阿的平及其代用品对乙型病毒性肝炎的治疗作用 技术领域 该项研究发现属于生物医学研究领域。 临床上研究开发化学治疗药物应用于抗乙 型肝炎病毒 (HBV) 治疗的研究。该研究发现增加了阿的平及其代用品咯萘啶等类药物的另 一个适应症——可有效地抑制和杀灭乙型病毒性肝炎。
背景技术
乙型病毒性肝炎是威胁人类健康的全球性主要传染病之一， 据世界卫生组织报道 全球约 20 亿人曾感染 HBV， 其中 3.5 亿～ 4.0 亿为慢性 HBV 携带者， 每年约有 100 万人死于 HBV 感染所致的肝硬化、 原发性肝细胞癌和肝衰竭等重大疾病。中国属 HBV 感染高流行区， 约有 1 亿之多 HBV 感染者， 占世界总数三分之一， 居世界第首位， 其中慢性乙型肝炎患者约 3000 万例。一般人群 HBsAg 阳性率为 9.09％。中国每年有近 30 万患者死于因乙肝诱发的 各种病变， 其数量远远超过艾滋病和禽流感的死亡人数， 所以针对乙肝防治刻不容缓。 目前 国内外尚无满意治疗方法和手段。临床上现行用于治疗乙肝主要有抗病毒药、 免疫调节药 和肝功能恢复和调节等药物。 这些药物特别是对慢性乙肝患者的治疗尚存在着严重的疗效 不足、 复发率高、 许多抗病毒药物在达到治疗剂量时而对人体产生严重细胞毒性以及药物 价格昂贵等问题。因此人们对抗 HBV 药物研究工作迫在眉睫。由于乙肝的发病机制至今尚 未彻底阐明， 多数学者认为与机体免疫功能低下、 感染 HBV 后出现免疫应答或免疫调节功 能紊乱而导致肝脏损伤有关。因此国内外尚无较满意地治疗方法及特效药物。目前用于核 苷类抗 HBV 药物其抗 HBV 原理主要是在体内以三磷酸化形式与天然核苷酸发生竞争性结合 至延长中的 DNA 链而导致链合成终止， 和 HBV DNA 聚合酶结合而通过限制该酶移动而影响 其活性。核苷类药物至今仍为抗 HBV 治疗的首选药。目前主要用于抗 HBV 核苷类药物能迅 速抑制病毒 DNA 逆转录过程， 在短时间内将体内血清 HBV DNA 降低至不能被检出水平的特 点， 但是对蛋白合成影响较慢， 易于诱导 DNA 聚合酶突变而形成耐药性， 耐药突变常发生在 拉米夫定耐药株 P 基因的 B 区和 C 区。一旦发生变异拉米夫定对 HBV DNA 抑制作用大大下 降， 长期使用出现耐药性等问题是目前临床治疗中出现的主要障碍， 因此引起人们极大关 注。阿德福韦酯是阿德福韦的二吡呋酯具有抗 HBV 活性。阿德福韦酯能有效地抑制拉米夫 定耐药变异株， 但长期使用也存在耐药现象。免疫调节抗 HBV 药物如 IFN 和核苷类似物只 能部分抑制 HBV 复制而不能在人体内彻底清除 HBV， 且 HBV 感染后诱导 IFN 能力显著地下 降， 同时使靶细胞的 HLA21 类抗原表达低下， 因此停药后复发率较高。
目前临床上对抗 HBV 感染的治疗方法远远不够理想， 生物大分子药物被国际社会 推向 21 世纪药物研究开发前沿。人们对几种有望成为针对慢性乙型肝炎基因疗法的生物 核酶、 干扰肽或蛋白质及治疗 大分子药物进行了深入研究， 包括 RNA 干扰、 反义寡核苷酸、 性 DNA 疫苗， 然而其研究费用极其昂贵且疗效差。目前临床上诸多针对乙肝治疗的药物以 及正待研究开发的新型药物均不能够彻底清除 HBV 感染。
阿的平是吖啶类洐生物， 化学结构与氯喹相似， 其化学结构式如图一所示。 阿的平 又名米帕林于 1932 年被研究发现的， 其学名为 6- 氯 -2- 甲氧基 -9-(1’ - 甲基 -4’ - 二乙氨基丁氨基 ) 吖啶双盐酸盐。分子式为 C23H30CLN3O·2HCL·2H2O， 分子量为 508.92。由 2- 甲 氧基 -6， 9- 二氧吖啶和 1- 二乙氨基 -4- 氨基戊烷在硫酸存在下缩合而成， 该类药物曾广泛 应用于临床上抗疟疾的治疗， 另外仍有抗绦虫作用， 直至大约 1976 年阿的平在临床上才停 止使用而被氯喹所取代， 临床上使用阿的平抗疟疾的治疗有近 45 年历史且抗疟疗效明显， 在抗疟疾病治疗中发挥了非常重要作用。 目前在临床上使用阿的平的代用品咯萘啶替代阿 的平而作为抗疟疾治疗。阿的平同类药物咯萘啶是在阿的平的 3 个苯环结构基础上保留了 氯离子活性基团， 改变其侧链基团而成， 合成后的咯萘啶对人体的副作用更小。 阿的平以及 阿的平同类药物咯萘啶等作用机制是其分子结构和肝细胞内疟原虫 DNA 分子结合， 阻碍疟 原虫 DNA 分子复制和转录， 抑制疟原虫 DNA 分子合成。由于该类药物在体内主要聚集在肝 脏且能和疟原虫 DNA 分子非特异性结合抑制其合成， 然而 HBV 也主要存在于肝细胞内， 阿的 平以及阿的平同类药物咯萘啶同样是否具有抑制 HBV DNA 合成的作用。在这一原理基础上 将阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶等分别与 HepG2-2.2.15 细胞长期共培养， 在长期培 养后却意外地发现阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶等具有极其强大地抗 HBV 作用。通过 系统的方法研究证明阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶能有效地抑制和杀伤 HBV 作用， 使 HepG2-2.2.15 细胞培养上清 HBV DNA、 HBsAg、 HBeAg 完全转阴性， 同样也可使肝脏细胞内 HBV cccDNA、 HBsAg、 HBeAg、 HBcAg 完全转阴性， HBV DNA 呈高度抑制状态， 大约是空白对照 组的 1000 倍。另外在实验中发现阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶等较目前临床上首选 抗 HBV 药物拉米夫定疗效强 30 倍以上。因此通过实验研究揭示人类使用化学药物阿的平 以及阿的平同类药物咯萘啶等完全地抑制和杀伤 HBV， 该研究从而为人类治疗 HBV 或其他 病毒开创了一种新型且有效的治疗方法和手段从而有望取代目前临床上治疗乙型肝炎的 方法和手段。 发明内容
