发明内容
本发明的目的在于，提供一种治疗咳喘病的胶囊剂的检测方法。本发明建立了系统的、完整的、有效的成分鉴别和含量测定方法，可有效控制该药品的质量，从而确保其临床疗效。
本发明所述治疗咳喘病的胶囊剂是以吉祥草600～650份、黄芩350～400份、浙贝母350～400份、蛤壳225～275份、毛大丁草400～450份、麻黄350～400份、炙桑白皮475～525份、炙葶苈子350～400份、天竺黄400～450份、炙僵蚕400～450份和地龙350～400份为原料药，加入适量辅料制成的。其制备方法为：称取十一味药材，加水煎煮3次，第一次加8倍量水，第二、三次各加6倍量水，每次煎煮1小时，滤过，合并滤液；滤液浓缩至50℃相对密度为1.1，加乙醇使含醇量为70％，静置24小时，吸取上清液，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩，80℃以下减压干燥，得干膏，粉碎过80目筛，加入淀粉25份和微晶纤维素50份，混匀，颗粒装入胶囊，即得胶囊剂。(以上份数均指重量份)
本发明所述的检测方法包括性状、鉴别、检查和含量测定项目；其中鉴别是对制剂中的黄芩、浙贝母、毛大丁草、麻黄的薄层色谱鉴别；含量测定是对制剂中麻黄碱和黄芩苷的含量测定。
黄芩的鉴别方法是以黄芩对照药材和黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品为对照，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸＝10∶3∶1∶2为展开剂的薄层色谱法；浙贝母的鉴别方法是以贝母素甲、贝母素乙对照品为对照，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液＝17∶2∶1为展开剂的薄层色谱法；毛大丁草的鉴别方法是以毛大丁草对照药材为对照，以氯仿-甲醇＝30∶10为展开剂的薄层色谱法；麻黄的鉴别方法是以麻黄对照药材为对照，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液＝20∶5∶0.5为展开剂的薄层色谱法。
具体的鉴别方法为：
(1)黄芩的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物2g，加乙酸乙酯-甲醇＝3∶1的混合溶液30mL，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，取上清液作为供试品溶液；另取黄芩对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每1mL各含1mg、0.5mg、0.5mg的对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各5μL，及对照品溶液2μl分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸＝10∶3∶1∶2为展开剂，饱和30分钟，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点；
(2)浙贝母的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物2g，加浓氨试液2mL与甲苯20mL，放置过夜，滤过，取滤液8mL，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取贝母素甲、贝母素乙对照品，加三氯甲烷制成每1mL各含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各20μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液＝17∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(3)毛大丁草的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物2g，加入石油醚溶液30mL，超声40分钟，倾去石油醚液，残渣加50％乙醇40ml超声40分钟，滤过，蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；另取毛大丁草对照药材1g，同法处理，制成对照药材溶液；照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液15ul、对照药材溶液5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇＝30∶10为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(4)麻黄的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物2g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷10mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL充分振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取麻黄对照药材1g，同法处理，作为对照药材溶液；照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液＝20∶5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液；在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
麻黄碱的含量测定方法是以盐酸麻黄碱对照品为对照，以乙腈∶0.1％磷酸＝5∶95为流动相的高效液相色谱法；黄芩苷的含量测定方法是以黄芩苷对照品为对照，以甲醇∶水∶磷酸＝47∶53∶0.2为流动相的高效液相色谱法。
具体的含量测定方法为：
(1)麻黄碱含量测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈∶0.1％磷酸＝5∶95为流动相；流速为1mL/min；柱温25℃；检测波长为207nm；理论板数按盐酸麻黄碱峰计不低于6000；
