桃果实病害生物防腐保鲜剂及用途和所用罗伦隐球酵母 【技术领域】
本发明涉及的是果实采后病害防治技术领域, 更具体的是一种桃果实生物防腐保鲜技术。 背景技术 由真菌引起的果实采后的腐烂变质是导致果实大量损失的主要原因之一。
桃是国内外主要水果品种之一, 目前世界总产量达 1100 万吨。中国是桃的原产 国, 也是目前世界桃产量最大的国家。桃果实富含维生素 C、 类胡罗卜素和酚类物质等抗氧 化剂, 深受人们的喜爱。 桃树适应性极广, 品种繁多, 主要可分为水蜜桃类、 黄肉桃类和油桃 类等。 水蜜桃和和油桃均属跃变型果实, 且由于采收期正值高温季节, 采后果实在常温下成 熟衰老和软化进程很快。 低温能延缓果实成熟衰老, 但桃果实对低温敏感, 在低温下长时间 贮藏易发生冷害症状。 中国发明专利 ( 一种油桃果实的贮藏方法, 专利号 200610042849.0) 公开了一种油桃果实的贮藏方法, 该方法包括对油桃果实的选择、 物理杀菌、 预冷处理、 装 袋密封、 入库冷藏五个步骤。 解决了油桃果实冷藏时果实品质损伤率高、 冷藏效果有限的技 术问题。中国发明专利申请号 200810162751.8( 一种水蜜桃果实贮藏方法 ) 公开了一种水 蜜桃果实贮藏方法, 该方法采用程序性降温, 对果实进行低温锻炼, 通过一定低温诱导果实 组织忍耐低温冷害能力, 低温冷藏 ; 可以有效减缓果实呼吸速率, 延长果实贮藏时间。
桃 果 实 采 后 易 受 多 种 真 菌 的 侵 染, 特 别 是 匍 枝 根 霉 (Rhizopus stolonifer) 引 起 的 软 腐 病, 链 核 盘 菌 (Monilinia fructicola) 引 起 的 褐 腐 病, 以及由扩展青霉 (Penicilliumexpansum) 引起的青霉病, 由灰葡萄孢 (Botrytis cinerea) 引起的灰霉病 等。这些病原菌主要依赖果实伤口或气孔、 皮孔等天然开口而侵染。传统上控制果实病害 主要依靠化学杀菌剂, 但由于化学杀菌剂存在着食品安全和环境保护的问题, 因此迫切需 要开发能替代化学杀菌剂的果实病害控制方法和技术。
利用微生物, 特别是酵母对病原真菌的拮抗活性的生物防腐保鲜技术, 作为一种 新型采后病害控制方法受到了国内外广泛的关注。 但目前拮抗酵母对病原物的控制效力与 杀菌剂相比还存在较大的差距。 通过商业化试验表明, 目前研究中的采后拮抗酵母, 包括国 外已商业化生产的拮抗酵母都只有在补充低剂量杀菌剂的条件下才能达到与杀菌剂 ( 正 常使用量 ) 同等的效果 (Droby 等, 2009 ; Sharma 等, 2009)。因此如何利用安全而且有效的 方法提高拮抗酵母的效力是影响采后拮抗酵母大规模推广应用的关键性问题。
罗伦隐球酵母 (Cryptococcus laurentii) 是国内外较广泛研究的采后生物防治 微生物菌株, 其拮抗机理涉及营养和空间竞争、 与病原菌粘合、 分泌 β-1, 3- 葡聚糖酶、 抗 降解病原菌分泌的真菌毒素和降解果实与激发 氧化胁迫、 诱导果实抗性或抗性相关反应、 病原菌孢子萌发相关的挥发物等。林丽等 (2003) 报道利用罗伦隐球酵母和低剂量杀菌剂 ( 扑海因 ) 能抑制桃果实青霉病和软腐病的发病率。Yao 和 Tian(2005) 报道罗伦隐球酵 母和茉莉酸能降低桃果实青霉病和褐腐病的发生。Zhang 等 (2007ab) 的研究表明, 罗伦 隐球酵母与热处理结合能减少桃果实的青霉病和灰霉病的发病率。中国发明专利 ( 专利
号 ZL200310115337.9, 用硅酸钠或硅酸钾防治果蔬采后病害的方法以及果蔬采后病害防治 液 ) 公开了一种利用硅酸盐及罗伦隐球酵母等控制甜樱桃、 黄瓜、 桃和冬枣等果实病害的 方法。 该发明专利显示, 利用硅酸钠或硅酸钾能降低桃果实病害的发病率 ; 但未显示利用罗 伦隐球酵母对桃果实病害的控制效应。