S100A16基因在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用
技术领域
本发明涉及S100A16基因在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。
背景技术
神经组织蛋白S100家族是一类广泛分布于不同组织的EF-hand型酸性可溶性钙结合蛋白，其中S即soluble，100表示该蛋白在饱和硫酸氨中的溶解度为100％，S100蛋白含2个与钙亲和力不同的EF螺旋结构，C-末端EF螺旋结构由12个氨基酸组成典型的Ca2+结合环，N-末端EF螺旋结构包含14个具有S100蛋白特异性的氨基酸。
人S100蛋白的基因在染色体1q21区，肿瘤在此区的基因常频繁重组，易引起S100基因表达失控，因此，肿瘤晚期和发生肿瘤转移时有S100异常表达，特别是神经外胚层起源的肿瘤组织中有异常表达，且与肿瘤分期和预后有相关性。S100蛋白在哺乳动物分布有特异性：S100A1主要在神经细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞和肾细胞的胞浆；S100A2在肺和肾细胞的胞浆和核中；S100A3和S100A5的分布尚不明确；S100A4在成纤维细胞，肌上皮细胞和肿瘤细胞胞浆和胞外液中；S100A12分布与海马细胞；S100A13在甲状腺细胞最丰富，特别是核周区；S100A16分布广泛，见于多种肿瘤组织。
研究显示S100蛋白可通过调节钙离子及糖基化受体RAGE参与细胞的增生、分化、迁移凋亡及认知[1]。如整个S100家族对神经轴突的生长起调节作用[2]，而S100A7，S100A 13，S100A 14等在肿瘤中差异表达，已被用做肿瘤诊断与预后的标志基因[3，4]。
S100A16基因是我们应用全基因组微阵列芯片技术，筛查代谢性疾病相关基因的研究中获得的差异表达新基因，是钙调蛋白S100家族的新成员，除了具有S100家族的基本结构特征，如：是一类较小的Ca2+、Zn2+结合蛋白，含2个与钙亲和力不同的EF螺旋结构，C-末端EF螺旋结构由12个氨基酸组成典型的Ca2+结合环，尚具有以下特异性：
1、不同于传统的S100蛋白的EF端由14个氨基酸组成，S100A16蛋白的EF端由15个氨基酸组成loop环；
2、在EF端最后位置缺少谷氨酸盐残基，这对于协调钙的位点是非常重要的；所以提示S100A16基因存在更复杂的调节机制。
S100家族在细胞的增生、分化、迁移与凋亡，神经轴突的生长与认知形成及肿瘤发生发展中均发挥着重要角色。关于其新成员S100A16基因与疾病发生发展的研究，由于研究尚浅，目前尚无明确定论。我们研究小组于2005年起即以其为靶标开展系列研究，初步阐明了其在代谢性疾病的发生发展中发挥的作用。
申请人早先的研究表明S100A16 mRNA在正常食道、脂肪及结肠组织中过表达，有研究表明S100A16也过表达在膀胱、肺、甲状腺、胰腺及卵巢肿瘤中[5]，提示其生物学功能的多样性。最新研究表明[1]，细胞内Ca2+浓度可有效调节S100A16蛋白的入核出核信号，细胞内Ca2+浓度增高，S100A16蛋白主要分布在胞浆，而随细胞内Ca2+浓度减低，S100A16蛋白的的核转运增强并在核中大量积累，并与核仁紧密相关，提示S100A16蛋白在核糖核蛋白复合体多相过程、基因沉默或细胞分裂中可能起作用。S100A16钙依赖的异位可能受最近描述[6，7]的核浆网状调节，在核附近终止，负责游离钙释放到局部固定的亚核位置。与S100家族其他成员一样，S100A16缺乏明显的入核信号肽，其入核可能与S100A11类似，需要与转运蛋白反应[6]或者像钙铜调节那样可能通过选择性的促进传播路径发生[7]。这些结果提示S100A16基因在特定的一些组织中，在钙信号通路调控或其他尚未鉴定的通路调控下，发挥着重要的生物学功能。但是S100A16在核周的作用及S100A16-Ca2+依赖的原因及功能意义，是否与脂肪细胞分化及胰岛素分泌有关需进一步阐明，目前国内外未见报道。
胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。在脂肪细胞内，胰岛素抗性导致储存的甘油三酸酯的水解，进而提高血浆内自由脂肪酸的含量。在肌肉细胞内，胰岛素抗性降低葡萄糖的吸收；而在肝细胞内，降低葡萄糖的储备，两者共同导致血糖含量的提高。胰岛素抗性引起的血浆中高胰岛素和高糖含量经常导致代谢综合征和2型糖尿病。胰岛素抵抗是基因与外环境共同作用的结果，细胞内钙离子在代谢紊乱相关的胰岛素抵抗中起重要作用[8]。近来，钙与胰岛素抵抗的关系逐渐成为一个研究热点，为寻找控制胰岛素抵抗及其相关疾病的治疗方法开拓了一片崭新的视野。研究表明，细胞内钙离子浓度在与胰岛素抵抗相关的能量代谢失衡中起着重要作用[9]。细胞内钙离子浓度的增加导致脂肪合成基因的表达和脂肪合成的增加、抑制脂肪分解，最终增加脂肪积聚而导致胰岛素抵抗。低钙饮食可导致1，25-二羟维生素D3的产生增加，刺激钙离子向细胞内流动从而促进胰岛素抵抗的发生[10，11]。在这个过程中，钙离子通道介导的钙离子细胞内流是一个重要环节。因此围绕着钙离子通道及其调控因素开展进一步的研究将具有重要的意义。
本专利申请首次证明S100A16对胰岛素抵抗具有治疗作用。
参考文献
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发明内容
技术目的
本发明的一个目的是提供S100A16基因制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。
技术方案
S100A16基因在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用，通过如下技术方案得到证实：
一、采用小鼠前脂肪细胞3T3-L1细胞模型，应用同位素标志的葡萄糖C14通过检测胰岛素刺激的葡萄糖摄取试验证实S100A16过表达对葡萄糖摄取的抑制作用。
二、采用小鼠前脂肪细胞3T3-L1细胞模型，应用Western blot方法检测S100A16对细胞内Akt磷酸化的影响，揭示S100A16影响胰岛素作用的机制。
三、在动物水平采用饮食诱导的肥胖鼠及转基因证实S100A16在肥胖胰岛素抵抗中的作用。
总而言之S100A16基因表达与胰岛素抵抗有直接关联，即S100A16过表达加剧胰岛素抵抗，S100A16低表达减弱胰岛素抵抗，从而为开发抗胰岛素抵抗药物提供一种选择的靶点。
其中S100A16基因的核苷酸序列为Seq NO.1
前脂肪细胞3T3-L1细胞模型为经典的检测胰岛素抵抗的模型。
有益效果
1、大量的研究表明，肥胖尤其是内脏型肥胖是产生胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)的重要因素。胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。在脂肪细胞内，胰岛素抵抗导致储存的甘油三酸酯的水解，进而提高血浆内自由脂肪酸的含量。在肌肉细胞内，胰岛素抵抗降低葡萄糖的吸收；而在肝细胞内，降低葡萄糖的储备，两者共同导致血糖含量的提高。胰岛素抵抗引起的血浆中高胰岛素和高糖含量经常导致代谢综合征和2型糖尿病。我们的实验结果提示S100A16在高脂饮食喂养的肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪组织中过表达，提示与肥胖及胰岛素抵抗有关。
2、胰岛素抵抗是基因与外环境共同作用的结果，细胞内钙离子在代谢紊乱相关的胰岛素抵抗中起重要作用。近来，钙与胰岛素抵抗的关系逐渐成为一个研究热点，为寻找控制胰岛素抵抗及其相关疾病的治疗方法开拓了一片崭新的视野。研究表明，细胞内钙离子浓度在与胰岛素抵抗相关的能量代谢失衡中起着重要作用。细胞内钙离子浓度的增加导致脂肪合成基因的表达和脂肪合成的增加、抑制脂肪分解，最终增加脂肪积聚而导致胰岛素抵抗。我们的研究结果发现高钙可促进S100A16基因表达的蛋白向细胞浆的输出，低钙可促进S100A16基因表达的蛋白向细胞核的转入。提示S100A16可能通过钙离子通道介导的钙离子细胞内流与胰岛素抵抗有关。
