一种抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的制备方法 【技术领域】
本发明涉及卵黄免疫球蛋白， 具体涉及抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的制备方法。背景技术 鸡卵黄免疫球蛋白 G 抗体是一种 7S 免疫球蛋白， 与哺乳动物 IgG 略有不同。该蛋 白质分子量约为 180kDa， 含两个亚单位， 即 67 ～ 70kDa 的重链和 22 ～ 30kDa 的轻链， 又称 IgY(Yolk Immunoglobulin)， 存在于免疫后母鸡的卵黄中。实验证明， 受免疫刺激后， 母鸡 产生免疫反应， 在输卵管内卵黄成熟期， 血液中 IgG 可被选择性地转移到卵黄中， 而且是卵 黄中唯一的免疫球蛋白类。早在 60 年代， 科学家们就发现鸡卵黄中存在 IgG 抗体， 其含量 与鸡血清相似甚至更高， 但一直未引起足够的重视。显然是由于很难将 IgG 抗体从丰富的 卵黄脂质中分离出来， 使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。直到 80 年代初， 科研人员 相继建立了有效且相对简便的聚乙二醇 (PEG) 提取法和硫酸葡聚糖提取法， 有关这方面的 研究便如雨后春笋般大量涌现， 并且被广泛应用在生物学的许多领域。
卵黄作为特异抗体 IgY 的来源有许多优点。如 ： 母鸡易于饲养， 费用不高 ； 收集鸡 蛋方便， 无需抽动物血， 无损伤， 符合现代动物保护规则 ； 产生有效免疫反应所需抗原量小， 尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原 性。因此， IgY 在免疫学检测方面正在受到愈来愈广泛的应用。在免疫治疗方面， 因鸡抗体 耐酸、 耐热且性能稳定， 可经口服用于预防或治疗年幼动物或人类的肠道传染病， 如婴儿防 病食品等。特别是抗生素或其它药物的使用存在问题时， IgY 成为首选。
引起人类腹泻的病原体主要是人轮状病毒和大肠埃希氏杆菌。人轮状病毒 (HRV) 是新生婴儿胃肠道感染并引起呕吐、 腹泻的最主要原因之一。 如果处理不当常导致死亡。 据 估计， 发展中国家每年有数百万婴幼儿因此而死亡。大肠埃希氏杆菌 (E.coli) 引起的腹泻 占腹泻发病病例的 30％以上。引起腹泻的大肠埃希氏杆菌分致病性、 产肠毒素性和侵袭性 等多种。
目前已见报道的有关抗腹泻卵黄免疫球蛋白 (IgY) 的研究， 其 IgY 都是单价的， 抗 腹泻的功能比较单一， 抗腹泻的范围比较狭窄。
发明内容 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种成本低、 产量 高、 应用范围广的抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 ： 一种抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的 制备方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ：
(1) 蛋鸡的免疫 ： 运用免疫学方法， 将大肠埃希氏杆菌和人轮状病毒制成疫苗后 同时对蛋鸡进行免疫， 均可在鸡血清和蛋黄中产生高效价的抗体， 并维持 35-50 天左右不 发生较大幅度的降低， 当鸡蛋中抗体效价出现较大程度的降低时， 通过追加免疫使其效价 恢复到接近最高水平， 且可持续 50 天左右， 收集鸡蛋制备具有抗腹泻功能的多价卵黄免疫
球蛋白 ；