中国发明专利申请号 200310115336.4( 一种生物拮 抗菌及其应用 ) 公开了一种利用罗伦隐球酵母和杀菌剂及氯化钙等防治甜樱桃、 冬枣及苹 果果实病害的方法 ; 中国发明专利申请号 200810128441.4( 一种生物活性果蔬保鲜膜 ) 公 开了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法 ; 中国发明申请 号 200910078858.9( 葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂 ) 公开一种 利用罗伦隐球酵母和硼酸盐等防治葡萄果实病害或脱粒的方法。另外, 中国发明专利 ( 专 利号 ZL200510090063.1, 一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基 ) 公开了一种罗伦隐 球酵母的培养基配方 ; 中国发明专利 ( 专利号 ZL200510090065.0, 酵母拮抗菌 C.laurentii 的真空冷冻干燥制品及其制备方法 ) 公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法 ; 中国发明申请专利 ( 申请号 200910079774.7, 一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法 ) 公 开了一种制备罗伦隐球酵母常温保存的胶囊剂制备方法。
壳聚糖是几丁质脱乙酰产物。作为一种可生物降解的天然物质, 壳聚糖不仅资源 丰富、 价格低廉、 无毒安全, 而且具有众多独特的功能, 在食品和采后保鲜等领域都有着广 泛的研究和应用。在采后领域, 国内外的研究重点关注壳聚糖具有的 3 个显著的生物学功 能, 即: 延缓果实成熟、 衰老、 维持采后品质的功能 ; 直接抑菌的功能和作为激发子诱导果 实抗性的功能 ( 等, 2006)。钙处理是采后保鲜的常用手段。据研究报道, 钙 处理不仅能延缓果实采后的成熟衰老, 维持采后品质, 而且还与果实对病害的抗性密切相 关。 例如, 不仅采前钙处理能降低桃果实褐腐病的发病率 ; 而且采后钙处理也能诱导梨果实 对黑斑病的抗性 (Tian 等, 2006 ; Elmer 等, 2007)。
参考文献
1. 林丽, 田世平, 秦国政, 徐勇 .2003. 两种拮抗酵母菌对桃果实贮藏期间主要病 害的防治效果 . 中国农业科学 36(12) : 1535 ~ 1539。
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为了解决上述技术问题, 本发明提供一种罗伦隐球酵母, 保藏名称为 : 罗伦隐球酵 母 (Cryptococcus laurentii)ZJU 10, 保藏单位 : 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心, 保藏地址 : 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号, 中国科学院微生物研究所 ; 保藏 日期 : 2010 年 1 月 20 日, 保藏号 : CGMCC NO.3590。
本发明还同时提供了一种桃果实病害生物防腐保鲜剂, 该保鲜剂由罗伦隐球酵母 9 悬浮液、 壳聚糖、 氯化钙和水组成 ; 每 1L 保鲜剂中含有 1×10 ~ 1×1012 个罗伦隐球酵母细 胞、 0.1 ~ 10g 的壳聚糖和 5 ~ 50g 的氯化钙, 其余为水。
本发明还同时提供了利用上述桃果实病害生物防腐保鲜剂进行的桃果实保鲜法, 包括以下步骤 :
1)、 预处理 :
用保鲜剂对采前桃果实进行表面喷洒或将采后的桃果实在保鲜剂中浸泡 1 ~ 5 分 钟;
2)、 将预处理后的桃果实进行常温或低温贮藏。
作为本发明的桃果实保鲜法的改进 : 常温是指 15 ~ 25℃, 低温是指 0 ~ 6℃。
本 发 明 提 供 的 桃 果 实 生 物 防 腐 保 鲜 方 法, 是将桃果实用罗伦隐球酵母 (Cryptococcuslaurentii, 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号
CGMCC 3590〕 悬浮液和病害控制增效剂 ( 壳聚糖和氯化钙 ) 复合进行处理, 然后进行常温或 低温贮藏。
本发明的桃果实生物防腐保鲜方法只有在确保酵母活性的基础上才能发挥最佳 的防腐效应, 通过复合增效, 能大幅度提高对果实病害的控制效果。