3、磷酸化途径在胰岛素抵抗中起重要的作用，胰岛素受体具有内在的酪氨酸蛋白激酶活性，通过使其自身及胰岛素受体底物-1(IRS-1)磷酸化而介导细胞对胰岛素的反应，磷酸化了的IRS-1相当于第二信使，它与富含SH2的蛋白质磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3k)结合，使之激活，促进葡萄糖转运体-4(GLUT-4)的合成及由细胞内池迁移至细胞膜，启动细胞对葡萄糖的摄取。我们的研究结果发现在脂肪细胞分化过程中S100A16过表达对于磷酸化途径，可抑制3T3-L1细胞分化后期Akt的磷酸化作用，从而抑制3T3-L1细胞分化后期胰岛素刺激的葡萄糖摄取。因此，S100A16通过抑制磷酸化作用在胰岛素抵抗中发挥生物学功能，即通过抑制S100A16过表达或S100A16表达下调，来实现胰岛素抵抗治疗作用，因此我们可以根据S100A16基因序列，相应开发与S100A16相作用的药物，或是作为筛选治疗胰岛素抵抗药物的靶点，具有非常重要应用意义和商业前景。
本研究结果首次揭示了S100A16与胰岛素抵抗有直接关联，作为新的药物靶点，S100A16基因在制备治疗胰岛素抵抗相关药物的应用中，包括通过S100A16基因上下游靶点制备胰岛素抵抗相关药物中申请专利保护。
附图说明
图1A显示3T3-L1细胞转染S100A16高表达质粒后提取蛋白，采用Western blot 分析验证S100A16高表达质粒转染效果。.Lane 1：正常3T3-L1细胞；lane 2：空载体pcDNA3.1质粒；lane 3：pcDNA3.1-S100A16-3T3-L1；对图A蛋白表达进行定量分析获得S100A16表达的灰度分析图B(数据来源于三组独立试验)。结果以均数+标准差表示。**P＜0.01或*P＜0.05与对照3T3-L1比较；
图2显示S100A16对3T3-L1细胞分化后期胰岛素刺激的葡萄糖摄取及对3T3-L1细胞分化过程中磷酸化作用；
其中图2A显示3T3-L1、pcDNA3.1空载体及pcDNA3.1-S100A16-3T3-L1细胞(S100A16过表达细胞)诱导分化后，检测分化不同天数胰岛素刺激的葡萄糖摄取情况，以正常3T3-L1细胞的检测值作为基数，其他检测值与之比较以相对比值表示，结果提示S100A16过表达可明显抑制3T3-L1细胞分化后期葡萄糖的摄取，结果以均数±标准差表示，n＝3.*P＜0.05，**P＜0.01与正常3T3-L1比较；
图2B显示S100A16过表达质粒转染3T3-L1细胞，诱导分化后10天采用不同浓度胰岛素(0、5、10、20、50nM)刺激十分钟后收集蛋白，用Western blot方法检测p-Akt表达，结果提示S100A16过表达可抑制3T3-L1细胞分化后期Akt的磷酸化作用；
图3显示3T3-L1细胞中Ca2+-依赖的核输出及核转入，3T3-L1细胞分别采用1.5mM Ca2+及1μM ionomycin刺激0，5，10，15分钟，或者应用钙耦合剂3mM EGTA刺激0，10，20，30分钟，检测细胞总蛋白及核蛋白中S100A16表达，结果提示高钙可促进S100A16蛋白向细胞浆的输出，低钙可促进S100A16蛋白向细胞核的转入。
图4显示S100A16在正常及饮食诱导的肥胖及ob/ob鼠脂肪组织中的表达，从16周大小的C57BL/6J野生鼠及12周大小的高脂饮食喂养的肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪组织提取蛋白，采用Western blot方法分析S100A16在上述三种组织的表达，结果提示S100A16在高脂饮食喂养的肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪组织中过表达。α-tubulin作为对照。
具体实施方式
实施例1
本实施例中参考实验指南第三册(第15章在大肠杆菌中表达克隆化基因；第16章哺乳动物培养细胞中导入克隆化基因；附录1分子克隆中使用的缓冲液和试剂的配制；附录8分子克隆中的常用技术)，现代实用细胞与分子生物学实验技术(第一章细胞培养方法；第八章细胞形态与细胞化学定量分析技术)。