实验研究发现阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶等抑制 HBV 复制与阿的平以及 咯萘啶存在着明显地量效关系， 剂量越大而抑制效果越强， 大剂量短期培养能够完全抑制 和杀灭乙型肝炎病毒。 改换低剂量长期培养同样可以达到完全抑制和杀灭乙型肝炎病毒的 目的。 具体方法是将该类药物与 HepG2-2.2.15 细胞在 G418(1mg/ml) 诱导下表达 HBV 颗粒情 况下与之共培养 45 天后， 通过荧光定量 PCR、 荧光定量 RT-PCR、 HBV DNA 定量、 HBsAg 定量、 HBeAg 定量、 cccDNA 定量、 Northern blot、 Southern blot、 Western blot、 免疫组织化学等 方法分析发现 ： ①在培养 HepG2-2.2.15 细胞的上清中 HBV DNA、 HBsAg、 HBeAg 完全呈阴性 ； ②在后代分裂增殖的 HepG2-2.2.15 肝脏子细胞中 HBV cccDNA、 HBsAg、 HBeAg 和 HBcAg 等 滴度逐渐减少直至完全呈阴性， HBV DNA 复制被高度抑制， 抑制效果是对照组的 1000 倍 ； ③ 在培养的 HepG2-2.2.15 细胞内 RT-PCR 检测发现表达 HBsAg 和 HBcAg 抗原的 mRNA 完全呈 阴性 ； ④使用虫荧光素酶报告基因载体检测发现阿的平以及咯萘啶可以和 HBV DNA 非特异 型结合而抑制病毒的复制， 说明阿的平以及咯萘啶等可以完全抑制、 杀伤、 清除细胞内 HBV 病毒。该研究发现阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶等对 HBV 具有强有力地抑制和杀伤作 用。实验观察还发现阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶等对 HBV 复制和扩增具有强烈抑制 和有效地杀伤作用， 其抗 HBV 效果远远强于拉米夫定， 是拉米夫定治疗效果的 30 倍以上。 该 研究发现属于人类抗 HBV 病毒研究领域内的重大发现。具有重要的科学和商业价值。阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶抗 HBV 重大发现开创了人类使用新型的化学治疗药物抗病 毒治疗的崭新局面。 附图说明
图一 ： 阿的平以及阿的平同类化学药物咯萘啶分子结构式 图二 ： 正常培养的 HepG-2.2.2.15 细胞以及加入治疗药物后细胞形态变化 图三 ： HepG-2.2.2.15 细胞在加入药物后细胞生长曲线 图四 ： 药物剂量与培养上清中 HBsAg 含量变化 图五 ： 药物剂量与培养上清中 HBeAg 含量变化 图六 ： 小剂量长期培养 HepG-2.2.2.15 细胞上清中 HBsAg 滴度变化 图七 ： 小剂量长期培养 HepG-2.2.2.15 细胞上清中 HBeAg 滴度变化 图八 ： 荧光定量 PCR 检测药物剂量与 HepG-2.2.2.15 细胞培养上清中 HBV DNA 滴 图九 ： 荧光定量 PCR 检测小剂量长期培养 HepG-2.2.2.15 细胞内和上清中 HBV DNA度变化
滴度变化 图十 ： 荧 光 定 量 qRT-PCR 检 测 小 剂 量 长 期 培 养 HepG-2.2.2.15 细 胞 内 HBcAg、 HBsAg 的 mRNA 变化
图十一 ： 荧 光 定 PCR 检 测 小 剂 量 长 期 培 养 HepG-2.2.2.15 细 胞 上 清 中 HBcAg、 HBsAg 变化
图十二 ： 荧光定 PCR 检测小剂量长期培养 HepG-2.2.2.15 细胞内 HBcAg、 HBsAg 变 化
图十三 ： 荧光定 PCR 检测小剂量长期培养 HepG-2.2.2.15 细胞内 cccDNA 含量变化
图十四 ： 阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶与拉米夫定抗 HBV 效果比较
图十五 ： 虫荧光素酶基因发光参数图
图十六 ： pGL3 载体构建流程图
图十七 ： Northern blot 杂交检测
图十八 ： Southern blot 杂交检测
图十九 ： Western blot 杂交检测
图二十 ： 间接免疫荧光图图二十一 ： HBsAg 定量检测试剂盒典型的剂量反应曲线 件图 具体实施方式
