用于构建干扰载体的质粒及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及用于构建干扰载体的质粒及其构建方法和应用。
背景技术
RNA干扰是将双链RNA(double strained RNA，dsRNA)导入细胞内引起特异靶基因mRNA降解的一种细胞反应过程，它是一种转录后的基因沉默(PTGS)现象。关于RNAi机制的探讨还不够完善，目前研究比较明确的结论是：Dicer是特异性核糖核酸酶家族的一个成员，与内源性mRNA互补的外源性dsRNA与Dicer结合，被切割成2l～23nt长的小片段，即小分子干扰核糖核酸(siRNA)。一部分siRNA与Dicer形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducing silencing complex，RISC)，RISC再与目标基因转录出的mRNA结合并降解该mRNA；部分siRNA可作为引物，以mRNA为模板合成新的dsRNA，这些新合成的dsRNA又可以与Dicer结合并被切割成siRNA，从而产生级连、放大和传递效应，沉默该基因。
Wesley等研究表明，在启动子下游插入反向重复片段的重组双元载体是导致RNA沉默的基本结构。同时内含子的有无、启动子的强弱和目的片段的大小等也会影响RNA沉默的效率(Wesley S V，Helliwell C A，Smith N A，et al.Construct design forefficient，effective and high-throughput gene silencing in plants.PlantJournal，2001，27：581-590.)。研究表明带有内含子的发卡式双链RNA(ihpRNA)基因沉默结构最高，可达90％～100％；不带有内含子的发卡RNA(hairpin RNA，hpRNA)结构的沉默效率常低于ihpRNA，正义(sense)和反义(antisense)靶基因或基因片段构建的载体，沉默效率则更低，分别仅有58％、13％和12％的沉默效应(Smith N A.，SinghS P，Wang M B，et al.Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.Nature，2000，407：319-320)。
启动子(Promoter)是RNA聚合酶能够识别并与之结合从而起始基因转录的DNA序列，是重要的顺式作用元件，位于结构基因5′端上游区的DNA序列，能指导全酶与模版的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心(朱玉贤，李毅.现代分子生物学.高等教育出版社，1997.)。目前，植物基因工程中常用的启动子为组成型表达启动子(Constitutive promoter)。研究发现在组成型启动子的控制下外源基因的表达存在一些缺陷，常对植物生长发育产生意想不到的负面影响。而种子特异性启动子具有显著的组织和发育时期的特异性，可以控制外源基因在植物种子中高效表达，避免外源基因在植物的其他部位表达，也可避免外源基因在转基因宿主植株中非特异表达所造成的能量负荷和物质浪费，减少对植物的不利影响。
植物的种子，尤其是油料和谷类作物的种子与人类的生产生活关系非常密切，种子贮藏蛋白是包括人类在内的动物界食用蛋白的第一来源。1.7S蛋白(napin)是芸薹属(Brassica)植物中存在的一类由多基因编码的种子贮藏蛋白。控制napin贮藏蛋白基因转录的一些启动子可控制外源基因在植物种子中特异表达。
发明内容
本发明的目的是提供用于构建干扰载体的质粒及其构建方法和应用。
本发明提供了质粒pFGC-NAP，是在质粒pFGC1008的Stu I和Asc I酶切位点之间插入序列表的序列1所示的DNA得到的重组质粒。
所述质粒pFGC-NAP可用于构建干扰载体。
用质粒pFGC-NAP作为出发质粒构建得到的干扰靶基因表达的干扰载体也属于本发明的保护范围；所示干扰载体中含有正义DNA片段和反义DNA片段；所述正义DNA片段和所述反义DNA片段是针对靶基因设计的反向互补序列。
所述的干扰载体中，所述靶基因可为ghFAD2-1基因，所述ghFAD2-1基因的核苷酸序列具体可如序列表的序列4所示。
所述干扰载体具体可为质粒pFGC-FAD；所述质粒pFGC-FAD是在质粒pFGC-NAP的Bam H I和SpeI酶切位点间插入序列表的序列2所示DNA，Swa I和Asc I酶切位点间插入序列表的序列3所示DNA得到的重组质粒。
所述的干扰载体可用于抑制靶基因表达。
本发明还保护一种制备转基因植物的方法，是将所述的干扰载体导入目的植物，得到干扰载体的靶基因表达被抑制的转基因植物；所述目的植物为基因组中具有干扰载体的靶基因的植物。
本发明还保护一种培育含油量提高的转基因棉花的方法，是将所述干扰载体导入棉花，得到含油量提高的转基因棉花。
所述棉花具体可为珂字棉201。
本发明还保护序列表的序列2自5’末端第9至523位核苷酸所示的DNA或其反向互补DNA。
本发明构建了具有能在种子发育时期特异表达启动子的干扰载体，干扰效率高且可控制时空特异性表达，可用于沉默植物种子中表达的特定基因，改良油料作物种子或其他植物种子品质。
附图说明
图1为pFGC1008的结构示意图。
图2为质粒pFGC-NAP的结构示意图。
