蜈蚣有效部位及其应用.pdf

发明内容

本发明公开了一种蜈蚣有效部位及其应用。鉴于动物类蛋白质、粘多糖等大分子物质只有到达胃肠道后受消化酶、酸、碱等作用，方可被酶解或水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物质，吸收入血而发挥药效，故本实验模拟胃和小肠的环境及消化过程，用胃蛋白酶和胰蛋白酶仿生提取蜈蚣，使药材中的大分子蛋白水解为小分子肽类以利于人体吸收。APTT法、纤维蛋白原平板法为较常用的体外抗凝，溶纤试验方法，本实验以其为考察指标，证明酶解工艺的可行性。具体为以水解度为指标，单因素考察了仿生酶解法提取蜈蚣的工艺条件；以APTT法、纤维蛋白原平板法为考察指标，对仿生酶解法提取蜈蚣的工艺进行验证。结果证实，仿生酶解法凝血时间长，抗血栓效果明显。

具体方法和结果通过以下实验证实：

1材料

1.1药材蜈蚣(由河北以岭医药研究院有限公司提供)

1.2试剂牛血清白蛋白(Sigma A7906，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)；牛纤维蛋白原(Sigma F8630，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)；胰蛋白酶1∶250(Amresco0458，购自北京华美转导科技有限公司)；胃蛋白酶1∶10000(Sigma P7000，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)；医用注射性尿激酶(购自北京市望京医院)；凝血酶(Sigma T4648，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)；APTT试剂10*1.5ml(购自上海太阳生物试剂公司)；Protein Assay Dye Rgnt(Bio-red 5000006，北京泽平科技有限责任公司)；三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙醇(分析纯)；屈臣氏纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

生理盐水(称取氯化钠9g，加蒸馏水定容至1000ml，摇匀，即得)；人工胃液(取盐酸9ml，加蒸馏水稀释成1000ml，即得)；人工肠液(取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得)。

1.3仪器UV-2000型分光光度计；800B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；ES-120型电子分析天平(长沙湘平科技发展有限公司)；恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂)；DZ-1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.4动物健康日本大耳白兔(雄性)，体重约2Kg(均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，符合国家健康一级动物标准。

2方法与结果

2.1以水解度为指标，考察仿生酶解工艺

工艺步骤如下：将1g蜈蚣细粉置于50ml具塞圆底烧瓶中，加入20ml人工胃液，密闭，于37℃水浴恒温作用30min，分别加入一定量胃蛋白酶酶解一定时间，将酶解液置85℃恒温水浴作用15min，流水冷却至室温后，以4200r/min离心15min，取上清液，即得，残渣60℃真空干燥称重，得干燥残渣。

称定胃蛋白酶解后的残渣1.0g，置50ml具塞圆底烧瓶中，加入20ml人工肠液，密闭于37℃水浴恒温作用30min，分别加入一定量胰蛋白酶酶解一定时间，将酶解液置85℃恒温水浴作用15min，流水冷却至室温后，以4200r/min离心15min，取上清液，即得。

以水解度为指标，进一步确定酶底比和酶解时间。

2.1.1水解度测定方法

2.1.1.1标准曲线的制备

染色液的配制：准确量取Bio-Rad Protein Assay 50ml，加入蒸馏水稀释定容至250ml，滤去不溶性物质即得，置室温下可保存6个月。

牛血清白蛋白(BSA)1mg/ml的配制：准确称取10mg BSA，蒸馏水定容于10ml，其浓度为1mg/ml(1000mg/L)，置冰箱保存。

精密吸取BSA溶液0.02、0.06、0.08、0.1ml分别置于10ml试管中，依次用蒸馏水补至0.1ml，加入5ml考马斯亮蓝染色液，漩涡混合器震荡混匀。以蒸馏水为空白对照，于595nm处测定吸光度。以牛血清白蛋白浓度(mg/ml)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程：y＝0.9947x+0.0238(r＝0.9986)：结果表明，BSA在0～1mg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。见表1。

表1测定蛋白质浓度的标准曲线的制备

2.1.1.2水解度测定法

水解度计算公式：DH=N2-N1N0-N1×100%]]>

式中：N2为药材酶解液加入20％TCA后测得的可溶性蛋白量(g/L)，即样品2及样品4；N1为药材酶解前加入20％TCA测得的可溶性蛋白量(g/L)-1g药材细粉加入10ml20％TCA，过滤，所得上清液；N0为不同酶解工艺提取总蛋白量(g/L)，即样品1或样品3。