前脂肪细胞3T3-L1购自上海细胞生物研究所，14C标记葡萄糖[3H]2-deoxy-D-glucose购自北京科美东雅生物技术有限公司，
一、在细胞水平采用小鼠前脂肪细胞3T3-L1证实S100A16在肥胖胰岛素抵抗中的作用。
①构建S100A16过表达质粒转染3T3-L1细胞，进行三联刺激诱导分化，通过胰岛素刺激的葡萄糖摄取试验及磷酸化检测观察S100A16对3T3-L1细胞分化过程中Akt的磷酸化作用，揭示S100A16在胰岛素抵抗中的作用。
②采用高钙及低钙刺激的3T3-L1细胞模型，探讨钙浓度变化对S100A16基因的核转入影响。
具体方法如如下
1、经典的3T3-L1细胞诱导分化模型的建立：
3T3-L1细胞培养在DMEM培养液中(10％胎牛血清)，5％CO2、37℃培养箱。当细胞生长至完全融合后48h后，加入0.5mM3-isobutyl-1-methyxan-thine(MIX)，1ug/ml胰岛素及1uM地塞米松(Sigma，USA)诱导分化。48h后换用仅含1ug/ml胰岛素的完全培养基，以后每两天换液直到第八天细胞完全分化成熟。
2、S100A16过表达质粒的构建及细胞转染
根据《分子生物克隆实验指南》，第16章哺乳动物培养细胞中导入克隆化基因方案1脂染介导的DNA转染方法，
以小鼠肝脏cDNA为模版；以引物S100a16-F，其序列为Seq NO.2；S100A16-R，其序列为Seq NO.3；扩增S100A16开放阅读框；PCR条件：100ul体系，56°退火，72°延伸30s，33个循环，获取目的片段；采用PCR纯化试剂盒(TakaRa DNA Fragment Purification Kit)纯化目的片段；采用NheI和EcoRI进行酶切，对酶切后产物进行切胶纯化；将纯化产物连接至载体pcDNA3.1上；取5UL连接产物转化感受态细胞，转化后将菌液涂至Amp板，放37度孵箱培养16小时，在超净台内挑单克隆加4ml LB+40ul Amp放摇床16小时，取1ul菌液当模版作PCR；阳性克隆的菌液3ml小抽质粒并送测序。测序比对完全正确后，中抽质粒转染3T3-L1细胞挑选克隆细胞株培养待用。通过western blot方法验 证 转 染 成 功 ( 附 图 1 ) 。转 染 S100A16 的 3T3-L1 细 胞(pcDNA3.1-S100A16-3T3-L1)按照上述1的方法培养诱导分化。
3、采用胰岛素刺激的葡萄糖吸收实验观察S100A16对细胞葡萄糖摄取的影响：
即用[3H]2-deoxy-D-glucose的方法检测不同分化阶段脂肪细胞处理葡萄糖的能力。
3T3-L1细胞(正常及S100A16过表达质粒转染后3T3-L1细胞)和pcDNA3.1空载体(阳性对照)，按照步骤1的方法诱导分化，在诱导分化后不同天数(0，2，4，6，8，10days)，用KRP液(NaCl 128mM，KCl 4.7mM，CaCl2 1.65mM，MgSO42.5mM，Na2HPO4 5mM，pH 7.4)洗涤两次，与100nM procine insulin胰岛素共孵10分钟，然后加入含有0.2％BSA，1μCi/ml[3H]2-deoxy-D-glucose及5mM glucose的KRP再孵10分钟，37℃；然后样本用冷的KRP液洗涤三次，用含有0.5M NaOH及0.1％SDS溶解，用闪烁计数仪确定细胞的放射性吸收情况。
结果提示S100A16过表达可明显抑制3T3-L1细胞分化后期葡萄糖的摄取；如附图中(2A)3T3-L1、pcDNA3.1空载体及pcDNA3.1-S100A16-3T3-L1细胞诱导分化后，检测分化不同天数胰岛素刺激的葡萄糖摄取情况，以正常3T3-L1细胞的检测值作为基数，其他检测值与之比较以相对比值表示。结果以均数±标准差表示。n＝3.*P＜0.05，**P＜0.01与正常3T3-L1比较。
4、采用Western blot方法检测S100A16对细胞内Akt磷酸化的影响：