对照品溶液的制备：精密称取盐酸麻黄碱对照品10mg，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL，置25mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含盐酸麻黄碱4μg的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取本制剂内容物0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱上，用50％甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL量瓶中，加盐酸1滴，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本制剂每粒含麻黄以盐酸麻黄碱C10H15NO·HCl计，不得少于1.29mg；
(2)黄芩苷含量测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶水∶磷酸＝47∶53∶0.2为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为207nm；理论板数按黄芩苷峰计不低于5000；
对照品溶液的制备：精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品10mg，加甲醇制成每1mL含黄芩苷50μg的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取本制剂内容物0.3g，精密称定，加70％乙醇40mL，回流3小时，放冷，滤过，滤液移至100mL量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；
本制剂每粒含黄芩以黄芩苷C21H18011计，不得少于13.8mg。
本发明所述的检测方法包括：
性状：其内容物为棕褐色粉末，气微，味微甜或微苦；
鉴别：(1)黄芩的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物2g，加乙酸乙酯-甲醇＝3∶1的混合溶液30mL，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，取上清液作为供试品溶液；另取黄芩对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每1mL各含1mg、0.5mg、0.5mg的对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各5μL，及对照品溶液2μl分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸＝10∶3∶1∶2为展开剂，饱和30分钟，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点；
(2)浙贝母的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物2g，加浓氨试液2mL与甲苯20mL，放置过夜，滤过，取滤液8mL，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取贝母素甲、贝母素乙对照品，加三氯甲烷制成每1mL各含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各20μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液＝17∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(3)毛大丁草的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物2g，加入石油醚溶液30mL，超声40分钟，倾去石油醚液，残渣加50％乙醇40ml超声40分钟，滤过，蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；另取毛大丁草对照药材1g，同法处理，制成对照药材溶液；照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液15ul、对照药材溶液5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇＝30∶10为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(4)麻黄的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物2g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷10mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL充分振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取麻黄对照药材1g，同法处理，作为对照药材溶液；照中国药典2005年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液＝20∶5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液；在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
检查：应符合《中国药典》2005年版一部附录I L胶囊剂项下有关的各项规定；
含量测定：(1)麻黄碱含量测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈∶0.1％磷酸＝5∶95为流动相；流速为1mL/min；柱温25℃；检测波长为207nm；理论板数按盐酸麻黄碱峰计不低于6000；
对照品溶液的制备：精密称取盐酸麻黄碱对照品10mg，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL，置25mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含盐酸麻黄碱4μg的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取本制剂内容物0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱上，用50％甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL量瓶中，加盐酸1滴，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本制剂每粒含麻黄以盐酸麻黄碱C10H15NO·HCl计，不得少于1.29mg；
(2)黄芩苷含量测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶水∶磷酸＝47∶53∶0.2为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为207nm；理论板数按黄芩苷峰计不低于5000；
