发明详述
一般性说明。应意识到的是本发明的某些方面、方式、实施方式、变化和特征以各种具体水平在下文描述，目的是提供对本发明的实质理解。
已投入深入的努力以发展Toll样受体(TLR)激动剂作为佐剂以改进疫苗效力，原因在于抗原呈递细胞(APCs)例如树突细胞(DCs)利用TLRs感知病原体的保守结构部分用于促炎基因级联反应以及先天和适应性免疫应答的活化。本文提供的是刺激高程度免疫效力的疫苗组合物和佐剂。
本发明提供疫苗和疗法，其中免疫细胞的免疫效力通过包括负免疫调节物的抑制剂和促炎分子的组合物得到增强。如实施例所示的结果表明：这些佐剂能够以协同方式增强免疫应答。因此，本发明通过增强细胞针对具体抗原的免疫刺激能力提供治疗益处。细胞因子受体和TLR信号传导的负调节物，例如细胞因子信号传导阻抑蛋白(SOCS)1和A20负调节DCs的成熟、炎性细胞因子产生和免疫刺激效力，其发挥关键的抗原呈递弱化子的作用。因此，描述了新型疫苗佐剂，其包括负免疫调节物的抑制剂和鞭毛蛋白多肽。
一方面，免疫细胞用本发明组合物(佐剂)转染。在一个实施方式中，免疫细胞是树突细胞(DCs)。尽管不期望被理论限制，DCs是最有效的专职抗原呈递细胞(APC)并具有引发针对病原体和肿瘤相关抗原(TAA)的适应性免疫应答的独特能力。DC疫苗已在小鼠肿瘤模型和临床试验中测试。但是，DC接种很少引起肿瘤退化(目标临床反应)或自身免疫病理，其表明宿主水平的自身耐受仍然维持在被免疫患者中。同样地，与慢性感染相关的病原体，例如丙型肝炎病毒(HCV)，用由接种或本身含有TLR配体的病原体自然感染诱导的免疫应答是难治的。对于DC疫苗一般的无效性存在许多可能的解释，包括低效抗原负载和DC成熟、DC群体的异质性质、肿瘤介导的免疫阻抑、自体反应的自身耐受、T细胞对TAAs的低亲和力以及调控T细胞的阻抑。
本发明的疫苗佐剂具有克服一些与DC疫苗相关的问题的优势。该佐剂可包括负免疫调节物的抑制剂。在一个实施方式中，负免疫调节物是细胞因子信号传导阻抑蛋白1(SOCS1)。SOCS1是在维持自身耐受和限制抗肿瘤免疫性中的抗原呈递弱化子(APA)(参见美国专利申请公开号2006/0292119和2006/0269519，其通过引用并入本文)。SOCS1SOCS家族的一个成员——是由不同促炎细胞因子进行信号传导的重要负调节物，所述促炎细胞因子包括T细胞和APCs中的IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15等等。(Kubo等人，NatImmunol，4：1169-1176，2003；Alexander等人，Annu Rev Immunol，22：503-529，2004.)。SOCS1在促炎刺激后以反馈方式可诱导地表达并作为假底物阻止JAK和STAT结合以及作为E3连接酶促进JAK遍在蛋白化用于它的降解(Yoshimura等人，Nat Rev Immunol，7：454-465，2007)。另外，SOCS1通过促进Mal多聚遍在蛋白化和随后的降解来负调节TLR信号传导(Mansell等人，NatImmunol，7：148-155，2006)。
尽管SOCS1的抑制有助于破坏自身耐受，但是单独的SOCS1抑制剂不足以激活DCs。本发明人已发现促炎刺激物例如鞭毛蛋白多肽是起始促炎信号传导级联反应所额外需要的。鞭毛蛋白是TLR5的配体并经由它与TLR5的相互作用诱导人DCs的成熟和趋化因子产生。因此，一方面，本发明提供具有编码负免疫调节物的抑制剂和鞭毛蛋白多肽的多核苷酸的疫苗佐剂。
在一个实施方式中，佐剂组合物包括一个或更多个编码SOCS1的抑制剂(例如SOCS1的siRNA)的多核苷酸和编码鞭毛蛋白多肽的多核苷酸。编码SOCS1抑制剂和鞭毛蛋白多肽的多核苷酸构建体分别显示于表1和表3。
在一些实施方式中，组合物进一步包括抗原。在选择的实施方式中，疫苗组合物包括一个或更多个编码SOCS1的抑制剂(例如SOCS1的siRNA)的多核苷酸，编码显性失活(DN)存活蛋白突变体多肽和MUC1片段的多核苷酸以及编码鞭毛蛋白多肽的多核苷酸。编码SOCS1抑制剂、DN存活蛋白突变体和MUC1片段以及鞭毛蛋白多肽的多核苷酸构建体分别显示于表1-3。在一些实施方式中，DN存活蛋白突变体和MUC1片段分开表达或一起表达。在一个实施方式中，编码DN存活蛋白突变体的核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸1至387。在一个实施方式中，编码MUC1片段的核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸394至573。在一个具体实施方式中，DN存活蛋白突变体和MUC1片段作为融合蛋白表达，例如由根据SEQID NO：2的序列表达。
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在一个示例性实施方式中，本发明提供疫苗组合物，其中SOCS1siRNA、DN存活蛋白/MUC1融合蛋白和鞭毛蛋白多肽提供在单个构建体中。该构建体的序列显示于表4。在选择的实施方式中，该构建体可插入腺病毒载体(如图1所示)。
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在实践本发明中，使用分子生物学、蛋白质化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。这些技术是熟知的并分别解释在例如Current Protocols in Molecular Biology，Vols.I-III，Ausubel，Ed.(1997)；Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Ed.(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)；DNA Cloning：APractical Approach，Vols.I and II，Glover，Ed.(1985)；Oligonucleotide Synthesis，Gait，Ed.(1984)；NucleicAcid Hybridization，Hames&Higgins，Eds.(1985)；Transcription and Translation，Hames&Higgins，Eds.(1984)；Animal Cell Culture，Freshney，Ed.(1986)；ImmobilizedCells and Enzymes(IRL Press，1986)；Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning；the series，Meth.Enzymol.，(Academic Press，Inc.，1984)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells，Miller&Calos，Eds.(Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1987)；以及Meth.Enzymol.，Vols.154and 155，Wu&Grossman，and Wu，Eds中。
用于本说明书的某些术语的定义提供如下。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语一般具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意思。如本说明书和所附权利要求所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非内容另外明确指出。举例来说，指代“一个细胞”(“a cell”)包括两个或更多细胞的组合等等。一般地，本文所用的命名法和如下所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学以及杂交中的实验室方法是本领域熟知并通常使用的。本文引用的所有参考通过引用全部并入本文并且用于所用目的，如同每个单独的公开、专利或专利申请被具体地并单独地用于所有目的全部通过引用并入本文一样。
如本文所用，疫苗、药剂或药物“施用”至对象或细胞包括将化合物引入或递送至对象以发挥它的意图功能的任何途径。施用可通过任何合适的途径进行，其包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠或外部。施用包括自我施用和由他人施用。还应意识到的是，医学状况的不同方式的治疗或预防意图意味着“基本”，其包括全部但也包括小于全部的治疗或预防，并且其中获得一些生物或医学相关效果。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其能够特异性地结合到抗原的特定表位上。抗体可以是衍生自天然来源或者重组来源的完整免疫球蛋白并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以以多种形式存在，包括，例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化的抗体。
如本文所用，术语“抗原”或者“Ag”被定义为激发免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或者特定的免疫活性细胞的激活或者两者。本领域普通技术人员会理解，包含几乎所有蛋白或者肽在内的任何大分子都能够充当抗原。而且，抗原可以来自重组DNA或者基因组DNA。本领域普通技术人员应理解，包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或者部分核苷酸序列的任何DNA因此编码“抗原”。而且本领域的普通技术人员应理解，抗原不需要由基因的全长核苷酸序列单独编码。显而易见的是，本发明包括但不限于，利用一个以上基因的部分核苷酸序列和以不同的结合排列这些核苷酸序列，以产生引发期望的免疫应答的多肽。举例来说，在一个实施方式中，编码对应DN存活蛋白突变体和MUC1片段的抗原的多核苷酸被组合以同时引发针对两种抗原的免疫应答。而且，本领域普通技术人员应理解，抗原根本不需要通过“基因”编码。容易显而易见的是，抗原可以被合成或者可以来自生物样品。
“抗原呈递细胞”(APC)是能够激活T细胞的细胞，包括但不限于单核细胞/巨噬细胞、B细胞和树突细胞(DCs)。
术语“树突细胞(dendritic)”或者“DC”指在淋巴或者非淋巴组织中发现的形态相似细胞类型的各种群体的任何成员。这些细胞的特征是它们独特的形态、高水平的表面MHC-II类表达。DCs可以从许多组织来源分离。DCs具有敏化MHC限制性T细胞的强大能力，并且很有效地将抗原原位呈递到T细胞。抗原可以是在T细胞发育和耐受过程中表达的自体抗原和在正常免疫过程中存在的外源抗原。
如本文所用，“激活的DC”是已经用抗原脉冲的和能够激活免疫细胞的DC。
如本文所用，术语“成熟DC”被定义为表达高水平的MHC II类CD80(B7.1)和CD86(B7.2)分子的树突细胞。反之，不成熟的树突细胞表达低水平的MHC II类CD80(B7.1)和CD86(B7.2)分子，但具有获取抗原的强大能力。
“抗原负载的APC”或者“抗原脉冲的APC”包括已经暴露于抗原并被抗原激活的APC。例如，APC可体外变为Ag负载的，如在存在抗原的培养过程中。APC也可以通过暴露于抗原在体内被负载。
“抗原负载的APC”以下列两种方式中的一种进行常规制备：(1)被称为抗原肽的小肽片段，被直接“脉冲(pulsed)”到APCs的外部；或者(2)将APCs与全蛋白或者蛋白颗粒温育，这些蛋白接着被APC摄取。在另一个实施方式中，可用抗原或编码抗原的多核苷酸转染APC。这些蛋白被APC消化为小的肽段，并且最后被运输和呈递到APC表面。另外，也可以通过将编码抗原的多核苷酸导入细胞中来产生抗原负载的APC。
如本文所用，术语“沉默的(silenced)APC”或者“沉默的DC”分别指这样的APC或者DC，其已被暴露于负免疫调节物的抑制剂(另外被已知为抑制负免疫调节物)，由此负免疫调节物与调节免疫应答相关联。当与未曾用负免疫调节物的抑制剂处理的其它方面相同的APC比较时，沉默的APC具有增强的免疫效能。
“反义”具体指编码多肽的双链DNA分子非编码链的核酸序列，或者与该非编码链基本同源的序列。如本文定义，反义序列与编码多肽的双链DNA分子序列互补。反义序列不必只与DNA分子编码链的编码部分互补。反义序列可以与编码多肽的DNA分子编码链上规定的调节序列互补，该调节序列调控编码序列的表达。
如本文所用，术语“自体的(autologous)”意思是指任何物质，其来自与这些物质后来要被再导入的个体相同的个体。
如本文所用，术语“癌症”被定义为其特征为异常细胞的快速和失控生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或者通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部分。各种癌症的实例包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等.
“细胞因子信号传导调节物”或者“细胞因子信号传导的调节物”或者“细胞因子信号转导调节物”指能够负调控细胞中细胞因子信号转导通路的蛋白质。细胞因子信号转导调节物包括但不限于：细胞因子信号转导的阻抑物(SOCS1-SOCS7，细胞因子诱导的含SH2结构域蛋白(CIS))、含SH2磷酸酶(SHP)和活化STAS的蛋白抑制剂(PIAS)。
“编码”指多核苷酸如基因、cDNA或者mRNA中的特定核苷酸序列充当合成生物过程中其它多聚体和大分子的模板的固有性质，这些多聚体和大分子具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或者限定的氨基酸序列和由此获得的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞和其它生物系统中产生了蛋白，那么该基因就编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或者cDNA转录的模板的非编码链都可以指代为编码该基因或者cDNA的蛋白质或者其它产物。
如本文所用，“内源的(endogenous)”指来自或者产生于生物体、细胞、组织或者系统内部的任何物质。
如本文所用，术语“外源的(exogenous)”指从生物体、细胞、组织或者系统外部导入或者产生的任何物质。
如本文所用，术语“表位(epitope)”被定义为能够引发包括B细胞和/或T细胞应答在内的免疫应答的抗原上的小化学分子。抗原可以具有一个或者更多个表位。大多数抗原具有许多表位，即它们是多价的。一般地，表位大小大约为5个氨基酸和/或糖。本领域普通技术人员理解，一般地，分子的全部三维结构——而非具体的线性序列——是抗原特异性的主要标准，并因此将一个表位同另一个区别开来。
如本文所用，术语“表达(expression)”被定义为通过其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或者翻译。
如本文所用，术语“表达载体(expression vector)”指含有编码能够被转录的基因产物的至少部分的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子接着被翻译成蛋白质、多肽或者肽。在其它情况下，例如在产生反义分子、siRNA、核酶和类似情况中，这些序列不翻译。表达载体可以含有多种控制序列，控制序列指在特定宿主生物体中，可操作地连接的编码序列的转录和可能的翻译所需要的核酸序列。除了调控转录和翻译的控制序列外，表达载体也可以含有发挥其它功能的核酸序列。
如本文所用，“融合蛋白”意思是非自然发生的蛋白产物，其中融合蛋白的结构域衍生自一个或更多个其它蛋白或人工衍生的序列。举例来说，每个结构域可衍生自不同的自然发生蛋白序列，或其突变体/变体，其具有所期望的性质。在本发明的一个实施方式中，两个或更多个抗原多肽由单个多核苷酸编码以产生能够引发对多个抗原的免疫应答的融合蛋白。
如本文所用，术语“辅助性T细胞(helper T cell)”被定义为其主要功能为促进其它B和T淋巴细胞和或者巨噬细胞活化和发挥功能的效应T细胞。大多数辅助性T细胞是CD4T细胞。
如本文所用，术语“异源的(heterologous)”被定义为来自不同种的DNA或者RNA序列或者蛋白质。
如本文所用，“同源的(homologous)”指两个聚合物分子之间的亚单位序列相似性，如两个核酸分子或者两个多肽分子之间。当两个分子的亚单位位置都被相同的单体亚单位占据时。两个序列之间的同源性是匹配的或者同源的位置的数目的直接函数，例如，如果在两个复合序列中半数(如，长度为10个亚单位的聚合物中的5个位置)的位置是同源的，那么这两个序列是50％同源的，如果90％的位置--例如10个中有9个——是匹配的或者同源的，则这两个序列共享90％的同源性。可进行用于比较的序列比对，例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J. Mol.Biol 48：443，1970的同源性比对算法，通过Lipman，PNAS USA 85：2444，1988的搜索相似性方法，通过算法GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA的计算机执行，或通过手动比对和视觉观察。用于确定同源性或同一性的其它算法包括，举例来说，还有BLAST程序(BasicLocal Alignment Search Tool at the National Center for Biotechnology Information)。如本文所用，“同源性(homology)”与“同一性(identity)”同义地使用。
如本文所用，“免疫原(immunogen)”指能够刺激或者诱导哺乳动物中的体液抗体和/或者细胞介导的免疫应答的物质。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或者“Ig”被定义为发挥抗体功能的一类蛋白。该类蛋白包含的5个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是身体分泌物如唾液、眼泪、乳汁、消化道分泌物和呼吸道与泌尿生殖道的粘液分泌物中存在的主要抗体。IgG是最普通的循环抗体。IgM是大多数哺乳动物中在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、补体结合和其它抗体反应中最有效的免疫球蛋白，在防御细菌和病毒中具有重要的作用。IgD是抗体功能还未知的免疫球蛋白，但是可能作为抗原受体。IgE是暴露于变应原后，通过引起介质从肥大细胞和嗜碱性细胞释放而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
如本文所用，“负免疫调节物(negative immune regulator)”或者“负调节物(anegative regulator)”或者“免疫应答的负调节物(a negative regulator of the immunerespons)”指能够负调控细胞中免疫信号转导途径的蛋白质。典型地，负免疫调节物负调控促炎信号转导途径。本文公开的负免疫调节物包括但不限于：sTLR、RP105、SIGIRR、ST2、NOD2、MyD88s、IRAK(IRAKM、IRAK1、IRAK2)、IRF-4、FLN29、TWEAK、TRIAD3A、CYLD、Cbl、A20、SUMO (SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4)、I-κB蛋白、MKPs、Foxj 1、Foxo3a、TWIST(Twist 1、Twist 2)、Roquin、Dok(Dok-1、Dok-2)、PI3K、前列腺素、TRAIL-R、抑制蛋白、TOLLIP、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7和CIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASx和PIASy)、SHP(SHp-1和SHP-2)或其组合。负免疫调节物可以属于不同的蛋白家族，包括但不限于参与信号转导的蛋白质的抑制性同源物(例如，可溶性诱饵TLRs、抑制性TIR同源物、抑制性信号传导分子同工型、抑制性细胞因子同源物等)、参与分子稳定的蛋白质、信号传导分子复合体的抑制性组分、参与调控信号传导分子磷酸化的蛋白质、抑制NF-κB靶向基因转录的转录因子、参与调控RNA翻译和稳定性的蛋白质、细胞因子信号传导调节物和类似物。一方面，抑制免疫细胞的一个或者更多个负免疫调节物起到提高细胞免疫效能的作用。
“分离的核酸(isolated nucleic acid)”指从以自然发生状态位于其两侧的序列分离出来的核酸区段或者片段，即，从通常与其相邻的序列移出的DNA片段，相邻的序列即在该片段自然发生的基因组中与该片段邻接的序列。该术语也适用于从自然伴随核酸的其它组分中被基本纯化的核酸，其它组分即RNA或者DNA或者蛋白质，它们在细胞中天然地伴随核酸。该术语因此包括，例如，整合到载体、自我复制的质粒或者病毒或者原核生物或者真核生物基因组DNA中的重组DNA，或者独立于其它序列作为单独分子存在的重组DNA(即，通过PCR或者限制性酶消化产生的cDNA、或者基因组或者cDNA的片段)。它也包括重组DNA，其是编码另外的多肽序列的杂交基因的一部分。