图3为干扰载体pFGC-FAD的结构示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。酶切所用的各种限制性内切酶均购自NEB公司，酶联反应所用的T4连接酶和反转录用的M-MLV反转录酶购自TAKARA公司，RNA提取试剂盒购自博迈德公司，出发载体pFGC1008(结构示意图见图1)购于ArabidopsisBiological Resource Center(ABRC)(产品编号：CD3-446)，其他各种试剂盒和大肠杆菌DH5α感受态均购自天根生化科技有限公司。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、质粒pFGC-NAP构建
一、种子特异启动子片段的制备
1、提取油菜基因组DNA
取油菜(甘蓝型油菜品种高油605；购于浙江凤起种业有限公司)幼叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒(产品目录号：DP320-02)提取基因组DNA。
2、PCR扩增NAPIN基因启动子片段
以基因组DNA为模板，设计一对引物(两个引物5’端分别引入Stu I和Asc I酶切识别序列和保护碱基)。
上游引物S1：5’-GAAGGCCTTCTTCATCGGTGATTGAT-3’(下划线为Stu I识别序列)；
下游引物S2：5’-AGGCGCGCCTGTATGTTTTTAATCTTG-3’(下划线为Asc I识别序列)。
用上述引物进行PCR扩增。得到1147bp的PCR产物，进行测序，测序结果表明PCR产物(NAPIN启动子片段)的核苷酸序列如序列表的序列1所示。
3、NAPIN启动子片段的酶切
(1)将NAPIN基因片段用Asc I内切酶进行酶切(37℃12小时)。
酶切体系(50μl)：10×NEB缓冲液5μl，DNA 10μl，内切酶1μl，灭菌双蒸水34μl。
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用普通DNA产物纯化试剂盒(目录号：DP204-02)进行纯化回收。
(2)将(1)中所得产物用Stu I内切酶进行酶切(37℃12小时)。
酶切体系(50μl)：10×NEB缓冲液5μl，DNA 30μl，内切酶2μl，灭菌双蒸水13μl。
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用普通DNA产物纯化试剂盒(目录号：DP204-02)进行纯化回收，即为酶切后的NAPIN启动子片段。
二、载体骨架的制备
1、用Asc I内切酶酶切pFGC1008(37℃ 12小时)。
酶切体系(50μl)：10×NEB缓冲液5μl，DNA 10μl，内切酶1μl，灭菌双蒸水34μl。
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用普通DNA产物纯化试剂盒(目录号：DP204-02)进行纯化回收。
2、用Stu I内切酶酶切步骤(1)的酶切产物(37℃12小时)。
酶切体系(50μl)：10×NEB缓冲液5μl，DNA 30μl，内切酶2μl，灭菌双蒸水13μl。
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用普通DNA产物纯化试剂盒(目录号：DP204-02)进行纯化回收，即为酶切后的载体骨架。
三、质粒pFGC-NAP构建
1、将步骤一得到的NAPIN启动子片段和步骤二得到的酶切后的载体骨架用T4连接酶进行连接(16℃ 12小时)。
酶连体系(25μl)：10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5μl，启动子片段10μl，载体骨架2.5μl，T4DNA Ligase 1μl，灭菌双蒸水9μl。
2、将步骤3的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板，37℃过夜培养。
3、挑取阳性克隆菌斑摇菌扩增，以扩增出的菌液为模板，用S1和S2组成的引物对进行PCR扩增，得到1147bp的PCR产物；将PCR产物进行测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列如序列表的序列1所示。
将PCR和测序检测阳性的质粒进行测序，测序结果表明，得到了质粒pFGC-NAP(在pFGC1008的Stu I和Asc I酶切位点之间插入了序列表的序列1所示的DNA，即用NAPIN启动子取代了CaMV 35S启动子)。质粒pFGC-NAP的结构示意图见图2。
实施例2、干扰载体的构建和应用
△12脂肪酸去饱和酶(即FAD2)是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶，其中FAD2-1在胚发育时期于种子中特异表达，被认为是负责种子中油脂进一步去饱和的关键酶。通过RNA干扰手段抑制棉花种子中特异表达的FAD2-1基因，可以大大降低棉籽脂肪酸中亚油酸和α-亚麻酸的生成，从而提高有利于生产的油酸的含量。所以本实施例中应用实施例1构建的质粒pFGC-NAP构建以棉花的FAD2-1作为干扰靶基因的RNA干扰表达载体。
一、目的基因干扰片段的制备
1、提取棉花总RNA
取棉花(珂字棉201，购于河北省农林科学院棉花研究所)开花后25天至35天期间的棉花幼胚，使用EASYspin植物快速提取试剂盒(编号：RN0901)提取棉花幼胚总RNA。
2、反转录得到cDNA