(2) 抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白分离提纯 ： 采用水稀释法将步骤 (1) 收集的鸡蛋 的蛋黄进行脱脂处理， 得到抗腹泻功能的多价卵黄免疫球蛋白溶液， 将该溶液用 5 千膜浓 缩 4-8 倍， 然后在硫酸铵饱和度 45-50％， pH 值 6.0-7.0 的条件下盐析， 将沉淀溶解后先后 用 5 万膜和 5 千膜超滤， 将盐析和超滤处理的产品经层析处理进一步纯化即得产品。
所述的步骤 (1) 中蛋鸡的免疫时间为 ：
(1) 基础免疫 ： 19 周龄蛋鸡， 1ml/ 羽接种，
(2) 第一次加强免疫 ： 基础免疫后 14 天， 1.5ml/ 羽接种，
(3) 第二次加强免疫 ： 基础免疫后 35 天， 1.5ml/ 羽接种，
(4) 第一次追加免疫 ： 基础免疫后 112 天， 1.5ml/ 羽接种，
(5) 第二次追加免疫 ： 基础免疫后 175 天， 1.5ml/ 羽接种。
所述的步骤 (2) 中的水稀释法是在蛋黄中加入水进行稀释浸提， 然后进行离心分 离脱脂， 脱脂条件为 ： 稀释倍数为 8-10 倍， pH 值为 5-6， 浸提 2 小时， 离心条件为 5000rpm， 30min。
所述的步骤 (2) 中的层析处理是采用 SephadexG-200 柱进行层析处理。 本发明把几种引起人体腹泻的细菌和病毒制成疫苗后接种于蛋鸡， 使这些蛋鸡所 下的鸡蛋中含有具有抗腹泻功能的抗体， 然后再从鸡蛋中提炼这种多价卵黄抗体， 把它制 成口服液或添加到食品和饮料中， 用以防治病菌性腹泻。本发明的特点是将 HRV 和 E.coli 灭活苗同时对蛋鸡进行免疫， 使其所产的蛋中同时含有抗 HRV 和 E.coli 的抗体， 从这些鸡 蛋中提取的 IgY 为多价抗体， 它的功能多， 抗腹泻范围广。同时我们对 IgY 的稳定性进行改 进， 以保证其功能的发挥及保存。
与现有技术相比， 本发明具有以下优点 ：
(1) 使用混合疫苗 ( 四联苗 )， 降低免疫劳动强度 ；
(2) 成本低、 产量高 ；
(3)IgY 为多价抗体， 抗腹泻的范围广 ；
(4)IgY 的回收率高， 纯度高 ；
(5) 经稳定性处理后 IgY 的稳定性好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一种抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的制备方法， 该方法包括以下步骤 ：
(1) 蛋鸡的特异性免疫 ： 运用免疫学方法， 将大肠埃希氏杆菌 (A、 B 和 C) 和人轮状 病毒 (HRV) 制成疫苗后同时对蛋鸡进行免疫， 均可在鸡血清和蛋黄中产生高效价的特异性 抗体 ( 效价＞ 1 ∶ 256)， 并可维持 35-50 天左右不发生较大幅度的降低。当鸡蛋中抗体效 价出现较大程度的降低时， 可通过追加免疫使其效价恢复到接近最高水平， 且可持续 50 天 左右。另外， 多种疫苗同时免疫时有一定的协同增效作用。收集鸡蛋制备具有抗腹泻功能 的多价卵黄免疫球蛋白 (IgY)， 并验证其作用效果。具体免疫时间 ：
基础免疫 ： 19 周龄蛋鸡， 1ml/ 羽接种，第一次加强免疫 ： 基础免疫后 14 天， 1.5ml/ 羽接种，
第二次加强免疫 ： 基础免疫后 35 天， 1.5ml/ 羽接种，
第一次追加免疫 ： 基础免疫后 112 天， 1.5ml/ 羽接种，
第二次追加免疫 ： 基础免疫后 175 天， 1.5ml/ 羽接种 ；
(2) 抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白分离提纯 ： 水稀释法可以很好地将蛋黄中大部分 脂类分离。其脱脂的最优条件为 ： 稀释倍数为 8-10 倍、 pH 值为 5-6， 浸提时间为 2 小时、 离心条件为 5000rpm， 30min ； 此条件下 IgY 回收率为 92.73， 所得 IgY 溶液中 IgY 纯度约为 28.81％， 将此溶液， 用 5 千膜浓缩 4-8 倍， 然后在硫酸铵饱和度 45-50％， pH 值 6.0-7.0 的 条件下盐析， 将沉淀溶解后先后用 5 万膜和 5 千膜超滤， 可得到纯度约为 90％的 IgY 溶液， 整个分离提纯过程 IgY 回收率为 63.4％。将盐析和超滤处理的 IgY 经 SephadexG-200 柱层 析处理进一步纯化后， 可得到纯度达 97.42％的 IgY 溶液。