如本文所用，术语“主要组织相容性复合体(mator histocompatibilitycomplex)”或者“MHC”被定义为特定的基因簇，它们中的许多编码参与抗原呈递的在进化上相关的细胞表面蛋白，它们是最重要的组织相容性决定子之一。I类MHC或者MHC-I主要在对CD8T淋巴细胞的抗原呈递中发挥功能。II类MHC或者MHC-II主要在对CD4T淋巴细胞的抗原呈递中发挥功能。
如本文所用，术语“多核苷酸(polynucleotide)”被定义为核苷酸链。而且，核酸是核苷酸的多聚体。因此，如本文所用，核酸和多核苷酸是可互换的。
如本文所用，术语“多肽”被定义为通常具有限定序列的氨基酸残基链。如本文所用，术语多肽与术语“肽”和“蛋白质”是相互包含的。
本文所用“增殖”指形式相似的实体的生殖或者繁殖，例如细胞的增殖。即增殖包括产生更多数量的细胞，并且可通过简单计数细胞、测量细胞中的3H-胸苷的掺入以及类似方法和其它方法进行测量。
如本文所用，术语“启动子(promoter)”被定义为被细胞的合成机构或导入的合成机构识别的DNA序列，其是起始多核苷酸序列的特定转录所需要的。“组成型(constitutive)”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其才导致所述基因产物在细胞内产生。“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
如本文所用，术语“自身抗原(self-antigen)”被定义为宿主细胞或者组织表达的抗原。自身抗原可以是肿瘤抗原，但在某些实施方式中，其在正常和肿瘤细胞中都表达。本领域普通技术人员容易理解自身抗原可在细胞中过度表达。
如本文所用，“基本纯化的”细胞是基本不含有其它细胞类型的细胞。基本纯化的细胞也指从在自然存在状态下通常与其关联的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本纯化的细胞群指同质细胞群。在其它情况下，该术语仅仅指从在它们的自然状态下与其自然相关联的细胞中分离出来的细胞。在一些实施方式中，所述细胞在体外被培养。在其它实施方式中，所述细胞未在体外培养。
如本文所用，术语“置换”是本领域通常使用的突变之一。置换变体具有至少一个多肽分子中的氨基酸残基被不同的残基取代。“保守置换”通常提供与保守修饰的变体从其中被衍生的未修饰的多肽序列相似的生物学活性。保守置换通常包括一个氨基酸用另一个具有相似性质的氨基酸置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域熟知的。举例来说，下列六组各自含有互为保守置换的氨基酸：脂肪族：甘氨酸(Glycine，G)、丙氨酸(Alanine，A)、缬氨酸(Valine，V)、亮氨酸(Leucine，L)、异亮氨酸(Isoleucine，I)；芳香族：苯丙氨酸(Phenylalanine，F)、酪氨酸(Tyrosine，Y)、色氨酸(Tryptophan，W)；含硫氨基酸：甲硫氨酸(Methionine，M)、半胱氨酸(Cysteine，C)；碱性(阳离子)氨基酸：精氨酸(Arginine，R)、赖氨酸(Lysine，K)、组氨酸(组氨酸，H)；酸性(阴离子)氨基酸：天冬氨酸(Aspartic acid，D)、谷氨酸(Glutamic acid，E)；酰胺：天冬酰胺(Asparagine，N)、谷氨酰胺(Glutamine，Q)。
如本文所用，术语“T细胞”被定义为来自胸腺的细胞，其参与多种细胞介导的免疫反应。
如本文所用，术语“B细胞”被定义为来自骨髓和/或者脾的细胞。B细胞能够发育成制造抗体的浆细胞。
如本文所用，“治疗有效量”是对被给予组合物的哺乳动物足以提供有益作用的治疗组合物的量。
如本文所用，术语“转染的(trahsfected)”或者“转化的(transformed)”或者“转导的(transduced)”指外源核酸被运输或者导入宿主细胞的过程。“转染的”或者“转化的”或者“转导的”细胞是已经用外源核酸转染的、转化的或者转导的细胞。所述细胞包括原代细胞和其子代。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“处理(treatment)”或“缓解”是指治疗性处理和预防或防止措施，其中所述目的是防止或减慢(减轻)目的病理状况或病症。举例来说，对于癌症，癌细胞数量降低或癌细胞不存在；肿瘤大小的降低；肿瘤转移的抑制(即，减慢至某种程度以及优选地停止)；某种程度上肿瘤生长的抑制；一个或更多个与具体癌症相关的症状的缓解时长的增加和/或在某种程度上的减轻；降低的发病率和死亡率，以及生命质量问题的改进。
如本文所用，短语“在转录控制下(under transcriptional control)”或者“可操作地连接(operatively linked)”意思是，启动子处于与多核苷酸相关的正确位置和方向中，以控制通过RNA聚合酶的转录的起始和多核苷酸的表达。
如本文所用，术语“疫苗”被定义为在给予哺乳动物后用于激发免疫应答的物质。
如本文所用，术语“变体(variant)”是核酸序列或者肽序列，其在序列上分别不同于参比核酸序列或者肽序列，但是保留参比分子的基本性质。核酸变体的序列的变化可不改变参比核酸编码的肽的氨基酸序列，或者可导致氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短。肽变体序列的变化一般是受限的或者保守的，以致参比肽和所述变体的序列总体非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参比肽的氨基酸序列可以通过一个或者更多个置换、添加、缺失的任意结合而不同。核酸或者肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或者可以是未知天然存在的变体。非天然存在的核酸和肽的变体可以通过诱变技术或者通过直接合成制备。
“载体(vector)”是物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可以被用于将所述分离核酸传输到细胞的内部。本领域已知许多载体，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子型或者两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或者病毒。所述术语也被解释为包括促进将核酸运输到细胞中的非质粒和非病毒化合物，如，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和类似载体。
疫苗和佐剂组合物
一方面，本发明提供用于DCs活化的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是负免疫调节物的抑制剂、促炎分子例如鞭毛蛋白以及任选地抗原。在一个实施方式中，疫苗或佐剂的组分由多核苷酸表达载体产生。在一个实施方式中，负免疫调节物的抑制剂是SOCS1或A20的siRNA。本详述部分将描述疫苗组合物的一般组分以及这些组分可以被如何组装。
负免疫调节物
一般性说明。负免疫调节物可以属于不同的蛋白家族，包括但不限于涉及信号转导的蛋白的抑制性同源物(如，可溶的诱饵TLRs、抑制性TIR同源物、抑制性信号传导分子同种型、抑制性细胞因子同源物等)、涉及分子稳定性的蛋白、信号传导分子复合体的抑制性组分、涉及调节信号传导分子磷酸化的蛋白、抑制NF-κB靶向基因转录的转录因子、涉及调节RNA翻译和稳定性的蛋白、细胞因子信号传导调节物等。负免疫调节物的例子包括但不限于，sTLR、RP105、SIGIRR、ST2、NOD2、MyD88s、IRAK(IRAKM、IRAK1、IRAK2)、IRF-4、FLN29、TWEAK、TRIAD3A、CYLD、Cbl、A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4)、I-κB蛋白、MKPs、Foxj 1、Foxo3a、TWIST(Twist 1、Twist 2)、Roquin、Dok(Dok-1、Dok-2)、PI3K、前列腺素、TRAIL-R、抑制蛋白、TOLLIP、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7和CIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASx和PIASy)、SHP(SHP-1和SHP-2)和类似物。
免疫细胞中的负免疫调节物在免疫细胞中发挥“沉默”控制点的作用，从而增强细胞中的免疫效力。一方面，当用于本发明疫苗组合物中时，对涉及信号转导的蛋白的抑制性同源物(如，可溶的诱饵TLRs、抑制性TIR同源物、抑制性信号传导分子同种型、抑制性细胞因子同源物等)、涉及分子稳定的蛋白、信号传导分子复合体的抑制性组分、涉及调节信号传导分子磷酸化的蛋白、抑制NF-κB靶向基因转录的转录因子、涉及调节RNA翻译和稳定的蛋白、细胞因子信号传导调节物或其任何组合的抑制对哺乳动物提供治疗益处。
各种负免疫调节物的多核苷酸和多肽序列可以在本领域普通技术人员所知的计算机化数据库中发现。一个这样的数据库是National Center for BiotechnologyInformation′s Genbank and GenPept数据库。利用本文公开的技术或者本领域普通技术人员知道的任何技术(如，Sambrook等人，2001)，这些已知基因的核酸序列可以被扩增、与本文公开的序列结合(如，连接)和/或者表达。虽然核酸可以在体外表达系统中表达，但是在一些实施方式中，所述序列包括用于体内复制和/或者表达的载体。
细胞因子信号传导的调节物。在一个方面，所述负免疫调节物是细胞因子信号传导的调节物，其包括但不限于细胞因子信号转导抑制剂(SOCS)、含有SH2的磷酸酶(SHP)和活化的STATs的蛋白抑制剂(PIAS)。
细胞因子信号传导的诱导型抑制剂是细胞因子信号传导的抑制剂(SOCS)蛋白，其中有八个家族成员：SOCS1-SOCS7和细胞因子诱导的含有SH2结构域的蛋白(CIS)。SOCS蛋白识别细胞因子受体或者相关的JAKs，并且通过直接干扰信号传导和通过靶向受体复合物进行泛素介导的蛋白酶体降解来衰减信号转导。SHP蛋白——包括但不限于(SHP-1和SHP-2)——被组成型表达，并且能够通过将信号传导中间体如Janus激酶(JAK)及其受体去磷酸化而衰减细胞因子信号转导。活化的STATs的蛋白抑制剂(protein inhibitors of activated STATs，PIAS)家族的成员--包括但不限于PIAS 1、PIAS3、PIASx和PIASy-也是组成型表达的，并且通过抑制STAT活性衰减信号转导。苏素化过程涉及对PIAS介导的STAT活性的抑制。
涉及信号转导的蛋白的抑制性同源物。有效的免疫应答是由于在应答致病性感染时的DC激活。这种激活包括通过病原识别受体如TLRs的信号传导。TLRs成员以相似方式进行信号传导，这是因为存在保守的、胞质Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域，其激活共同的信号传导途径，尤其是那些导致NF-κB和应激活化蛋白激酶激活的信号传导途径。NF-κB激活通过分泌促炎细胞因子如TNF、IFN、白细胞介素1(IL-1)、IL-6和IL-12和通过表达共刺激分子如CD80、CD86和CD40而催化免疫应答。
经常使用的用于调控细胞内基于TLR信号传导的免疫应答的策略是，通过它们在TLR的细胞外部分不具有刺激活性的非功能同源物或者同工型，竞争性地抑制关键的信号传导分子。在该负免疫调节物家族中的蛋白包括，但不限于可溶的诱饵TLRs(sTLR)。sTLR抑制TLRs与病原产物(如，微生物产物)之间的相互作用。例如，可溶的诱饵TLR2与TLR2竞争，以便与相应的微生物配体相互作用。在另一个例子中，可溶的诱饵TLR4与MD2相互作用并且抑制MD2-TLR4复合体的形成，从而通过TLR4阻断LPS介导的信号传导。
基于本公开内容，本领域普通技术人员应理解，本发明包括抑制负免疫调节物的组合物和方法，其中所述负免疫调节物是信号传导分子的非功能性同源物。优选地，信号传导分子的非功能性同源物是可溶的诱饵TLR。抑制信号传导分子的非功能性同源物(或者在其它方面，抑制sTLR)起到抑制非功能性同源物对所述信号传导分子的抑制作用的作用。
除了抑制可溶的诱饵TLRs，增强TLR信号传导的另一个策略是抑制在TLR的胞质区含有非功能的TIR同源物或者同工型的蛋白质。这些蛋白质是共有膜结合的非功能性TIR同源物的蛋白家族成员，所述非功能性TIR同源物含有不具有刺激活性的TIR结构域(另外被称为非功能性受体)。这样的蛋白质包括，但不限于SIGIRR(单免疫球蛋白IL-1R相关分子)、ST2和RP105。
不希望束缚于任何具体的理论，这些蛋白质通过抑制或者隔绝TLR结合其相应的信号传导分子来阻抑TLR信号传导。例如，SIGIRR通过同TLR4竞争与信号传导分子相互作用而衰减TLR4信号传导。因此，本发明包括抑制负免疫调节物的组合物和方法，其中所述负免疫调节物是膜结合的非功能性TIR同源物，以增强免疫细胞中的TLR信号传导。该策略对抑制负免疫调节物以提高免疫细胞的免疫效能的总体构思提供了支持。
TLR信号传导也可以通过NOD2调节。NOD2是能够识别细菌产物胞壁酰二肽(MDP)的核酸结合的寡聚结构域家族成员。NOD2是TLR2信号传导的负调节物。基于本文提供的本公开内容，抑制免疫细胞的NOD2抑制了NOD2对细胞中TLR信号传导的抑制作用。因此，在免疫中抑制NOD2提高了所述细胞的免疫效能。
调节TLR信号传导的另一个策略是调节胞质信号传导蛋白，如MyD88和IRAK。抑制胞质信号传导分子的负免疫调节物被认为是TLR信号传导中关键信号传导分子的非功能性同工型(或者另外称为信号传导分子同工型)。被认为是非功能性同工型的负免疫调节物的例子是可选剪接的短MyD88变体，其缺少中间结构域。该MyD88剪接变体——其被表示为MyD88s——已经被发现抑制TLR信号传导。例如，MyD88s抑制LPS诱导的NF-κB激活。认为MyD88s抑制LPS诱导的NF-κB的激活，这是由于其不能结合到IRAK4和促进IRAK1磷酸化。基于本文提供的公开内容，抑制负免疫调节物，其中所述负免疫调节物是细胞中的非功能性同工型(如，MyD88s)，提供了增强细胞中的TLR信号传导的手段，并且由此提高所述细胞的免疫效能。
属于参与信号转导的蛋白质的抑制性同源物家族的蛋白质的另一个例子是IRAK。所述IRAK激酶家族包括四个成员：IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAKM。并且，IRAKM缺少激酶活性，其作为细胞中TLR信号传导的完全负免疫调节物发挥功能。因此，抑制负免疫调节物，其中，所述负免疫调节物是非功能性同工型如IRAKM，对抑制免疫细胞中的负免疫调节物以提高该细胞的免疫效能的总体构思提供了支持。
TLR信号传导的其它负免疫调节物包括但不限于转录因子的IFN调节因子(IRF)家族的成员、FLN29(新的干扰素和LPS诱导的基因)和TWEAK。因此，抑制这些负免疫调节物的任何一个或者更多个可以阻止每个负免疫调节物对免疫应答的抑制作用。因此，抑制这些负免疫调节物的任何一个或者更多个提供了增强细胞中TLR信号传导的手段，并从而提高细胞的免疫效能。
分子稳定性调节物。负免疫调节物的一个家族利用调节信号传导分子稳定性的策略。该策略与通过泛素化/去泛素化调控关键信号传导分子的稳定性相关，并且通过苏素化和其它机制增加信号传导分子复合体的抑制性组分的稳定性。许多这些负免疫调节物如TRIAD3A、Cyld、Cbl、A20和SUMO是泛素修饰的酶，其修饰靶TLRs和信号传导分子，并且促进它们降解来衰减TLR信号转导。在一些例子中，这些负免疫调节物也可以衰减TNFR信号转导。因此，基于本文提供的公开内容，本领域普通技术人员应理解，抑制免疫细胞中的这些负免疫调节物的一个或者更多个增强细胞中的TLR和/或者TNFR信号传导。增强细胞中的TLR和/或者TNFR信号传导的结果是细胞的增强免疫效能。
参与调节分子稳定性的其它负免疫调节物包括抑制蛋白家族。基于本公开内容，本领域普通技术人员应理解，抑制免疫细胞中的抑制蛋白家族成员抑制了抑制蛋白家族成员对NF-κB激活的抑制作用。对抑制蛋白家族成员的抑制因此提高了细胞的免疫效能。
信号转导分子复合体的抑制性组分。作为信号传导分子复合体的抑制性组分家族成员的负免疫调节物包括I-κB蛋白。包括I-κBα、I-κBβ和I-κBε的I-κB蛋白隔绝胞质中的NF-κB蛋白，由此抑制NF-κB发挥其正常功能。I-κB蛋白通过掩蔽NF-κB亚单位上的核定位序列(NLSs)而保留胞质中的NF-κB。
在激活NF-κB中的重要事件是通过I-κB激酶(IKK)复合体的I-κB磷酸化。所述IKK复合体是用于通过包括TLR配体和TNF的各种刺激激活NF-κB的汇集点。IKK复合体含有两个催化亚基，IKKα和IKKβ，并控制NF-κB转录因子的激活。IKKβ在应答促炎细胞因子和微生物产物时介导NF-κB激活。已经观察到IKKα在调控NF-κB激活中的负调控作用。IKKα通过加速NF-κB亚单位RelA和c-Rel的降解、和从促炎基因启动子中除去RelA和c-Rel而有助于抑制NF-κB活性。
基于本文提供的公开内容，负调控NF-κB或者在其它方面阻止NF-κB激活的蛋白质是利用本文公开的方法靶向抑制以提高细胞的免疫效能的候选者。本领域普通技术人员应理解，抑制I-κB蛋白、IKKα和IKKβ或者任意组合能够抑制这些蛋白对NF-κB激活的抑制作用。
信号传导分子磷酸化的调节。MAPK信号传导途径与免疫应答的激活相关。MAPK途径受到MAPK磷酸酶(MKPs)的反馈抑制，因为所述磷酸酶在MAPK途径激活后被诱导。基于本文提供的公开内容，抑制MKP(如，MKP5和MKP6)起到抑制MKP对其相应的MAPK途径的抑制作用的作用。MKP5和MKP6已经显示通过抑制它们各自的MAPK靶的活性而负调控T细胞激活。
基于本文提供的公开内容，本领域普通技术人员应理解，抑制MKP(如，MKP5和MKP6)能够抑制所述磷酸酶对MAPK信号传导途径的抑制作用。抑制免疫细胞中的MKP能够提高细胞的免疫效能。
靶基因转录的调节物。调节免疫应答的另一个策略是抑制NF-κB靶向基因的转录或者增强信号传导分子复合体中的负组分(negative component)的转录。这样的策略包括抑制包括但不限于Twist-1、Twist-2、Foxj 1和Foxo3a的负免疫调节物。本文提供的公开内容显示，抑制这些蛋白的至少一个的水平能够提高细胞的免疫效能。
Foxo3a和Foxj 1是叉头转录因子(forkhead transcription factor)家族成员，其活跃地参与NF-κB的负调控。Twist是NF-κB的另一个负免疫调节物。Twist结合到细胞因子启动子的E框(E box)并且抑制结合到临近的κB位点的NF-κB的活性。
抑制负免疫调节物的方法：
本发明包括抑制细胞中的负免疫调节物以提高所述细胞的免疫效能。优选地，本发明包括抑制一个或者更多个选自以下的负免疫调节物：A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4)、Foxj 1、Foxo3a、TWIST(Twist-1、Twist 2)、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7和CIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASx和PIASy)、SHP(SHP-1和SHP-2)和类似物。
在一个实施方式中，包括负免疫调节物抑制剂的组合物选自小干扰RNA(siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性失活突变的表达载体、细胞内抗体、肽和小分子。
本领域普通技术人员应理解，基于本文提供的公开内容，减少负免疫调节物如细胞中的细胞因子信号传导调节物的mRNA和/或蛋白质水平的一个方法是通过降低或者抑制编码所述调节物的核酸的表达。因此，细胞中的所述负免疫调节物的蛋白质水平也可以利用抑制或者降低基因表达的分子或者化合物例如反义分子或者核酶加以降低。
反义核酸。在一个实施方式中，调节序列是通过载体表达的反义核酸序列。所述反义表达载体被用于转染哺乳动物细胞或者哺乳动物本身，由此造成所述期望的负免疫调节物内源表达减少。反义分子和其抑制基因表达的用途是本领域所熟知的(见，如Cohen，1989，在：Oligodeoxyribonucleotides，Antisense Inhibitors ofGene Expression，CRC Press)。反义核酸分子是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或者RNA分子(Weintraub，1990，Scientific American 262：40)。在细胞中，反义核酸分子杂交到相应的mRNA，形成双链分子，由此抑制基因的翻译。
使用反义方法抑制基因的翻译是本领域所知的，并且如在Marcus-Sakura(1988，Anal.Biochem.172：289)中被描述。这样的反义分子可以通过美国专利号5,190,931所教导的使用编码反义分子的DNA进行的基因表达被提供给细胞。