对照品溶液的制备：精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品10mg，加甲醇制成每1mL含黄芩苷50μg的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取本制剂内容物0.3g，精密称定，加70％乙醇40mL，回流3小时，放冷，滤过，滤液移至100mL量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；
本制剂每粒含黄芩以黄芩苷C21H18O11计，不得少于13.8mg。
为了确保本发明检测方法科学、合理、可行，申请人进行了一系列试验研究和考察。
(一)鉴别
1、黄芩的薄层色谱鉴别
照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，取本制剂内容物2g，按本发明所述方法制成供试品溶液。另取黄芩对照药材1g，缺黄芩的阴性制剂，同法制成对照药材溶液、阴性对照溶液；再取黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每1mL各含1mg、0.5mg、0.5mg的对照品溶液；吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液各5μL及对照品溶液2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)为展开剂，饱和30分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点；阴性对照无干扰。故选择其列入本发明检测项目。
2、浙贝母薄层色谱鉴别
照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验。取本制剂内容物2g，按本发明所述方法制成供试品溶液。另取贝母素甲、贝母素乙对照品，缺浙贝母的阴性制剂，同法制成对照品溶液、阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(17∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果Rf值适中，斑点清晰，阴性对照无干扰。故选择其列入本发明检测项目。
3、毛大丁草的薄层色谱鉴别
照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验。实验中曾参照文献“毛大丁草化学成分研究”，结果阴性有干扰，后参照“薄层扫描法测定毛大丁草中熊果苷的含量”，加入甲醇溶液40mL，超声30分钟，过滤，回收甲醇至干，残渣加甲醇2mL溶解，取上清液作为供试品溶液。另取毛大丁草对照药材，同法制成对照药材溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各3μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰。结果重现性差，样品斑点不清晰。因此，采用取本制剂内容物2g，加入石油醚溶液30mL，超声40分钟，倾去石油醚液，残渣加50％乙醇40ml超声40分钟，过滤，蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为供试品溶液。另取毛大丁草对照药材1g，缺毛大丁草的阴性制剂，同法处理，制成对照药材溶液、阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液15ul、对照药材溶液、阴性对照溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(30∶10)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。故选择其列入本发明检测项目。
4、麻黄薄层色谱鉴别
照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，取本制剂内容物2g，按本发明所述方法制成供试品溶液。另取麻黄对照药材，缺麻黄的阴性制剂，同法制成对照药材溶液、阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各9μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液(20∶5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液。在105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。故选择其列入本发明检测项目。
5、桑白皮的薄层色谱鉴别
照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验。实验中曾参照2005年版《中国药典》桑白皮TLC的鉴别，结果阴性有干扰，效果不好。经过分析，认为黄芩中的黄酮成分对试验造成干扰，故改变前处理办法，加95％乙醇90mL回流1小时，过滤，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2mL溶解，取上清液作为供试品溶液。对照药材同法处理，结果对照药材斑点不清晰，后又采用加水20ml回流30分钟，过滤，滤液加乙醇使其含醇量为80％，放置过夜，取上清液挥干，加1ml乙酸乙酯溶解，制成对照药材溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各9μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，但色谱条件不稳定，样品Rf变化较大，斑点模糊。故不列入本发明检测项目。
6、地龙的薄层色谱鉴别
实验中分别参考了《中国药典》2005年版地龙项下的鉴别方法，薄层扫描法测定地龙类药材中琥珀酸的含量，丹黄胶囊的薄层鉴别研究，舒心丸的质量标准研究，双波长薄层扫描法测定地龙注射液中缬氨酸的含量，小活络丸的薄层分析，均因干扰太大而未列入本发明检测项目。
7、吉祥草的薄层色谱鉴别
实验中分别参考了《贵州省中药材、民族药质量标准》以及复方吉祥草含片质量标准研究等文献，均因干扰太大未列入本发明检测项目。
(二)含量测定
本制剂以麻黄为君药，故选择麻黄中的有效成分盐酸麻黄碱作为质量标准的含测指标，以很好地控制成品质量；另外黄芩具有清热燥湿，泻火解毒功效，所以配合黄芩中的有效成分黄芩苷作为本发明含量测定指标成分，可以更好地控制成品质量。
1、麻黄碱照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI D)测定。
