一种用啤酒废渣生产环链拟青霉菌剂的方法
技术领域
本发明涉及一种生产环链拟青霉菌剂方法，具体地说是涉及一种用啤酒废渣生产环链拟青霉菌剂的方法。
背景技术
环链拟青霉(ecilomyces cateniannulatus)能够防治多种农作物害虫，利用环链拟青霉的真菌制剂进行农作物害虫的防治具有巨大的潜力。已经进行了哺乳动物急慢性毒理试验，对哺乳动物安全，多名学者研究指出林间的环链拟青霉的存在量较大，对多种林间田间的害虫有生物防治作用。
啤酒废渣的主要成分是麦壳和残留的淀粉、蛋白质等。啤酒废水主要是啤酒厂的偏碱性的洗瓶、洗灌水，含有多种营养物质和微量元素，适宜微生物生长。据有关统计资料，我国啤酒年产已达4000万t，按每生产1万t啤酒产干渣280t计，啤酒行业每年的啤酒干渣产出量达112万t以上，目前国内啤酒厂家的啤酒废渣大多数没有进行深加工利用，较多情况是出售给农户成为饲料使用，而根据研究指出，家禽甚至猪等动物食用啤酒渣后可能会出现“啤酒渣中毒”现象。所以导致大量的啤酒渣被废弃，污染环境，甚至成为多种有害微生物滋长的温床。
在现在的农作物生产中，广泛使用化学农药，虽然防治效果较好，但是化学农药制剂高毒性、高残留的特性污染环境，污染农产品，农产品中农药超标造成中毒，农产品被勒令退回甚至罚没销毁的事件时有发生。农药的生产又大量使用社会紧缺的资源和能源，造成了大量的温室气体的排放。鉴于此，采用生物方法防治农作物害虫代替传统的化学防治成了必然趋势。
由于啤酒渣中含有大量的没有被完全利用的碳源氮源物质，且碳氮比较高，故被微生物利用后前期产酸性就十分严重，严重抑制真菌的生长，故国内外均较少利用啤酒渣作为培养基主体培养真菌等微生物。
迄今尚未见有用啤酒废渣作为原料生产环链拟青霉菌的相关报导。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种用啤酒废渣生产环链拟青霉菌剂的方法，解决了以啤酒渣作为主体培养生防真菌的问题。该方法既可以提供高效无毒的生物防治菌剂，又可以解决啤酒废渣排放的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用啤酒废渣生产环链拟青霉菌剂的方法，包括如下步骤：
步骤一：一级培养，用马铃薯-葡萄糖琼脂培养基PDA斜面上，装成试管斜面，接种环链拟青霉菌种，在20-25℃培养7-14天；得到纯种斜面培养物；
步骤二：二级培养，培养液按重量百分比计5-25％啤酒废渣、75-95％啤酒废水，配比混合，调PH值5-9；经高压灭菌后接种一级培养的纯种斜面培养物，通气震荡培养，于在12-28℃下培养6-14天；得到纯种液体培养物；
步骤三：三级培养，按重量百分比计，培养基组分为85-99％的啤酒废渣、1-5％的氯化钠、5-15％的废酵母泥提取物与2％碳酸钙混合，湿度在RH40-75之间，接种二级培养的纯种液体培养物，于在12-28℃下培养6-14天；干燥后成为饼块状或颗粒状固体培养物。
优选技术方案是，所述的一级培养是在24℃-26℃培养7-9天；所述的二级培养中培养液是啤酒废渣∶啤酒废水的重量比为20∶80；培养条件为24℃-26℃、PH 7-7.5，震荡培养7-9天；所述的三级培养是重量比为90％啤酒废渣、1％氯化钠和9％啤酒酵母泥培养基，在湿度RH60-70培养10-12天。
所述的步骤三中干燥方法为自然晾干或低于40℃低温烘干。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明的最大特点在于对啤酒废渣中的营养成分的综合利用，且由于采用三步法培养，解决原本不适宜用在生产环链拟青霉菌剂的啤酒废渣的问题。
试验表明，用此法生产的环链拟青霉菌剂，每克样品含3×108-9.5×109孢子，按照每平方米3克的使用量播撒到农田中，可有效降低虫口密度。环链拟青霉菌剂作为一种新型生物防治菌剂，可用于温带，亚热带、热带田间和寒带、温带，亚热带、热带的温室或大棚的农作物害虫防治中。有效的降低虫口密度，提高农作物产量，减少化学农药的使用，提高农产品在国际市场的竞争力。并用啤酒的废料制造该菌剂，使废料资源化，减少环境污染压力，提高啤酒废渣利用率，增加其附加价值。