1.HepG-2.2.2.15 细胞体外与阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶长期共培养
HepG-2.2.2.15 细胞体外培养， 在 1mg/ml 的 G418 诱导下 HepG-2.2.2.15 细胞表达 HBV 全基因组序列的病毒颗粒。 采用加入大剂量和小剂量阿的平以及咯萘啶的培养方法， 在 分别加入阿的平以及咯萘啶后首先发现 HepG-2.2.2.15 细胞形态在光学显微镜下发生明 显改变， 细胞形态由原来的梭形转变为圆形、 细胞体积变小、 细胞分裂增殖减慢、 由原来的 贴壁生长细胞转变为悬浮生长的细胞， 而加入拉米夫定后细胞形态不产生任何变化 ( 如图 二所示 )。
2.MTT 法检测细胞生长曲线
①接种细胞 ： 用含 10 ％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液， 以每孔 1000 ～ 10000 个细胞接种到 96 孔极， 每孔体积 200ul.。② ： 培养细胞 ： 同一般培养条件， 培养 3 ～ 5 天 ( 可根据试验目的利要求决定培养时间 )。③呈色 ： 培养 3 ～ 5 天后， 每孔加 MTT 溶液 (5mg/ml 用 PBS
配 )20ul. 继续孵育 4 小时， 终止培养， 小心吸弃孔内培养上清 液， 对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。 每孔加 150ul DMSO， 振荡 10 分钟， 使 结晶物充分融解。④比色 ： 选择 490nm 波长， 在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值， 记录 结果， 以时间为横坐标， 吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。如图三所示， 加入阿的平以及 咯萘啶后细胞生长减慢， 但是细胞长期处于低分裂状态之中， 而加入拉米夫定和 PBS 组细 胞生长没有明显改变。
3.HBsAg 定量测定
1). 洗涤液 ： 将 40ml 浓缩洗液和 960ml 去离子水在干净的洗液瓶中混合， 作为工 作洗涤液备用。
2). 铕标记物 ： 使用前 1 小时内用铕标记物稀释液按 1 ∶ 50 倍稀释并一次用完 ( 使用一次性的塑料容器来配制 )。3). 将试剂及所需数量的微孔反应条至室温 ( 室温专 指 20 ～ 25℃范围， 下同 ) 平衡。4). 吸取 100ul HBsAg 校准品及待检样品， 按顺序加入微 孔反应条小孔中并加贴封片。5). 微孔反应条在室温条件下， 用振荡仪缓慢振荡孵育 40 分 钟。6). 在第一次孵育结束后， 小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉， 将微孔反应条放入 洗机板吸干各孔并每孔注入洗涤液 400ul， 再吸干各孔， 重复以上洗涤 4 次， 最后一次将微 孔反应条拍干。7). 每孔加入 100ul 铕标记物工作液， 并加贴封片。8). 微孔反应条在室 温条件下， 用振荡仪缓慢振荡孵育 40 分钟。9). 第二次孵育结束后， ， 小心将微孔反应条上 的封片揭下并弃掉， 将微孔反应条放入洗机板吸干各孔并每孔注入洗涤液 400ul， 再吸干各 孔， 重复以上洗涤 6 次， 最后一次将微孔反应条拍干。10). 每孔加入增强液 100ul( 加样过 程中避免碰到小孔边缘或其中的试剂， 尽量避免污染 )， 并加贴封片。11). 微孔反应条在室 温条件， 用振荡仪轻摇 5 分钟。( 在半个小时内完成测定 )。12). 使用乙肝表面抗原定量测 定试剂盒是必须使用 6 个校准品， 或者使用两点定标方法。每次更换批号是必须使用试剂 盒提供的 6 个校准品作出曲线 ( 双对数 )， 校准品复孔使用以保准确性。血样中 HBsAg 浓度 通过标准曲线得出。检查程序的参数是否如下所示。如不符， 则修改。
分析类型 ： IFMA( 时间分辨免疫荧光法 )
曲线拟合方式 ： 样条曲线 X轴： LOG Y轴： LOG-B
BLANKS( 背景孔数 ) ： 2 校准品复孔数 ： 2
校准品浓度 ： 0.2 校准品浓度 ： 1.0 校准品浓度 ： 5.0
校准品浓度 ： 25.0 校准品浓度 ： 150.0 待测样本孔数 ： 1
对试验结果的解释 ： 结果判读 ： 建议浓度值≥ 0.2ng/ml 的样品判断为阳性， 否则 为阴性。浓度值＞ 150ng/ml 的血样应稀释后再计算浓度值， 稀释后浓度值应在线性范围 内。以下三点如不符合要求应重新进行实验。① A 点计算值应＜ 5000， F 点计算值应＞ 1000000。②剂量反应曲线的线性相关系数 r 值应＞ 0.9800。③典型的剂量反应曲线。产 品性能指标 ： ①本试剂盒测定范围 ： 0.2ng/ml-150ng/ml ； ②典型的剂量反应曲线件右图 ； ③ HBsAg adr 亚型的最低检出量为 0.2ng/ml， adw 亚型的最低检出量为 1.0ng/ml， ay 亚型 的最低检出量为 1.0ng/ml ； ④剂量 - 反应曲线的线性相关数 r 值应＞ 0.9800。(HBsAg 定量测定结果如图四、 六所示 )。
4.HBeAg 定量测定