(1)仪器与试药
仪器：Angilent1100高效液相色谱仪；HB-10250型超声清洗器(250W，40kHz)，江苏汉邦科技有限公司；梅特勒-托利多AE电子分析天平(METTLER TOLEDO十万分之一)。
试剂：甲醇为色谱纯，乙腈为色谱纯，水为重蒸水，磷酸、中性氧化铝均为分析纯。
盐酸麻黄碱对照品：购自中国药品生物制品检定所(供含量测定用)，批号为：241-200102。
样品：本发明制剂(吉贝咳喘胶囊，批号：20041001、20041002、20041003)。
(2)对照品溶液的制备
精密称取盐酸麻黄碱对照品13.5mg，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置25mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得(每1mL含盐酸麻黄碱5.4μg)。
(3)色谱条件的选择：
在进行盐酸麻黄碱色谱条件选择时，参考了《中国药典》2005年版一部麻黄项下盐酸麻黄碱的含量测定色谱条件，进行了色谱波长的筛选。根据实验确定盐酸麻黄碱的色谱条件为：DiamonsilTM(钻石)C18 5μm(250×4.6mm)；流动相为乙腈-0.1％磷酸(5∶95)；流速为1mL/min；柱温25℃；检测波长为207nm。选择条件见表6。
表6 盐酸麻黄碱色谱条件选择
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(4)系统适用性试验
阴性溶液的制备：取缺麻黄的阴性样品约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率16W，频率50kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱(100～200目，1.5g，内径1cm)上，用50％甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL量瓶中，加磷酸1滴，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
空白溶液的制备：取具塞锥形瓶，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱(100～200目，1.5g，内径1cm)上，用50％甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL量瓶中，加磷酸1滴，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本制剂内容物约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率16W，频率50kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱(100～200目，1.5g，内径1cm)上，用50％甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL量瓶中，加磷酸1滴，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
从图谱可知，在此色谱条件下，盐酸麻黄碱峰与其他组分峰完全分离，在与盐酸麻黄碱峰相同的保留时间内，阴性对照无干扰。样品理论板数以盐酸麻黄碱峰计为6502，故确定理论板数以盐酸麻黄碱计，应不得低于6000。
(5)供试品溶液的制备方法选择
A.提取溶剂的选择：
取同一批号本制剂的内容物约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入75％甲醇、甲醇和乙醇各25mL，称定重量，超声处理(功率16W，频率50kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过。分别精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱(100～200目，1.5g，内径1cm)上，分别用50％甲醇、50％甲醇和50％乙醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL量瓶中，加磷酸1滴，分别用50％甲醇、50％甲醇和50％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，测定样品中盐酸麻黄碱的含量。结果见表7。
表7 提取溶剂选择
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结果显示：用甲醇提取本制剂(吉贝咳喘胶囊)中的盐酸麻黄碱的量最大。
B.提取方法的选择：
取同一批号本制剂的内容物约0.5g，精密称定，精密加入甲醇25mL，称定重量，配制三份，一份超声处理45分钟；另一份回流提取60分钟；第三份索氏提取60分钟。三份提取后放冷，再称定重量。用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱(100～200目，1.5g，内径1cm)上，分别用50％甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，置10mL量瓶中，加磷酸1滴，分别用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，测定样品中盐酸麻黄碱的含量。结果见表8。
表8 提取方法选择
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结果显示：索氏提取效果较差，热回流提取和超声提取两种方法无显著性差异，故选用操作简单方便的超声提取法。
C.提取时间的选择
取同一批号本制剂的内容物约0.5g，精密称定，精密加入甲醇25mL，称定重量；超声处理15分钟、25分钟、35分钟，45分钟，60分钟，放冷，称定重量。用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中丹参酮IIA的含量。结果见表9。
表9 提取时间选择
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结果显示：45分钟与60分钟盐酸麻黄碱测定结果无显著性差异，故将提取时间定为45分钟。
根据上述实验确定供试品溶液制备方法为：取装量差异项下的本制剂内容物约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率16W，频率50kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱(100～200目，1.5g，内径1cm)上，分别用50％甲醇洗脱，收集洗脱液约9mL，移置10mL量瓶中，加磷酸1滴，分别用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