上述罗伦隐球酵母和病害控制增效剂的复合处理是指将病害控制增效成分直接 添加到酵母菌菌悬液中而制成的生物防腐保鲜剂。
上述果实生物保鲜处理可采用采前果实表面喷洒 ( 使果实表面湿润即可 ) 或采后 浸泡 1-5 分钟的方法。 所述果实为水蜜桃和油桃 ; 所述病害为软腐病和青霉病 ; 所述生物防 腐保鲜主要成分为罗伦隐球酵母悬浮液 ; 所述病害控制增效剂为壳聚糖和氯化钙。
上述罗伦隐球酵母悬浮液是指经过菌种活化, 并配制成的具有抑菌效果且浓度适 6 宜的酵母菌悬液, 其有效浓度为 1×10 细胞 / 毫升~ 1×109 细胞 / 毫升。
上述罗伦隐球酵母悬浮液是指经过菌种活化和制备而成。活化后的菌体在 3000rpm 条件下离心分离 10 分钟, 用灭菌蒸馏水洗 2 次, 去除培养介质 ; 用无菌蒸馏水重新 悬浮酵母细胞, 用血球记数板的方法确定酵母的浓度, 并用无菌蒸馏水调整到试验所需要 的浓度。 上述病害控制增效剂壳聚糖和氯化钙, 其有效浓度分别为, 每 1L 保鲜剂中含有 0.1 ~ 10g 的壳聚糖和 5 ~ 50g 的氯化钙。上述病害控制增效剂的有效浓度是指其使用量 确保不抑制拮抗酵母的生长和繁殖, 并能发挥壳聚糖和氯化钙特定生理功能的浓度。
本发明提供的生物防腐保鲜剂有效整合了拮抗酵母、 壳聚糖和氯化钙的抑菌和生 理活性, 从而显著抑制桃果实病害的发生和发展 ; 并能根据具体情况大幅度降低拮抗酵母、 壳聚糖的使用量, 从而显著降低成本。本发明具有安全高效、 环境友好, 病害防治效果突出 等优点。该技术的使用有利于转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方 法, 对确保食品安全, 环境保护和农业增效、 农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要 意义。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施例。
选用 “玉露” 作为水蜜桃 (Prunus persica L.) 果实 ; 选用 “沪油 2 号” 作为油桃 (Prunuspersica L.) 果实。壳聚糖可购自浙江澳兴生物科技有限公司, 氯化钙为分析纯无 水氯化钙。
实施例 1、 生物防腐保鲜剂对水蜜桃青霉病的控制
1 处理方法 :
1.1 生物保鲜剂配制 :
以下所用的 NYDA 培养基为 : 牛肉浸膏 8g, 酵母粉 5g, 葡萄糖 10g, 琼脂 20 克, 水定 容至 1000ml, 高压 (121℃, 30 分钟 ) 灭菌。所用的 NYDB 种子培养基为 : 牛肉浸膏 8g、 酵母 粉 5g、 葡萄糖 10g, 水定容至 1000ml, 高压 (121℃, 30 分钟 ) 灭菌。
罗伦隐球酵母 CGMCC NO.3590 在低温 (4℃ ) 下保存在 NYDA 培养基中。培养程序 依次为 :
①、 活化 : 罗伦隐球酵母 CGMCC NO.3590 先在 NYDA 培养基中 28℃培养 48 小时, 然后重复传代培养 2 次 ( 每次均为在 NYDA 培养基中 28℃培养 48 小时 ) ;
将上述重复传代培养 2 次所得的活化好的酵母用接种环接到 NYDB 种子培养基中, 于 200rpm、 28℃下培养 24 小时 ; 然后在相同条件下重复培养 1 次 ( 即将 NYDB 种子培养基 中培养而得的酵母再次用接种环接到 NYDB 种子培养基中, 200rpm、 28℃下培养 24 小时 ) ;
②、 液体培养 : 用步骤①活化所得的酵母按照 5% ( 重量比 ) 的接种量接到 NYDB 种 子培养基中, 在 200rpm、 28℃条件下培养 24 小时 ;
③、 离心分离 : 将步骤②液体培养后的所得物在 3000rpm 条件下, 离心 10 分钟, 并 用灭菌蒸馏水洗 2 次, 以去除培养介质 ;