可选地，本发明的反义分子可以合成制备，接着提供给细胞。大约10到大约30之间和更优选的大约15个核苷酸的反义寡聚物是优选的，因为它们容易合成和导入到靶细胞中。本发明考虑的合成的反义分子包括本领域已知的寡核苷酸衍生物，其与未修饰的寡核苷酸相比具有提高的生物学活性(见美国专利号5,023,243)。
核酸。核酶及其抑制基因表达的用途也为本领域所熟知(见如，Cech等人，1992，J. Biol.Chem.267：17479-17482；Hampel等人，1989，Biochemistry28：4929-4933；Eckstein等人，国际公开号WO 92/07065；Altman等人，美国专利号5,168,053)。核酶是这样的RNA分子，其具有以类似于DNA限制性内切核酸酶的方式特异性裂解其它单链RNA的能力。通过修饰编码这些RNAs的核苷酸序列，分子可以被设计以识别RNA分子中特定的核酸序列并切割它(Cech，1988，J.Amer.Med.Assn.260：3030)。这个方法的主要优点是核酶是序列特异性的事实。
存在两种基本类型的核酶，即，四膜虫类型(Hasselhoff，1988，Nature 334：585)和锤头型。四膜虫型核酶识别长度为四个碱基的序列，而锤头型核酶识别长度为11-18个碱基的碱基序列。序列越长，序列在靶mRNA种类中会唯一发生的可能性越大。结果，锤头型核酶比四膜虫型核酶更优选用于失活特异性mRNA种类，并且18个碱基的识别序列比可以在各种非相关mRNA分子中随机存在的更短的识别序列更优选。
对抑制负免疫调节物的表达有用的核酶可以通过将靶序列整合到基本核酶结构中而设计，其与期望的负免疫调节物的mRNA序列互补。靶向期望的负免疫调节物的核酶可以利用商业购买的试剂(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)合成，或者它们可以从编码它们的DNA进行遗传表达。
小干扰RNA(siRNA)。“小干扰RNA”或“短干扰RNA”或“siRNA”或“短发夹RNA”或“shRNA”是靶向感兴趣核酸序列的RNA核苷酸双链体。如本文所用，术语“siRNA”包括所有形式的siRNA，包括但不限于(i)双链RNA多核苷酸；(ii)单链多核苷酸；和(iii)(i)或者(ii)的多核苷酸，其中这样的多核苷酸在其中具有一个、两个、三个、四个或者更多的核苷酸改变或者置换。
双链多核苷酸形式的siRNA包括大约18个碱基对、大约19个碱基对、约20个碱基对、约21个碱基对、约22个碱基对、约23个碱基对、约24个碱基对、约25个碱基对、约26个碱基对、约27个碱基对、约28个碱基对、约29个碱基对或者约30个碱基对的长度。双链siRNA能够干扰负免疫调节物的表达和/或者活性。
单链siRNA包括靶向感兴趣基因或者多核苷酸的部分RNA多核苷酸序列。单链siRNA包括长度为约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约21个核苷酸、约22个核苷酸、约23个核苷酸、约24个核苷酸、约25个核苷酸、约26个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核苷酸、约29个核苷酸或者约30个核苷酸的多核苷酸。所述单链siRNA能够干扰如下的靶多核苷酸的表达和/或者活性：A20、SUMO(SUMO1，SUMO2，SUMO3，SUMO4)、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist-1、Twist-2)、SOCS(SOCS1，SOCS2，SOCS3，SOCS4，SOCS5，SOCS6，SOCS7和CIS)、PIAS(PIAS1，PIAS3，PIASx和PIASy)、SHP(SHP-1和SHP-2)等。单链siRNA也能够与互补序列退火，生成能够干涉负免疫调节物的表达和/或者活性的dsRNA。
在还另一个方面，siRNA包括多核苷酸，所述多核苷酸包括双链或者单链多核苷酸，其中所述siRNA在其中具有一个、两个、三个、四个或者更多的核苷酸改变或者置换。
siRNA多核苷酸是一般认为通过转录后基因沉默机制干扰RNA活性的RNA核酸分子。siRNA多核苷酸优选地包括双链RNA(dsRNA)，但不旨在如此地被限定，和可以包括单链RNA(见，如Martinez等人，2002Cell 110：563-74)。siRNA多核苷酸可以包括其它天然存在的、重组的或者合成单链或者双链的核苷酸多聚体(核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸或者两者的结合)和/或者核苷酸类似物，如本文所提供的(如，通常以5′到3′磷酸二酯键方式的寡核苷酸或者多核苷酸等)。因此，应被理解的是，鉴于明确确立的互补核苷酸碱基配对原则，某些在此作为DNA序列公开的、能够引导siRNA多核苷酸转录的代表性序列也意图描述相应的RNA序列和它们的互补体。
可以使用含有用于RNA聚合酶启动子的启动子的DNA(基因组DNA，cDNA或者合成DNA)作为模板转录siRNA。举例来说，启动子可以是U6启动子或者H1RNA聚合酶III启动子。
可选地，siRNA可以是合成来源的RNA分子。在某些实施方式中，siRNA多核苷酸可以具有平端。在某些其它的实施方式中，siRNA多核苷酸的至少一条链具有在siRNA多核苷酸的任一条链的3′端“突出(overhang)”(即，不与相对链的互补碱基进行碱基配对)的至少一个、优选地两个核苷酸。在本发明的优选实施方式中，siRNA多核苷酸双链体的每个链在3′端具有两个核苷酸的突出。所述两个核苷酸突出优选地是胸苷二核苷酸(TT)，但也可以包括其它碱基，例如TC二核苷酸或者TG二核苷酸，或者任何其它二核苷酸。所述突出二核苷酸也可以与被靶向用于干扰的多核苷酸序列5′端的两个核苷酸互补。关于siRNA多核苷酸3′端的论述，见如WO 01/75164。
优选的siRNA多核苷酸包括大约18-30个核苷酸碱基对的双链多核苷酸，优选地，大约18、大约19、大约20、大约21、大约22、大约23、大约24、大约25、大约26或者大约27个碱基对，在其它优选的实施方式中，大约19、大约20、大约21、大约22或者大约23个碱基对、或者大约27个碱基对，由此，使用“大约”表明，在某些实施方式中和在某些条件下，加工切割步骤——其可以产生能够干扰所选择的多肽的表达的功能性siRNA多核苷酸——可能不是绝对有效。因此，siRNA多核苷酸可包括一个或者更多个siRNA多核苷酸分子，这些siRNA多核苷酸分子在长度上可有一个、两个、三个、四个或者更多碱基对的不同(如，通过核苷酸插入或者缺失)，这是由于加工、生物合成或者人工合成siRNA的变异性所致。本发明的siRNA多核苷酸也可包括通过与特定序列在一个、两个、三个或者四个核苷酸处不同(如，通过包括转换或者颠换的核苷酸置换)而表现出变异性的多核苷酸序列。这些不同可以发生在特定siRNA多核苷酸序列的任何核苷酸位置，这取决于分子的长度，不管其位于双链多核苷酸的有义链或者反义链上。所述核苷酸的差异可以在双链的多核苷酸的一条链上发现，其中置换核苷酸将与其通常形成氢键碱基对的互补核苷酸可不必相应地被置换。在优选的实施方式中，就具体的核苷酸序列而言，siRNA多核苷酸是均质(homogeneous)的。
包括本发明的siRNA多核苷酸的多核苷酸在一些实施方式中可以来自单链多核苷酸，所述单链多核苷酸包括单链寡核苷酸片段(如，大约18-30个核苷酸)和典型地被间隔序列分开的其反向互补链。根据某些这样的实施方式，间隔的切割提供了单链寡核苷酸片段和其反向互补链，这样，任选地利用可以造成从任一条链或者两条链的3′端和/或5′端添加或者除去一个、两个、三个或者更多核苷酸的附加加工步骤，它们可以退火形成本发明的双链siRNA多核苷酸。在一些实施方式中，所述间隔是这样的长度，其允许间隔切割前片段和其反向互补链退火并形成双链结构(如，类似发夹型多核苷酸)，和任选地随后进行可以造成从任一条链或者两条链的3′端和/或5′端添加或者除去一个、两个、三个、四个或者更多核苷酸的加工步骤。因此，间隔序列可以是本文所提供的任何多核苷酸序列，其位于两条互补的多核苷酸序列区域之间，所述互补的多核苷酸序列区域当退火为双链核酸时生成siRNA多核苷酸。优选地，间隔序列包括至少4个核苷酸。在一些实施方式中，间隔可以包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21-25、26-30、31-40、41-50、51-70、71-90、91-110、111-150、151-200个或者更多的核苷酸。来自包括由间隔隔开的两个互补核苷酸序列的单核苷酸链的siRNA多核苷酸的例子已经被描述(如，Brummelkamp等人，2002Science 296：550；Paddison等人，2002Genes Develop.16：948；Paul等人，2002Nat.Biotechnol.20：505-508；Grabarek等人，2003BioTechniques 34：734-44)。
多核苷酸变体可以含有一个或者更多个置换、添加、缺失和/或者插入，使得siRNA多核苷酸活性基本不降低。核苷酸内容的任何这样的变更对siRNA多核苷酸活性的影响一般可以按本文另外描述那样进行评价。变体优选地显示与编码下列的多核苷酸序列的一部分至少大约75％、78％、80％、85％、87％、88％或者89％的同一性，以及更优选地至少大约90％、92％、95％、96％或者97％的同一性：天然A20、SUMO(SUMO1，SUMO2，SUMO3和SUMO4)、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist-1，Twist-2)、SOCS (SOCS1，SOCS2，SOCS3，SOCS4，SOCS5，SOCS6，SOCS7和CIS)、PIAS(PIAS1，PIAS3，PIASx和PIASy)、SHP(SHP-1和SHP-2)等。通过使用本领域普通技术人员熟知的任何方法，包括应用计算机算法比较多核苷酸序列与靶多核苷酸的相应部分，可以容易确定同一性百分比。这些包括Align或者BLAST算法(Altschul，1991 J. Mol.Biol.219：555-565；Henikoff和Henikoff，1992，PNAS 89：10915-10919)。
某些siRNA多核苷酸变体可以与编码靶多肽的多核苷酸的一部分基本同源。来自这些多核苷酸变体的单链多核苷酸能够在中等严格条件下与编码靶多肽的自然存在的DNA或者RNA序列杂交。在中等严格条件下可检测地杂交到编码靶多肽的多核苷酸序列的siRNA多核苷酸可以具有这样的核苷酸序列，其包括与特定的靶多核苷酸互补的至少10个连续核苷酸，更优选地11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30个连续核苷酸。在一些优选的实施方式中，这样的siRNA序列(或者其互补序列)对编码期望干扰表达的靶多肽的单个特定多核苷酸将是独特的。在一些其它的实施方式中，序列(或者其互补链)可以被编码期望干扰多肽表达的靶多肽的两个或者更多的相关多核苷酸共有。
合适的中等严格条件包括，例如，在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液中预洗多核苷酸；在50℃-70C下、在5×SSC中杂交多核苷酸1-16小时(如，过夜)；接着用含有0.05-0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC的一种或者更多种在22-65℃漂洗多核苷酸一次或者两次20-40分钟。对附加的严格性，杂交条件可以包括在0.1×SSC和0.1％SDS中在50-60℃下另外漂洗15-40分钟。本领域普通技术人员应理解，杂交条件严格性的变化可以通过改变用于预杂交、杂交和漂洗步骤的时间、温度和/或者溶液浓度获得。合适的条件也可以部分取决于所用探针的具体核苷酸序列和印迹的、先证者核酸样品的具体核苷酸序列。因此，应被理解的是，当多核苷酸的期望选择性被鉴定时，基于其与一个或者更多个某些先证者序列杂交而与某些其它先证者序列不杂交的能力，合适的严格性条件可以容易地进行选择，而不需要过多的实验。
可以利用几个标准中的一个或者更多个设计本发明的序列特异性siRNA多核苷酸。例如，为了设计具有与编码感兴趣多肽的序列相同的大约21个连续核苷酸的siRNA多核苷酸，可以对所述多核苷酸序列的可读框进行具有下列一个或者更多个特征的大约21个碱基序列长度的扫描：(1)A+T/G+C之比为大约1∶1但不超过2∶1或者1∶2；(2)在5′端具有AA二核苷酸或者CA二核苷酸；(3)内部发夹环，其解链温度小于55℃；(4)同源二聚体解链温度小于37℃(使用本领域普通技术人员已知的计算机软件可以确定(3)和(4)中所描述的解链温度计算)；(5)至少16个连续核苷酸的序列，其未被鉴定存在于任何其它已知的多核苷酸序列中。可选地，使用从不同的卖主如OligoEngine.TM.(Seattle，Wash.)、Dharmacon，Inc.(Lafayette，Colo.)、Ambion Inc.(Austin，Tex.)和QIAGEN，Inc.(Valencia，Calif.)商业购买的计算机软件可以设计和选择siRNA多核苷酸序列。也见Elbashir等人，2000Genes&Development 15：188-200；Elbashir等人，2001Nature 411：494-98。然后，根据本领域已知的和本文其它地方描述的方法，可以测试所述siRNA多核苷酸干扰靶多肽表达的能力。对siRNA多核苷酸的效力的确定包括，不仅要考虑其干涉靶多肽表达的能力，而且也要考虑所述siRNA多核苷酸是否对宿主细胞有毒。例如，期望的siRNA将表现RNA干扰活性并也不会表现出不需要的生物学后果。不需要的生物学后果的例子是细胞的凋亡，所述细胞不期望由于siRNA导入宿主细胞中而导致细胞死亡。
基于本公开内容，应该理解的是，siRNA可以不同程度地实现靶多肽表达的沉默。因此必须首先检验siRNA的效力。基于给定siRNA干扰或者调节靶多肽表达的能力，由此做出siRNA选择。因此，能够干扰期望靶多肽表达的具体siRNA多核苷酸序列的鉴定需要产生和测试各siRNA。测试各siRNA和选择合适的siRNAs用于本发明的方法在实施例中进一步描述。因为并不是干扰蛋白质表达的所有siRNA都会具有生理上的重要作用，因此本公开内容也提出了各种生理上相关的分析，用于确定用本发明的siRNAs干扰靶蛋白表达的水平是否具有临床上相关的意义。
本领域普通技术人员应容易理解，作为遗传密码简并的结果，许多不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。即，氨基酸可以被几个不同的密码子中的一个编码，并且本领域的普通技术人员可以容易确定，虽然一个特定的核苷酸序列可以与另一个不同，但多核苷酸可以实际上编码含有相同氨基酸序列的多肽。因此，由于密码子使用的不同而不同的多核苷酸是本发明特别考虑的。
本文提供了许多用于干涉靶多肽表达的具体siRNA多核苷酸序列。siRNA多核苷酸一般可以通过本领域已知的任何方法制备，包括例如固相化学合成。利用标准的诱变技术如寡核苷酸定点特异性诱变，也可以在多核苷酸序列中引入修饰。而且，siRNA可被化学修饰或者与其它分子偶联以改善其稳定性和/或者递送性质。本发明的一方面包括本文所述的siRNA，其中一种或者更多种核糖已经从中去除。
可选地，siRNA多核苷酸分子可以通过体外或者体内转录合适的DNA序列(如，编码靶多肽的多核苷酸序列或者其期望部分)产生，只要将所述DNA用合适的RNA聚合酶启动子(如，例如T7、U6、H1或者SP6，但是同样可以使用其它的启动子)整合到载体中。另外，可以给予哺乳动物siRNA多核苷酸，其可以是支持转录(和任选地，合适的加工步骤)的DNA序列(如，本文提供的重组核酸构建物)，以使体内产生期望的siRNA。
在一个实施方式中，siRNA多核苷酸——其中所述siRNA多核苷酸能够干涉靶多肽的表达——可以被用于产生沉默的细胞。当在细胞中表达或与细胞接触时，导致靶多肽的表达显著减少的任何siRNA多核苷酸包括在本发明中。相对于在所述siRNA不存在时检测到的靶多肽的表达水平，优选地所述减少超过大约10％，更优选地超过大约20％，更优选地超过大约30％，更优选地超过大约40％，大约50％，大约60％，大约70％，大约75％，大约80％，大约85％，大约90％，大约95％或大约98％。优选地，siRNA多核苷酸在细胞中的存在没有产生或者造成任何不期望的毒性效应，如，细胞凋亡或者细胞死亡，其中凋亡不是RNA干扰的期望效应。
在另一个实施方式中，siRNA多核苷酸当在细胞中表达或与细胞接触时导致靶多肽的表达显著地减少。相对于在siRNA不存在时检测到的靶多肽的表达水平，优选地所述减少为约10％至20％，更优选地约20％至30％，更优选地约30％至40％，更优选地约40％至50％，更优选地约50％至60％，更优选地约60％至70％，更优选地约70％至80％，更优选地约80％至90％，更优选地约90％至95％，更优选地约95％至98％。优选地，siRNA多核苷酸在细胞中的存在没有产生或者造成任何不期望的毒性效应。
在另一个实施方式中，siRNA多核苷酸当在细胞中表达或与细胞接触时导致靶多肽的表达显著地减少。相对于在所述siRNA不存在时检测到的靶多肽的表达水平，优选地所述减少为约10％或更高，更优选地约20％或更高，更优选地约30％或更高，更优选地约40％或更高，更优选地约50％或更高，更优选地约60％或更高，更优选地约70％或更高，更优选地约80％或更高，更优选地约90％或更高，更优选地约95％或更高，更优选地约98％或更高。优选地，siRNA多核苷酸在细胞中的存在没有产生或者造成任何不期望的毒性效应。
同样地，本发明包括siRNA多核苷酸，例如在表6SEQ ID NOS：5-160中示例的siRNAs。SEQ ID NOs：5-7是SOCS1的人siRNA候选物序列。SEQ IDNOs：8-13、14-19、20-25、26-31和32-37是PIAS1、PIAS3、PIASx、PIASy和SHP-1的人siRNA候选序列的序列。A20、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、Twist-1、Twist-2、Foxj1和Foxo3a的靶序列的实例分别在SEQ ID NOs：38-59、60-67、68-80、81-87、88-103、104-111、112-124、125-136和137-160中示例。
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本发明的siRNA多核苷酸产生后，本领域普通技术人员应理解，所述siRNA多核苷酸应具有某些特征，这些特征可以被修饰以改进作为治疗化合物的siRNA。因此，可以通过将其修饰为包括硫代磷酸酯或者其它的键、甲基膦酸酯、砜、硫酸酯、羰游基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等，进一步设计所述siRNA多核苷酸，以抵抗降解(见，如Agrwal等人，1987Tetrahedron Lett.28：3539-3542；Stec等人，1985Tetrahedron Lett.26：2191-2194；Moody等人，1989Nucleic Acids Res.12：4769-4782；Eckstein，1989Trends Biol.Sci.14：97-100；Stein，In：Oligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of Gene Expression，Cohen，ed.，MacmillanPress，London，pp.97-117(1989))。
本发明的任何多核苷酸可以被进一步修饰以增加其体内稳定性。可能的修饰包括但不限于，增加5′和/或者3′端的侧翼序列；利用硫代磷酸或者2′O-甲基而不是骨架上的磷酸二酯键；和/或者包含非常规碱基如肌苷、Q核苷(queosine)和怀丁苷等，以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基修饰形式、甲基修饰形式、硫代修饰形式和其它修饰形式。
用于本发明组合物的抗原
本发明包括用于脉冲APCs的不同方法，包括但不限于用蛋白质、cDNA或者mRNA形式的全抗原负载APC。然而，本发明不应该被解释为限于用于脉冲APC的具体形式的抗原。相反，本发明包括本领域已知的用于产生抗原负载的APC的其它方法。APC可用编码确定抗原的mRNA转染。序列已知的基因产物对应的mRNA可以在体外用合适的引物和反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)结合转录反应快速地产生。用mRNA转染APC同其它用于产生脉冲的APC的抗原负载技术相比提供了优点。例如，从微观量的组织即肿瘤组织扩增RNA的能力扩大了APC用于对大量患者接种的应用。
抗原可以来自病毒、真菌或者细菌。抗原可以是自身抗原或者疾病相关的抗原，所述疾病选自感染性疾病、癌和自身免疫性疾病。而且多个抗原可单独地或作为融合蛋白同时提供。