(6)线性关系的考察
标准曲线的绘制：精密称取盐酸麻黄碱对照品13.5mg，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取30mL置150mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为盐酸麻黄碱储备液一。分别精密吸取盐酸麻黄碱储备液一各10mL、17mL、24mL、31mL、38mL置50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含盐酸麻黄碱5.4μg/mL，9.18μg/mL，12.96μg/mL，16.74μg/mL，20.52μg/mL的系列对照品溶液，精密吸取上述溶液20μL，分别注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积为横坐标，对照品的进样量为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。结果见表10。
表10 线性关系考察实验结果
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盐酸麻黄碱回归方程为：y＝7×10-4x-3.8×10-4(r＝0.9996)。
经拟合过原点的方程为：y＝7×10-4x(r＝0.9994)。
将同一样品的盐酸麻黄碱峰面积分别代入上述两方程中，结果相对偏差为0.96％，可认为截距为零，用外标一点法计算含量，盐酸麻黄碱在0.108μg～0.4104μg范围内呈良好的线性关系。
(7)精密度试验
A.取对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，重复进样6次，以盐酸麻黄碱峰面积进行计算，求出相对标准偏差RSD(％)，结果见表11。
表11 精密度考察实验结果
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结果：相对标准偏差RSD(％)为1.40％(n＝6)，表明重复性良好。
B.取同一批号本制剂的内容物，按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，重复进样6次，以盐酸麻黄碱峰面积进行计算，求出相对标准偏差RSD(％)，结果见表12。
表12 精密度考察实验结果
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结果：相对标准偏差RSD(％)为1.6％(n＝6)，表明重复性良好
(8)中间精密度试验
取同一批号本制剂的内容物，不同实验人员按供试品溶液制备方法操作制备供试品溶液，吸取供试品溶液20μL，注入不同高效液相色谱仪：
仪器一：Angilent1100高效液相色谱仪；Diamosile-C18(250mm×4.6mm，5μm)
仪器二：岛津LC-20A高效液相色谱仪；Diamosile-C18(250mm×4.6mm，5μm)
按(3)项下色谱条件测定峰面积，两台仪器分别重复进样6次，以测得峰面积计算盐酸麻黄碱的含量，求出相对标准偏差RSD(％)，结果见表13。
表13 中间精密度考察实验结果
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结果表明：相对标准偏差RSD(％)为2.7％(n＝12)，表明中间精密度良好。
(9)稳定性试验
取同一批号样品的内容物，按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取供试品溶液20μL，分别在0，1，2，4，8，12h注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，以盐酸麻黄碱峰面积进行计算，求出相对标准偏差RSD(％)，结果见表14。
表14 稳定性实验结果
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结果：取供试品溶液，在设定的时间内注入色谱仪，平均峰面积为：293.54，RSD(％)为0.74％(n＝6)，表明本供试品溶液在12h内稳定。
(10)重复性试验
取同一批号本制剂的内容物，按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，按下式计算出各样品中盐酸麻黄碱含量，计算式如下：
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C：盐酸麻黄碱对照品浓度(mg/mL)
W：样品称样量(g)
A样：样品峰面积
A对：盐酸麻黄碱对照品峰面积
B样：样品进样量(μL)
B对：盐酸麻黄碱对照品进样量(μL)
根据上式计算出样品中盐酸麻黄碱含量，结果见表15。
表15 重复性试验结果
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结果表明：该样品的平均含量为3.34mg/g，RSD为0.47％(n＝6)，表明重现性良好。
(11)加样回收率试验
取同一批号本制剂内容物，混匀，取约0.25g，9份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，每三份分别加入盐酸麻黄碱储备液一(浓度为0.169mg/mL)4mL，5mL和6mL。按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取对照品溶液和供试品溶液各15μl和20μl，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，按下式计算出回收率，计算式如下：
回收率＝(C-A)/B×100％
A：样品盐酸麻黄碱的量(mg)
B：盐酸麻黄碱对照品加入量(mg)
C：测得量(mg)
结果见表16。
表16 加样回收实验结果
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结果：平均回收率为102.82％，RSD为0.11％(n＝9)，表明盐酸麻黄碱的回收率良好。
(12)样品测定
取10个批号的本制剂内容物，按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，按(9)项下计算公式，计算出各样品中盐酸麻黄碱含量(mg/g)。
每粒含量(mg/粒)＝含量(mg/g)×每粒粒重(g)
注：每粒粒重为0.48g。
结果见表17。
表17 十批样品含量测定结果
