( 实验 U 组 细胞数 - 饲养层细胞数 )/ 对照细胞数= 5.6) ; 而用转基因脐血 MSCs 做饲养层细胞, 可使 细胞扩增数增加 10 倍 (( 实验 T 组细胞数 - 饲养层细胞数 )/ 对照细胞数= 10.0)。
     三、 结论
     用脐血 MSCs 做饲养细胞, 可明显促进老年人骨髓 MSCs 的生长和扩增 ; 而用转 BDNF 基因的脐血 MSCs 做饲养细胞, 骨髓 MSCs 扩增更明显。
     实施例九 : 转 BDNF 基因脐血 MSCs 对体外培养人骨髓 MSCs 增殖和定向分化的影 响。
     发明人在利用转 BDNF 基因脐血 MSCs 促进体外培养人骨髓 MSCs 增殖时研究发现, 部分骨髓 MSCs 出现多突起的改变, 状似神经细胞。为此, 发明人进行了转 BDNF 基因脐血 MSCs 促进体外培养人骨髓 MSCs 向神经细胞分化的实验研究。
     一、 材料和方法
     1、 转 BDNF 基因的 UMSCs(transgene UMSCs, TUMSCs) 和人骨髓单个核细胞的制备 : 见实施例五。
     2、 TUMSCs 和人骨髓单个核细胞共培养。 取终浓度 : TUMSCs 细胞, 0.25×105/ml ; 骨 6 2 髓小单核细胞, 1×10 /ml 细胞浓度, 25cm 的培养瓶, 用骨髓 MSCs 培养基 ( 见实施例一 ) 每 瓶 5ml 进行培养。
     3、 每 3-4 天换液 1 次。待贴壁细胞达 80% -90%融合时, 以 0.125%胰酶消化, 按
     1 ∶ 3 比例传代。
     4、 待细胞出现明显的多突起时, 以 1×104/cm2 接种于预铺有盖玻片的 6 孔培养板 中制备细胞爬片, 以人 MSCs 为分化对照, 同时制备细胞爬片。每孔加入含 10% FBS 的 DMEM 培养液 2ml, 达 80%融合时终止培养。
     5、 以免疫细胞化学方法检测神经细胞表面标志物 NSE 的表达。 人 MSCs 和混合培养 MSCs 细胞爬片, 用 4%多聚甲醛室温下固定 30min, 0.2% TritonX-100PBS 渗透细胞 5min, 0.3 %过氧化氢室温下封闭 30min, 羊血清封闭 30min。加 NSE 多克隆抗体 (1 ∶ 400 稀释 度 ), 4℃孵育 12h 过夜。加入生物素标记的二抗, 室温下孵育 30min, 加入链酶亲和素 - 过 氧化物酶复合物 (SABC), 37℃孵育 60min。DAB 显色, 中性树脂封固, 光学显微镜观察。
     二、 结果
     1、 细胞接种 36h 后可见少量细胞贴壁, 呈梭形, 类似成纤维细胞, 成集落样生长, 以后逐渐增多。培养 1 周左右, 细胞形态开始变化, 可见较多指状突起细胞。培养至 12 天 时, 细胞融合成片。 将混合细胞传代培养于载玻片上, 五天后部分细胞呈现梭形、 多角形、 锥 形或星形, 似神经细胞, 相互接成网 ( 见图 11)。
     2、 细胞表面标志物的变化 : 载玻片上混合培养的 MSCs 与单纯骨髓 MSCs 比较, 细胞 NSE 染色明显增强。
     三、 结论
     骨髓 MSCs 具有向神经细胞分化的能力, 转 BDNF 基因的脐血 MSCs 能促进 MSCs 向 神经细胞方向定向分化。
     实施例十、 转 GDNF 基因脐带 MSCs 对体外培养人骨髓 MSCs 增殖的影响。
     MTT 比色法 ( 噻唑蓝法 ) 主要用于检测细胞内琥珀酸脱氢酶的活力, 它可反映细 胞的增殖活力和细胞数量。本实验用 MTT 法检测转 GDNF 基因脐带 MSCs 对体外培养人骨髓 MSCs 增殖的影响。
     一、 材料与方法
     1、 主要试剂见实施例一和实施例五。
     2、 脐带间充质干细胞 (umbilical cord MSCs, UMSCs) 的分离培养 ( 参见实施例 6 一 ), 细胞培养扩增至 3×10 左右进行冻存, 共三管, 每管 1×106 左右。
     3、 转 GDNF 基因的 UMSCs(transgene UMSCs, TUMSCs) 的制备 : 在 UMSCs 细胞培养基 中加入适量转 GDNF 基因的 AAV 病毒液, 37℃ 5% CO2 中孵育 2 天, 经 Western blot 检测能 6 表达 GDNF。细胞培养扩增至 3-4×10 左右进行冻存, 共三管, 每管 1×106 左右。
     4、 人骨髓单个核细胞的制备 : 53 岁成人, 参照实施例一的方法制备骨髓单个核细 8 胞, 细胞总数为 2.6×10 。
     5、 UMSCs 和 TUMSCs 作为饲养层细胞的制备 : 收集第 3 代的 UMSCs 和 TUMSCs, 分别 加入丝裂霉素 C( 浙江海正药业, 国药准字 H33020786, 100μg/ml, 用 DMEM 培养基配制 ) 处 理 1h, 用 DMEM 培养液洗涤 4 次, 用骨髓 MSCs 培养基稀释成 0.5×105/ml 细胞浓度待用。
     6、 分组试验 :
     1) 对照组 : 成人骨髓单个核细胞, 用骨髓 MSCs 培养基稀释成 1×106/ml 加入 96 孔 板中, 每孔 0.1ml, 每组 8 孔。
     2)UMSCs 饲养层细胞对照组 ( 对照 U) : 丝裂霉素处理后的 UMSCs, 0.25×105/ml 细胞浓度加入以 96 孔板内, 每孔 0.1ml, 每组 8 孔。
     3)TUMSCs 饲养层细胞对照组 ( 对照 T) : 丝裂霉素处理后的 TUMSCs, 0.25×105/ml 细胞浓度加入以 96 孔板内, 每孔 0.1ml, 每组 8 孔。