对于用作疫苗的抗原组合物，抗原组合物必须诱导细胞、组织或者哺乳动物(如人)中对抗原的免疫应答。在特定实施方式中，抗原组合物包括或编码本文所述的任何抗原的全部或部分，或者其免疫学上的功能等同物。在某些实施方式中，抗原组合物被偶联到HLA锚定基序氨基酸或者包括HLA锚定基序氨基酸。
在一个实施方式中，抗原组合物可以是两个或更多个抗原的融合蛋白。所述融合蛋白可由表达载体编码，其被引入细胞中或可与细胞直接接触。当融合蛋白由表达载体编码时，编码每个抗原的多核苷酸区段可操作地连接以使mRNA翻译产生融合蛋白。任选地，具有编码间隔的序列，其分开两个区段。在一个具体实施方式中，抗原组合物包括在融合蛋白中连接在一起的显性失活存活蛋白突变体和MUC1片段。
可以理解，本发明的抗原组合物可以通过本领域公知的方法制备，所述方法包括但不限于，通过固相合成进行化学合成并通过HPLC从化学反应的其它产物中纯化，或者通过在体外翻译系统或者活细胞中表达编码包括本发明抗原的肽或者多肽的核酸序列(如，DNA序列)而产生。另外，抗原组合物可以包括从生物样品分离的细胞组分。优选地，分离抗原组合物并充分透析以除去一种或者更多种不期望的小分子量分子和/或者将其冻干以更容易地配制到期望的载体中。进一步理解的是，在疫苗组分中制备的附加的氨基酸、突变体、化学修饰等如果存在，它们应优选地基本不干涉抗体对表位序列的识别。
本发明的一种或者更多种抗原决定簇对应的肽或者多肽一般应该为至少5或者6个氨基酸残基的长度，并且可以含有多达约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个残基左右。肽序列可以通过本领域普通技术人员已知的方法合成，如，例如，用如可以从Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA(Foster City，CA)购买的自动肽合成仪进行肽合成。
较长的肽或者多肽也可以如通过重组方法制备。在某些实施方式中，编码抗原组合物和/或者本文所述的组分的核酸可以被用于本发明的各种组合物或者方法，例如在体外或者体内产生抗原组合物。例如，在某些实施方式中，编码抗原的核酸被包括在，例如重组细胞中的载体中。所述核酸可以被表达产生包括抗原序列的肽或者多肽。所述肽或者多肽可以从细胞分泌或者作为细胞的部分被包括或者包括在细胞内。
在某些实施方式中，通过用编码抗原的核酸转染或者接种哺乳动物可以促进免疫应答。包括在靶哺乳动物内的一个或者更多个细胞在将所述核酸给予所述哺乳动物后，接着表达所述核酸编码的序列。疫苗也可以以如编码全部或者部分抗原肽或者多肽序列的核酸(如，cDNA或者RNA)的形式存在。核酸的体内表达可以通过如，质粒类型的载体、病毒载体或者病毒/质粒构建体载体进行。
在优选的方面，所述核酸包括编码全部或者部分序列的编码区，所述序列编码合适的抗原或者其免疫功能的等同物。当然，所述核酸可以包括和/或者编码附加的序列，其包括但不限于包括一种或者更多种免疫调节剂或者佐剂的那些。
肿瘤相关抗原。在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或者“过度增殖疾病抗原”或者“过度增殖疾病相关抗原”指特定的过度增殖疾病共同的抗原。在某些方面，本发明的肿瘤相关抗原来自于包括但不限于以下的癌症：原发性或者转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、胃癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
在一个实施方式中，本发明的肿瘤抗原包括一种或者更多种由来源于哺乳动物癌瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫识别的抗原癌表位。增加数量的TAAs已被鉴定用于肿瘤接种。理想的TAA应在肿瘤细胞而不是正常细胞中高表达，并且应对肿瘤细胞的生存是必需的。抑制性凋亡蛋白(IAP)基因家族的成员存活蛋白已被发现在大多数人类癌症中高表达，其包括肺、结肠、胰腺、前列腺、乳腺、胃肿瘤等等，但在大部分正常组织中很大程度上不可检测。在人正常和癌症组织的人类转录组分析中，与正常组织相比，在通常的人癌症组织中，存活蛋白被鉴定为第四高的差别表达基因。另外，存活蛋白中的MHC限制表位被鉴定并且几次临床试验表明存活蛋白在小鼠和癌症患者中诱导抗肿瘤免疫应答的免疫原性。
一般还认为对于肿瘤疫苗，靶向多个TAAs会比靶向一个TAA更有效。在一个实施方式中，MUC1可被选为DC疫苗的第二免疫原，与存活蛋白组合使用。MUC1是高度糖基化的跨膜蛋白，具有通常在导管上皮的顶表面上表达的细胞外串联重复结构域(TRD)。TRD由可变数目(20-100)的20个氨基酸序列的重复组成。MUC1以异常的低糖基化形式在包括肺、前列腺、胃和结肠直肠癌的不同上皮恶性肿瘤中广泛地过表达，其暴露T细胞表位。MUC1在肿瘤细胞表面上表达，其可由抗体识别用于抗体-介导的肿瘤破坏。因此，本发明的靶向两个TAAs存活蛋白和MUC1的疫苗组合物可广泛地用于治疗不同类型的人类癌症，包括但不限于肺、前列腺、胃、胰腺、乳腺和结肠直肠癌。
本发明的其它实施方式可使用其它TAAs。恶性肿瘤表达多种可以充当免疫攻击的靶抗原的蛋白。这些分子包括但不限于组织特异性抗原如黑素瘤中的MART 1、酪氨酸酶和GP 100与前列腺癌中的前列酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它的靶分子属于转化相关分子组，如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胚抗原(onco-fetal antigens)如癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成该个体肿瘤独特的真正肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤靶抗原的其它候选物。这些抗原的一些(CEA、HER-2、CD 19、CD20、独特型)已经用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶，取得了有限的成功。
肿瘤抗原和其抗原癌表位可以从天然源如从原始临床分离物、细胞系等纯化和分离。癌肽和它们的抗原表位也可以通过化学合成或者通过本领域已知的重组DNA技术获得。
微生物抗原。微生物抗原可以是病毒、细菌或者真菌来源。感染性病毒的例子包括：逆转录病毒科(Retroviridae)(如人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也指HTLV-III、LAV或者HTLV-III/LAV或者HIV-III，和其它的分离物如HIV-LP)、小RNA病毒科(Picornaviridae)(如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒(enteroviruses)、人科萨奇病毒(human coxsackie viruses)、鼻病毒(rhinoviruses)、埃可病毒(echoviruses))、杯状病毒科(Calciviridae)(如，导致胃肠炎的毒株)、披膜病毒科(Togaviridae)(如马脑炎病毒(equine encephalitis viruses)、风疹病毒(rubella viruses))、黄病毒科(Flaviridae)(如登革病毒(dengue viruses)、脑炎病毒(encephalitis viruses)、黄热病毒(yellow fever viruses))、冠状病毒科(Coronaviridae)(如冠状病毒(coronaviruses))、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(如水泡性口炎病毒(vesicular stomatitisviruses)、狂犬病病毒(rabies viruses))、线状病毒科(Filoviridae)(如埃博拉病毒(ebolaviruses))、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(如副流感病毒(parainfluenza viruses)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus))、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒(influenza viruses))、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(如汉坦病毒(Hantaan viruses)、bunga病毒、白蛉病毒和内罗毕病毒(phleboviruses and Nairo viruses)、沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒(hemorrhagic fever viruses))、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(如呼肠孤病毒(reoviruses)、环状病毒(orbiviruses)和轮状病毒(rotaviruses))、双RNA病毒科(Bimaviridae)、嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)、细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒(parvoviruses))、乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒(papilloma viruses)、多瘤病毒(polyoma viruses))、腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(herpes simplex virus(HSV))1和2、水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)、疱疹病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒(variola viruses)、牛痘病毒(vacciniaviruses)、痘病毒(pox viruses))和虹彩病毒科(Iridoviridae)(如非洲猪瘟热病毒(Africanswine fever virus))与未分类的病毒(如海绵状脑病(Spongiform encephalopathies)的病原物、δ肝炎的病原物(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星病毒)、非甲型非乙型肝炎的病原物(类1＝内部传输的，类2＝非肠道传输的(即丙型肝炎)、诺沃克病毒及其相关病毒和星状病毒(astroviruses))。
感染性细菌的例子包括：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属各种(Mycobacteria sps)((如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分支杆菌(M.avium)、胞内分支杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分支杆菌(M.kansasii)、戈登分支杆菌(Mgordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A族链球菌(Group AStreptococcus))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B族链球菌(Group BStreptococcus))、链球菌(Streptococcus)((草绿色菌群(viridans group))、粪链球菌(Streptococcus faecalis )、牛链菌球菌 (Streptococcus bovis) 、链球菌(厌氧型各种)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、致病性弯曲菌属各种(pathogenic Campylobactersp.)、肠球菌属各种(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属各种(corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、巴斯德杆菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属各种(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、细弱密螺旋体(Treponemapertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)和衣氏放线菌(Actinomyces israelli)。
感染性真菌的例子包括：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)。其它的感染性生物体(即，原生生物)包括：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和弓形虫(Toxoplasma gondii)。
本发明的促炎分子
本发明的疫苗组合物进一步包括编码促炎分子的多核苷酸。促炎分子例如Toll样受体(TLR)激动剂或细胞因子刺激促炎信号转导级联反应。在一个实施方式中，提供编码TLR配体或促炎细胞因子的多核苷酸。尽管不期望被理论限制，DCs使用模式识别受体(PRR)例如TLRs来识别保守的微生物结构例如脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白、未甲基化的细菌DNA(CpG)和RNA。TLR信号传导通过激活NF-κB和MAP激酶促进DC成熟，其然后调节数百个促炎基因的上调，包括MHC分子和共刺激分子以及大量的促炎细胞因子，引起先天和适应性免疫性的诱导。然后，成熟DCs转移至引流淋巴结，在其中细胞通过形成免疫学突触建立与T细胞的接触进行T细胞活化。
存在多种免疫刺激物，例如促炎细胞因子、趋化因子和TLR激动剂，它们可与负免疫调节物的抑制剂组合使用。在一个实施方式中，促炎分子是TLR激动剂，例如鞭毛蛋白。鞭毛蛋白——其是TLR5配体——是细菌鞭毛的结构蛋白亚基并通过引起NF-κB活化具有有效的免疫调节作用。另外，由于TLR5信号传导要求它与鞭毛蛋白的表面相互作用，鞭毛蛋白基因可以可操作地连接至信号前导序列，用于分泌并随后以自分泌和旁分泌方式结合DCs上的表面TLR5以最大化它的刺激活性。在其它实施方式中，可使用细胞因子。细胞因子涉及免疫细胞活化、增殖和分化的调节。
本发明疫苗组合物的制备
在一些方面，本发明提供核酸的表达，其包括负免疫调节物的抑制剂、一个或更多个抗原和促炎分子。在每种情况下，这些可被提供为分离的核酸，其可操作地连接至包括启动子/调控序列的核酸，这样所述核酸能够指导所述核酸编码的蛋白质或RNA分子的表达。因此，本发明包括用于将外源DNA引入到细胞中的表达载体和方法，在该细胞中同时表达外源DNA，如Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和Ausubel等人(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)所述。
在一个实施方式中，本发明包括包含siRNA多核苷酸的载体。优选地，所述siRNA多核苷酸能够抑制靶多肽的表达，其中所述靶多肽选自A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4)、Foxj 1、Foxo3a、TWIST(Twist 1、Twist 2)、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7和CIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASx和PIASy)、SHP(SHP-1和SHP-2)或者它们的任意组合。期望的多核苷酸向载体中的整合和载体的选择为本领域公知，如Sambrook等人，见上述和Ausubel等人，见上述所述。
本发明的多核苷酸可以克隆到多种类型的载体中。然而，本发明不应该被解释为被任何特定的载体所限定。相反，本发明应该被解释为包括大量的、容易获得和/或者本领域公知的载体。例如，本发明的多核苷酸可以被克隆到包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和黏粒的载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
在具体的实施方式中，表达载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物细胞载体。存在包括至少部分或全部上述组合物的许多表达载体系统。基于原核生物和/或者真核生物载体的系统可以在本发明中使用以产生多核苷酸或者其关联多肽。许多这样的系统可以从商业上和广泛地获得。
而且，表达载体可以以病毒载体的形式被提供给细胞。病毒载体技术为本领域公知并被描述，如在Sambrook等人(2001)和在Ausubel等人(1997)以及在其它的病毒学和分子生物学手册中。用作载体的病毒包括但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般地，合适的载体包含在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或者更多个选择标记(见，如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
对于本发明多核苷酸的表达，每个启动子中至少有一个组件起着定位RNA合成的起始位点的作用。其最著名的例子是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子中，如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40基因的启动子，覆盖起始位点的单独元件本身有助于固定起始位置。
附加的启动子元件，即增强子，调节转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp区域，但最近已经显示许多启动子也含有位于所述起始位点下游的功能性元件。启动子元件之间的间距通常是柔性的，这样当元件相对于彼此反向或者移动时，启动子功能得以保持。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距可以增加到50bp，其后其活性才开始下降。取决于启动子，各个元件似乎可以协同或者独立地起激活转录的作用。
启动子可以是自然地与基因或者多核苷酸序列相连的启动子，其可以通过分离位于编码段和/或外显子的上游的5′非编码序列获得。这样的启动子可被称为“内源的”。同样，增强子可以是自然地与多核苷酸序列相连的增强子，其位于所述序列的上游或者下游。可选地，通过将编码多核苷酸片段置于重组或者异源启动子的控制下，将获得一些益处，重组或者异源启动子指在其自然环境下通常不与多核苷酸序列相连的启动子。重组或者异源增强子也指在自然环境下通常不与多核苷酸序列相连的增强子。这样的启动子或者增强子可以包括其它基因的启动子或者增强子，和从任何其它原核生物、病毒或者真核细胞分离的启动子或者增强子，以及非“天然存在的”启动子或者增强子，即，含有不同转录调控区域的不同元件和/或者改变表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，可以利用重组克隆和/或者包括PCR的核酸扩增技术，与本文公开的组合物结合，产生序列(美国专利4,683,202，美国专利5,928,906)。而且，考虑也可以使用指导无核细胞器如线粒体、叶绿体和类似物内的序列转录和/或者表达的调控序列。
自然地，利用对所选用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中的DNA区段的表达进行有效地指引的启动子和/或者增强子会是重要的。分子生物学领域的普通技术人员一般知道如何使用启动子、增强子和细胞类型组合来进行蛋白表达，例如见Sambrook等人(2001)。所利用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在合适的条件下用于指导引入的DNA区段高水平表达，如在大规模产生重组蛋白和/或者肽方面是有利的。所述启动子可以是异源的或者内源的。
