4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲 酰胺在制备抗肿瘤药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及化工领域及医药领域， 涉及 4-[(3-([(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正 丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰胺在制备抗肿瘤药物中的应用。背景技术
亲 环 素 Cycliphilins(CyPs) 是 普 遍 分 布 的 细 胞 内 蛋 白， 在 植 物、 细菌和哺乳 动物中均存在， 具有高度保守性， 最初是作为环孢素 A 的细胞受体被发现的。环孢素 A(CyclosporinA， CsA) 是从真菌代谢产物中分离得到的含 11 个氨基酸的环状多肽， 是一种 用于器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制剂， 已被广泛用于临床， 年销售额在 50 亿美元 以上。由于 CsA 用于临床以来表现出各种毒副作用， 对患者及移植物存活率的影响越来越 引起人们的重视， 许多科学研究者正在努力寻找与 CsA 作用类似的、 毒副作用低的替代物。 目前 CsA 也已经开始用于肿瘤治疗当中， 并且主要是与其它抗癌药物如紫杉醇、 阿霉素、 长 春新碱等搭配使用， 增强这些药物的抗肿瘤活性 (Clin Cancer Res.11， 2320-2326)。因为 环孢菌素 A 同时也是极为有效的免疫抑制剂， 因此用于这些疾病的治疗时不可避免会带来 免疫抑制的副作用。克服免疫抑制的方法主要两种， 一是对环孢菌素 A 的免疫抑制基团进 行修饰， 或者从真菌中提取非免疫抑制的环孢菌素衍生物 ； 另一种方法是根据 CYP 蛋白的 结构， 筛选或设计新的非肽类小分子抑制剂。
CyPs 广泛分布于从微生物到哺乳动物的各类物种中。Cyclophilin A(CyPA) 是首 先从牛的胸腺细胞中发现的 CyP 家族中第一个成员， 并验证它具有 PPIase 活性 (Science， 226， 544-547 ； Nature 337， 473-478)。 重 组 人 T 细 胞 的 cyclophilinA(hCyPA) 的 三 维 结构及它与 CsA、 四肽及一些二肽形成的复合物的三维结构已有报道 (Proc.Nat.Acad. Sci.U.S.A.88 ， 9483-9487 ； J.Mol.Biol.228 ， 539-550 ； J.Mol.Biol.234 ， 1119-1130. ； Nature， 353， 276-279 ； Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88， 3324-3328 ； Biochemistry， 35， 7362-7368)。CyPA 与 HIV 相 关 蛋 白 质 的 复 合 物 的 结 构 也 已 报 道 (Cell， 87， 1285-1294 ； Structure 5， 139-146)。CyP 家族的其他成员与 CyPA 具有序列同源性及三维结构类似 的 特 性 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90， 11850-11854 ； Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91， 5183-5186 ； J.Mol.Biol.331， 45-56)。
CyPJ 是 CyP 家族的新成员， CYP-J cDNA 长 1.25Kb， 编码 161 个氨基酸， 已从人的 胎脑 cDNA 文库中分离并鉴定 (Cytogenet.Cell Genet.92， 231-236)。 在氨基酸序列上与线 虫 (C.elegans.)CYP10 具有 72％的同源性。其具体核苷酸和氨基酸序列详见 NCBI 网站上 基因登陆号为 AF146799 的基因报告。 CYPJ 蛋白能促进肝癌细胞的克隆形成率， 可以促进肝 癌细胞物质的复制增殖， 并且能促进肝癌肿瘤细胞生长， 因此， 可以作为筛选抗肝癌药剂的 靶标。
恶性肿瘤已成为人类致死的最重要原因之一， 但是目前市售的抗肿瘤药物均有各 种不良反应， 因此， 寻找新型的低副作用抗肿瘤药物成为生物医药领域的一大热点。发明内容 本发明的目的是提供 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰 胺的新的药物用途。具体涉及 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰 胺在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物为针剂或者片剂。 所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物或者抗结肠 癌药物。
本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法， 即将 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰 基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰胺加入肿瘤细胞的培养液中。