3T3-L1，pcDNA3.1空载体及pcDNA3.1-S100A16过表达细胞分别种6孔板，三联刺激诱导分化，到第十天培养液换为无血清无胰岛素的普通培养液(含0.1％的BSA)培养2小时后用不同浓度胰岛素(0，5，10，20，50nM)刺激十分钟，收集蛋白，用Western blot方法检测p-Akt，total-Akt作为对照。IP3K/Akt信号通路是胰岛素作用的主要信号通路，Akt(丝氨酸/苏氨酸激酶)接受IP3K(磷酯酰肌醇3激酶)调节，IP3K激活Akt后，可通过以下三种途径发挥生物学作用。(1)对细胞内葡萄糖运载体Glut4的异位作用，使其发挥转运葡萄糖的作用；(2)通过糖原合成酶激酶3(GSK 3)促进糖原合成；(3)在脂肪细胞，胰岛素通过IP3K和Akt依赖的信号途径抑制脂肪分解。而Akt磷酸化是启动上述信号通路的主要步骤，Akt磷酸化活性下降则抑制IP3K/Akt信号通路，从而影响葡萄糖的吸收。研究表明，在胰岛素抵抗状态，胰岛素刺激引起的IP3K/Akt信号传导途径的作用下降，我们通过检测S100A16过表达对激活IP3K/Akt信号通路的影响，探讨S100A16在胰岛素抵抗中的作用。
结果提示S100A16过表达可抑制3T3-L1细胞分化后期Akt的磷酸化作用。如附图2B所示S100A16过表达质粒转染3T3-L1细胞，诱导分化后10天采用不同浓度胰岛素(0，5，10，20，50nM)刺激十分钟后收集蛋白，用Western blot 方法检测p-Akt表达。
5、采用Western blot方法检测细胞内钙水平变化对S100A16的影响
3T3-L1细胞分别采用1.5mM Ca2+及钙离子载体1μM ionomycin刺激0，5，10，15分钟促进胞内钙的浓度的升高；或者应用钙耦合剂3mM EGTA刺激3T3-L1细胞0，10，20，30分钟，检测细胞总蛋白及核蛋白中S100A16表达，如附图3所示，结果提示高钙可促进S100A16蛋白向细胞浆的输出，低钙可促进S100A16蛋白向细胞核的转入。
二、在动物水平采用饮食诱导的肥胖鼠及转基因证实S100A16在肥胖胰岛素抵抗中的作用。
饮食诱导肥胖鼠模型的建立：雄性SD大鼠30只(购自江苏省实验动物中心)，分笼饲养，1只/笼，体重90 120克。饲以基础饲料、自由摄水进食物，环境温度21℃-23℃，大鼠适应环境一周后，称量体重，分为两组，一组继续喂养基础饲料，另外一组(diet-induced obesity；DIO)改喂高脂饲料(实验动物饲料购置南京协同动物饲料公司)。饲料配方：基础饲料营养成分配比，碳水化合物65％，脂肪20％，蛋白质15％；高脂饲料营养配比，碳水化合物20％，脂肪60％，蛋白质20％)，每天记录体重、体长及尾长，两周后高脂组的体重明显增加，继续喂养六周。处死前禁食12小时，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，称体重，打开心脏取血5-10毫升，分离血清，-70℃冻存备用，同时称内脏脂肪重量，取内脂、皮脂、骨骼肌、脑等组织-70℃冻存备用。ob/ob鼠模型：购自南京大学模式动物中心，常规饲养，处死后取脂肪组织提取蛋白检测S100A16基因的表达。
分离高脂饲料喂养的小鼠及正常对照鼠的脂肪组织，检测S100A16在上述组织中的表达，并购买leptin受体缺陷的自发性肥胖模型鼠ob/ob，检测S100A16基因在ob/ob鼠脂肪组织中的表达。
结果提示S100A16在高脂饮食喂养的肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪组织中过表达，证明S100A16与肥胖和胰岛素抵抗有关。如附图4从16周大小的C57BL/6J野生鼠及12周大小的高脂饮食喂养的肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪组织提取蛋白，采用Western blot方法分析S100A16在上述三种组织的表达。α-tubulin作为对照。上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。
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