④、 悬浮和确定浓度 : 用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞, 用血球记数板的方法确定 酵母的浓度, 并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。在浓度为 5×108 个细胞 /ml、 体积 为 2 升的罗伦隐球酵母悬浮液中缓慢加入浓度为 1% (w/v) 的壳聚糖溶液 1 升 ( 即每 L 壳 聚糖溶液中含有 10g 壳聚糖 ), 壳聚糖溶液加入完毕后继续搅拌混匀 5 分钟 ; 然后在保持搅 拌的条件下, 缓慢加入浓度为 10% (w/v) 的氯化钙溶液 1 升, 氯化钙溶液加入完毕后继续搅 拌混匀 5 分钟, 加水稀释到 10 升备用。该最终所得的每 L 保鲜剂中含有 1×1011 个罗伦隐 球酵母细胞、 1g 壳聚糖和 10g 氯化钙。 1.2 果实处理 : 可任选以下任意一种处理方式 :
处理一 : 选择无机械损伤、 未感染、 大小和成熟度等外观品质基本一致的桃果实, 用自来水冲洗、 并在室温 (25℃左右 ) 下放干。将桃果实在上述生物防腐保鲜剂溶液 ( 每 L 保鲜剂中含有 1×1011 个罗伦隐球酵母细胞、 1g 壳聚糖和 10g 氯化钙 ) 中浸泡 3 分钟后, 取 出放干, 然后放入保鲜薄膜袋中在室温 (25℃左右 ) 下保持 20 ~ 24 小时, 接着将果实从薄 膜袋中取出, 装箱贮藏。
处理二 : 采前采用喷壶喷洒的处理方法, 将上述生物防腐保鲜剂溶液 ( 每 L 保鲜 11 剂中含有 1×10 个罗伦隐球酵母细胞、 1g 壳聚糖和 10g 氯化钙 ) 喷在果实表面 ( 湿润即 可 ), 待干后取下果实放入保鲜薄膜袋中在室温 (25℃左右 ) 下保持 20 ~ 24 小时, 再将果 实从薄膜袋中取出, 装箱贮藏。
1.3 生物防腐保鲜效果评价 : 用消过毒的打孔器在水蜜桃每个果实表面形成统一 大小和深度的伤口 (30 ~ 50μl), 每个伤口处等量 ; 分别设置如下处理 :
处理 1 : 空白对照, 每个果实伤口处加入同伤口体积的无菌水, 2 小时以后在每个 4 伤口加入 30μl、 浓度为 1×10 个孢子 / 毫升的 P.expansum 孢子悬浮液 ;
处理 2 : 以浓度为 1×1011 个细胞 / 升的罗伦隐球酵母悬浮液替换无菌水, 其余同 处理 1 ;
处理 3 : 以浓度为 1% (w/v) 的壳聚糖溶液 ( 即, 每 L 溶液中含有 10g 壳聚糖 ) 替 换无菌水, 其余同处理 1 ;
处理 4 : 以浓度为 5% (w/v) 的氯化钙溶液 ( 即, 每 L 溶液中含有 50g 氯化钙 ) 替 换无菌水, 其余同处理 1 ;
处理 5 : 以保鲜剂 I( 每 L 保鲜剂 I 中含有 1×1011 个罗伦隐球酵母细胞和 11g 壳 聚糖 ) 替换无菌水, 其余同处理 1 ;
处理 6 : 以保鲜剂 II( 每 L 保鲜剂 II 中含有 1×1011 个罗伦隐球酵母细胞和 11g 氯化钙 ) 替换无菌水, 其余同处理 1 ;
处理 7 : 以浓度为 1×1012 个细胞 / 升的罗伦隐球酵母悬浮液替换无菌水, 其余同 处理 1 ;
处理 8 : 以本发明的生物防腐保鲜剂 ( 每 L 保鲜剂中含有 1×1011 个罗伦隐球酵母 细胞、 1g 壳聚糖和 10g 氯化钙 ) 替换无菌水, 其余同处理 1 ;
处理 9 : 以本发明的生物防腐保鲜剂 ( 每 L 保鲜剂中含有 1×1012 个罗伦隐球酵母 细胞、 10g 壳聚糖和 50g 氯化钙 ) 替换无菌水, 其余同处理 1 ;
处理 10 : 以本发明的生物防腐保鲜剂 ( 每 L 保鲜剂中含有 1×1010 个罗伦隐球酵 母细胞、 0.1g 壳聚糖和 5g 氯化钙 ) 替换无菌水, 其余同处理 1。
处理完毕后放入贮藏于常温下 (25℃ ), 并用 PE 塑料膜密封作保湿处理。每天定 时对果实病害进行观察和统计, 结果以平均病害发生率 (% ) 和平均病斑直径 (mm) 表示。 每处理重复 4 次, 每个重复 24 个果实。整个实验重复 2 次以上。
以下结果为在处理后 6 天检测而得。
2、 生物防腐保鲜效果评价结果
生物防腐保鲜剂对水蜜桃青霉病的控制效果如表 1 所示。
表 1、 对水蜜桃青霉病的控制效果
处理 处理 1( 空白对照 ) 处理 2 处理 3 处理 4 处理 5 处理 6 处理 7 处理 8( 中等浓度的本发明 ) 处理 9( 高浓度的本发明 ) 处理 10( 低浓度的本发明 )
