一种小麦凝集素类蛋白TaJRL1及其编码基因与应用
一、技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种来源于小麦的凝集素蛋白TaJRL1及其编码基因与应用。
二、背景技术
植物在整个生命周期中会面临各种细菌、真菌、病毒、蚜虫、蝗虫、螟虫、飞蛾等病虫害的危害等，这些病虫害对植物生长发育产生诸多不利的影响。为了应对各种病虫害，植物自身形成了一系列调控机制：除了通过在侵染部位合成和积累木质素、植保素等物质来阻止病菌的入侵和扩展之外，植物还通过诱导防卫反应产生广谱抗性来应对病原菌的侵入。研究表明，植物的防卫反应受两类基因的控制，一类是R基因，一类是病程相关基因，前者属于基础抗性，后者属于诱导型抗性。R基因产物作为受体，直接或者间接的参与病原蛋白互作，从而启动植物体内的抗病信号途径。这类抗病反应产生的抗病性较强，但是由于R基因的资源有限，尤其是对某些复杂的数量性状抗病性如小麦的赤霉病抗性，这类R基因的获得尤其困难。除开资源有限较难获得之外，R基因介导的抗性具有病原种类和病原生理小种的特异性，抗谱不广，抗性易于丧失。与R基因相比较，病程相关基因介导的抗性具有抗性持久、抗谱广泛和资源丰富等优点。在缺乏R基因的情况下，通过克隆病程相关基因提高植物的抗性显得尤为重要。这类病程相关基因的共同特点是在经过病原菌诱导后表达量明显升高或减少。
小麦是世界上重要的粮食作物之一，但病虫害的影响往往导致产量和品质的下降。病原菌对植物的侵害及引起的一系列防卫反应在不同植物与病原菌之间存在相似性，因此，我们可以通过抗病反应相关基因的应用来提高植物广谱及长效的抗性。抗病反应的调控因子分为正调控因子和负调控因子两类。正调控因子的超量表达，可以快速而有效的启动抗病反应，提高植物的抗病性，拓宽植物的抗谱；而抑制该基因的表达则会导致抗病性的减弱。
凝集素是一类非免疫起源的糖结合蛋白，各种生物中分布广泛、种类众多，家族内各成员的结构和功能亦差异悬殊。根据特征性质的不同可以将植物凝集素分为七个亚家族：苋科凝集素、葫芦科韧皮部凝集素、橡胶蛋白结构域凝集素、豆科凝集素、单子叶植物甘露糖结合凝集素、II型核糖体失活蛋白凝集素和jacalin相关凝集素。值得说明的是，本发明的TaJRL1蛋白是来源于小麦的jacalin相关凝集素，在本发明提出之前，Genbank中与TaJRL1的同源性最高的多肽链为大麦的mJRL蛋白LEM2，两者的同源性仅为48％。
三、发明内容
技术要求
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗病虫相关的小麦凝集素类蛋白TaJRL1。
本发明还要解决的技术问题是提供上述蛋白的编码基因。
本发明还要解决的技术问题是提供上述基因在培育抗病虫品种中的应用。
技术方案
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种小麦凝集素类蛋白TaJRL1(Triticum aestivum Jacalin Related Lectin)，它是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。
所述的小麦凝集素类蛋白TaJRL1优选具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该蛋白包含301个氨基酸，等电点为6.36，含有2个jacalin结构域，一个结构域为AA21-AA148，第二个结构域为AA163-AA298。在NCBI网站上进行序列比对没有发现与该多肽链同源性超过50％的蛋白序列公布。在已公布的蛋白序列中，与该多肽链同源性最高的蛋白质序列是大麦mJRL蛋白LEM2，两者之间的同源性仅为48％。因此，TaJRL1是一个新的jccalin类似蛋白。
上述小麦凝集素类蛋白TaJRL1的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列；
2)编码序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
小麦凝集素类蛋白TaJRL1的编码基因优选序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。小麦凝集素类蛋白TaJRL1的编码基因含有906bp的核苷酸。
含有上述基因TaJRL1的表达载体和转基因细胞系也在本发明的保护范围之内，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和转基因细胞系。
上述基因TaJRL1在培育抗病虫品种中的应用。利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的凝集素类基因TaJRL1导入植物细胞，可获得改变植物对白粉病、赤霉病和棉铃虫的抗性的转基因细胞系及转基因植株。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因(如：潮霉素、卡那霉素和庆大霉素)，加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于快速和有效的获得转基因植株。