在本文提供的实验实例中示例的启动子序列是即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强的组成型启动子序列，其能够驱动可操作地与之连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于，猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期启动子、鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV，mouse mammary tumor virus)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、Moloney病毒启动子、禽白血病病毒(avian leukemia virus)启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、Rous肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)启动子，以及人基因启动子，例如但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌肉肌酸(muscle creatine)启动子。而且本发明不应被限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑为本发明的部分。本发明的诱导型启动子的使用提供了分子开关，当需要这样的表达时，其能够打开与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者当表达不期望时，关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于，金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素(糖皮质素)启动子、孕酮(progesterone)启动子和四环素(tetracycline)启动子。进一步，本发明包括使用只在期望组织中有活性的组织特异性启动子。组织特异性的启动子为本领域所公知，包括但不限于HER-2启动子和PSA相关的启动子序列。
为了评价本发明多核苷酸的表达，引入到细胞的表达载体也可以含有选择标记基因或者报告基因或者两者，以利于从试图通过病毒载体转染或者感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它的实施方式中，选择标记可以被携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因侧翼可以有合适的调节序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记在本领域中是已知的，包括，例如抗生素抗性基因，如neo等等。
报告基因被用于鉴定潜在地转染的细胞和评价调节序列的功能性。编码容易分析的蛋白的报告基因被本领域公知。一般地，报告基因是在受体生物体或者组织中不存在或不表达的基因，其编码通过一些容易检测的性质如酶活性显示其表达的蛋白。在将DNA导入受体细胞后的合适时间，分析报告基因的表达。
合适的报告基因可以包括编码荧光素酶(luciferase)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase)、分泌的碱性磷酸酶的基因，或者绿色荧光蛋白基因(见，如Ui-Tei等人，2000FEBSLett.479：79-82)。合适的表达系统是公知的并且可以利用公知技术制备或者商业获得。利用独特的内部限制性位点或者通过非独特限制性位点的部分消化，可以产生内部缺失构建物。接着，将构建物转染到显示高水平siRNA多核苷酸和/或者多肽表达的细胞中。一般地，含有显示报告基因最高表达水平的最小5′侧翼区的构建物被鉴定为启动子。这样的启动子区域可以被连接到报告基因上，并用于评价试剂调控启动子驱动的转录的能力。
疫苗和佐剂组合物的用途
沉默和激活免疫细胞的产生
在一个实施方式中，本发明提供了用于表达细胞中负免疫调节物抑制剂、促炎分子以及任选地抗原的基于细胞的系统。所述基于细胞的系统包括细胞和一个或更多个用于表达抑制剂、促炎分子和抗原的表达载体。包括抑制剂的细胞被称为“沉默的”并且与其它未用所述抑制剂如此沉默的相同细胞相比具有增加的免疫效力。
本发明包括含有负免疫调节物抑制剂的细胞。在一方面，所述抑制剂能够抑制以下的至少一种：A20、SUMO(SUMO1，SUMO2，SUMO3和SUMO4)、Foxj 1、Foxo3a、TWIST(Twist 1，Twist 2)、SOCS(SOCS1，SOCS2，SOCS3，SOCS4，SOCS5，SOCS6，SOCS7和CIS)、PIAS(PIAS 1，PIAS3，PIASx和PIASy)、SHP(SHP-1和SHP-2)等。一方面，所述细胞可以用包括编码抑制剂的多核苷酸的载体转染。所述多核苷酸不需要被整合到细胞中。在另一个方面，所述细胞根本不需要用载体转染，相反，将所述细胞暴露于不由载体表达的抑制剂中。这样的抑制剂的一个例子是化学合成的siRNA。
本发明进一步包括已经暴露于抗原或者另外地用抗原“脉冲”并被抗原活化的细胞。例如，APC可以通过例如在抗原存在下离体培养在体外成为Ag负载的，或者通过暴露于抗原在体内成为Ag负载的。
本领域普通技术人员还应容易理解，APC可以以这样的方式被“脉冲”：将APC暴露于抗原一段时间，该时间足以促进该抗原在APC表面的呈递。例如，APC可以被暴露于被称为抗原肽的小肽片段形式的抗原，所述抗原肽被直接脉冲到APC的外面(Mehta-Damani等人，1994)；或者将APCs与全蛋白或者蛋白颗粒温育，这些全蛋白或者蛋白颗粒接着被APC摄取。这些全蛋白被APC消化为小的肽段，并且最后被运输和呈递到APC表面(Cohen等，1994)。肽形式的抗原可以通过本文所述的标准“脉冲”技术暴露于细胞。
在本发明的进一步的实施方式中，可以用允许通过APC表达特定蛋白的载体转染所述APC。通过APC表达的蛋白接着可以被加工并在MHC受体上呈递在细胞表面上。转染的APC接着可以被用作免疫原组合物，以对载体编码的蛋白质产生免疫应答。
不希望束缚于任何具体的理论，外来或者自身抗原形式的抗原通过本发明的APC加工，以保留抗原的免疫原性形式。抗原的免疫原形式意味着通过碎裂加工抗原，以产生可以被免疫细胞识别并刺激免疫细胞如T细胞的抗原形式。优选地，这样的外来或者自身抗原是通过APC被加工成肽的蛋白。通过APC产生的相关肽可以被提取和纯化，以用作免疫原性组合物。通过APC加工的肽也可以被用于诱导对通过APC加工的蛋白质的耐受性。
认为自身免疫性疾病是由于针对“自身蛋白(self-protein)”的免疫应答，自身蛋白另外也称为自身抗原，即，个体中存在的或者内源性的自身抗原。在自身免疫性应答中，这些“自身蛋白”被呈递到T细胞，这导致所述T细胞“自反应(self-reactive)”。根据本发明所述的方法，用抗原脉冲APC以产生相关的“自身肽(self-peptide)”。对每个个体，相关的自身肽是不同的，因为MHC产物是高度多态的并且每个个体MHC分子可能结合不同的肽片段。然后，所述“自身肽”和细胞因子信号传导抑制剂的激动剂可以被用来设计竞争性肽或者在需要治疗的个体中诱导对自身蛋白的耐受性。
本发明的抗原活化的APC，另外被称为“脉冲的APC”，通过在体外或者体内将所述APC暴露于抗原而产生。在APC被体外脉冲的情况下，将所述APC铺板在培养皿上，并且以足够的量和足够的时间暴露于抗原，以允许抗原与所述APC结合。实现抗原与APC结合所需要的量和时间可以通过利用本领域已知的或者本文另外公开的方法确定。本领域普通技术人员已知的其它方法，例如免疫分析或者结合分析，可以被用于检测抗原在暴露于所述抗原后的APC上的存在。
在表达载体的情况下，所述载体通过本领域任何的方法可以容易地导入到宿主细胞如哺乳动物、细菌、酵母或者昆虫细胞中。例如，表达载体通过物理的、化学的或者生物学的方法可以被转移到宿主细胞中。容易理解的是，包括本发明的多核苷酸的表达载体的引入就负免疫调节物而言产生了沉默细胞。
将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀(calcium phosphateprecipitation)、脂质转染(lipofection)、粒子轰击(particle bombardment)、显微注射(microinjection)、电穿孔(electroporation)和类似方法。产生包括载体和/或者外源核酸的细胞的方法为本领域公知。例如，见Sambrook等人(2001，MolecularCloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和Ausubel等人(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)。
将感兴趣的多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体尤其是逆转录病毒载体已经成为将基因插入到哺乳动物如人细胞中的最广泛使用的方法。其它的病毒载体可以来自慢病毒、痘病毒(poxvirus)、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒和类似物。例如，见美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸导入宿主细胞的化学工具包括胶体分散体系(colloidal dispersionsystems)，如大分子复合物、纳米囊、微球体、珠子和脂质基系统，包括水包油乳状液、胶束、混合的胶束和脂质体。用作体内和体外输送载体的优选的胶体系统是脂质体(即，人工膜囊泡)。这样的系统的制备和使用为本领域公知。
不管使用什么方法将外源核酸导入宿主细胞或者以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了确定重组DNA序列存在于宿主细胞中，可以进行多种分析。这样的分析包括，例如本领域普通技术人员公知的“分子生物学”分析，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”分析，如，例如通过免疫学方法(ELISAs和蛋白质印迹法)或者本文所述的分析方法，检测具体肽的存在或者不存在，以确定落入本发明范围内的试剂。
为了产生沉默的和激活的细胞，可以使用任何的DNA载体或者输送载体以将期望的多核苷酸体内或者体外运输到免疫细胞中。在使用非病毒输送系统的情况下，优选的输送载体是脂质体。因此上述的输送系统和方案可以在Gene TargetingProtocols，2ed.，pp 1-35(2002)和Gene Transferand Expression Protocols，Vol.7，Murray ed.，pp 81-89(1991)中发现。
脂质配制物的使用被考虑，用于将编码负免疫调节物的抑制剂、促炎分子和/或抗原的多核苷酸导入宿主细胞(体外、离体或者体内)。在本发明的具体实施方式中，所述多核苷酸可以与脂质连接。与脂质连接的多核苷酸可以被包封在脂质体的水相内部、被散布在脂质体的脂双层中、通过与脂质体和寡核苷酸二者连接的连接分子结合到脂质体上、被夹带在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬液包含在脂质中、包含或复合于胶束、或者以其它方式与脂质连接。本发明的与脂质、脂质/多核苷酸或者脂质/表达载体相连的组合物不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可以存在于双层结构中，作为胶束或者具有“坍缩(collapsed)”结构。它们也可以仅仅被散布于溶液中，可能形成大小或者形状不均匀的聚集体。
脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或者合成的脂质。例如，脂质包括在细胞质中天然存在的脂肪滴，以及本领域普通技术人员公知的含有长链脂族烃和它们的衍生物如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类。
磷脂可以用于制备本发明所述的脂质体并且可以携带净正、负或者中性电荷。可以利用二乙酰磷酸酯将负电荷赋予脂质体上，并且可以使用硬脂胺将正电荷赋予脂质体上。脂质体可以由一种或者更多种磷脂构成。
带中性电荷的脂质可以包括不带电荷的脂质、基本不带电荷的脂质或者具有同样数量的正和负电荷的脂质混合物。合适的磷脂包括本领域普通技术人员公知的磷脂酰胆碱和其它物质。
适合于本发明的用途的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(dimyristyl phosphatidylcholine)(“DMPC”)可以从Sigma，St.Louis，MO ChemicalCo.获得；联十六烷基磷酸酯(dicetyl phosphate)(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇(cholesterol)(“Chol”)可以从Calbiochem Behring获得；二肉豆蔻磷脂酰甘油(dimyristyl phosphatidylglycerol)(“DMPG”)和其它的脂质可以从Av抗Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL.)获得。在氯仿或者氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可以贮存在约-20℃。优选地，氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易挥发。
细胞疫苗
在一个实施方式中，可以从培养物、组织、器官或者生物体中分离细胞并作为细胞疫苗转染并施用给哺乳动物。因此，本发明考虑“细胞疫苗(celluar vaccine)”。当然，该细胞也可以表达一种或者更多种附加疫苗组分，如免疫调节剂或者佐剂。疫苗可以包括细胞的全部或者部分。在合适的实施方式中，本发明的细胞疫苗包括人APC，在更优选的实施方式中，所述APC是DC。
细胞疫苗可以包括根据本发明已被沉默以提高其免疫效能的APC。免疫效力可进一步通过用编码促炎分子(例如TLR激动剂)的多核苷酸转染细胞来增强。沉默的APC接着可以用编码抗原的核酸转染以产生抗原负载细胞。基于本公开内容，使用任何类型的抗原，通过任何方法可以将沉默的APC脉冲使其负载抗原。另外，在APC沉默之前、同时或者之后，可通过任何方法将APC脉冲。
如本文其它地方所公开，可以使用各种方法用抗原脉冲细胞。本发明的抗原含有至少一个表位，其中所述表位能够诱发哺乳动物的免疫应答。在一个实施方式中，抗原通过表达载体表达。在另一个实施方式中，抗原是分离的多肽。优选地，抗原与选自感染性疾病、癌和自身免疫性疾病的疾病有关。用于脉冲本发明的细胞的许多优选抗原在本文的其它地方被公开。所述抗原可以为下面的至少一种或者更多种形式：肿瘤裂解物、蛋白质、肽、mRNA、DNA、载体表达物、脂质体等。
已经被负免疫调节物抑制剂沉默的APC具有提高的免疫效能并因此诱发增强的免疫应答，即增强的呈递抗原和激活对抗原免疫应答的能力。与未被沉默的其它地方相同的APC相比，本发明所述的已经被沉默和脉冲的APC能够刺激效应T细胞和诱发对抗原的增强的免疫应答。
治疗组合物和方法
本发明包括用于提高免疫细胞如APC的免疫效能的组合物。对APC呈递的抗原的应答可以利用本领域已知的方法，通过监测溶细胞性T细胞应答、辅助性T细胞应答和/或者抗体对抗原的应答的诱导而加以测定。
本发明包括增强哺乳动物的免疫应答的方法，其包括将一个或者更多个细胞与抗原组合物接触的步骤。基于本公开内容，细胞可通过暴露于负免疫调节物的抑制剂而被沉默以及通过编码促炎分子的多核苷酸的表达而被激活，由此暴露于抑制剂和促炎分子提高细胞的免疫效能。在细胞暴露于抗原组合物以另外地脉冲细胞之前、同时或者之后，利用本文公开的方法可以沉默细胞。
增强的免疫应答可以是主动或者被动的免疫应答。所述应答可以是过继性免疫治疗方法的一部分，在该方法中APCs如树突细胞、B细胞或者单核细胞/巨噬细胞从哺乳动物(如患者)获得，接着用包括抗原组合物的组合物脉冲(在将所述细胞暴露于负免疫调节物的抑制剂以另外沉默所述免疫细胞之前、同时或者之后)，再接着将APC施用至需要的哺乳动物。
所述组合物包括下列至少一种或者更多种的任意结合：负免疫调节物的抑制剂、促炎分子、抗原、沉默的免疫细胞、脉冲的细胞以及也用抗原脉冲的沉默的免疫细胞。所述组合物可以是用于哺乳动物的离体(先体外后体内，ex vivo)免疫和/或者体内治疗的疫苗。优选地，所述哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞给予哺乳动物前，至少下列的一种在体外发生：i)沉默所述细胞、ii)脉冲所述细胞、iii)通过促炎分子对细胞的激活和/或iv)沉默、脉冲和激活所述细胞。应该理解，在用抗原处理APC以脉冲该免疫细胞之前、同时或者之后，本发明的免疫细胞(即APC)可以利用本文其它地方公开的方法被沉默。
离体程序为本领域所公知，并将在下面更充分论述。简而言之，从哺乳动物(优选地为人)分离细胞，并用负免疫调节物的抑制剂或者本文公开的其它形式的负免疫调节物(即化学合成的siRNA)将其沉默。可以使用促炎分子(例如TLR激动剂，例如鞭毛蛋白)进一步将沉默的细胞激活。可用抗原组合物进一步将沉默的细胞脉冲。可以将沉默的或脉冲的细胞施用至哺乳动物受体，以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且这样沉默的细胞对受体来说可以是自身的。可选地，对受体来说，所述细胞可以是同种异体的、同系基因的或者异种的。
美国专利号5，199,942描述了造血干细胞和祖细胞的离体扩增程序，其可以应用于本发明的细胞。其它合适的方法为本领域所知，因此本发明不限于任何具体的细胞离体扩增的方法。简而言之，DCs的离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物的外周血采集物或者骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这样的细胞。除了美国专利号5，199,942描述的细胞生长因子，其它的因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可以被用于培养和扩增细胞。
已知多种细胞选择技术被用于从细胞群中鉴定和分离CD34+造血干细胞或者祖细胞。例如，单克隆抗体(或者其它特异性细胞结合蛋白)可以被用来结合在干细胞或者祖细胞上发现的标记蛋白或者表面抗原蛋白。造血干细胞的几个这样的标记或者细胞表面抗原(即，flt-3、CD34、My-10和Thy-1)被本领域已知。
收集的CD34+细胞用合适的细胞因子培养。接着使CD34+细胞分化和定向为树突谱系细胞。这些细胞接着通过流式细胞术或者相似的方法，利用树突细胞的标记特性，如CD1a、HLA DR、CD80和/或者CD86被进一步纯化。分离培养的DCs后，可根据本发明的方法将所述细胞修饰。可选地，所述祖细胞在分化为DC样细胞前可以被修饰。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗外，本发明也提供用于体内免疫的组合物和方法，以在患者中诱发针对抗原的免疫应答。
关于体内免疫，本发明提供了使用负免疫调节物的抑制剂，作为通过失活APC的关键调控点而提高疫苗效能的一般方法。同样地，用于体内免疫的疫苗至少包括抑制剂组分，其中所述抑制剂组分能够抑制负免疫调节物。在另一个方面，所述疫苗包括抑制剂组分、促炎组分和抗原组分，其中所述抗原组分能够诱发哺乳动物的免疫应答。
关于体内免疫，从患者获得的细胞在体内被转染或者转导，以另外地产生沉默的细胞。所述细胞在体内被表达细胞因子调控因子的抑制剂的载体沉默。可选地，使用本文公开的、非载体表达的、任何其它形式的负免疫调节物的抑制剂(即化学合成的siRNA)沉默所述细胞。本文论述了体内产生沉默细胞的方法。
所述疫苗的另外方面包括用于体内脉冲细胞的抗原组分。任何抗原可以与本发明的负免疫调节物的抑制剂结合给药。在用包括抑制剂的疫苗沉默细胞之前、同时和之后，使用本文其它地方所述的方法可以脉冲细胞。容易理解的是，在细胞被同时脉冲和沉默的情况下，可以用包括抑制剂和抗原的单个疫苗免疫哺乳动物。可选地，可以用两个单独的疫苗免疫哺乳动物，一个疫苗包括抑制剂，第二个疫苗包括抗原。
本发明包括对癌和感染性疾病进行体内免疫。在一个实施方式中，紊乱或者疾病可以通过体内给予负免疫调节物抑制剂和促炎分子结合抗原以在患者中产生针对抗原的免疫应答而进行治疗。基于本文的公开内容，负免疫调节物的抑制剂(例如，对于A20、SUMO(SUMO1，SUMO2，SUMO3和SUMO4)、Foxj 1、Foxo3a、TWIST(Twist 1，Twist 2)、SOCS(SOCS1，SOCS2，SOCS3，SOCS4，SOCS5，SOCS6，SOCS7和CIS)、PIAS(PIAS1，PIAS3，PIASx和PIASy)、SHP(SHP-1和SHP-2)或者它们任意组合，为siRNA)结合抗原配制物的给药提高了不使用负免疫调节物的抑制剂但其它方面相同的接种方案的效能。不希望束缚于任何具体的理论，认为对患者抗原的免疫应答取决于(1)给予的负免疫调节物抑制剂和/或促炎分子，(2)给药的持续时间、剂量和频率，(3)患者的总体情况，和如果适合的话(4)给予的抗原组合物。
在一个实施方式中，哺乳动物具有表达肿瘤特异性抗原的癌类型。根据本发明，可以制备包括肿瘤特异性抗原序列组分的免疫刺激性蛋白。在这样的情况下，可以将负免疫调节物抑制剂与促炎分子(例如TLR激动剂)结合施用至需要的患者，引起对患者改进的治疗效果，显示为例如癌细胞或者表达肿瘤特异性抗原的实体瘤生长变慢或者缩小，或者癌细胞总数目或者总肿瘤负荷减少。