1). 洗涤液 ： 将 40ml 浓缩洗液和 960ml 去离子水在干净的洗液瓶中混合， 作为工 作洗涤液备用 (pH7.8)。2). 铕标记物 ： 使用前一小时内用铕标记物稀释液按 1 ∶ 100 倍稀 释并一次用完 ( 使用一次性的塑料容器来配制 )。 3). 将试剂及所需数量的微孔反应条至室 温 ( 室温专指 20 ～ 25℃范围， 下同 ) 平衡。4). 吸取 100ul 阴性、 阳性对照及待测样本， 按 顺序加入包被反应条小孔中并加贴封片。 5). 包被反应条在室温条件下， 用振荡仪缓慢振荡 孵育 1 个小时。6). 在第一次孵育结束后， 小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉， 将微孔 反应条放入洗机板吸干各孔并每孔注入洗涤液 400ul， 再吸干各孔， 重复以上洗涤 4 次， 最 后一次将微孔反应条拍干。7). 每孔加入 100ul 铕标记物工作液。并加贴封片。8). 包被反 应条在室温条件下， 用振荡仪缓慢振荡孵育 1 小时。9). 第二次孵育结束后， 小心将微孔反 应条上的封片揭下并弃掉， 将微孔反应条放入洗机板吸干各孔并每孔注入洗涤液 400ul， 再 吸干各孔， 重复以上洗涤 6 次， 最后一次将微孔反应条拍干。 10). 每孔加入增强液 100ul( 加 样过程中避免碰到小孔边缘或其中的试剂， 尽量避免污染 )， 并加贴封片。11). 微孔反应条 在室温条件， 用振荡仪轻摇 5 分钟。( 在半个小时内完成测定 )。对试验结果的解释 ： A结 果测定 ： 用 WALLAC 公司时间分辨荧光测定仪 (1230、 1234、 1420) 或本公司 ANYTEST2000 时 间分辨荧光测定仪测量时， 检查程序的参数是否如下所示。如不符则修改。
分析类型 ： 比率 测定参数 ： Eu 阴性对照孔数 ： 2
阳性对照孔数 ： 2 待测样本孔数 ： 1
B 结果判读 ： (1) 公式计算 ： CUT OFF ＝ COUNTS( 阴性对照 )×2.1， 如果被测样本的 荧光记数值 (COUNT) 与 CUT OFF 的比值≥ 1.0， 判断为阳性， 否则为阴性。(2) 如果阴性对 照的 COUNTS 值低于 2250， 按 2250 计算， 如果阴性对照的 COUNTS 值高于 2250， 按实际计数 值计算。质量控制 ： 阳性质控 ： 阳性对照 COUNTS 值应≥ 600000。否则试验无效， 全部试验 重做。阴性质控 ： 阴性对照 COUNTS 值应≤ 8000. 否则试验无效， 全部试验重做。(HBeAg 定 量测定结果如图五、 七所示 )。
5. 细胞培养上清 HBV DNA 荧光定量检测
试验方法 ： 标本、 对照品的处理和加样， 血清标本、 试剂盒内阴性血清、 阳性血清梯 度各去 50ul( 冻存血清使用前在室温融解， 振荡混匀 10 分钟 )， 分别加入 50ul 核酸抽提 液， 振荡 10 秒钟， 99℃干欲或水浴 10 分钟， 13000rpm 离心 10 分钟， 保留上清备用。处理后 的样品应在 3 小时内使用， 或在 -20℃～ -80℃最长保存一个月 ( 不宜反复冻融 )。血清梯 度为 HBV DNA 荧光定量标准品。去 N×36ulHBV DNA 荧光定量检测混合液与 N×0.4ul 酶 (Taq+UNG) 混匀 (N 为反应管数 )， 3000rpm 离心数秒， 取 36.4ul 上述 PCR 检测混合液与适当 容量离心管中， 然后将血清标本、 阴性血清、 阳性血清梯度处理上清液各 4ul 分别加入反应 管中， 立即进行 PCR 扩增反应。PCR 扩增 ： 加样后， 离心管置于定量荧光 PCR 仪上， 循环参数 设置 ： 37℃ ×2 分钟 ； 94℃ ×2 分钟 ； 再按 93℃ ×15sec → 60℃ ×60sec， 循环 40 次 ； 单点 荧光检测在 60℃， 反应体系为 40ul。 荧光通道检测选择 ： HBV DNA 荧光定量检测选用 FAM 通 道。将定量标准品及各稀释度拷贝数浓度输入仪器软件中。结果分析 ： 进行定量分析， 选择 荧光检测模式 FMA 荧光， 基线调整取 5 ～ 15 个循环的荧光信号， 阈值设定原则以阈值线刚
好超过阴性血清的最高点。阴性血清 HBVDNA 拷贝数应为 UNDET ； 强阳性对照 HBV DNA 拷贝 数≥ 1×107copies/ml、 临界阳性对照 HBV DNA 拷贝数 1×104copies/ml ～ 5×104copies/ ml， 标准曲线相关系数应≤ -0.98， 否则试验视为无效。 结果判断根据工作曲线计算， 仪器自 动显示待检样品定量值， 仪器显示 UNDET 表示待检样品为阴性。 检测样品中 5×102copies/ ml ≤ HBV ≤ 5×108copies/ml， 测定结果有效， 可直接报告相应的拷贝数。检测样品中 HBV DNA ＞ 5×108copies/ml， 即可直接报告为＞ 5×108copies/ml， 也可用正常人血清按 10 倍 梯度做相应稀释， 使其拷贝数落在 1×105copies/ml ～ 5×108copies/ml 范围内重新测定， 测定结果应以稀释倍数进行校准。检测样本中 HBV DNA ＜ 5×102copies/ml 时， 拷贝数仅 供参考， 报告为小于最低检测限。对试验结果的解释 ： HBV DNA 定量值反映病毒在外周血中 的浓度， 浓度高则传染性强， 同时可反映药物疗效， 结合临床情况综合判断。 ( 细胞培养上清 HBV DNA 荧光定量检测如八、 九所示 )。
