一种海豚链球菌疫苗及其制备和应用
技术领域
本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种海豚链球菌疫苗及其制备和应用。
背景技术
海豚链球菌为革兰氏阳性菌，属于链球菌科的链球菌属。该菌是一种条件性人/鱼/畜共患病原菌，不仅能够感染多种海水和淡水鱼类，如真鲷、罗非鱼、条石斑、牙鲆、鲈鱼、虹鳟等，还可感染人类，造成蜂窝组织炎、脑膜炎、心内膜炎等疾病。目前，海豚链球菌被公认为世界范围内几种重要鱼类病原菌之一。在以色列、西班牙等国家，海豚链球菌灭活疫苗已广泛应用于水产养殖中，但近年来发现这些疫苗的保护效果不佳。在我国以及其它亚洲国家，海豚链球菌防控主要依靠抗生素，尚无商业化疫苗。因而，具免疫保护效应的海豚链球菌疫苗亟待开发。
发明内容
本发明目的在于提供一种海豚链球菌疫苗及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海豚链球菌疫苗：由序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。
制备方法：菌株DH5α/pTASP11的构建：以海豚链球菌G26为模板，采用F2和R5为引物进行PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSSP11；将质粒pBSSP11用NdeI/XhoI双酶切回收0.9kb，同时将质粒pBTA1用NdeI/XhoI双酶切回收5.3kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α得菌株DH5α/pTASP11，即得表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的海豚链球菌疫苗蛋白的疫苗菌株；
所述引物为F2：5’-CATATGTCAAAACAAGAAGCTAAAAAAG-3’和R5：5’-CTCGAGTTTTGATTGAAGATCAACAAAG-3’。
应用：将上述所得的海豚链球菌疫苗菌株经LB培养基培养至OD600为0.8后溶于PBS，所得的疫苗制备液具有对海豚链球菌免疫保护的作用。
所述疫苗制备液是将上述所得的海豚链球菌疫苗菌株DH5α/pTASP11在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0.1ml过夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap的LB液体培养基中，于28℃摇动培养至OD600为0.8-1，而后将细菌培养液离心，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4x108cfu/ml，即为疫苗制备液。
将所述疫苗制备液100ul腹腔注射于牙鲆体内，20天后再次将100ul疫苗菌悬液液腹腔注射于牙鲆。
本发明具有如下优点：
1.制备简单。本发明的疫苗抗原只需简单的常规细菌培养，无需任何提取、纯化过程。
2.高保护效应。本发明所得疫苗保护效应可达100％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell：Molecular Cloning：A LaboratoryMannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
海豚链球菌疫苗，由序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示(参见序列表1)。
序列表1
ATGCGTAACAAATTCTTTTCTTTACTCGTCGCTTCAACAACAGTTCTTAGTTTGGCGGCATGTGGATCAAAACAAGAAGC
TAAAAAAGAGGATAAGGGCAGTGATAAACTGGTTGTTTACTCTCCCAATTCAGAAGGCTTAATCAATGCGACAATTCCAG
CTTTTGAGGAAAAATATGGGGTTAAGGTTGAATTGATCCAAGCAGGTACTGGGGAACTCTTTAAAAAAGTTGAGAGTGAA
GCAAGTAAACCAGTTGCTGATATTGTCTTTGGAGGTTCTTATACTCAGTATGCTCAACATCCTAGTTTATTTGAAAAATA
CACTGCAAAAGATAATGACAAGGTGATTAAGGATTATCAAAATACAACTGGCTATTCAACACCATACACCTTAGATGGTT
CTGTTTTGATTGTTAATCCTGATTTGACAAAAGGCATGAAGATTAAAGGTTACAAAGATTTATTGAACCCTGAGTTGAAA
GGCAAGATTGCAACAGCAGACCCTGCTAACTCATCAAGTGCTTTTGCACAATTAACTAATATTTTACTTGCTAATGGTGG
TTACGATAAAGACCAATCATGGTCTTATGTCAAAGACTTATTTACCTTGGTAGATGGTAAAATTAATTCAAGTTCTTCAA
ATGTTTACAAATCTGTAGCTGATGGTGAAATGGCTGTTGGTTTGTCCTATGAAGACCCAAGTGTTAAATTATTAAATGAT
GGAGCTAATATTAAGGTTATTTACCCAGAAGAAGGATCAGTCTTCTTACCTGCAAGTGCAGCAATCATTAAAAATGCTCC
AAATAAATCAAATGCTCAAAAATTCATTGATTTTATTGTCTCTAAAGAAGCTCAAGATGCTCTTGGAACAGAAACAACTA
ACAGACCTGTTCGTAAAGATGCTAAAGTTAGCAAAAACATGAAATCATTGAAAGACATTAAGACTATTACGGAAGACTAT
GATTATGTCATTAAACATAAAGAAGATATTGTAAAACACTACAGTGACATCTTTGTTGATCTTCAATCAAAATAG
(a)序列特征：
●长度：1035bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：双链DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：海豚链球菌G26
(f)特异性名称：sip11
实施例2
海豚链球菌疫苗的构建方法：