在相关的实施方式中，患者已经被诊断患有与特定抗原如病毒抗原的表达相关的病毒、细菌、真菌或者其它类型的感染。根据本发明，可以制备包括由抗原如HIV特异性抗原组成的序列组分的蛋白。在这样的情况下，将负免疫调节物抑制剂和促炎分子与蛋白抗原结合施用至需要的患者，引起对患者改进的治疗效果，显示为患者体内的原因性感染因子生长变慢和/或与特定感染性疾病通常相关的可检测症状减少或者消除。
在任一情况下，可以通过将负免疫调节物的抑制剂结合抗原给予需要的患者来治疗紊乱或者疾病。本发明提供了在患者中针对抗原产生保护性DC诱导的免疫应答的方法。
药物组合物的剂量和制剂
本发明期望通过给予本发明的疫苗和佐剂组合物来治疗哺乳动物中的疾病，例如HCV感染、癌症等等。根据本发明的疫苗施用可以是连续的或者间断的，这取决于例如接受者生理状况、给药的用途是治疗还是预防和熟练从业人员已知的其它因素。疫苗施用可以在预选的时间内基本连续或者可以是系列的间隔剂量。局部和系统给药都被考虑。施用的量将取决于各种因素变化，包括但不限于所选择的组合物，具体的疾病，哺乳动物的体重、身体状况和年龄以及要实现预防还是治疗。应用动物模型或者本领域公知的其它检测系统的临床人员容易确定这样的因素。
本发明的疫苗组合物可包括核酸。核酸的药学制剂、施用剂量和途径一般公开在例如Felgner等人，1987，PNAS 84：7413-7417中。在一个实施方式中，核酸被直接施用至患者，例如施用至肿瘤位点或使用一个或更多个靶向剂的组合将核酸靶向至免疫细胞。在另一个实施方式中，核酸与从对象分离的免疫细胞接触，并且转染的细胞被引入患者。
当制备本发明的疫苗进行施用时，它们优选地与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合以形成药学制剂或单位剂量形式。这些制剂中的总活性成分占按制剂重量计0.1至99.9％。“药学上可接受的”物质是与制剂的其它组分相容并且不对其受体有害的载体、稀释剂、赋形剂和/或者盐。给予的活性成分可以以粉末或者颗粒、溶液、悬浮液或者乳状液存在。
含有本发明的治疗剂的药学制剂可以通过本领域已知的方法，利用公知的和容易获得的成分制备。本发明的治疗剂也可以配制成适合于胃肠外给药如通过肌肉内、皮下或者静脉内途径给药的溶液。本发明治疗剂的药物制剂也可以采用水的或者无水的溶液或者分散体的形式，或者可选地采取乳状液或者悬浮液的形式。
本发明的表达载体、转导细胞、多核苷酸和多肽(有效成分)可以被配制，并通过使有效成分与生物体内的药剂作用部位接触的任何方法施用以便治疗多种疾病状态。它们可以通过可用于结合药物的任何常规方法，以单独的治疗有效成分或者治疗有效成分的结合进行给药。虽然它们可以单独给药，但是通常与药物载体一起给药，药物载体基于所选择的给药途径和标准的药学实践进行选择。
一般地，水、合适的油、盐水、含水右旋糖(葡萄糖)和相关的糖溶液与二醇类如丙二醇或者聚乙二醇是胃肠外溶液的合适载体。用于胃肠外给药的溶液含有有效成分、合适的稳定剂，和如果需要则含有缓冲物质。抗氧化剂如硫酸氢钠、亚硫酸钠或者抗坏血酸——单独或者结合地——是合适的稳定剂。也用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸(EDTA)钠。另外，胃肠外溶液可以含有防腐剂如苯扎氯铵、对羟苯甲酸甲酯或者对羟苯甲酸丙酯和氯代丁醇。本领域的标准参考手册Remington′s Pharmaceutical Sciences描述了合适的药物载体。
另外，可以使用标准的药学方法控制作用持续时间。这些是本领域公知的，其包括控释制剂和可以包括合适的大分子，例如，聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或者硫酸鱼精蛋白。可以调整大分子的浓度以及包含方法以控制释放。另外，药剂可以包含到高分子材料如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或者乙烯乙酸乙烯酯共聚物的颗粒中。除了被包含外，也可以用这些药剂截留微囊中的化合物。
核酸施用至免疫细胞。本领域普通技术人员认识到，可以使用不同的输送方法将载体施用至细胞中。例子包括：(1)利用物理手段的方法，如电穿孔(电力)、基因枪(物理力)或者利用大体积的液体(压力)；和(2)其中所述载体被复合到另一个实体如脂质体、聚集蛋白或者转运分子的方法。
而且，实际的剂量和方案可以根据组合物是否与其它药物组合物结合给药或者根据药物动力学、药物分布和代谢的个体差异而变化。相似地，体外施药的量可以根据所用的具体细胞系而变化(如，基于细胞表面存在的载体受体的个数，或者用于基因转移的具体载体在细胞系中复制的能力)。而且，每个细胞施加的载体的量可能随插入到载体中的基因(一个或更多个)的长度和稳定性变化，也随序列的性质而变化，并且其特别是一个需要根据经验确定的参数，而且可以由于本发明方法的非固有的因素(例如，与合成相关的费用)而改变。本领域普通技术人员能够容易地根据具体情况的迫切性做出任何必要的调整。
实验动物模型
本发明的方法和组合物对于引发免疫应答具有有益作用，例如在癌症或病原体感染治疗中。大量癌症动物模型是已知的，其可用于选择合适剂量或施用方法用于实施方法或使用本发明的组合物。
在啮齿类动物中用前致癌剂1，2-二甲肼及其代谢物氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)诱导的结肠腺癌是良好表征的致癌剂诱导的肿瘤，这是由于它与人结肠癌的形态学相似性、高繁殖性和相对短的潜伏期(Shamsuddin，(1986)Human Path.17：451-453)。该啮齿类动物肿瘤模型不但它的形态学(Shamsuddin&Trump，(1981)J. Natl.Cancer Inst.66：389-401)而且涉及肿瘤发生的基因(Shivapurkar等人，(1995)Cancer Lett.96：63-70；Takahashi等人，(2000)Carcinogenesis 21：1117-1120)均与人结肠腺癌相似。
除了啮齿类动物结肠癌的化学致癌剂诱导模型，磷酸肌醇-3-OH激酶催化亚基(PI3-Kγ)的(Sasaki等人，(2000)Nature 406：897-902)或鸟苷-结合蛋白Gai2(Rudolph等人，(1995)Nat.Genet.10：143-50)的基因破坏导致啮齿类动物的自发结肠癌。这些研究显示，除了原型肿瘤阻抑蛋白基因和癌基因中的改变之外的可能原因可涉及人结肠癌的病原学。
口腔鳞状细胞癌的大量动物模型已被发展，其包括大鼠、小鼠和仓鼠模型。用致癌剂7，12-二甲基苯并蒽诱导的仓鼠颊囊肿瘤模型仍是最常用的模型之一(Baker(1986)Malignant neoplasms of the oral cavity.In：Otolaryngology-Head andNeck Surgery，Cummings等人(eds.)pp.1281-1343.St.Louis，Mo.：CV Mosby)，但显示与人口腔肿瘤发生的大量差异。最近，已发展使用致癌剂4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)的小鼠模型，其更接近地模拟了人口腔癌和食道癌发生的许多方面(Tang等人(2004)Clin.Cancer Res.10：301-313)。
多发性骨髓瘤的动物模型已被描述(Garrett等人(1997)Bone 20：515-520)，其使用鼠骨髓瘤细胞系5TGM1，其在被注射至小鼠中时导致人骨髓瘤特有的损伤。这些损伤包括严重的骨质溶解并涉及非骨器官，包括肝和肾。用培养的5TGM1细胞接种的小鼠可预见地并可重现地引起疾病，其症状包括单克隆γ-球蛋白病和放射骨损伤的形成。
存在用于神经胶质瘤研究的大量动物模型，其包括脑内大鼠神经胶质瘤模型(Sandstrom等人(2004)Br.J. Cancer，91：1174-1180)和使用源自狗的J3T1神经胶质瘤细胞注射的鼠模型(美国专利号6,677,155)。
用于研究非小细胞肺癌的动物模型已在先描述，举例来说，通过将LC-6人非小细胞肺癌皮下移植至BALB/C-nu/nu小鼠来进行异种移植人肿瘤(Tashiro等人(1989)Cancer Chemother.Pharmacol.24，187)。
用于胃癌研究的动物模型已被描述，其在裸鼠中使用AZ-521人胃癌异种移植物(Fukushima等人(2000)Biochem.Pharmacol.59，1227-1236)。
多种AML动物模型已在以往被描述，其包括大鼠(Blatt，J等人(1991)Leuk.Res.15：391-394)和SCID小鼠(Vey，N.等人(2000)Clin.Cancer Res.，6：731-736)。
大量用于HCC研究的动物模型已被描述(Chisari等人，(1985)Science 230：1157-1160；Babinet等人(1985)Science 230：1160-11；美国公开号2004/0016011)。这些参考公开了通过将HBV病毒并入基因组产生HCC转基因小鼠模型。
具有实验转移模式的动物模型，所述模式与在人类患者中通常观察到的类似(Engebraaten&Fodstad，(1999)Int.J. Cancer.82：219-25)，其利用MA-11和MT-1——两种雌激素和孕酮受体-阴性人乳腺癌细胞系。乳腺癌的其它模型包括美国公开号2003/0215861(通过引用并入本文)。可选地，本发明的化合物单独或与其它药剂组合发挥抗乳腺癌药剂作用的能力可在野生型Sprague-Dawley大鼠中致癌剂诱导的乳腺肿瘤中在体内证实(Thompson H.J等人，Carcinogenesis，(1992)13：1535-1539)。
卵巢癌的大量动物模型是本领域已知的。举例来说，Connolly等人((2003)Cancer Research，63，1389-1397)公开了通过在MISIIR启动子的控制下嵌合表达SV40Tag在小鼠中发展上皮卵巢癌的方法。在另一个实例中，Liu等人(CancerResearch 64，1655-1663(2004))已将人HRAS或KRAS癌基因引入永生化人卵巢表面上皮细胞，其在注射至无免疫应答的小鼠后形成皮下肿瘤。
研究前列腺癌的多种动物模型是可利用的。利用被引入SCID小鼠中的前列腺癌异种移植物的一种鼠类模型在美国专利号6,756,036中公开。可选地，转移性前列腺癌的原位小鼠模型可使用，如美国公开号2004/0009508公开的。
实施例
本发明通过下列实施例被进一步说明，其不应被解释为以任何方式进行限制。实施例1描述了在实施例2至7中用于制备和测试本发明不同实施方式的材料和方法。
实施例1-材料和方法
细胞培养。人胚胎肾细胞系293在补充10％热灭活的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、100U/mL青霉素、100μg/mL抗霉菌剂和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的气氛下培养。人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MD-231、人肾癌细胞系A498和人卵巢癌细胞系SK-OV-3(ATCC)在37℃维持在含有10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL抗霉菌剂和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中。
SOCS1下调和免疫印迹分析。为了评价由siRNA引起的人SOCS1下调，计算机程序(www.dharmacon.com)用于选择靶向人SOCS1的siRNA序列。合成三条寡核苷酸：siRNA1(SEQ ID NO：5)、siRNA2(SEQ ID NO：6)和siRNA3(SEQ ID NO：7)。使用![]()
试剂，按照厂商方案(Genlantis，San Diego，CA)，将293T细胞用合成的siRNA寡核苷酸双链体或不相关的乱序寡双链体和flag-标记的人SOCS1表达载体(pCMVhSOCS1)共转染(Shen等人，Nat Biotechnol，22：1546-1553，2004)。简言之，将3μL20μM寡核苷酸溶液添加至3μLGenePorter试剂和94μL无血清RPMI1650中。将混合物在25℃温育30分钟，然后将100μL的GenePorter/寡核苷酸混合物添加至每个PBMC-DCs孔并在37℃温育4h。温育后，将500μL每孔的补充20％FBS的RPMI1640添加至PBMC-DCs。
对于免疫印迹分析，在转染后48小时收获细胞并进行SDS-PAGE，然后转移至Hybond-P膜(Amersham，Piscataway，NJ)。初次抗体(一抗)山羊抗人存活蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)、小鼠抗人MUC1(SeroTec，Oxford，UK)和兔抗沙门氏菌H:I抗体(Santens Serum Institute)用于分别检测存活蛋白、MUC1和鞭毛蛋白的表达水平。小鼠单克隆抗体抗Flag(Sigma，St.Louis，MO)用于检测Flag-SOCS1表达(Shen等人，Nat Biotechnol，22：1546-1553，2004)。用适合的HRP-偶联的抗山羊、抗小鼠或抗兔IgG探测每个印迹然后用ECL-Plus试剂(Amersham，Piscataway，NJ)检测来对结合的一抗进行检测。用Densitometer SI扫描膜并用ImageQuant软件(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)定量条带。条带的亮度针对β-肌动蛋白条带的亮度进行标准化。
定量RT-PCR分析。通过定量实时RT-PCR来评价人SOCS1在人DCs中的相对表达。简言之，使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从3.5-5×105BM-DC中提取总RNA。用随机六聚体引物和SuperScript First-Strand Synthesis试剂盒(InVitrogen，Carlsbad，CA)对每个样品的一微克(1.0μg)总RNA进行逆转录。实时5’-核酸酶荧光PCR分析在ABI 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)上以20μl的四个平行反应进行，每个反应用相等的5ng的起始RNA材料作为模板。用于小鼠SOCS1的预形成的引物/探针组(6FAM)和18S核糖体对照(VIC)购自Applied Biosystems(SOCS1的引物：5′-ACCTTCTTGGTGCGCGAC-3′(SEQ ID NO：161)和5′-AAGCCATCTTCACGCTGAGC-3′(SEQ ID NO：162)，以及杂交探针，5-6FAM-TCGCCAACGGAACTGCTTCTTCG-TAMRA-3′(SEQ ID NO：163)。PCR参数如TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)建议，SOCS1和18S反应在单独的管中进行。SOCS1水平针对18S rRNA标准化，以及SOCS1相对于模拟转染(mock-transfected)的被刺激DCs对照的水平用比较ΔΔCt方法(Shen等人，Nat Biotechnol，22：1546-1553，2004)计算。
重组复制缺陷型腺病毒的产生。AdEasy系统(E1和E3缺失；QuantumBiotechnologies Inc.，Palo Alto，CA)用于构建和产生复制缺陷型腺病毒，如前所述(Ren等人，Cancer Res，64：6645-6651，2004)。DN截短的人存活蛋白突变体基因通过使用Thr34-Ala突变体hSVNT34A(Mesri等人，.JClin Invest，108：981-990，2001)为模板用一对引物P-SF(5′-GAGTCGACATGAAGGACCACCGCATCT-3′，SEQ IDNO：164)和P-SR(5′-ACCAAGCTTATCCATGGCAGCCAGCTG-3′，SEQ IDNO：165)进行PCR产生。含有人MUC1三个重复MUC1序列的寡核苷酸双链体用引物P-MF(5′-ATTAACAAGCTTGGTGTCACCTCGGC-3′，SEQ ID NO：166)和P-MR(5′-TTAATTGCGGCCGCTTAGTGGGCTG-3′，SEQ ID NO：167)通过Operon和PCR扩增而合成，以添加克隆位点Hind III和Not I。扩增的存活蛋白和MUC1片段用限制酶HindIII消化并在室温连接1h。然后，DN存活蛋白突变体-MUC1融合片段用引物(P-SF和P-MR)通过PCR扩增，以产生含有5′末端SalI限制位点和3′末端NotI位点的DN存活蛋白突变体-MUC1片段。具有人酪氨酸酶信号前导序列的修饰的鞭毛蛋白(fliC)基因使用肠沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)(ATCC)为模板、用一对引物(5′-TAGTCGACCTCGAGATGCTCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAGACCTCCGCTGGCCATTTCCCTAGAATGGCACAAGTCATTA-3′，SEQ IDNO：168和5′-GGCTCTAGAGCGGCCGCTTAACGCAGTAAAGAGAGG-3′，SEQ IDNO：169通过PCR进行扩增。
脑心肌炎病毒IRES序列从Huang等人产生的pShuttle-CMV-HSPIRES-E1A载体(Cancer Res，63：7321-7329，2003)用引物(5′-AATTGCGGCCGCTAAATTCCGCCCCTCT-3′，SEQ ID NO：170和5′-GGCCTCGAGTGTGGCCATATTATCATCG-3′，SEQ ID NO：171)扩增。存活蛋白-黏蛋白-IRES片段通过连接NotI消化的存活蛋白-黏蛋白片段和IRES片段进行构建。产生的穿梭载体pshuttle-siSSF通过将SalI/Xhol消化的存活蛋白突变体-MUC1-IRES片段插入Sal I/Xho l-消化的pshuttle-SF载体中进行构建，所述pshuttle-SF载体之前通过将修饰的分泌型鞭毛蛋白插入XhoI/Xbal-消化的pshuttle-hSOCS1载体中而构建。pshuttle-hSOCS1载体通过将从pSuper-hsiS1载体PCR-扩增的人H1RNA启动子、人SOCS1-siRNA和转录终止序列插入Ad pshuttle载体中而产生。然后，根据制造商说明书，产生含有H1RNA启动子(来自pSuper载体)控制下的人SOCS1siRNA和CMV启动子控制下的连接至具有脑心肌炎病毒IRES序列的修饰的鞭毛蛋白的DN人存活蛋白突变体-MUC融合基因的重组复制缺陷型Ad-siSSF病毒。重组Ad病毒中这些基因片段的插入通过PCR和DNA测序证实。根据制造商说明书(Quantum Biotechnologies Inc.，Palo Alto，CA)，在293细胞中产生重组腺病毒并对其滴定。
从外周血单核细胞(PBMC)产生人DC和Ad转染。如Schroers等人所述所述，产生来自人PBMCs的DCs(Schroers等人，Methods Mol Biol，246：451-459，2004；Schorers等人，Clinical Can Res，9：4743-4755，2003)。简言之，PBMCs通过对获自the Gulf Coast Regional Blood Bank of Houston的健康供体的血沉棕黄层制备物的肝素化血液进行Ficoll-paque(GIBCO-BRL，Grand Island，NY)密度梯度离心来分离。将培养基中的细胞以每毫升5×106的细胞密度接种在150-mm细胞培养板中。在37℃温育3小时后，未贴壁细胞被去除并以每毫升1×106冷冻用于以后使用。贴壁血单核细胞在添加人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF，1,000U/mL，R&D Systems，Minneapolis，MN)和白细胞介素-4(rhlL-4，1,000U/ml，R&DSystems，Minneapolis，MN)的CellGro DC培养基(Freiburg im Breisgau，Germany)中培养。rhGM-CSF和rhIL-4每三天补充一次。在第5天，收获PBMC衍生的DCs，以每毫升1×106的细胞密度再接种在12孔培养板上，然后在无血清RPMI1640培养基中用不同MOIs的Ad载体转染1.5h，然后在添加1000U/rnL rhIL4和1000U/mL rhGM-CSF的DC培养基中温育48小时。收获Ad-转染的DCs并用无血清RPMI1640培养基洗涤用于进一步研究。