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。
具体实施方式
实施例1：用啤酒废渣生产环链拟青霉菌剂
将纯化的环链拟青霉菌种接种到马铃薯-葡萄糖琼脂培养基PDA斜面上，在20-25℃培养8天。用5克啤酒废渣，95克啤酒废水，盐酸和氢氧化钠调PH值至6.5-7.5，高压灭菌后接种一级培养的环链拟青霉，25℃培养8天。再取85克榨干的啤酒废渣、5克废酵母泥提取物、1克氯化钠和1克碳酸钙接种等量二级培养物，于25℃培养10天，湿度RH50。风干后成饼块状，干燥方法为自然晾干或低于40℃低温烘干。
称取1克菌剂，于组织捣碎机内加水搅散，定容至100ml，用血球计数板法计算得出，每克含孢子3.5×108个。
实施例2：用啤酒废渣生产环链拟青霉菌剂
将纯化的环链拟青霉菌种接种到马铃薯-葡萄糖琼脂培养基PDA斜面上，在20-25℃培养8天。用20克啤酒废渣，80克啤酒废水，盐酸和氢氧化钠调PH值至6.5-7.5，高压灭菌后接种一级培养的环链拟青霉，25℃培养8天。再取95克榨干的啤酒废渣、15克废酵母泥提取物、1克氯化钠和1克碳酸钙接种等量二级培养物，于25℃培养10天湿度RH50。风干后成饼块状。
称取1克菌剂，于组织捣碎机内加水搅散，定容至100ml，用血球计数板法计算得出，每克含孢子5.5×109个。
实施例3：用啤酒废渣生产环链拟青霉菌剂
将纯化的环链拟青霉菌种接种到马铃薯-葡萄糖琼脂培养基PDA斜面上，在20-25℃培养8天。用25克啤酒废渣、75克啤酒废水，盐酸和氢氧化钠调PH值至6.5-7.5，高压灭菌后接种一级培养的环链拟青霉，25℃-26℃培养8天。再取85克榨干的啤酒废渣、15克废酵母泥提取物、1克氯化钠和2克碳酸钙接种等量二级培养物，于25℃培养10天。风干后成饼块状。
称取1克菌剂，于组织捣碎机内加水搅散，定容至100ml，用血球计数板法计算得出，每克含孢子8.5×109个。
实施例4：用啤酒废渣生产环链拟青霉菌剂对蚜虫的致病性试验。
用纯化的环链拟青霉菌种集中到一级培养斜面，25℃培养7天，接种到二级培养，再在25-27℃培养7天，接种到三级培养，26℃培养10天。风干后成饼状。经此培养后的1克菌剂经血球计数板计数，每克含菌剂孢子9×109个。将本实施例的菌剂1克倒入适量的0.05％土温-80溶液，震荡后稀释成各浓度备用。
人工饲料饲养得到2、3、4龄幼虫。准备新鲜的离体甘蓝叶片，并以吸足标准十字花科营养液的棉球包裹叶柄，将20℃下饲养10日龄的桃蚜无翅成蚜移到叶片上，繁殖24h后移去，保留若蚜饲养至2，3，4龄时供生物测定。
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摘取长有蚜虫的甘蓝叶柄用浸湿加营养液的脱脂棉球包裹叶柄，然后将叶片(叶柄不浸入)浸入含有菌悬液的烧杯中2-3s立即取出，室温下将蚜虫和叶片晾干，置于铺滤纸的培养皿内。每皿一片叶每片叶上15-40头虫，26℃恒温培养。每3d给棉球加一次无菌水，每日光照10h，镜检死亡率，连续8d。致死效果如表1所示。
表一、环链拟青霉对不同蚜龄的蚜虫致死率
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本实验表明，利用本实施例生产的环链拟青霉菌剂，对农作物害虫中为害较为严重的蚜虫防治效果较好，其致死率和校正致死率均较高。
实施例5：环链拟青霉菌剂的田间防治试验
将通过实施例1或2或3生产的环链拟青霉菌剂，于田间取地头土按照生防菌和土重量比1∶5进行混合，碾碎，于播种前1-2天犁耕后撒播于田间，能有效防治田间蚜虫，白粉虱、小菜蛾、菜青虫等害虫。利用此法进行田间防治，其防治效果可持续90天。
实施例6：环链拟青霉菌剂的田间防治试验
将通过实施例1或2或3生产的环链拟青霉菌剂，碾碎后直接拌种，播撒至田间，然后可直接进行其他标准的田间后续操作，本方法可有效防治地老虎等啮根茎害虫。