6.HepG-2.2.2.15 细胞内 HBV DNA 检测
标本的处理： 将 细 胞 3000rpm 离 心 5 分 钟 去 上 清， 在细胞中加入含 2％ Triton-100TE 溶液 500μl， 剧烈振荡 2 分钟， 加入酚 - 氯仿 (1 ∶ 1) 溶液 500μl 至每管， 振荡 20 秒， 13000rpm， 离心 15 分钟， 取上清移至另一离心管中， 补加 3mol/LNaAc 使溶液终 浓度为 0.33mol/L， 然后加入等倍体积的异丙醇， 室温放置 20 分钟， 13000rpm， 离心 15 分钟， 弃上清， 加入 1ml 75％乙醇颠倒混匀， 13000rpm， 离心 15 分钟， 弃上清， 倒置离心管至液体 滴尽， 最后加入 TE 或纯水 200μl 溶解。
血清 ( 血浆或全血 ) 取 100μl( 冻存血清或对照品使用前在室温融解， 振荡混匀 10 秒钟 )， 加入含 2％ Triton-100TE 溶液 500μl， 剧烈振荡 2 分钟， 加入酚 - 氯仿 (1 ∶ 1) 溶液 500μl 至每管， 振荡 20 秒， 13000rpm， 离心 15 分钟， 取上清移至另一离心管中， 补加 3mol/LNaAc 使溶液终浓度为 0.33mol/L， 然后加入等倍体积的异丙醇， 室温放置 20 分钟， 13000rpm， 离心 15 分钟， 弃上清， 加入 1ml 75％乙醇颠倒混匀， 13000rpm， 离心 15 分钟， 弃上 清， 倒置离心管至液体滴尽， 最后加入 TE 或纯水 200μl 溶解。
将上述 HBV DNA 进行特殊消化
酶消化体系 ： 42ul HBV DNA
2ul 25Mm ATP+5ul 10x Reaction Buffer 两种试剂预先混合置于 -20℃
1ul Plasmid-Safe Dnase(10U)
总 50ul 体系 ： 37℃孵育 10 小时或过夜， 70℃孵育 30 分钟， 混合液备用
取 N×36μl HBV DNA 荧光定量 PCR 检测混合液与 N×0.4μl Taq 酶混匀 (N 为反 应管数 )， 3000rpm 离心 10 秒， 取 36.4μl 上述 PCR 反应混合液于适当薄壁 PCR 反应管中， 然后将 HBV DNA 定量标准品系列、 样品、 血清、 H2O 各 4μl 分别加入离心管中， 立即进行 PCR 扩增反应。
离心管置于定量荧光 PCR 仪上， 循环参数设置 ： 37℃ ×2 分钟 ； 94℃ ×2 分钟 ； 再 按 93℃ ×10sec → 62℃ ×40sec， 循环 40 次 ； 荧光检测在 62℃， 反应体系为 40μl。进行 定量分析， 选择荧光检测模式 FAM 荧光， 基线调整取 5 ～ 15 个循环的荧光信号。阈值设定 原则以阈值线刚好超过 H2O 对照品的最高点。标准曲线相关系数应≤ -0.98， 否则试验视为 无效。根据工作曲线计算， 仪器自动显示待检样品定量值， 仪器显示 UNDET 表示待检样品为 阴性。( 实验结果如图八、 九所示 )。7.HBV cccDNA 定量检测
取 N×36μl HBV cccDNA 荧光定量 PCR 检测混合液与 N×0.4μl Taq 酶混匀 (N 为反应管数 )， 3000rpm 离心 10 秒， 取 36.4μl 上述 PCR 反应混合液于适当薄壁 PCR 反应管 中， 然后将样品、 血清 ( 酶消化后 )， 定量标准品各 4μl 分别加入离心管中， 立即进行 PCR 扩 增反应。离心管置于定量荧光 PCR 仪上， 循环参数设置 ： 37℃ ×2 分钟 ； 94℃ ×2 分钟 ； 再 按 93℃ ×20sec → 62℃ ×50sec， 循环 40 次 ； 荧光检测在 62℃， 反应体系为 40μl。进行 定量分析， 选择荧光检测模式 FAM 荧光， 基线调整取 5 ～ 15 个循环的荧光信号。阈值设定 原则以阈值线刚好超过 H2O 对照品的最高点。标准曲线相关系数应≤ -0.98， 对照血清应为 UNDET， 否则试验视为无效。根据工作曲线计算， 仪器自动显示待检样品定量值， 仪器显示 UNDET 表示待检样品为阴性。 组织样品 HBV cccDNA 含量计算方法 ： 组织样品 HBV cccDNA 含 量 ( 拷贝 / 细胞数 ) ＝仪器显示定量值 ( 拷贝 /μl)×200(μl)× 稀释倍数 ÷ 抽提细胞 数量。实验研究发现在给与低剂量阿的平和咯萘啶共培养至 30 天细胞内 HBV cccDNA 含量 小于 250。( 结果如图十三所示 )。
荧光定量 PCR 中所用引物序列
9CN 101856355 A说明10书引物、 探针名称 c-1up c-1down TaqmanProbe-c1 c-2up c-2down TaqmanProbe-c2 3’ ： TCACAATACCGCAGAGTC 3’ ： GAAAGCCCTACGAACCAC 3’ ： AATACAGGTGCAATTTCCGTCCGA 3’ ： TCGTTTTTGCCTTCTGAC 3’ ： CTAGGGGACCTGCCTCGT 3’ ： AAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTG序列 5’ to 5’ to 5’ to 5’ to 5’ to 5’ to浓度 10uM 10uM 10uM 10uM 10uM 10uM8/12 页CN 101856355 A