对采用上述方法得到的抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的稳定性进行研究 ： 研究 IgY 的物理化学性质， 探索提高 IgY 稳定性的途径， 以提高多价卵黄免疫球蛋白的效价， 研制出 具有抗腹泻功能的食品添加剂。
(1)pH 对 IgY 热稳定性的影响 ： 在 pH6.5-7.5 范围内耐热性最好， 在高 pH 值和在 低 pH 值时对热不稳定。
(2)IgY 热稳定保护剂的选择 ： 加入 0.4g/ml 的甘氨酸可使 IgY 溶液在 70℃， 25 分 钟加热时仍比较稳定。甘氨酸、 葡萄糖、 山梨醇、 蔗糖等对 IgY 的热稳定性均有一定保护作 用。
(3)IgY 储藏稳定性的研究 ： IgY 冻干粉在 4℃和常温下储藏时非常稳定， 可分别维 持 10 和 6 个月不发生显著变化 ； 37℃时可保藏 2-3 个月不发生变化。IgY 溶液在 -10℃下 冻藏时可维持 6 个月以上效价不会降低。但在 4℃时仅可维持 1 个月左右， 在 4℃下储藏 6 个月效价降低了 3 个中和滴度。IgY 溶液在 25℃和 37℃下保藏时很不稳定， 维持时间不到 1 个月。
(4) 肠 溶 IgY 胶 囊 的 制 作 ： IgY 胶 囊 在 15 ℃， 36 ％ 的 甲 醛 饱 和 蒸 汽 中 熏 蒸 18.5-22.5 小时， 可制成 IgY 肠溶性胶囊 . 在熏蒸的过程中 IgY 损失较少， 如在胶囊接口处， 用 20％的明胶封腰则效果更好。
(4)IgY 的技术指标 ：
项目 鸡蛋中浓度 ( 中和滴度 ) 鸡蛋中 IgY 回收率 (％ ) 初级产品纯度 (％ ) 冻干粉纯度 (％ ) 耐热性能 (℃ /min)主要技术性能指标 ≥ 7.0 ≥ 60 ≥ 90 ≥ 99 ≤ 70/155CN 101921334 A说耐酸碱性能 (PH) 硫酸铵残留量 (mg/ml)明书4 ≤ PH ≤ 10 0.75 ≥ 10 ≥64/5 页4℃条件下保存时间 ( 月 ) 常温下保存时间 ( 月 )
分别对免疫时间不同的产品进行测试， 其结构如下 ： 1. 收集基础免疫后 28 天鸡蛋所做产品测试 ：项目 鸡蛋中浓度 ( 中和滴度 ) 鸡蛋中 IgY 回收率 (％ ) 初级产品纯度 (％ ) 冻干粉纯度 (％ ) 耐热性能 (℃ /min) 耐酸碱性能 (PH) 硫酸铵残留量 (mg/ml) 主要技术性能指标 ≥ 7.5 ≥ 61.2 ≥ 91.3 ≥ 99.2 ≤ 70/15 4 ≤ PH ≤ 10 0.68
2. 收集基础免疫后 56 天鸡蛋所做产品测试 ：项目 鸡蛋中浓度 ( 中和滴度 ) 鸡蛋中 IgY 回收率 (％ ) 初级产品纯度 (％ ) 冻干粉纯度 (％ ) 耐热性能 (℃ /min) 耐酸碱性能 (PH) 主要技术性能指标 ≥ 9.5 ≥ 64.8 ≥ 93.5 ≥ 99.5 ≤ 70/15 4 ≤ PH ≤ 106CN 101921334 A说硫酸铵残留量 (mg/ml)明书0.655/5 页
3. 收集基础免疫后 84 天鸡蛋所做产品测试 ：项目 鸡蛋中浓度 ( 中和滴度 ) 鸡蛋中 IgY 回收率 (％ ) 初级产品纯度 (％ ) 冻干粉纯度 (％ ) 耐热性能 (℃ /min) 耐酸碱性能 (PH) 硫酸铵残留量 (mg/ml) 主要技术性能指标 ≥ 7.0 ≥ 61.6 ≥ 91.1 ≥ 99.1 ≤ 70/15 4 ≤ PH ≤ 10 0.677