使用M-MLV反转录酶，将步骤1中得到的总RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增目的基因干扰片段
分析NCBI上已登录的ghFAD2-1基因序列(GENBANK ACCESSION NO.X97016)，确定一段大小为515bp的RNA干扰片段。利用primer 5.0软件设计引物，分别在正义和反义干扰片段的两端加上相应的酶切位点和保护碱基。
正义片段的PCR扩增的引物对(引物对甲)如下：
上游引物：5’-CGGGATCC AGGCTACAAGTTTACATCTCCG-3’(Bam H I)；
下游引物：5’-GACTAGT AGGCAGTTGGTCGGTCTTT-3’(SpeI)。
反义片段的PCR扩增的引物对(引物对乙)如下：
上游引物：5’-ATTTAAATAGGCTACAAGTTTACATCTCCG-3’(Swa I)；
下游引物：5’-GGCGCGCCAGGCAGTTGGTCGGTCTTT-3’(Asc I)。
以步骤2得到的cDNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物甲(正义片段)和PCR扩增产物乙(反义片段)。将PCR产物进行测序，PCR产物甲的核苷酸序列如序列表的序列2所示，PCR产物乙的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
4、干扰片段的酶切
(1)用Bam H I和SpeI内切酶酶切PCR扩增产物甲，纯化后得到酶切产物甲。
(2)用Swa I和Asc I内切酶酶切PCR扩增产物乙，纯化后得到酶切产物乙。
二、干扰载体的构建
1、正义片段的连接
(1)用Bam H I和SpeI内切酶酶切质粒pFGC-NAP，回收载体骨架。
(2)将酶切产物甲与载体骨架用T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板，37℃过夜培养。
(3)挑取阳性克隆菌斑摇菌扩增，取菌液提取质粒进行测序；测序结果证明：正义片段已插入pFGC-NAP的Bam H I和SpeI酶切位点间，得到了重组质粒甲。
2、反义片段的连接
(1)用Swa I和Asc I内切酶酶切重组质粒甲，回收载体骨架。
(2)将酶切产物乙与载体骨架用T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板，37℃过夜培养。
(3)挑取阳性克隆菌斑摇菌扩增，取菌液提取质粒进行测序；测序结果证明：反义片段已插入pFGC-NAP的Swa I和Asc I酶切位点间，得到了重组质粒乙(干扰载体pFGC-FAD)。
将干扰载体pFGC-FAD进行测序，测序结果表明：出发载体为pFGC-NAP，在Bam HI和SpeI酶切位点间插入了序列表的序列2所示DNA，在Swa I和Asc I酶切位点间插入了序列表的序列3所示DNA。干扰载体主要由三部分组成：启动子区、茎体部分、终止子区；启动子为NAPIN启动子(种子发育时期特异表达的启动子)；茎体部分由2个反向重复序列(目标基因的同-段序列的反向重复序列)和1个内含子(GUS基因的部分片段)组成。干扰载体pFGC-FAD为种子特异性表达的RNA干扰载体。干扰载体pFGC-FAD的结构示意图见图3。
三、对照干扰载体的构建
用出发载体pFGC1008代替质粒pFGC-NAP，其它步骤与步骤二相同，得到对照干扰载体。将对照干扰载体进行测序，测序结果表明：对照干扰载体与干扰载体pFGC-FAD的差别仅在于，对照干扰载体中的启动子为CaMV 35S启动子，干扰载体pFGC-FAD中的启动子为NAPIN启动子。
四、干扰载体pFGC-FAD的应用
1、转基因再生棉花植株甲的获得
(1)将干扰载体pFGC-FAD通过冻融法转化根癌农杆菌菌株EHA105(购于Invitron公司)感受态，获得重组农杆菌(含有pFGC-FAD的农杆菌)。
(2)重组农杆菌菌液侵染棉花(珂字棉201)无菌苗外植体，经过共培养，恢复培养和筛选培养，阳性植株进行分子鉴定(鉴定引物为S1和S2)，得到转基因再生棉花植株甲(T0代)。
上游引物S1：5’-GAAGGCCTTCTTCATCGGTGATTGAT-3’(下划线为Stu I识别序列)；
下游引物S2：5’-AGGCGCGCCTGTATGTTTTTAATCTTG-3’(下划线为Asc I识别序列)。
2、转基因再生棉花植株乙(对照植株)的获得
(1)将对照干扰载体通过冻融法转化根癌农杆菌菌株EHA105(购于Invitron公司)感受态，获得重组农杆菌(含有对照干扰载体的农杆菌)。
(2)重组农杆菌菌液侵染棉花(珂字棉201)无菌苗外植体，经过共培养，恢复培养和筛选培养，阳性植株进行分子鉴定，得到转基因再生棉花植株乙(T0代)。
3、棉籽含油量和籽仁含油量测定
将T0代转基因再生棉花植株甲、T0代转基因再生棉花植株乙和野生型植株(珂字棉201)移栽至中国农业大学科学园试验田，收获种子进行籽仁含油量测定。
将棉籽剪成两半，在烘箱内105℃温度下烘90min，每隔30min复烘直到前后两次重量差不超过0.005g；逐粒剥壳，计算籽仁占棉籽总重量的百分率；将籽仁粉碎后，依据国标GB/T 14488.1-1993检测籽仁含油量和棉籽含油量(干基含油量)。
结果见表1。
表1棉籽油含量比较
样品数
棉籽含油量(平均值)
籽仁含油量(平均值)
|
转基因再生棉花植株甲
100粒
24.34 Aa
37.61 Aa
转基因再生棉花植株乙
100粒
23.25 Bb
35.97 Bb
野生型植株
100粒