流式细胞分析。DCs和T细胞的表型通过流式细胞分析测定。针对人CD40(B-ly6)、CD80(L307.4)、CD86(2331)、HLA-DR(TU39)、HLA-A2(BB7.2)、CD11c(B-ly6)(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)、OX40配体(OX40L)(ANC 10G1)、GITR配体(GITRL)(109101)、和CCR7受体(150503)(R&D Systems)的异硫氰酸荧光素(FITC)-、藻红蛋白(PE)-和(APC)-偶联的单克隆抗体(Mabs)，以及匹配的同种型对照用于DCs的多色染色。针对人CD4(RPA-T4)、CD8(G42-8)和IFN-γ(4S.B3)的FITC-或PE-偶联的MAbs(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)用于染色T细胞。DC存活率用抗膜联蛋白V染色(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)测定。小鼠抗人CD227(MUC1，Clone C595，Serotec，Oxford，UK)用于染色人肿瘤细胞系。细胞在含有2％FCS和0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液中洗涤并悬浮。
对于直接染色，细胞在200μg/mL多克隆人IgG(Sigma，St.Louis，MO)中在冰上预温育10分钟。添加特定标记的Mabs或适合的同种型对照，细胞进一步在冰上温育25分钟。对于间接染色，细胞在与抗人CD227Ab温育之前与200μg/mL多克隆人IgG预温育。特定Mab用FITC标记的山羊抗小鼠Ab(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)显示。无一抗而用FITC标记的山羊抗小鼠Ab的染色通常在单独的管中作为对照进行。然后，在FACSaria(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)上用FloJo软件分析染色的细胞。ELISA和细胞因子抗体阵列分析：DC培养物中细胞因子和趋化因子的浓度通过可购得的BD Bioscience的两点夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)(IL-6、IL-12、IL-10、TNF-α、IFN-γ和Rantes)根据制造商说明书测量(Evel-Kabler等人，J Clin Invest，116：90-100，2006)。![]()
人细胞因子抗体阵列3(Ray Biotech，Norcross，GA)用于根据制造商说明书检测DCs培养基中42种人细胞因子和趋化因子的相对水平。
趋化性分析。DC迁移使用transwell系统(24孔板；8μM孔大小；Costar，Corning，NY)(Giordano等人，Blood，107：1537-1545，2006.)测量。收集用不同Ad载体转染48小时的人PBMC衍生的DCs并接种至24孔transwell板(5μM孔大小)的上层室中(每孔100μL，1×105个细胞)。五百微升(500μL)含有100ng/ml CCL21(Genetex，San Antonio，TX)的DC培养基或只有培养基被铺在下层室中。只含有培养基的孔用做自发迁移对照。在37℃培养3小时后，收集下层孔中的500μL培养基并用FACS收集50秒计算细胞数量。该计数落入通过测试细胞增加的浓度获得的对照滴度曲线的线性范围。自发迁移细胞的平均数从响应于趋化因子迁移的细胞总数中减去。迁移率(％)＝(CCL21培养基中的细胞数-DC培养基中的细胞数)/(DC培养基中的细胞数)×100。
人DC的内吞分析。PBMC衍生的DCs的内吞能力使用Dextran-Texas Red测试，如前所述(Sallusto等人，J Exp Med，182：389-400，1995)。人PBMC衍生的DCs的1×106个细胞用不同Ad载体以MOI为25,000vp转染。四十八小时(48h)后，2×105个转染DCs用Dextran-Texas Red(Invitrogen，Carlsbad，CA)以1mg/mL的浓度脉冲4h。添加冷染色缓冲液(PBS中1％FBS)以停止反应。细胞洗涤四次并用PE-偶联的抗CD11c Abs染色，然后在FACSaria上分析。葡聚糖与DCs的非特异结合被显示，其通过在4℃用Dextran-Texas Red温育DCs来测定。用于培养的培养基补充有GM-CSF，原因在于如果DCs在无GM-CSF的条件下培养，DCs捕获Ag的能力就丧失(Inaba等人，J ofExp Med，176：1693-1702，1992)。
体外T细胞致敏。自体T细胞的体外致敏如所述进行(32，36，37)。1×106个人PBMC衍生的DCs用Ad载体以MOI为25000vp在12孔培养板1mL无血清RPMI1640培养基中模拟转染或转染1.5小时，然后添加1ml含有20％FBS的1ml DC培养基48h。收获转染的DCs，用RPMI1640洗涤，然后与自体T细胞以DC：效应物比值为1∶20共培养，其在不含rhIL-4和rhGM-CSF的2min DC培养基中、在37℃、在含有5％CO2的潮湿气氛中进行7天。每3天，培养物用重组人IL-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)以50U/mL的浓度补充。T细胞每周用新鲜制备的模拟或Ad-转染的自体DCs重刺激。14天共培养后，收集T细胞用于细胞内细胞因子染色、ELISPOT和CTL分析。
体外T细胞增殖和阻抑分析。为了评估Ad-转染的DCs对Treg功能的作用，如上所述，人PBMC衍生的DCs(第5天)用不同Ad载体以MOI 25000vp转染48小时。来自不同供体的人CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-Teff细胞通过使用人CD4+CD25+MACS试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)如其说明书所述分离。Ad-转染的DCs(5×105)与自体CD4+CD25+Treg细胞(1×105)在12孔细胞培养板中共培养5天。CD4+CD25+Treg细胞(1×105)用CD4+CD25+MACS试剂盒纯化并与1×105个CD4+CD25-Teff细胞和5×104个自体模拟DC在0.5μg/mL抗人CD3存在的情况下在96孔板中另外共培养60小时。然后，将一微居里(1μCi)的[3H]胸腺嘧啶(DuPontNEN，Wilmington，DE)添加至每个孔并另外温育16小时。将三个重复孔中的细胞使用Filter Mate Harvester(Packard)收获至玻璃纤维滤器上，并且将滤器充分洗涤。干燥后，25μL的MicroScint 20(Packard)添加至每个孔，并且放射性用TopCount NXT Microplate Scintillation and Luminescence Counter(Packard)计数。平行地，1×105个同种异体的CD4+CD25-T细胞用20μM CFSE(Invitrogen，Carlsbad，CA)在37℃标记15分钟。将CFSE标记的T细胞添加至上述共培养系统以监测增殖。
ELISPOT分析。ELISPOT分析如前所述具有一些修改地进行(Schroers等人，Methods Mol Biol，246：451-459，2004；Schorers等人，Clinical Can Res，9：4743-4755，2003)。简言之，MultiScreen-HA板(Millipore，Bedford，MA)在4℃用包被缓冲液(碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6))中的10μg/mL抗人IFNγmAb 1-D 1K(Mabtech，Stockholm，Sweden)过夜包被。板用RPMI 1640和10％人血清(Bethyl，Inc.，Montgomery，TX)在37℃封闭至少2小时。被刺激的T细胞以2×105/每孔接种并与无Ad转染的照射的(irradiated)4×103个自体DCs共培养，其在20μg/mL HLA-A2-限制的存活蛋白肽(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO：172)(Schmidt等人，Blood，102：571-576，2003)和20μg/ml HLA-A2-限制的MUC 1肽(STAPPAHGV，SEQ ID NO：173)(Brossart等人，Blood，93：4309-4317，1999；Brossart等人，Blood，96：3102-3108，2000)存在的情况下在37℃、5％CO2三次重复进行。板在37℃5％CO2湿润的培养箱中温育16小时，然后通过用PBS-0.05％Tween 20(Sigma，St.Louis，MO)洗涤六次去除细胞。添加在PBS-0.5％人血清中1μg/ml浓度的生物素化的抗人IFNγ抗体7-B6-1(Mabtech，Stockholm，Sweden)，并且将板在37℃温育2小时。添加链霉抗生物素偶联的碱性磷酸酶(Mabtech，Stockholm，Sweden)另外1小时。产生细胞因子的细胞在与5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和氮蓝四唑(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)进行4分钟反应后检测。结果以ZellNet Consulting，Inc.(New York，NY)的盲法方式用自动ELISPOT读出系统(Carl Zeiss，Inc.，Thomwood，NY)使用KSELISPOT 4.3软件评价。
CTL分析。CTL标准51Cr-释放分析如Schroers等人(Cancer Res，62：2600-2605.，2002)所述进行。DC-致敏的T细胞用20μg/mL MUC1和20μg/mL存活蛋白肽脉冲的无Ad转染的自体DCs再刺激2小时。靶向细胞(MCF7、A498、SK-OV3和MDA-MB-231)用RPMI 1640中的[51Cr]-铬酸钠在37℃标记1小时。靶向细胞(104)转移至圆底96孔板的孔中。添加不同数量的DC-致敏T细胞以达到16个200μL终体积并在37℃温育4小时。在分析的最后，收获上清液(50μL/孔)并在β-板计数器中计数。细胞裂解的百分比如下计算：100×(实验释放-自发释放/最大释放-自发释放)。自发和最大释放分别在培养基或1％SDS存在的情况下测定。
实施例2-重组Ad载体Ad-siSSF的构建和特征
根据本发明的一个实施方式，重组表达构建体被设计为共表达负免疫调节物的抑制剂、促炎分子和抗原。具体地，本实施例描述了重组复制缺陷型腺病毒载体的构建被设计为共表达小发夹人SOCS1-siRNA(siSOCS1)、显性失活(DN)存活蛋白和MUC1融合蛋白、以及分泌鞭毛蛋白——TLR5配体(图1)。载体使用如实施例1所述的单个基因区段的PCR扩增而被组装。
为了构建重组复制缺陷型腺病毒载体——其命名为Ad-siSSF，其共表达小发夹人SOCS1-siRNA(siSOCS1)、显性失活(DN)存活蛋白和MUC1融合蛋白以及分泌鞭毛蛋白——TLR5配体(图1)，存活蛋白、MUC1和鞭毛蛋白基因被修饰。而且，可有效沉默人SOCS 1的siRNA的一个实例被鉴定。选择腺病毒载体系统，原因在于它的人DCs高转染效率、已良好建立的Ad制备系统、限制潜在自身免疫毒性风险的转基因表达的瞬时性质以及在超过一千人中已证明的安全性(Song等人，J Exp Med，186：1247-1256，1997；van Ginkel等人，J Immunol，159：685-693，1997；Dietz等人，Blood，91：392-398，1998；Barouch等人Hum Gene Ther，16：149-156，2005；Shiver等人，Annu Rev Med，55：355-372，2004)。
由于存活蛋白对于恶性细胞存活和转化的潜在促进的抗凋亡生物活性，将两个突变引入存活蛋白基因中以产生DN存活蛋白突变体。在位置34用Ala置换突变Thr以消除p34cdc2-cyclin B1磷酸化位点和抗凋亡活性，如前所述(O’Connor等人，Proc NatlAcadSci USA，97：13103-13107，2000)。另外，为了避免存活突变体可能反向突变回功能磷酸化位点，在存活蛋白N-末端进一步进行16个氨基酸的截短，原因在于N-末端序列是其凋亡抑制所需的(Sun等人，Nature，401：818-822，1999)。使用只含有三段20个氨基酸串联重复序列的短的人黏蛋白1(MUC1)片段，因为已知的显性T细胞表位位于20个氨基酸重复内(Fontenot等人，JBiomol StructDyn，13：245-260，1995)并且发现全长或过长的MUC1蛋白通过抑制Th1型CTL反应具有免疫抑制活性(Carlos等人，JImmunol，175：1628-1635，2005)。
对于Ad-siSSF载体，为了产生DN存活蛋白-MUC1融合基因(DNSM)作为靶向肿瘤相关抗原，双突变的DN存活蛋白被遗传地按阅读框连接至MUC1的三段20个氨基酸重复片段。为了便于转染DCs分泌鞭毛蛋白并随后与DCs上的表面TLR5相互作用，衍生自人酪氨酸酶的信号前导序列被遗传地连接至鞭毛蛋白基因的N-末端。
使用实施例1所述的计算机程序，具有特异性下调人SOCS1能力的小干扰RNAs(siRNA)被鉴定(siRNA1、siRNA2和siRNA3)。图2显示人SOCS1siRNA1，但不是SOCS1siRNA2和siRNA3，有效地下调人SOCS1表达。siRNA对人SOCS1mRNA下调的特异性通过乱序siRNA1寡核苷酸双链体(mut)不能下调SOCS1mRNA而证实。因此，人SOCS1siRNA1(SEQ ID NO：5)被选择用于Ad-siSSF载体的构建。
产生的Ad载体Ad-siSSF如图1示意性所示构建，并且这些基因在重组腺病毒中的插入由DNA测序证实。另外，只表达DN SM融合蛋白的腺病毒载体Ad-SM和表达GFP标记的腺病毒载体Ad-GFP被构建并产生作为对照(图1)。
Ad-siSSF病毒在转染的细胞中有效地共表达siSOCS1、DN SM融合蛋白和分泌鞭毛蛋白这三个组分的能力通过免疫印迹分析证明。图3A显示DN存活蛋白-MUC1融合蛋白和鞭毛蛋白在用不同MOIs(10、100、1000和10000vp，道1-4)的Ad-siSSF转染的293T细胞中的表达。100vp或更高的MOIs显示多肽的良好表达。图3B显示用人SOCS1表达载体DNA转染和用不同MOIs(0、10、100、1,000、10,000和20,000vp)(道1-6)的Ad-siSSF或对照Ad-GFP(10、100、1,000、10,000和20,000vp的MOIs；道7-11)感染的293T细胞的裂解液的免疫印迹。人SOCS1条带比肌动蛋白的相对密度显示于柱状图中(图3C)。1,000vp或更高的MOI能够显著降低SOCS1在293T细胞中的表达，而同时提供鞭毛蛋白和DN存活蛋白-MUC1融合蛋白的良好表达。因此，本实施例的结果表明，编码负免疫调节物的抑制剂、促炎分子的多核苷酸可在同一细胞中共表达。
实施例3-Ad-siSSF引起的人DCs的有效成熟
根据本发明的一方面，疫苗组合物——其包括编码负免疫调节物的抑制剂、促炎分子和抗原的多核苷酸——被施用至DCs以诱导它们的成熟。
多核苷酸在Ad-载体中提供，如实施例2所述。首先，测定Ad载体合适的MOI(感染复数)，其使得有效转染人PBMC衍生的DCs，但不会具有显著的毒性。人PBMC衍生的DCs转染效率通过检测Ad-GFP转染24小时后GFP+DCs的百分比来测定。在MOI为25,000或50,000个病毒粒子(vp)的情况下，当转染24小时后检测时，分别约66％或75％的DCs被转染(图4)。用Ad-siSSF或Ad-GFP转染后不同时间DCs的DC存活率用台盼蓝、碘化丙锭(PI)和膜联蛋白-V染色测定。当使用MOI为25,000vp时，大多数Ad-siSSF转染的DCs仍存活(＞94％)，如转染后48小时和96小时染色证实(图5)。但是，用更高的MOIs转染引起对DCs相当大的毒性，它们的存活率具有降低的百分比。因此，选择Ad转染人PBMC衍生的DCs的MOI为25,000vp用于以下研究。
下一步，Ad-siSSF转染对人PBMC衍生的DCs成熟的作用通过流式细胞测定来检测。流式细胞方法和用于检测的抗体在实施例1中描述。图6显示表面共刺激分子例如CD40、CD80和CD86、以及MHC II类分子的水平在Ad-siSSF-转染的DCs上在转染后48小时与Ad-SM转染的DCs相比显著上调。肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员的表面水平在Ad-siSSF-DCs上也显著增强(图6)，例如GITR(糖皮质素-诱导的肿瘤坏死因子受体)配体和OX40配体(T细胞共刺激信号配体)。TLR5在人PBMC衍生的DCs上表达，但它的表达不被Ad-siSSF转染上调。而且，显示Ad-siSSF-转染的DCs保持内吞能力，以在4℃或37℃温育90分钟后内化Texas Red-偶联的葡聚糖(图7)。
因此，根据本发明的疫苗方面，这些结果表明表达负免疫调节物的抑制剂、促炎分子和抗原的Ad-siSSF载体有效地促进人DC成熟的效力，如表面共刺激分子增加的表达所证实。
实施例4-Ad-siSSF转染的人DCs引起的促炎细胞因子的大量(robust)产生
在本实施例中，本发明的疫苗组合物实施方式被检测，检测它对转染的人PBMC衍生的DCs产生促炎细胞因子的作用。细胞因子关键地参与免疫细胞活化、增殖和分化的调节。最近的研究表明，DCs产生的细胞因子发挥作为T细胞和B细胞引发和活化第三信号的功能(Curtsinger等人，JExp Med，197：1141-1151，2003；Valenzuela等人，J Immunol，169：6842-6849，2002)。小鼠DCs的研究表明由SOCS1-siRNA-转导的DCs引起促炎细胞因子的增强产生(Shen等人，NatBiotechnol，22：1546-1553，2004；Evel-Kabler等人，J Clin Invest，116：90-100，2006)。如实施例1所述，人DCs用Ad-siSSF或对照Ad-GFP或Ad-SM转染，并在转染后不同时间，收集培养基用于细胞因子ELISA分析。图8显示与Ad-GFP-DCs相比，Ad-siSSF-DCs引起的代表性促炎细胞因子例如IL-12p40、IL-12p70、IFN-γ、IL-6和TNF-α的增强产生。
为了进一步评价Ad-siSSF转染对DCs细胞因子产生的作用，![]()
人细胞因子抗体阵列(Ray Biotech，Norcross，GA)用于检测Ad-转染的DCs的培养基中的42种细胞因子。发现各种促炎细胞因子的产生和分泌在Ad-siSSF-转染的DCs中广泛上调(图9)。另外，ELISA分析显示，趋化因子例如RANTES在Ad-siSSF-DC培养物中显著升高(图8)。支持ELISA数据，人细胞因子阵列数据也显示，在Ad-siSSF转染的DCs的培养基中趋化因子例如MIP3和RANTES的增强水平。综上所述，这些结果显示，Ad-siSSF转染有效地刺激人PBMC衍生的DCs的成熟以及它们对广泛的促炎细胞因子和趋化因子的产生。
实施例5-Ad-siSSF-DCs的有效运输
在本实施例中，本发明的疫苗组合物实施方式被检测，检测它对转染的人PBMC衍生的DCs迁移的作用。抗原呈递DCs迁移至引流淋巴结——在其中它们引发抗原-特异性T细胞和B细胞——对免疫的癌症患者中抗肿瘤免疫性的诱导是关键的。成熟后DCs表达它们的主要淋巴结-归巢趋化因子受体——CC-趋化因子受体7(CCR7)，以通过对CCR7配体、CCL19和/或CCL21的趋化梯度的响应迁移至淋巴结，CCL19和/或CCL21起源于外周淋巴管(51)。有趣的是，观察到与对照Ad-GFP-DCs相比，在Ad-siSSF-转染的DCs上趋化因子受体CCR7的水平显著上调(图6)。因此，转染的细胞表达的显著更高水平的CCR7-关键淋巴结归巢受体——表明疫苗组合物可在免疫的患者中提高AdsiSSF-DCs向引流淋巴结的迁移能力。
下一步，Ad-siSSF-DCs的迁移能力使用transwell体外迁移分析检测，如实施例1所述。人PBMC衍生的DCs用Ad-siSSF或对照Ad-SM转染，然后以三个重复添加至transwell的上室。重组CCL21CCR7配体——添加至下室，然后在温育3小时后，测定Ad-转染的DCs迁移率。图10显示与Ad-SM-转染的DCs相比，Ad-siSSF-转染的DCs响应于CCL21显著(P＜0.05)增加的迁移率，这表明Ad-siSSF转染的DCs向免疫的患者的引流淋巴结的迁移能力增强，这可能是趋化因子受体升高表达的结果。因此，这些结果显示本发明的疫苗组合物能够有效地刺激DCs的迁移，并在施用至患者后可提高DCs定位至淋巴结的能力。
实施例6-Ad-siSSF-DCs激活CTLs的有力的免疫刺激效力