所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞或者结肠癌细胞等。具体的说， 所述的肿瘤细胞 是例如 SMMC7721 细胞或者 SK-Hep1 细胞的肿瘤细胞， 或者例如 sw480 细胞的结肠癌细胞。 加入 FD2 的具体方法可以采用实施例 4 中所采用的方法， 或者其它常规的操作。
本 发 明 的 4-[(3-{[(2- 萘 氧 代 ) 乙 酰 基 ] 亚 肼 } 正 丁 酰 ) 胺 ] 苯 甲 酰 胺 ( 即 4-[(3-{[(2-naphthyloxy)acetyl]hydrazono}butanoyl)amino]benzamide)， 在本发明中 简称为 FD2。
本发明的 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰胺， 其分子 量为 418.45， 结构式为 ：其相关信息如下 ：
化合物 Id ： AG-205/11132151，
分子式 ： C23H22N404。
先前对于本发明的 FD2 的研究主要集中在其是一种 CypJ 抑制剂， BIAcore 分子 -5 互作仪验证其能与 CypJ 结合， 其平衡 - 解离常数 KD(M) ： 7.68×10 。其次， 通过 α- 胰 凝 乳 蛋 白 酶 活 性 测 定 法 (α-chymotrypsin-coupled enzymic assay) 测 得 本 发 明 的 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰胺， 其酶活抑制 IC50 值 (μM) 为 74.8±1.44。
进一步的研究表明， 本发明的 CypJ 小分子抑制剂 FD2 对肿瘤细胞生长有抑制作 用。
本发明测定了 FD2 对肿瘤细胞的杀伤情况， 结果显示， FD2 对肿瘤细胞 SK-Hep1 和 sw480 细胞有一定程度的杀伤力。此外， FD2 还能够有效降低 SMMC7721 细胞的克隆形成率。
因此， 本发明的 FD2 能够抑制 CYPJ 的活性或者表达量， 对于 CYPJ 表达量高的肿瘤 细胞杀伤效果更好。
本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如， 采用人工化学 合成的方法。
利用本发明小分子化合物， 通过各种常规筛选方法， 可筛选出与 FD2 发生相互作 用的物质， 如受体、 抑制剂或拮抗剂等。
本发明及其抑制剂、 拮抗剂等， 当在治疗上进行施用 ( 给药 ) 时， 可提供不同的效 果。通常， 可将这些物质配制于无毒的、 惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中 pH 通常约为 5-8， 较佳地 pH 约为 6-8， 尽管 pH 值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而 有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药， 其中包括 ( 但并不限于 ) ： 肌 内、 腹膜内、 皮下、 皮内、 或局部给药。
以本发明的 FD2 为例， 可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组 合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括 ( 但并不限 于) ： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。 药物制剂应与给药方式相匹配。 本发 明的人 FD2 可以被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过 常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物， 可通过常规方法进行制备。药物 组合物如针剂、 溶液、 片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量， 例如每天约 1 微克 / 千克体重 - 约 5 毫克 / 千克体重。此外， 本发明的 FD2 还可与其他治 疗剂一起使用。
当本发明的 FD2 被用作药物时， 可将治疗有效剂量的 FD2 施用于哺乳动物， 其中该 治疗有效剂量通常至少约 10 微克 / 千克体重， 而且在大多数情况下不超过约 8 毫克 / 千克 体重， 较佳地该剂量是约 10 微克 / 千克体重 - 约 1 毫克 / 千克体重。当然， 具体剂量还应 考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供了小分子化合物 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰胺在制备抗肿瘤药物中的应用。该化合物能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。FD2 是针 对细胞靶点 CYPJ 设计的药物， 不易形成耐药性， 而且， 对于高表达 CYPJ 蛋白的肿瘤细胞效 果特别明显。因此， 本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物进行开发， 抑瘤效果明显， 特异性好。因此， 本发明的 FD2 可以作为新的抗肿瘤药物进行开发， 为治疗和治愈肿瘤提供 了一种新的途径和手段。 具体实施方式
实施例 1CypJ 小分子抑制剂的虚拟筛选