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外源基因之间加入报告基因(GUS基因、GFP和荧火虫荧光素酶报告基因)，构建报告基因和外源基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以通过观察报告基因的表达与否和表达量高低，推测外源基因在植物体内表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以构建载体时不携带任何筛选标记基因，而在苗期进行PCR检测。含有本发明的TaJRL1表达载体可通过使用基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道，电击，显微注射，Ti质粒，Ri质粒或植物病毒等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的植株材料既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如：水稻、棉花、小麦、大豆、烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。
TaJRL1基因可提高南芥对赤霉菌的抗性。
TaJRL1基因可提高烟草对棉铃虫的抗性。
TaJRL1基因可提高小麦对白粉病的抗性。
有益效果
通过基因工程的方法将本发明提供的小麦凝集素类蛋白转入植物中，可以提高植物对棉铃虫、赤霉病和白粉病的抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可以广泛应用于各种植物的抗病虫性育种过程。
四、附图说明
图1A为转基因拟南芥的PCR检测。
图1B为转基因拟南芥的赤霉菌抗性得到了提高。
图2A为转基因烟草的PCR检测。
图2B为转基因烟草对棉铃虫的抗性得到了提高。
图3为构建的TaJRL1基因的体外转录载体结构。
图4A为VIGS处理后小麦中TaJRL1基因表达丰度降低。
图4B为TaJRL1基因被沉默后小麦的白粉病抗性降低。
五、具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：TaJRL1蛋白的获得。
在抗赤霉病材料望水白开花期，将赤霉菌孢子液用喷雾器喷洒到穗部，所用孢子液为江苏省范围内强致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子混合液，接种后立即将穗子套上塑料袋，保持湿度，以保证赤霉菌发病。在接种后6小时、12小时和24小时后分别取麦穗，同时用水接种做为对照，取材后立即用液氮冷冻。取700mg冻存的麦穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL 10％三氯醋酸/丙酮振荡混匀、-20℃沉淀1小时；4℃15,000g离心15min，沉淀重新悬浮于5mL冷丙酮中，-20℃放置2小时；4℃15,000g离心15min，沉淀悬浮于80％的冷丙酮中，-20℃放置1小时，离心去丙酮，将沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10μL裂解液(7M脲，2M硫脲，4％CHAPS，1％CA，0.3％蛋白酶抑制剂，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4℃搅拌抽提15min后加入14mM的DTT；4℃再搅拌20min，然后35,000g离心10min，上清即为蛋白抽提液。将蛋白提取液进行等电聚焦后，进行SDS-PAGE电泳。电泳缓冲液用Tris-Glycine-SDS缓冲液，温度设为17℃；先用2.5W/胶预电泳30min后，再用5W/胶电泳至溴酚蓝到玻璃板下缘为止。电泳结束后，取下凝胶进行银染。分析在侵染后蛋白点的丰度与对照相比超过3倍的蛋白点，取一个分子量为31.1千道尔顿，等电点为6.36的蛋白点即为TaJRL1蛋白。
实施例2：编码TaJRL1蛋白的cDNA序列的获得。
对实施例1得到的蛋白点进行质谱分析获得其氨基酸组成信息，根据对应肽片段的EST用来搜索小麦EST数据库，得到了3条EST序列：CK163175，CK163203和CK163203，将上述3条EST序列进行拼接，然后用MacVector软件设计引物P1，P1引物对如下：F-5′-ATGGCCGGCGCTGTGAAGATTGGT-3′；R-5′-GTCATCCAGCGGCACGACATA-3′。以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，用英俊公司的Trizol试剂盒提取小麦穗部的总RNA，采用Promega公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。用引物P1进行PCR扩增，扩增体系为25μL，包括5ng模板，F和R引物各5pmol，dATP，dTTP，dCTP和dGTP各5nmol，37.3nmol MgCl2，0.5单位的DNA聚合酶，1x PCR缓冲液。扩增的程序是：94℃变性3分钟；30个循环，94℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸1.2分钟；最后72℃延伸5分钟。通过PCR扩增，获得了包含开放读码框的906bp的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。该序列编码301个氨基酸，如SEQ ID NO：2所示，等电点为6.36，含有2个jacalin结构域，一个结构域为AA21-AA148，第二个结构域为AA163-AA298。