发病率 (% ) 100±0 58.8±3.7 53.2±1.4 100±0 21.7±1.8 23.6±2.1 10.1±1.4 11.7±2.2 0±0 33.2±4.9病斑直径 (mm) 21.2±0.9 6.96±0.4 6.5±0.21 21.7±1.1 4.16±0.78 4.54±1.1 1.28±1.1 1.3±0.6 0±0 5.6±0.99实施例 2、 生物防腐保鲜剂对水蜜桃软腐病的控制 :
罗伦隐球酵母活化、 培养和制备如实施例 1 所述。生物防腐保鲜剂的制备方式同 实施例 1, 即最终所得的每 L 保鲜剂中含有 1×1011 个罗伦隐球酵母细胞、 1g 壳聚糖和 10g 氯化钙。
实验一、 水蜜桃果实经过挑选, 清洗和表面消毒后, 用消过毒的打孔器在水蜜桃每个果实表面形成统一大小和深度的伤口 (30 ~ 50μl), 每个伤口处等量 ; 该水蜜桃果实为 5 高成熟度 ( 硬度为 5.3±0.4×10 Pa) 水蜜桃果实 ; 分别设置如下处理 :
处理 1 : 空白对照, 每个果实伤口处加入同伤口体积的无菌水, 2 小时以后在每个 4 伤口加入 30μl、 浓度为 1×10 个孢子 / 毫升的 R.stolonifer 孢子悬浮液 ;
处理 2 : 以浓度为 1000 毫克 / 毫升的″丰收纯″杀菌剂溶液替换无菌水, 其余同 处理 1 ;
处理 3 : 以浓度为 1×1011 个细胞 / 升的罗伦隐球酵母悬浮液替换无菌水, 其余同 处理 1 ;
处理 4 : 以保鲜剂 I( 每 L 保鲜剂 I 中含有 1×1011 个罗伦隐球酵母细胞和 11g 壳 聚糖 ) 替换无菌水, 其余同处理 1 ;
处理 5 : 以保鲜剂 II( 每 L 保鲜剂 II 中含有 1×1011 个罗伦隐球酵母细胞和 11g 氯化钙 ) 替换无菌水, 其余同处理 1 ;
处理 6 : 以本发明的生物防腐保鲜剂 ( 该保鲜剂中含有 1×1011 个罗伦隐球酵母细 胞、 1g 壳聚糖和 10g 氯化钙 ) 替换无菌水, 其余同处理 1。
分别在 24 小时、 48 小时、 72 小时、 96 小时和 120 小时进行检测, 统计分析方式同实 施例 1, 结果如表 2-1 所示 :
表 2-1、 对高成熟度水蜜桃软腐病的控制效果
实验二、 以低成熟度 ( 硬度为 11.1±0.5×105Pa) 的水蜜桃果实替代实验一中的 高成熟度 ( 硬度为 (5.3±0.4×105Pa) 水蜜桃果实, 其余同实验一, 结果如表 2-2 所示 :
表 2-2、 对低成熟度水蜜桃软腐病的控制效果
处理 4 处理 5 处理 6( 本发明 )
0 0 00 0 00 0 02.8 3.7 09.3 10.1 0实施例 3、 生物防腐保鲜剂对油桃青霉病的控制效果 : 以油桃替代实施例 1 中的水蜜桃, 其余同实施例 1 ; 结果如表 3 所示。 表 3、 对油桃青霉病的控制效果处理 处理 1( 空白对照 ) 处理 2 处理 3 处理 4 处理 5 处理 6 处理 7 处理 8( 中等浓度的本发明 ) 处理 9( 高浓度的本发明 ) 处理 10( 低浓度的本发明 ) 发病率 (% ) 100±0 39.1±7.2 32.5±8.5 100±0 19.5±3.1 22.1±4.6 8.7±3.2 9.2±3.4 0±0 24.9±3.9 病斑直径 (mm) 19.4±0.8 5.3±2.1 4.6±0.5 21.1±0.7 3.1±0.8 4.1±0.3 0.8±0.3 1.0±0.6 0±0 3.3±0.4
实施例 4、 生物防腐保鲜剂对油桃软腐病的控制效果 以高成熟度的油桃果实替代实施例 2 的实验一中的高成熟度的水蜜桃果实, 其余同实施例 2 的实验一, 检测时间为 72 小时, 结果如表 4 所示 :
表 4、 对高成熟度油桃软腐病的控制效果
最后, 还需要注意的是, 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然, 本发 明不限于以上实施例, 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形, 均应认为是本发明的保护范围。11