说明书9/12 页8. 荧光定量 Real Time-PCR
RNA 抽提 (Trizol， Invitrogen) ： a). 将装有细胞培养液的离心管置于离心机中， 3000rpm 离心 5 分钟， 弃上清 ； b). 加入 1ml PBS， 轻轻吹打混匀， 3000rpm 离心 5 分钟， 弃上 清； c). 加入 1ml 裂解液 (Trizol)， 吹打混匀 ； 加入 200ul 氯仿， 混匀器上振荡混匀 5sec， 13000rpm 离心 15 分钟 ； d). 吸取上层液体 (400ul)， 加入等体积异丙醇， 颠倒混匀室温静置 10 分钟， 13000rpm 离心 10 分钟 ； e). 轻轻倒去上清， 加入 1ml 75％乙醇， 7500rpm 离心 5 分 钟； 倒去上清， 倒置于吸水纸上， 弃尽液体， 3000rpm 离心 15sec， 用微量加样器尽量吸干液 体， 加入 50ul Rnase Free dH2O 溶解 RNA。
DNA 抽提 (TIANamp Genomic DNAKit， TIANGEN， 操作按其说明书 ) ： a). 将装细胞培 养液的离心管置于离心机中， 3000rpm 离心 5 分钟， 弃上清 ； b). 加入 1ml PBS， 轻轻吹打混 匀， 3000rpm 离心 5 分钟， 弃上清 ； c). 加 200ul 缓冲液 GA， 振荡至彻底悬浮 ； e). 加入 20ul 蛋白酶 K(25mg/ml) ； f). 加 220ul 缓冲液 GB， 充分颠倒混匀， 70℃放置 10 分钟， 3000rpm 离 心 15sec ； g). 加 220ul 无水乙醇， 充分振荡混匀 15sec ； h). 将上一步所得溶液和絮状沉 淀都加入吸附柱中， 13000rpm 离心 30sec， 倒去废液 ； i). 向吸附柱中加入 500ul 去蛋白液 GB， 13000rpm 离心 30sec， 倒去废液 ； j). 向吸附柱中加入 700ul 漂洗液 PW， 13000rpm 离心 30sec， 倒去废液 ； k). 向吸附柱中加入 500ul 漂洗液 PW， 13000rpm 离心 30sec， 倒去废液 ； 1). 将吸附柱放入离心机， 13000rpm 离心 2 分钟， 50℃温箱放置 3 分钟 ； m). 将吸附柱转入 一个干净的离心管中， 向吸附柱的吸附膜中间悬空滴加 50ul 经 70℃水浴预热的 dH2O， 室温 放置 2 分钟， 13000rpm 离心 30sec ； n). 离心得到的溶液再加入吸附柱中， 室温放置 2 分钟， 13000rpm 离心 2 分钟。( 结果如图十所示 )
a).RNA 模板的 PCR 反应体系及反应条件 ：
试剂 2×One Step RT-PCR BufferIII TaKaRa Ex TaqTMHS(5U/ul) PrimeScriptTMRT Enzyme Mix II c-1up c-1down TaqmanProbe-c1 Total RNA 模板 RNase Free dH2O Total 使用量 12.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 1ul 2ul 7.5ul 25ul 终浓度 1×0.2uM 0.2uM 0.4uM
PCR 反应条件 Stage1 ： 42℃ ×5 分钟， 95℃ ×10sec Stage2 ： 95℃ ×5sec， 60℃ ×30sec， Repeat ： 40times b).DNA 模板的 PCR 反应体系及反应条件 试剂 Premix Ex TaqTM(2×) c-1up c-1down TaqmanProbe-c1 使用量 12.5ul 0.5ul 0.5ul 1ul11终浓度 1× 0.2uM 0.2uM 0.4uMCN 101856355 A说使用量 2ul 8.5ul 25ul明书终浓度10/12 页试剂 DNA 模板 dH2O Total
PCR 反应条件 Stage1 ： 95℃ ×10sec Stage2 ： 95℃ ×5sec， 60℃ ×30sec， Repeat ： 40times 9.pGL3 虫荧光素酶报告载体的构建
将 HBV DNA 全基因组序列分成 3 个部分片段， 分别设计 3 段引物将 HBV DNA 全基因 组序列克隆出来， 每个片段二端分别带有 Xb1 酶切位点， PCR 引物设计如下 ： 第 1 个片段引 物： 上游 ： GTTCTAGACAACCTCCAATCACTCACC ； 下游 ： GCTCTAGATAACGCAGGATAACCACAT。第 2 个 片段引物 ： 上游 ： CCTCTAGATTCCCATCCCATCATCC ； 下游 ： CCTCTAGACCACAGTAGCTCCAAATTCTT。 第 3 个 片 段 引 物： 上 游： GGTCTAGATATTTGGTGTCTTTCGGAGTG ； 下 游 ： GTTCTAGAGTTTGCTCTGAAGGCTGGA。