1)菌株DH5α/pTASP11的构建：以海豚链球菌G26为模板，采用F2/R5为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，50℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，56℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBSSP11。将质粒pBSSP11用NdeI/XhoI双酶切回收0.9kb，同时将质粒pBTA1用NdeI/XhoI双酶切回收4.6kb片段，所述质粒pBTA1构建过程参见Zhang W，Sun K，Cheng S，Sun L.Characterization ofDegQVh，a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain.Appl Environ Microbiol 2008；74：6254-62.；将上述回收两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，挑取1个转化子，命名为DH5α/pTASP11。将DH5α/pTASP11在含有100ug/ml Ap的LB培养基中过夜培养，提取质粒，用引物BRF2(5’-ATAGGGGTTCCGCGCACA-3’)测序，结果表明序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的海豚链球菌疫苗蛋白。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1984，分类命名为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。
所述引物为F2：5’-CATATGTCAAAACAAGAAGCTAAAAAAG-3’和R5：5’-CTCGAGTTTTGATTGAAGATCAACAAAG-3’。
实施例3
海豚链球菌疫苗的应用
步骤1)疫苗制备液以及疫苗对照液的制备。将上述所得表达由序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的蛋白的菌株DH5α/pTASP11，在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0.1ml过夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速160rpm摇动培养至OD600为0.8-1，而后将培养液离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4x108cfu/ml，即为疫苗制备液。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％ Na2HPO4.12H2O，0.024％ NaH2PO4。
步骤2)疫苗的免疫注射。将80条牙鲆(每条重约10g)随机分为2组，每组40条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)疫苗制备液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS。20天后，再次将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)疫苗制备液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS。
步骤3)海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养海豚链球菌G26至OD600为0.7，然后离心(5000g，4℃，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x108cfu/ml，即为海豚链球菌悬液。
步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)第一次免疫注射后的第35天，用上述步骤3)的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，0条；B组，32条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS＝100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
故DH5α/pTASP11针对海豚链球菌的免疫保护效率为100％。
由此得出DH5α/pTASP11能够高效地保护牙鲆抵御海豚链球菌侵染。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种海豚链球菌疫苗及其制备和应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1035
<212>DNA
<213>海豚链球菌G26
<220>
<221>sip11
<222>(1)..(1035)
<223>
<400>1
atgcgtaaca aattcttttc tttactcgtc gcttcaacaa cagttcttag tttggcggca 60
tgt9gatcaa aacaagaagc taaaaaagag gataagggca gtgataaact ggttgtttac 120
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tttaccttgg tagatggtaa aattaattca agttcttcaa atgtttacaa atctgtagct 660
gatggtgaaa tggctgttgg tttgtcctat gaagacccaa gtgttaaatt attaaatgat 720
ggagctaata ttaaggttat ttacccagaa gaaggatcag tcttcttacc tgcaagtgca 780
gcaatcatta aaaatgctcc aaataaatca aatgctcaaa aattcattga ttttattgtc 840
tctaaagaag ctcaagatgc tcttggaaca gaaacaacta acagacctgt tcgtaaagat 900
gctaaagtta gcaaaaacat gaaatcattg aaagacatta agactattac ggaagactat 960
gattatgtca ttaaacataa agaagatatt gtaaaacact acagtgacat ctttgttgat 1020
cttcaatcaa aatag 1035