胃蛋白酶酶解工艺筛选

2.1.2.1酶底比考察结果见表2

表2胃蛋白酶酶解酶底比考察结果

结论：随着酶底比增大，吸光度基本呈上升趋势；4％、5％、％酶底比的吸光度较高但差别不大，从节约成本考虑，确定酶底比为4％。

2.1.2.2酶解时间考察结果见表3

表3胃蛋白酶酶解的酶解时间考察结果

结论

随着酶水解时间的延长，吸光度呈上升趋势；但考虑到酶解时间过长会影响到下一步的操作，及会发生变质等问题，故酶解时间确定为4h。

2.1.3胰蛋白酶酶解工艺筛选

2.1.3.1蜈蚣胰蛋白酶酶底比考察结果见表4

表4胰蛋白酶酶解的酶底比考察结果

结论：随着酶底比增大，吸光度呈上升趋势；酶底比在5.0％、6.0％、7.0％时吸光度增加趋势平缓。为节约成本选择酶底比为5.0％较为合适。

2.1.3.2酶解时间考察结果见表5

表5胰蛋白酶酶解的酶解时间考察

结论

随着酶水解时间的延长，吸光度呈上升趋势；但考虑到酶解时间过长会影响到下一步的操作，及会发生变质等问题，故酶解时间确定为4h。

综上，以水解度为指标，通过单因素考察，蜈蚣的仿生酶解工艺为：蜈蚣药材细粉加入人工胃液(固液比1∶20)，密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入4.0％胃蛋白酶水解4h，将酶解液置于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胃蛋白酶酶解物；沉淀干燥，继加入20倍量人工肠液，密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入5％胰蛋白酶水解4h，将酶解液于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胰蛋白酶酶解物。

2.2复合酶解法

按照上述仿生酶解法的条件，对蜈蚣进行复合酶解作为仿生酶解法的对照。

称取2g蜈蚣药材细粉于50ml圆底烧瓶，加入40ml人工胃液，密闭于37℃水浴锅30min后加入60mg胃蛋白酶水解，3h后用1mol/mlNaOH溶液调节酶解液的pH＝6.8，加入100mg胰蛋白酶酶解4h，于85℃水浴灭酶15min，4200r/min离心15min，取上清液，60℃真空干燥称重，得干燥复合酶解物。

3药效实验

3.1样品制备

称取以上各种提取方法所得干燥物适量，加入生理盐水制成每320μl生理盐水含有0.25g原药材的样品。

3.2APTT法

3.2.1血浆的制备

取大耳白兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉后，颈动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝(1∶9)，混匀后以3000r/min，离心15min，取上清液，分离出贫血小板血浆(PPP)。

3.2.1APTT时间的测定

取PPP100μl于测试槽中，加样品液10μl(预温5min)和APTT试剂100μl(预温10min)，孵育5min后加入CaCl2100μl(预温15min)，同时计时，用针尖拨动溶液，当有丝状凝结物被针挑起时，记录时间。以生理盐水为阴性对照(每个样品平行测定6份)，结果见表：

表6蜈蚣酶解法APTT抗凝药效考察(n＝6)

注：与生理盐水组相比P＜0.05。

结论：各样品都能显著延长APTT时间，其中仿生酶解组比复合酶解组抗凝下效果更显著，证明仿生酶解方案可行。

3.3纤维蛋白原平板法

3.3.1试液的配制

磷酸缓冲液(PBS)：称取3.12g磷酸二氢钠，加蒸馏水定容到100ml，即得A液；称取磷酸氢二钠7.1632g，加蒸馏水定容到100ml，即得B液；使用时，取A液760μl、B液3240μl加入76ml生理盐水，即得磷酸缓冲液。

纤维蛋白原溶液：称取纤维蛋白原0.3g加入60mlPBS，振摇，溶解，即得。

3.3.2纤维蛋白平板的制备

在平皿内加入9ml 5g·L-1的纤维蛋白原溶液，再加入2×103μ·L-1的凝血酶溶液1ml，立即打旋混匀大约10s，即形成1mm厚的纤维蛋白凝块，在平皿上盖加滤纸，水平处放置，凝固后形成纤维蛋白平板。

3.3.3测定步骤：将样品液、尿激酶(6×105μ·L-1)和生理盐水各10μl分别点在纤维蛋白平板上，各点间距大于1.5cm。置纤维蛋白平板于湿盒内，放入37℃烘箱中，4h后观察有无溶解圈，并测量溶解圈的直径，计算溶解圈面积，以溶解圈面积大小衡量纤溶活性的大小。结果见表7。

表7纤维蛋白平板溶栓实验结果

结果表明仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分有明显溶解圈，其中胃酶酶解部分溶解圈最大，各个样品在热板上均无溶解圈，证明仿生酶解的工艺方案可行。