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上述10批样品测得盐酸麻黄碱平均含量为3.35mg/g。从大批量规模生产考虑，本制剂每克盐酸麻黄碱的最低含量限度以平均含量的80％计算，即3.35×0.48×0.8＝1.29mg/粒，即每粒含麻黄以盐酸麻黄碱(C10H15NO·HCl)计，不得少于1.29mg。
2、黄芩苷照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI D)测定。
(1)仪器与试药
仪器：Angilent1100高效液相色谱仪；HB-10250型超声清洗器(250W，40kHz)，江苏汉邦科技有限公司；梅特勒-托利多AE电子分析天平(METTLER TOLEDO十万分之一)。
试剂：甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，重蒸水。
黄芩苷对照品：购自中国药品生物制品检定所(供含量测定用)，批号为：110715-200212。
样品：本发明制剂(吉贝咳喘胶囊，批号：20041001、20041002、20041003)。
(2)对照品溶液制备
精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。
(3)色谱条件的选择
在进行黄芩苷色谱条件选择时，参考了《中国药典》2005年版一部黄芩项下黄芩苷的含量测定色谱条件，进行了色谱波长的筛选。根据实验确定黄芩苷的色谱条件为：DiamonsilTM(钻石)C18 5μm(250×4.6mm)；以甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为280nm。选择条件见表18。
表18 黄芩苷色谱条件选择
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(4)系统适应性试验
阴性对照试验及理论板数的确定
阴性对照品溶液的制备：取缺黄芩的阴性样品内容物约0.3g，精密称定，加70％乙醇40mL，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置于100mL量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一容量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
空白溶液的制备：加70％乙醇40mL，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取本制剂内容物约0.3g，精密称定，置于烧瓶中，加70％乙醇40mL，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定方法：精密吸取对照品溶液5μL，阴性溶液、空白溶液及供试品溶液各10μL，按上述色谱条件注入色谱仪。
根据图谱可知，在此色谱条件下，黄芩苷峰与其他组分峰完全分离，在与黄芩苷峰相同的保留时间内，阴性对照无干扰。样品理论板数以黄芩苷峰计为5331，故确定理论板数以黄芩苷计，应不得低于5000。
(5)供试品溶液的制备方法的选择
A.提取溶剂的选择：
取同一批号本制剂的内容物约0.3g，精密称定，置于烧瓶中，分别精密加入50％乙醇、60％乙醇和70％乙醇各40mL，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，分别用少量50％乙醇、60％乙醇和70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，分别加50％乙醇、60％乙醇和70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1mL，移置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定样品中黄芩苷的含量。结果见表19。
表19 提取溶剂选择
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试验结果表明，用70％乙醇提取本制剂(吉贝咳喘胶囊)中的黄芩苷的量最大。
B.提取方法的选择：
取同一批号本制剂的内容物约0.3g，精密称定3份，1份置于烧瓶中，精密加入70％乙醇各40mL，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；一份置于具塞锥形瓶中，精密加入100mL70％乙醇，称定重量，超声处理120分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定样品中黄芩苷的量。结果见表20。
表20 提取方法选择
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结果显示：热回流提取较超声提取的黄芩苷含量高，故选用热回流提取3小时作为供试品的提取方法。
C.提取时间的选择
取同一批号样品的内容物约0.3g，精密称定5份，分别精密加入70％乙醇各40mL，分别加热回流1小时、2小时、3小时、4小时和5小时，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，分别用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定样品中黄芩苷的含量。结果见表21。
表21 提取时间选择
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结果表明：热回流提取3小时前黄芩苷含量较低，热回流提取4小时和5小时黄芩苷的含量与热回流3小时的含量无显著差异，因此热回流提取3小时为最佳提取时间。
根据实验确定供试品溶液制备方法为：取装量差异项下的本制剂内容物约0.3g，精密称定，置烧瓶中，精密加入70％乙醇各40mL，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
(6)线性关系的考察
标准曲线的绘制：精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品15.5mg，置100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取2、4、6、8、10mL置于25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成黄芩苷浓度别为12.4μg/mL，24.8μg/mL，37.2μg/mL，49.6μg/mL，62μg/mL的系列对照品溶液，精密吸取上述溶液10μL，分别注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积为横坐标，对照品的进样量为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。结果见表22。