分别将成功克隆的 3 个片段插入 pGL3 虫荧光素酶报告载 体单个 Xb1 酶切位点， 测序挑选出正向插入 Xb1 酶切位点的序列。将 pGL3 大量扩增后通过 脂质体转染 HepG-2 细胞， 筛选出稳定表达 HBV DNA 序列的 HepG-2 细胞株， 将稳定表达 HBV DNA 序列的 HepG-2 细胞株分别和阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶共培养， 6 ～ 7 天后收 获培养的 HepG-2 细胞株在多功能酶标仪上进行检测。对照组任意选择 XIAP 一段非编码序 列成功克隆后将其插入 pGL3 虫荧光素酶报告载体单个 Xb1 酶切位点， PCR 引物设计如下 ： 上游 ： GTTCTAGACTGTTCTGGGAGCCGCACTTCATT ； 下游 ： GGTCTAGAACCCACTCTACCCTACCTTAGCCCG TAAT。实验结果和 pGL3 虫荧光素酶报告载体的构建以及效应见图十五和十六。从发光强 度的改变可见阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶是和 HBVDNA 序列非特异性结合从而抑制 HBVDNA 复制发挥抗 HBV 作用。 说明阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶抗 HBV 的作用机制是
在细胞内和 HBV 非特异性结合从而抑制其复制。
10. 药物剂量与效价之间的关系
阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶的抗 HBV 作用存在着明显的量效关系， 在治疗 剂量范围内， 随着阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶剂量在 HepG-2.2.2.15 细胞培养基中 逐渐增加， 在阿的平以及咯萘啶浓度达到 6mg/ml 时与 HepG-2.2.2.15 细胞共培养 6 天～ 7 天后， 培养上清中 HBV DNA、 HBeAg 滴度逐渐减少到最低水平， 与对照组相比下降到 15 倍以 上， 此时 HBVDNA、 HBeAg 转变为阴性。然而随着阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶剂量渐增 HBsAg 滴度迅速下降到一定程度后， 在长达约 45 天时间内维持在一个平台期， 然后迅速下 降转变为阴性。说明阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶抗 HBV 的治疗存在着明显的剂量依 赖性。大剂量抗 HBV 效果明显优于小剂量治疗效果的现象 ( 如图四、 五、 八所示 )。
11. 在 HepG-2.2.2.15 培养细胞上清中 HBVDNA、 HBsAg、 HBeAg 变化规律
采用小剂量 0.2mg/ml 长期培养， 使用 HBV DNA 定量和常规试剂盒检测方法， 测定 HBsAg、 HBeAg、 HBV DNA 滴度。将实验分成 4 个小组， 在培养基中分别加入阿的平、 咯萘啶、 拉米夫定以及生理盐水作为空白对。在经过长迏 20 天与 HepG-2.2.2.15 细胞共培养后检 测发现 HBV DNA、 HBeAg 转阴， 而 HBsAg 滴度维持在一个较低水平， 继续培养达到 45 天后HBsAg 滴度转变成阴性， HBsAg 滴度变化规律是当加入阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶 药物后， HBsAg 滴度迅速下降到一个较低水平， 然后维持在一个平台期， 继续培养后到达 45 天后 HBsAg 滴度才转变成阴性。而拉米夫定组 HBVDNA、 HBsAg、 HBeAg 滴度与空白对照组相 比也出现一定程度显著下降， 但是不能够完全使 HBV DNA、 HBsAg、 HBeAg 转阴， 说明拉米夫定 具有一定的抗 HBV 作用， 使细胞内 HBV 的复制在一个较低的水平， 但是不能够完全抑制和杀 灭细胞内 HBV 病毒。而阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶则呈现具有彻底清除和杀灭 HBV 病毒的作用， 能够彻底根治乙型肝炎病毒 ( 如图六、 七、 九、 十、 十一、 十二所示 )。
12.Western blot 检测 HepG-2.2.2.15 细胞内 HBsAg、 HBeAg、 HBcAg 表达状况
使用 Western blot 杂交方法检测阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶组、 拉米夫 定组和空白对照组中肝细胞和 HepG-2.2.2.15 细胞内 HBsAg、 HBeAg、 HBcAg 滴度变化， 结果 如图十九所示， 在经过 45 天与阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶、 拉米夫定等共培养后， 弃上清收集培养细胞， 实验观察发现阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶组 HBeAg、 HBcAg、 HBsAg 蛋白基本没有表达， 显著低于拉米夫定组和空白对照组 HBeAg、 HBcAg、 HBsAg 蛋白表 达。而拉米夫定组 HBsAg、 HBeAg、 HBcAg 等 3 种蛋白均有表达， 但是表达水平显著低于空白 对照组， 在空白对照组 HBsAg、 HBeAg、 HBcAg 呈高表达状态。Western blot 检测更进一步说 明阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶可以完全抑制和杀伤 HBV 复制增殖， 而拉米夫定仅能 够部分抑制 HBV 复制， 不能够完全消除和根治 HBV 病毒， 在肝细胞内仍然存在着一定量的 HBV 复制。