在 PDB 蛋白结构数据库中， 检索到了人类 CYPA 蛋白的 X 光衍射晶体结构 (PDB 代 码： 1CWA)。这个结构是 CYPA 与其天然抑制剂环孢菌素 A(CsA) 的复合物晶体结构。从这 个结构中， 确定了 CYPA 的活性位点， 并且确定了活性位点中， 能够被 CsA 所抑制的若干关 键氨基酸位点。根据 CYPJ 与 CYPA 高度同源的序列， 我们与中国科学院上海药物所合作， 建立了 3D 结构模型， 并且在此后的蛋白结晶及结构解析时也得到了证实 (CYPJ PDB 代码 ： 1XYH)。针对 CypJ 活性位点， 对若干小分子数据库进行了筛选。用于筛选的小分子数据库 主要包括 SPECS 和 CNPD。最后筛选到了本发明的 FD2。整个计算过程是在中科院上海药物 所 64CPU-SGI ORIGN3800 计算机和上海超算中心 392CPU- 神威 I 超级计算机上进行的。
实施例 2 利用 BIAcore 分子互作仪验证虚拟筛选结果
BIAcore 分子互作仪是基于表面等离子共振技术来实现跟踪生物分子间的相互作 用， 无需任何标记物， 因此最大限度的保证了实验结果的真实性。实验时， 将目的生物分子(CypJ 蛋白 ) 固定在传感芯片表面， 然后将小分子化合物溶于溶剂并且流过芯片表面。 监测 器能实时跟踪检测溶液中的分子与芯片表面目的生物分子结合、 解离整个过程的变化。通 过 BIAcore 的结合数据， 本发明的 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯 甲酰胺与 CypJ 结合的平衡 - 解离常数 KD(M) ： 7.68×10-5。
实施例 3 利用酶活实验证明小分子化合物对 CypJ 酶活抑制的能力
测 定 CyP 活 性 的 方 法 很 多，但 以 α- 胰 凝 乳 蛋 白 酶 活 性 测 定 法 (α-chymotrypsin-coupled enzymic assay) 最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物， 如 N- 琥珀酰 -Ala-Ala-Pro-Phe 对硝基苯胺 (N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phep-nitroanilide) 在溶液中其顺式、 反式结构处于平衡， CyP 能催化该底物发生顺反异构作用， 即催化脯氨酸 由顺式变为反式 ； 当其处于反式结构时， C 端 p-nitroanilide 被 α- 胰凝乳蛋白酶裂解， 释 放出色素基团对硝基苯胺， 在 390nm 连续测定吸光值的变化即可得知 CyP 的 PPIase 活性。
本发明以不加小分子抑制剂的反应作为对照反应， 测定小分子配体在不同浓度下 对酶活反应的抑制率， 从而计算出小分子配体的 IC50 值。本发明的 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰胺 (Interchim 公司 ) 其酶活抑制 IC50 值 (μM) 为 74.8±1.44。 实施例 4MTS 法测定 FD2 对肿瘤细胞的生长抑制作用
人肝癌细胞株 SK-Hep1 细胞 (ATCC 公司 )3×103/ 孔接种至 96 孔板， 培养 24 小 时使之贴壁后加入 FD2(Interchim 公司 )， 设 6 个浓度梯度， 每个浓度设 3 个复孔。细胞在 37℃， 5％ CO2 条件下培养 72 小时后， 倒掉培养液， 用 MTS 试剂盒 (Promega 公司 ) 测定细胞 存活率， 测试方法为 ： 将细胞用无血清培养基洗一遍， 按照 100μl/well 的量加入预先配制 好的 MTS 显色溶液 (10ml 无血清培养基中加入 2ml 溶液 1 和 100μl 溶液 2， 充分混匀 )。将 一个没有细胞的孔设为本底孔， 用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继 续培养 2 ～ 4 小时， 然后用酶标仪读取光吸收值 ( 参考波长 630-700nm， 测定波长 490nm)， 计算细胞存活率， 以测定孔光吸收值 / 对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。
结果 ： 加入了 4-[(3-{[(2- 萘氧代 ) 乙酰基 ] 亚肼 } 正丁酰 ) 胺 ] 苯甲酰胺后， SK-Hep1 细胞的数量约为对照的 52％。
用同样的方法处理 sw480 细胞， 结果 sw480 细胞的数量约为对照的 78％。
实施例 5FD2 对克隆形成率的影响
SMMC7721 细胞 (ATCC 公司 )1000 个 / 皿接种于 60mm 细胞培养皿， 一组加入 FD2， 另 一组加入 DMSO 作为对照。连续培养 15-20 天时间， 中间酌情换液。用室温 1×PBS 洗一次， 加 2ml 预冷的甲醇 4℃固定 10min。弃去固定用的甲醇， 用预冷的 1×PBS 洗一次， 加 GIMESA 染色剂， 室温染色 10min， 清水洗 3 遍， 去浮色， 拍照、 计数。
根据细胞数目确定克隆大小， 大于 200 个细胞的称为大克隆， 100-200 个细胞之间 的称为中克隆， 50-100 个细胞之间的称为小克隆。 比较大中克隆之间的差异， 重复 2 次每次 三皿取平均值， 加入 FD2 后 SMMC7721 细胞所形成的克隆数显著少于加入 DMSO 后所形成的 克隆数。这些结果提示， FD2 能抑制细胞克隆形成。
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