实施例3：转TaJRL1基因拟南芥的赤霉菌抗性得到提高。
以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，利用引物P2进行PCR扩增，P2引物对如下：F-5′-TAATCTAGAATGGCCGGCGCTGTGAAGATT-3′；R：5′-TAAGGATCCGTCATCCAGCGGCACGACATA-3′。将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶XbaI和BamHI进行酶切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的pBI121表达载体进行连接，获得由CaMV35S启动子启动的TaJRL1超量表达的质粒载体。构建好的载体通过电击法转化到LBA4404农杆菌菌株中，通过含有50μg/mL的卡那霉素和50μg/mL的利福平的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1998年Clough和Bent发表在Plant Journal第16期735-743页上的文章中的材料与方法，在拟南芥花期将携带有TaJRL1超量表达载体的农杆菌菌液浸泡花器官进行遗传转化，收获到的拟南芥种子种植于含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，获得TaJRL1超量表达的抗卡那霉素的转基因拟南芥。拟南芥自交繁殖后，将T3代转基因拟南芥叶片和非转基因叶片同时接种赤霉菌，3天后进行赤霉病抗性鉴定，所用赤霉菌为江苏省内感染小麦的强赤霉菌(F4，F15，F17，F34)菌株的混合物。结果表明，转基因植株对赤霉菌的抗性增强，叶片上赤霉菌菌丝生长变慢(图1)。
实施例4：转TaJRL1基因烟草对棉铃虫的抗性得到提高。
按照Khodakovskaya在2006年发表在Plant Cell Report第25期1181-1192页的文章中的实验方法，取幼嫩的烟草叶片进行消毒后，于添加2mg/L 2，4-D的MS培养基上进行诱导愈伤组织，15天后，将上述携带有TaJRL1超量表达载体的农杆菌菌液浸泡诱导获得的愈伤组织，进行遗传转化，转化后用含有100μg/mL卡那霉素的培养基进行筛选，获得抗性转基因植株。通过人工饲喂得到棉铃虫的3龄幼虫，停止喂食棉铃虫2小时后，称量棉铃虫的初始体重，分别用T2代转基因烟草和野生型非转基因烟草叶片饲喂，每个叶片饲喂6头3龄棉铃虫，36小时后再次称量棉铃虫的重量。用饲喂过程中增加的棉铃虫重量占棉铃虫初始重量的比例来表示相对生长量，实验设置了3次重复。发现转基因烟草饲喂的棉铃虫的生长明显受到抑制(表1，图2)。
表1转基因烟草和非转基因烟草饲喂棉铃虫对棉铃虫生长的影响
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实施例5：沉默TaJRL1基因降低小麦对白粉病的抗性。
以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，用引物P3进行PCR扩增，引物P3如下：F-5′-ATATTAATTAACCTTCATCAGCGGCACCTAC-3′；R-5′-CAGATAGCTAGTCATCCAGCGGCACGACAAAG-3′。扩增产物用NotI和PacI进行双酶切，酶切后的基因片段和同样经NotI和PacI双酶切的野生型BSMV ND18γ质粒连接，(BSMV ND18α、β及γ载体，引自美国堪萨斯州立大学Scofield实验室)，构建体外转录载体(图3)，通过热激法将该载体转化大肠杆菌DH5α菌株中。提取野生型BSMV ND18α、β、γ及BSMV：TaJRL的质粒DNA。用MluI单酶切BSMV ND18α、γ及BSMV：TaJRL2质粒DNA，用SpeI单酶切BSMV ND18β质粒DNA。将酶切完全的线性化质粒DNA用体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿；异戊醇进行纯化。以纯化好的线性化质粒DNA为模板，用Ambion公司的T7.mMessage Machine Kit试剂盒的实验步骤体外合成RNA。在小麦生长一周后，用体积比为0.05％的Tween20溶液将叶片洗2-3遍，除去叶片表面的蜡质，然后再用无菌水清洗2-3遍，待叶片表面晾干。配制FES溶液：0.2mol/L甘氨酸，0.6mol/L磷酸氢二钾，10g/L焦磷酸钠，10g/L膨润土(美国Fluka公司，货号#11959)和10g/L硅藻土(美国Fluka公司，货号#22141)。将分别以野生型BSMV ND18α、β及γ为模板体外转录的3种RNA与FES按1∶1∶1∶22的比例混合，将以野生型BSMV ND18α、β及BSMV：TaJRL1为模板体外转录的3种RNA与FES也按1∶1∶1∶22的比例混合。用上述两种混合液分别涂抹处于同一生长期不同植株的叶片。涂抹病毒RNA 7天后取部分接种植株的叶片提取RNA，反转录为cDNA，进行实时定量PCR检测，发现涂抹携带TaJRL1病毒的植株中TaJRL1的表达明显受到抑制(图4A)。接着，接种白粉菌生理小种Bgt19，7天后，对每株接种白粉病的材料进行抗性调查，以未进行接种的材料和只接种不携带TaJRL1的病毒作为对照，发现TaJRL1的沉默降低了小麦对白粉病的抗性(图4B)。
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