22.65 Cc
34.96 Cc
表注：小写字母表示差异显著；大写字母表示差异极显著。
转基因再生棉花植株甲的棉籽含油量和籽仁含油量与转基因再生棉花植株乙和野生型植株差异极显著。转基因再生棉花植株甲的棉籽含油量比非转基因植株提高约7.43％，转基因再生棉花植株甲比转基因再生棉花植株乙的棉籽含油量提高约4.69。
序列表
<110>中国农业大学
<120>用于构建干扰载体的质粒及其构建方法和应用
<130>CGGNARY102388
<160>4
<210>1
<211>1147
<212>DNA
<213>油菜(Brassica campestris L.)
<400>1
aagctttctt catcggtgat tgattccttt aaagacttat gtttcttatc ttgcttctga 60
ggcaagtatt cagttaccag ttaccactta tattctggac tttctgactg catcctcatt 120
tttccaacat tttaaatttc actattggct gaatgcttct tctttgagga agaaacaatt 180
cagatggcag aaatgtatca accaatgcat atatacaaat gtacctcttg ttctcaaaac 240
atctatcgga tggttccatt tgctttgtca tccaattagt gactacttta tattattcac 300
tcctctttat tactattttc atgcgaggtt gccatgtaca ttatatttgt aaggattgac 360
gctattgagc gtttttcttc aattttcttt attttagaca tgggtatgaa atgtgtgtta 420
gagttgggtt gaatgagata tacgttcaag cgaatggcat accgttctcg agtaaggatg 480
acctacccat tcttgagaca aatgttacat tttagtatca gagtaaaatg tgtacctata 540
actcaaattc gattgacatg tatccattca acataaaatt aaaccagcct gcgcctgcat 600
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tccgaatttg gaagattttg actcaaattc ccaatttata ttgaccgtga ctaaatcaac 720
tttaacttct ataattctga ttaagctccc aatttatatt cccaacggca ctacctccaa 780
aatttataga ctctcatccc cttttaaacc aacttagtaa acgttttttt tttttaattt 840
tatgaagtta agtttttacc ttgtttttaa aaagaatcgt tcataagatg ccacgccaga 900
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tcatccgctt cactcttact caaaccaaac tcatcaattc caacaagatt aaaaacatac 1140
aggatcc 1147
<210>2
<211>530
<212>DNA
<213>棉花(Gossypium hirsutum)
<400>2
cgggatccag gctacaagtt tacatctccg atactggtat atttgcggta atttatgtac 60
tttataagat tgctgcaaca aaagggctgg cttggctttt atgcacttat ggggtgcctc 120
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tgccgcatta tgactcgtcc gaatgggatt ggttgcgagg agcattgtcg acgatggatc 240
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caaaagagtg cctttacgtt gagcctgacg ttggtggtgg tggtggtggt agcaaaggtg 480
ttttttggta tcgtaacaag ttctaaagac cgaccaactg cctactagtc 530
<210>3
<211>531
<212>DNA
<213>棉花(Gossypium hirsutum)
<400>3
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ttttttggta tcgtaacaag ttctaaagac cgaccaactg cctggcgcgc c 531
<210>4
<211>1158
<212>DNA
<213>棉花(Gossypium hirsutum)
<400>4
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aatcgagttc cgatcgagaa gcctccgttt acgctcggtc agatcaagca agccattccg 120
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