一方面，本发明提供刺激针对表达不同抗原的细胞的CTL反应的疫苗组合物。Ad-siSSF-DCs引发抗原-特异性CTLs的免疫刺激效力使用体外T细胞致敏分析测试，如实施例1所述。HLA-A2+人PBMC衍生的DCs用Ad载体转染，然后与自体T细胞共培养两周。在用存活蛋白和MUC1肽脉冲的未用Ad转染的自体DC再刺激后，抗原-特异性T细胞在共培养物中的数量通过IFN-γ.ELISPOT和细胞内染色分析测定。IFN-γ细胞内染色分析显示，与Ad-SM-DCs相比，在与Ad-siSSF-DCs的共培养物中产生IFN-γ的CD8+T细胞和CD4+T细胞的增加的百分比(图11)。一致地，IFN-γELISPOT分析显示，在Ad-siSSF-DC共培养物中产生IFN-γ的T细胞的增加的数量(图12)。因此，这些结果显示，转染Ad-siSSF的DCs具有有效的免疫刺激效力以引发抗原-特异性CTL应答。
引发的T细胞对人肿瘤细胞的溶细胞活性使用标准51Cr释放分析进一步测试。通过流式细胞测定，显示人乳腺(MDA-MD-231和MCF-7)和肾(A498)肿瘤细胞是HLA-A2+和MUC1+(图13A)，而人卵巢(SK-OV-3)癌细胞是HLA-A2-和MUC1+(图13A)。在所有这些人肿瘤细胞系中通过RT-PCR检测细胞内存活蛋白的表达(图13B)。为了进行51Cr释放分析，来自HLA-A2+供体的T细胞在转染DCs体外致敏两周后，用MUC1和存活蛋白肽脉冲的无Ad转染的自体DCs再刺激，然后用靶向51Cr-标记的人肿瘤细胞以不同比值温育。图14显示Ad-siSSF-DCs引发的HLA-A2+T细胞比Ad-SM-DCs引发的T细胞对HLA-A2+和存活蛋白/MUC1+人肿瘤细胞(MCF-7、MDA-MB-231和A498)具有更有效的溶细胞活性。溶细胞活性特异性通过Ad-siSSF-DC引发的HLA-A2+T细胞不能杀死HLA2-存活蛋白/MUC1+SK-OV-3细胞以及Ad-GFP-DCs引发的HLA-A2+T细胞不能杀死这些HLA2+、存活蛋白/MUC1+MDAMB-231、MCF-7和A498肿瘤细胞来证明。综上所述，这些结果表明了本发明的疫苗组合物引发能够选择性地杀伤人肿瘤细胞的抗原特异性抗肿瘤CTL应答的有效的免疫刺激效力。
实施例7-Ad-siSSF-DC引起的克服Treg-介导的阻抑
在本实施例中，本发明的疫苗组合物的实施方式被检测，检测它对克服CD4+CD25+Foxp3+T调控(Treg)细胞引起的阻抑的作用。Treg细胞在限制小鼠和人类抗肿瘤免疫性中发挥抑制作用(Sakaguchi，Nat Immunol，6：345-352，2005)。效应物T细胞的增殖和扩展可被CD4+CD25+Treg阻抑(Sakaguchi，Nat Immunol，6：345-352，2005)。在本研究中，发现在Ad-siSSF-DC上GITRL和OX40L水平显著升高(图6)，以及细胞因子例如IL-6和TNFα的更高水平由Ad-siSSF-DCs产生(图8和9)。发现这些促炎共刺激分子和细胞因子不仅刺激效应T细胞，而且阻抑Treg细胞的阻抑活性(Pasare等人，Science，299：1033-1036，2003；Peluso等人，JImmunol，178：732-739，2007)。同样地，根据实施例1所述的方法，测试Ad-siSSF-转染的被超激活的DCs是否能够克服人CD4+CD25高Treg的阻抑活性。自体CD4+CD25高Treg通过FACS分选，然后与Ad-转染的DCs共培养5天。3H胸苷掺入和CFSE稀释分析均显示，与Ad-siSSF-DCs共培养后，CD4+CD25高Treg不再能够阻抑CD4+CD25-效应T细胞的增殖，而CD4+CD25高Treg在与Ad-SM-DCs共培养后仍有效地阻抑CD4+CD25-效应T细胞的增殖(图15)，这表明Ad-siSSF-DCs克服Treg-介导的免疫阻抑的独特能力。
实施例8-保护性免疫应答的佐剂，用于增强小鼠和人DCs中促炎细胞因子和共刺激分子的水平
本实施例描述了包括TLR5配体和细胞因子受体和TLR信号转导的调节物的抑制剂SOCS1的佐剂。佐剂在刺激鼠和人树突细胞产生炎性细胞因子的水平和持续时间以及激活体内细胞和体液免疫应答方面比TLR激动剂明显更加有效和持久。因此，该佐剂具有将更有效的免疫应答升高至更高水平的独特能力，这是TLR激动剂或天然感染刺激不能获得的。因此，该佐剂用于针对与慢性感染相关的病原体的保护性免疫应答方法。
共表达SOCS1-shRNA(shS1)和修饰的分泌鞭毛蛋白(FliC)-TLR5配体的重组复制缺陷型腺病毒载体，其命名为Ad-shS1/FliC，以及一组表达单独shS1、shGFP或分泌型FliC的重组Ad载体被构建(图16)。FliC刺激抗原-特异性细胞和体液免疫应答。Ad-Easy系统(E1和E3缺失；Quantum Biotechnologies Inc.，PaloAlto，CA)用于构建和产生复制缺陷型腺病毒。如实施例1所述，使用肠沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌为模板通过PCR扩增鞭毛蛋白(FliC)基因。小鼠shS1CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT(SEQ ID NO：175)和人shS1CACGCACTTCCGCACATTC(SEQ ID NO：176)被插入Ad载体，这些产生的Ad载体的插入物通过DNA测序证实。
重组Ad载体已知具有DCs高转导效率。Ad-shS1/FliC和Ad-shS1下调SOCS1的能力通过qRT-PCR和免疫印迹证实(图17)。高水平的FliC蛋白通过用Ad-shS1/FliC和Ad-FliC转导的骨髓(BM)衍生的DCs产生(图18)。
下一步，测试Ad-shS1/FliC是否比Ad-shS1和Ad-FliC更有效地增强DCs表达的促炎细胞因子和共刺激分子水平。表达表面TLR5的鼠BM-DCs、J774A.1巨噬细胞和D2SC/1DCs(图19)用于该研究。我们发现与Ad-shS1或Ad-FliC-BM-DCs相比，Ad-shS1/FliC-转导的BM-DCs产生较高水平的促炎细胞因子例如IL-12、IL-6和TNF-α(图20A)。较高水平的表面共刺激分子还在Ad-shS1/FliC-BM-DCs上观察到(图20B)。类似结果在Ad-转导的J774A.1巨噬细胞和D2SC/1DCs中获得，其表明SOCS1沉默和TLR刺激的明显协同作用。
多种TLR激动剂，例如咪喹莫特、polyI：C和CpG已被发展用作佐剂。检测Ad-shS1/FliC是否比常用TLR激动剂更有效地增强DCs产生的促炎细胞因子和共刺激分子的表达水平。图20C显示，Ad-shS1/FliC比常用TLR激动剂(LPS、PolyI：C、CpG和咪喹莫特)更有效地刺激促炎细胞因子和共刺激分子的表达(数据未显示)，其表明Ad-shS1/FliC优异的刺激效力。
由于抗原呈递的持续时间和强度对确定适应性免疫应答的大小和记忆是重要的，因此比较用不同刺激处理的DCs产生炎性细胞因子的持续时间。用不同Ad载体转导或用TLR激动剂刺激BM-DCs 24小时，然后用不含刺激物的新鲜培养基洗涤并置换。洗涤前后检测培养基中的细胞因子浓度。图20D显示在洗涤后，Ad-shS1/FliC-DCs仍产生高水平的炎性细胞因子。相反，在洗涤后，TLR激动剂-DCs不能活跃地产生细胞因子。通过比较Ad-转导的或TLR激动剂-刺激的DCs的炎性信号传导动力学，也检测Ad-shS1/FliC是否独特地引发和维持DCs中的TLR信号传导级联反应。免疫印迹分析显示关键细胞内促炎信号传导分子例如pIκBα和pSTAT4的延长的磷酸化(数据未显示)。综上所述，这些数据显示，Ad-shS1/FliC具有刺激DCs延长地并增强地产生促炎细胞因子的独特能力。
为了评价该佐剂的翻译能力，测试Ad-shS1/FliC是否在刺激人DCs中也具有效力。由于小鼠和人SOCS1序列的异质性，我们产生重组载体Ad-shhS1/FliC，其共表达FliC和能够有效地沉默人SOCS1mRNA(＞80％降低)的人(h)shS1-shRNA。图20F显示，转导Ad-shhS1/FliC的人DCs比转导Ad-shhS 1或Ad-Fli的人DCs产生更高水平的促炎细胞因子。也观察到转导Ad-shhS1/FliC的人DCs比常用TLR激动剂刺激的DCs产生显著更高水平的细胞因子(图20G)。而且，与Ad-shhS1或Ad-FliC转导的、或TLR激动剂刺激的人DCs相比，用Ad-shhSl/FliC转导的人DCs产生炎性细胞因子的持续时间显著延长(图20H和20I)。这些结果显示，SOCS1也在人DCs中发挥关键作用，并且组合的FliC刺激与人SOCS1沉默比常用TLR激动剂更有效并更持续地刺激人DCs。因此，包括SOCS的siRNA抑制剂和鞭毛蛋白多肽的组合物用作疫苗佐剂用于增强免疫应答。
实施例9-保护性免疫应答的Ad-shSl/FliC佐剂，用于体内增强DC疫苗效力
体内评估Ad-shSl/FliC提高DC疫苗效力的能力。野生型小鼠组用Ad载体转导的或用LPS——最有效的TLR激动剂刺激以及用模型抗原卵清蛋白(OVA)或代表性病毒抗原(HCV E2)脉冲的BM-DCs间隔一周两次免疫(爪垫)。鼠BM-DCs分别用等量的重组Ad载体以MOI为250ifu转导或用LPS(100ng/ml)刺激24小时，然后用重组HCV-E2蛋白(20μg/ml)脉冲另外6小时。C57BL/6小鼠组(6只小鼠/组)用转导的或LPS-刺激的DCs(每只小鼠1×106个细胞)经爪垫间隔一周两次免疫。
图21A-21D显示，Ad-shSl/FliC-DCs比用Ad-shS10或Ad-FliC转导的或用TLR激动剂刺激的DCs显著更有效地诱导OVA-特异性(数据未显示)以及HCV E2-特异性CD8+CTL和CD4+Th应答，如IFNγ细胞内细胞因子染色和ELISPOT分析表明，这表明Ad-shSl/FliC-DCs在激活抗HCV CD8+CTL和CD4+Th应答中的优异效力。
还研究了Ad-shSl/FliC对DCs诱导抗HCV抗体反应的刺激作用。图21E显示，与用Ad-shSl或Ad-FliC转导的或用TLR激动剂刺激的DCs免疫的小鼠中相应IgG亚类比较，在用Ad-shS1/FliC-DCs免疫的小鼠中，全部HCV-E2-特异性抗体滴度的增加。HCV E2-特异性抗体亚类分布显示Th1-极化的IgG应答，较高的IgG2a——与Th1应答相关的亚类，其由Ad-shSl/FliC-DCs诱导。
为了直接测试Ad-shSl/FliC-DCs激活B细胞的增强的能力，B细胞Elispot分析用于检测在免疫的小鼠中产生抗HCV E2IgG的B细胞的频率。图21F显示在Ad-shS 1/FliC-DC小鼠中，产生抗HCV E2IgG的B细胞的频率显著高于用Ad-shSl或Ad-FliC转导的或用TLR激动剂刺激的DCs免疫的小鼠(P＜0.01)。因此，这些结果表明，Ad-shS1/FliC-DCs也更有效地激活HCV E2-特异性B细胞以产生较高滴度的中和抗体。
实施例10-保护性免疫应答的Ad-shA20/FliC佐剂，用于增强体内DC疫苗效力
AdEasy系统(E1和E3缺失；Quantum Biotechnologies Inc.，Palo Alto，CA)用于构建和产生复制缺陷型腺病毒。具有人酪氨酸酶信号前导序列的修饰的鞭毛蛋白(fliC)基因如上所述通过PCR扩增。构建含有小鼠shA20序列(CAAAGCACTTATTGACAGA(SEQ ID NO：177))和人(h)shA20序列(CCATGCACCGATACACACT(SEQ ID NO：178))的pSuper载体。穿梭载体Ad-shA20/FliC和Ad-shhA20/FliC通过插入SpeI-消化的pSuper-shA20或pSuper-shhA20载体的U6-shA20或U6-shhA20至SpeI消化的Ad-FliC载体中来构建。形成共表达U6RNA启动子控制下的小鼠A20shRNA或人A20shRNA和CMV启动子控制下的鞭毛蛋白的重组复制缺陷型病毒Ad-shA20/FliC和Ad-shhA20/FliC，并根据制造商说明书(Quantum Biotechnologies Inc.，Palo Alto，CA)产生。这些重组腺病毒载体的示意图显示于图22。分泌FliC蛋白的表达和shA20对A20的下调在Ad-shA20/FliC和Ad-shhA20/FliC转导的BM-DCs中通过免疫印迹分析和qRT-PCR表明。
首先，体外测试共表达shA20和分泌型FliC的Ad-shA20/FliC在刺激DCs方面是否优于只表达shA20的Ad-shA20和只表达分泌型FliC的Ad-FliC。发现Ad-shA20/FliC-转导的BM-DCs比Ad-shA20或Ad-FliC-转导的BM-DCs产生更高水平的促炎细胞因子。另外，shA20/FliC-转导的BM-DCs比用TLR激动剂例如PolyI：C和CpG刺激的DCs产生更高水平的促炎细胞因子。
下一步，体内测试共表达shA20和分泌型FliC的Ad-shA20/FliC在刺激DC疫苗的抗原特异性T细胞和B细胞反应方面是否优于Ad-shA20和Ad-FliC。发现HBsAg-脉冲、Ad-shA20/FliC-转导的BM-DCs比HBsAg-脉冲、Ad-shA20或Ad-FliC-转导的BM-DCs诱导强得多的HbsAg-特异性T细胞和B细胞反应(图23A和图23C)。而且，HBsAg-脉冲、Ad-shA20/FliC-转导的BM-DCs比用TLR激动剂例如LPS、PolyI：C和CpG刺激的HBsAg脉冲的BM-DCs诱导强得多的HbsAg-特异性T细胞和B细胞反应(图23B和图23D)。
综上所述，实施例9和10所示结果支持了TLR及下游细胞因子信号传导和TLR刺激的组合抑制可破坏天然负反馈屏障以引发和维持APCs中促炎信号传导级联反应/环的命题。持续并增强的炎性信号传导会使APCs具有持续激活先天和适应性免疫性的独特能力。实际上，由这一概念产生的原型佐剂Ad-siSl/FliC和Ad-siA20/FliC比常用TLR激动剂更有效地刺激鼠和人DCs产生的促炎细胞因子水平。重要地，该佐剂以持续方式独特地刺激DCs产生炎性细胞因子。我们进一步发现，用该佐剂刺激的DCs具有针对与慢性感染相关的病原体的抗原诱导细胞和体液免疫应答的显著增强的效力。该新的佐剂显著地将细胞和体液免疫应答的大小和持续时间提高至更高水平，这是TLR激动剂或天然感染刺激不能获得的，该新的佐剂可用于发展针对感染性疾病更有效的预防和治疗疫苗。同样地，包括负免疫调节物的siRNA抑制剂和鞭毛蛋白的组合物用于提高哺乳动物中的免疫应答的方法。
实施例11-FliC-鱼精蛋白融合蛋白/siRNA复合物作为疫苗佐剂
虽然Ad-siRNA/FliC载体可用作离体治疗DC疫苗的佐剂，但是Ad载体的免疫原性可限制它们作为体内佐剂的效力和用途。从各个患者制备的自体DC疫苗不可能用于慢性感染的治疗，原因在于与这些治疗相关的技术困难和成本。发展基于siRNA治疗方法的主要障碍是体内穿过细胞膜递送它到细胞质来调节mRNA降解。因此，本实施例描述FliC-鱼精蛋白融合蛋白/siRNA复合体用作疫苗佐剂(图24)。
在较早研究中，产生重组双功能融合蛋白用于核酸的递送。该融合蛋白由抗体——抗HIV Fab F105(针对gp120，其为HIV-1的包膜糖蛋白)和DNA结合部分——鱼精蛋白组成，所述鱼精蛋白作为靶向基因载体在精子中使DNA成核。参见Chen等人Gene Ther 2，116-23(1995)。核酸(负电荷)与鱼精蛋白蛋白(正电荷)静电相互作用以形成可溶的蛋白-核酸复合体而不需要共价结合。这些复合体可通过受体-介导的内吞作用被特异性转移至靶向的HIV-1感染的细胞。最近，发现siRNA寡聚物(负电荷)可有效地结合抗HIV F105Fab-鱼精蛋白融合蛋白，用于有效递送至靶向的HIV感染的细胞。Song等人Nat Biotech 23，709-717(2005)。抗ErbB2-鱼精蛋白融合蛋白还显示有效地将siRNAs特异地递送至表达ErbB2的乳腺癌细胞。在最近与前同事的合作研究中，发现抗HBsAg单链抗体和鱼精蛋白融合蛋白有效地携带siRNA-表达质粒至HBsAg-阳性细胞中以抑制HBV基因表达和复制。Wei-Hong等人，Hepatology 46，84-94(2007)。另外，Peer等人PNAS 104，4095-4100(2007)表明，靶向LFA-1的抗体-鱼精蛋白融合蛋白有效地递送siRNAs并特异地诱导初级单核细胞和DCs中的沉默。另外，他们在抗整联蛋白β纳米粒子中使用鱼精蛋白浓缩的siRNA以系统地将siRNA递送至白细胞。综上所述，这些研究表明使用鱼精蛋白融合蛋白作为载体用于siRNA靶向递送的可行性。
杆状病毒表达系统(Novagen)用于产生重组FliC-鱼精蛋白融合蛋白。FliC基因按阅读框与人鱼精蛋白基因(aa 1-51)融合，其利用之前构建的质粒pCMV-Fab105-鱼精蛋白载体作为模板通过重叠PCR被PCR-扩增(参见表6)。
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然后，FliC-鱼精蛋白融合基因插入杆状病毒转移载体pBAC(Novagen)，用于在杆状病毒早期启动子的控制下组氨酸标签-FliC-鱼精蛋白(P)融合蛋白的表达(图25)。产生的表达载体通过DNA测序证实。根据制造商说明书，杆状病毒转移载体和BacMagic DNA被共转染至昆虫细胞中，以产生重组杆状病毒用于蛋白表达。该FliC-P融合蛋白的估计分子量为约58kd。为了检测融合蛋白表达，三次冻融循环后，FliC-P杆状病毒感染的Sf9细胞或对照Sf9细胞的细胞裂解液的上清液用于免疫印迹分析，其中使用抗组氨酸抗体和抗人鱼精蛋白抗体。图26显示抗FliC、抗组氨酸和抗鱼精蛋白抗体对杆状病毒表达系统表达的重组FliC-P融合蛋白的特异性识别。
3次冻融后，FliC-P-杆状病毒感染的Sf9细胞裂解液的上清液中的重组蛋白用Ni++层析根据制造商说明书(Novagen)纯化。纯化蛋白被透析至PBS中，然后浓缩并储存在-70℃。FliC-P/siA20寡核苷酸双链体复合体经由融合蛋白带正电荷的鱼精蛋白与负电荷siRNA寡聚物的静电作用而配制，如上述研究所述。
siRNA寡聚物双链体与融合蛋白或对照蛋白(白蛋白)在PBS中以6∶1摩尔比在4℃混合30分钟。温育后，含有蛋白/siRNA复合体的溶液用于在1mM MgCl2/CaCl2或5mM MgCl2/1mM EDTA存在的情况下在RPMI培养基1640/10％FCS中抗原呈递细胞(APCs)的转染。FliC-P/siYFP-Cy5复合体能够转染约70％的鼠骨髓衍生的DCs。
下一步，检测FliC-P/siA20复合体是否比FIiC和其它常用TLR激动剂更有效地增强鼠APCs产生的促炎细胞因子的水平。A20-siRNA寡聚物双链体与重组(r)FliC-P融合蛋白、FliC蛋白或白蛋白(Sigma)以6∶1摩尔比混合30分钟。FliC蛋白从鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株14028分离并购自Axxora Inc(cat#ALX-522-058)。GFP-siRNA寡聚物双链体也与FliC-P融合蛋白混合作为另外的对照。三次重复的鼠BM衍生的DCs(1×106个/ml)分别用FliC-P/siRNA复合体、FliC-P/siGFP复合体、FliC-P单独或FliC单独处理48至72小时。收集培养基用于代表性细胞因子的ELISA分析(BD)。FliC-P/siA20复合体在刺激BM-DCs产生促炎细胞因子中比FliC-P/siGFP复合体、FliC-P单独和FIiC单独更有效，表明FliC-P/siA20复合体对于APCs增强地产生炎性细胞因子TNF-α和IL-6s具有优异的刺激效力(分别为图27A和27B)。同样地，包括负免疫调节物的siRNA抑制剂和连接至鱼精蛋白多肽的鞭毛蛋白多肽的组合物用于增强需要其的哺乳动物中的免疫应答的方法。
实施例12-涉及使用本发明组合物离体刺激DCs细胞的治疗方法
本发明的疫苗组合物用于治疗某些疾病，例如癌症。在本实施例中，患有表达存活蛋白或MUC1抗原的癌症的对象使用基于细胞的疫苗治疗。基于细胞的疫苗通过从需要治疗的患者中分离和/或扩增DCs，用Ad-siSSF转染DCs，然后将DCs再引入患者来产生。具体地，DCs从患者中扩增或分离并用表达SOCS1的抑制剂、可操作地连接至分泌信号序列的鞭毛蛋白多肽、和包括显性失活存活蛋白突变体和MUC1的抗原融合蛋白的载体转染(即，体外转导或转染)。
实施例13-涉及使用本发明组合物体内接种的治疗方法
除了使用基于细胞的疫苗用于离体免疫，本发明还提供组合物和方法用于体内免疫，以在患者中引发针对抗原的免疫应答。在本实施例中，患有表达存活蛋白或MUC1抗原的癌症的对象通过向患者施用表达SOCS1的抑制剂、可操作地连接至分泌信号序列的鞭毛蛋白多肽、和包括显性失活存活蛋白突变体和MUC1的抗原融合蛋白的载体来治疗。
等同物
本发明不限于本申请所述的具体实施方式，所述具体实施方式意图是作为本发明个别方面的单个说明。如本领域普通技术人员应显而易见的，本发明的许多修改和变化可被进行而不偏离它的精神和范围。根据之前的描述，除本文列举那些之外的本发明范围内的功能等同的方法和组合物对本领域普通技术人员将是显而易见的。这些修改和变化意图落入所附权利要求范围内。本发明仅由所附权利要求连同这些权利要求赋予的等同物的全部范围所限定。应理解的是，本发明不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以变化。还应理解的是，本文所用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，并不试图进行限制。
其它实施方式在所附权利要求中阐述。