     4)UMSCs 饲养层细胞 + 成人骨髓单个核细胞培养实验组 ( 实验 U) : 用骨髓 MSCs 培 5 养基调整细胞终浓度为 : 丝裂霉素处理后的 UMSCs, 0.25×10 /ml 细胞浓度 ; 骨髓小单核细 6 胞, 1×10 /ml 细胞浓度 ; 加入 96 孔板中, 每孔 0.1ml, 每组 8 孔。
     5)TUMSCs 饲养层细胞 + 成人骨髓单个核细胞培养实验组 ( 实验 T) : 用骨髓 MSCs 5 培养基调整细胞终浓度为 : 丝裂霉素处理后的 TUMSCs, 0.25×10 /ml 细胞浓度 ; 骨髓小单 6 核细胞, 1×10 /ml 细胞浓度 ; 加入 96 孔板中, 每孔 0.1ml, 每组 8 孔。
     7、 上 述 细 胞 于 培 养 后 第 三 天 第 一 次 全 部 换 液, 以 后 隔 天 换 液 一 半, 第三次 换 液 后 48 小 时, 每 孔 加 入 5mg/ml 噻 唑 蓝 (3-(4, 5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3, 5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)PBS 液 20ul。
     继续孵育 4 小时, 终止培养, 小心吸弃孔内培养上清液, 每孔加 1000ulDMSO, 振荡 10 分钟, 使结晶物充分融解。
     MK3 型酶标仪 (Thermo 公司, 美国 ) 测定 570nm 波长附近的吸光度, 计算光密度值 (OD)。
     8、 统计学处理采用 t 检验和分组方差分析, p < 0.01 显示有显著性差异。
     二、 结果
     各组细胞光密度值测量结果见表 3。
     表 3. 转 GDNF 基因 UMSCs 对人 MSCs 生长的影响 (OD 值, X±sd, n = 8)
     *, 同对照组比较, p < 0.05 ; **, 同对照组比较, p < 0.01 ; +, 同实验 U 组比较, p < 0.01 ;
     三、 结论
     用脐带 MSCs 做饲养细胞, 可明显促进老年人骨髓 MSCs 的生长 ; 而用转 GDNF 基因 的脐带 MSCs 做饲养细胞, 骨髓 MSCs 生长更明显。
     序列表 (SEQUENCE LISTING)
     <110> 广州和竺生物科技有限公司
     <120> 表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用
     <130>
     <160>6
     <170>PatentIn version 3.4 <210>1 <211>61 <212>DNA <213> 人工合成 <400>1 gtgctagcca tatgtacagg atgcaactcc t <210>2 <211>52 <212>DNA <213> 人工合成 <400>2 actaagtctt gcacttgtca caaacagttc <210>3 <211>34 <212>DNA <213> 人工合成 <400>3 tcaagcttgg atcctcagat acatccacac <210>4 <211>64 <212>DNA <213> 人工合成 <400>4 gtccatggcc cgggatgtac aggatgcaac ttgt <210>5 <211>55 <212>DNA <213> 人工合成 <400>5 actaagtctt gcacttgtca caaacagtca <210>6 <211>41 <212>DNA <213> 人工合成 <400>6 gcctctagaa agcttctatc ttcccctttt20tgtcttgcat tgcactaagt cttgcacttg60 61tgagaagaag cgccggggat ca52cttt34tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac60 64ctctgaccct gcccgccgag gggag55aatggtcaat g

表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用.pdf_第1页
第1页 / 共24页
表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用.pdf_第2页
第2页 / 共24页
表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用.pdf_第3页
第3页 / 共24页
点击查看更多>>
资源描述

《表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用.pdf(24页珍藏版)》请在专利查询网上搜索。

本发明涉及一种骨髓、脐带或脐血间充质干细胞及其在细胞移植、干细胞培养、扩增与定向分化领域的用途。本发明所述的表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞,该间充质干细胞是按以下步骤制备的:从骨髓、脐带或脐血中提取间充质干细胞;采用腺相关病毒(AAV)为载体,将神经营养因子家族相关基因重组到AAV载体上;制备表达神经营养因子家族相关基因的AAV;将上述AAV颗粒感染分离、纯化的间充质干细胞,得到表达神。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 化学;冶金 > 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程


copyright@ 2017-2020 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1