表22 线性关系考察结果
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黄芩苷回归方程为：y＝3027.7x+10.94(r＝0.9998)
经拟合过原点的方程为：y＝3051.8x(r＝0.9997)。
将同一样品的黄芩苷峰面积分别代入上述两方程中，结果相对偏差为0.8％，可认为截距为零，用外标一点法计算含量，黄芩苷在0.124μg～0.620μg范围内呈良好的线性关系。
(7)精密度试验
A.取对照品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，重复进样6次，以黄芩苷的峰面积进行计算，求出相对标准偏差RSD(％)，结果见表23。
表23 精密度考察实验结果
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结果表明：相对标准偏差RSD(％)为0.26％(n＝6)，表明重复性良好。
B.取同一批号本制剂的内容物，按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，重复进样6次，以黄芩苷峰面积进行计算，求出相对标准偏差RSD(％)，结果见表24。
表24 精密度考察实验结果
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结果表明：相对标准偏差RSD(％)为0.82％(n＝6)，表明重复性良好。
(8)中间精密度试验
取同一批号本制剂的内容物，不同实验人员按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL、10μL，注入不同高效液相色谱仪：
仪器一：Angilent1100高效液相色谱仪；Diamosile-C18(250mm×4.6mm，5μm)
仪器二：岛津LC-20A高效液相色谱仪；Diamosile-C18(250mm×4.6mm，5μm)
按(3)项下色谱条件测定峰面积，两台仪器分别重复进样6次，以测得峰面积计算黄芩苷的含量，求出相对标准偏差RSD(％)，结果见表25。
表25 中间精密度考察实验结果
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结果表明：相对标准偏差RSD(％)为2.9％(n＝12)，表明中间精密度较好。
(9)稳定性试验
取同一批号本制剂的内容物，按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取供试品溶液5μL，分别在0，1，2，4，8，12h注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，以黄芩苷的峰面积进行计算，求出相对标准偏差RSD(％)，结果见表26。
表26 稳定性实验结果
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结果：取供试品溶液，在设定的时间内注入色谱仪，测得平均峰面积为：349.65，RSD(％)为1.62％(n＝6)，表明本供试品溶液在12h内稳定。
(10)重复性试验
取同一批号本制剂的内容物，按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，按下式计算出各样品中黄芩苷含量，计算式如下：
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C：黄芩苷对照品浓度(mg/mL)
W：样品称样量(g)
A样：样品峰面积
A对：黄芩苷对照品峰面积
B样：样品进样量(μL)
B对：黄芩苷对照品进样量(μL)
根据上式计算出样品中黄芩苷含量，结果见表27。
表27 重复性实验结果
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结果：该样品的平均含量为37.13mg/g，RSD为0.39％(n＝6)，表明重现性良好。
(11)加样回收率试验
储备液的制备：精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品58.13mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
取同一批号本制剂内容物约0.15g，9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，3份精确加入黄芩苷储备液(浓度为1.1626mg/mL)各4mL；3份精确加入黄芩苷储备液(浓度为1.1626mg/mL)各5mL；另3份精确加入黄芩苷储备液(浓度为1.1626mg/mL)各6mL；按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL、10μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，按下式计算出回收率，计算式如下：结果见表28。
回收率＝(C-A)/B×100％
A：样品中黄芩苷的量(mg)
B：黄芩苷对照品加入量(mg)
C：测得量(mg)
表28 加样回收实验结果
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结果：平均回收率为104.92％，RSD(％)为2.22％(n＝9)，表明黄芩苷的回收率良好。
(12)样品测定
取10个批号的本制剂按(5)项下供试品溶液制备方法操作，吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL、10μL，注入高效液相色谱仪，按(3)项下色谱条件测定峰面积，按(9)项下计算公式计算出各样品中黄芩苷含量(mg/g)；结果见表29。
表29 十批样品含量测定结果
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上述10批样品测得黄芩苷平均含量为36.03mg/g。从大批量规模生产考虑，本制剂每克黄芩苷的含量限度以80％计算，黄芩苷的含量为36.03×0.8×0.48＝13.8mg/粒，故本制剂的限度定为：每粒含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，不得少于13.8mg。
与现有技术相比，本发明针对新开发的治疗咳喘病的中药制剂建立了系统的、完整的、有效的质量检测方法，且所述方法的专属性强，精密度高，重现性好，回收率高，测量结果准确，达到了有效控制药物质量的目的，从而确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。