13.Northern blot 检测
在阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶、 拉米夫定与 HepG-2.2.2.15 细胞共培养 45 天后收集细胞， 使用分子杂交方法 Northern blot 检测 HepG-2.2.2.15 细胞内 HBV mRNA 表达状况， Northern blot 杂交分子探针的设计和合成， 使用 mRNA 抽提试剂盒抽提总 RNA， 使用 RT-PCR 方法反转录合成 cDNA， 在合成引物正向引物 5’ TCACAATACCGCAGAGTC3′和反 向引物 5′ GTGGTTCGTAGGGCTTTC3′作 PCR 合成模版探针， 使用地高锌标记探针， 结果如图 十七所示。阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶组 HepG-2.2.2.15 细胞内 HBV mRNA 表达转 变为阴性， 难以检测。而拉米夫定组出现 HBV mRNA 低表达状态， 空白对照组 HBV 呈现高表 达状态， 利用分子生物学检测手段再次证明阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶可以完全抑 制 HBV 病毒抗原表达， 而拉米夫定能够抑制 HBV 的复制， 但是不能够完全地抑制 HBV 病毒的 复制、 转录和翻译过程。
14.southern blot 检测
在阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶、 拉米夫定与 HepG-2.2.2.15 细胞共培养 45 天后收集细胞和上清液， 使用分子杂交方法 southern blot 检测 HepG-2.2.2.15 培养的上 清和细胞内 HBV DNA 表达状况， 首先抽提培养上清和细胞内总 DNA， 在合成引物正向引物 5’ TCACAATACCGCAGAGTC3′和反向引物 5′ GTGGTTCGTAGGGCTTTC3′作 PCR 合成模版探针， 使用地高锌标记探针， 结果如图十八所示， 在培养的 HepG-2.2.2.15 细胞内阿的平以及咯 萘啶组 HBV DNA 呈高度抑制状态。
15. 间接荧光检测
将分别与阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶组、 拉米夫定组和空白对照组培养 30 天～ 60 天 HepG-2.2.2.15 细胞收集制备成悬液充分混匀， 置于 CO2 温箱中 37℃孵育 30 分钟， 分别涂片， 丙酮固定， 室温下晾干待用。 PBS 清洗涂片， 洗去残留的固定液， 滴加 5％ BSA， 孵育 60 分钟以抑制非特异型结合， 分别加入抗 HBsAg、 抗 HBeAg、 抗 HBcAg 单克隆抗体后 4℃ 暗盒过夜， PBS 洗去未结合抗体， 然后在培养孔内分别滴加 FITC 标记的抗 HBsAg、 抗 HBeAg、 抗 HBcAg 二抗 ( 羊抗兔抗体 )， 室温下避光孵育 2 小时， PBS 洗去多余的二抗， 甘油封片， 在 倒置荧光显微镜下观察。 结果如图二十所示， 图 A 和 B 为对照组 HBsAg 和 HBcAg 在显微镜下 观察照片， 显示强荧光 ； 说明 HBsAg 和 HBcAg 在对照组细胞中高表达 ； C 和 D 为拉米夫定组 HBsAg 和 HBcAg 在显微镜下观察照片， 显示弱荧光 ； 说明拉米夫定对 HBV 的 HBsAg 和 HBcAg 表达具有一定抑制作用 ； F、 G、 H 和 I 组为阿的平和咯萘啶组 HBsAg 和 HBcAg 在显微镜下观 察照片， 显示无荧光， 说明阿的平和咯萘啶对 HBV 的 HBsAg 和 HBcAg 表达强烈的抑制作用。
专利总结
阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶等主要的药理作用是抑制疟原虫增生繁殖， 杀 灭细胞内疟原虫， 在治疗疟原虫的感染过程中发挥了非常重要作用。然而有关阿的平以及 阿的平同类药物咯萘啶具有强大的抗 HBV 病毒作用直到最近在实验中被首次证实。阿的平 以及阿的平同类药物咯萘啶远远强于目前临床上抗 HBV 首选药物， 是拉米夫定治疗效果的 30 倍以上， 尤为重要的是阿的平以及阿的平同类药物咯萘啶可以完全根除和杀灭肝细胞内 的 HBV， 可以使乙肝患者痊愈， 这是人类历史上首次发现该类药物抗 HBV 的生物学活性， 其 中最主要的原因是使用该类药物可以彻底清除体内所有的 HBV， 为人类征服 HBV 感染打下 坚实的基础。