用于预防 HIV 经上皮传播的组合物和方法 本申请是申请日为 2000 年 6 月 23 日、 申请号为 00811362.9( 国际申请号为 PCT/ US00/17293)、 发明名称为 “用于预防 HIV 经上皮传播的组合物和方法” 的发明申请的分案 申请。
美国政府根据分别由 NIDA 和 NIAID 批准的 DA 09717、 DA 09973、 DA 05972 和 AI 07417 号基金， 对本发明享有确定的权利。本申请要求 1999 年 6 月 24 日提交的， 已全文引 入本文作为参考的美国临时专利申请 60/140,698 的优先权。
发明领域 本发明涉及用于阻止人类免疫缺陷病毒 ( “HIV” ) 传播的方法、 组合物和制品。在 一个特别优选的实施方案中， 本发明涉及 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂以及它们在阻止 HIV 经粘 膜表面而传播中的应用。
参考
本文引用了多篇文献。这些文献的完全引用见下。除非特别指明， 这些文献均全 文引入本文作参考。
发明背景
理解病毒传播的机制是防止 HIV， 这种获得性免疫缺陷综合征 (AIDS) 的致病因子 扩散的关键。限制 AIDS 的世界范围内大流行， 很大程度上取决于阻止 HIV 进一步传播和扩 散的能力。
HIV-1 性传播的一个关键特点是最初与该病毒接触的阴道或粘膜表面覆盖着上皮 细胞， 它们并非一般情况下与 HIV-1 感染相关的细胞。为了跨过这道屏障， 病毒必须 (1) 直 接跨过上皮细胞或感染上皮细胞， (2) 与能在上皮细胞间移动的那些细胞结合， 或 (3) 延伸 (extend) 在上皮细胞间的那些可被感染的宿主细胞接触。 已有实验证据支持所有这些可能 性。此前的研究提示， 上皮细胞可被生殖性 (productively) 感染， 但传播至这些细胞或从 这些细胞开始传播需要直接与已感染的细胞或可感染的细胞接触。
HIV 潜伏感染的白细胞， CD4 白细胞和不相关个体的上皮细胞之间的物理接触可 激发 HIV-1 快速装配并释放至供体细胞与受体细胞之间的封闭空间。在这一过程中， 单核 细胞形成与上皮膜亲密接触的微绒毛。 隔离在这些部位的病毒体随后通过内在化而进入上 皮细胞内的吞噬体中。 这些观察得到其它很多项研究的支持， 它们证实， 细胞与细胞间的相 互作用是 HIV-1 有效传播至上皮细胞和从上皮细胞有效传播至其它部位的关键。
ICAM-1 是组成型表达于静息态内皮细胞、 静息态单核细胞、 静息态上皮细胞以 及活化的 T 细胞上的一种单链糖蛋白粘附分子。ICAM-1 的表达可由各种细胞因子包括 IFN-γ， TNF-α， 和 IL-1 来诱导。CD18 家族的细胞粘附分子介导免疫系统与炎症系统的细 胞之间的相互作用。LFA-1( 也称为淋巴细胞功能相关抗原 -1 或 CD11a/CD18) 可识别并结 合内皮细胞表面的 ICAM-1、 ICAM-2 和 ICAM-3。LFA-1 的异二聚体结构由一条 α 链以及一 条 β 链组成。作为整合蛋白家族的一个成员， LFA-1 在多种细胞过程如迁移、 抗原提呈、 和 细胞增殖中发挥作用。例如， LFA-1 介导白细胞对内皮细胞的结合， 使得白细胞可从血液中
迁移至组织中。ICAM-1 是 LFA-1 的主要配体。ICAM-1 通过一个跨膜结构域而锚着在内皮 细胞上， 它具有一个较短的胞浆尾， 含有 5 个细胞外免疫球蛋白样结构域， 可在被 HIV 感染 的单核细胞和上皮细胞上表达。
美国专利 5,891,841(“841 专利” ) 涉及用细胞间粘附分子 (ICAM-3) 抑制 HIV-1 所感染的细胞从循环系统迁移至其它部位的方法。根据此 “841 专利” ， 对上皮细胞、 内皮细 胞、 和成纤维细胞表面的 ICAM-1 的诱导可介导淋巴细胞的 LFA-1 依赖性粘附 ( 第 12 栏， 第 48-50 行 )。LFA-1 和 ICAM-1 互为受体， 它们在 “841 专利” 中分别被称为 “受体” 和 “配体” 。 同前。具体是， “841 专利” 涉及在 HIV 诱导的合胞体形成中 ICAM-1 与 LFA-1 之间的相互作 用。根据 “841 专利” ， LFA-1 对 ICAM-1 的亲和力相对于 ICAM-2 和 ICAM-3 为最大 ( 第 14 栏， 第 9-16 行 )。
美国专利 5,674,982( “982 专利” ) 涉及抗 ICAM-1 抗体通过干扰 LFA-1 与 ICAM-1 之间的相互作用而降低鼻病毒的感染性的应用。 PCT 申请 WO90/13316 A1 涉及通过使被 HIV 感染的白细胞具有与 ICAM-1 或 CD11/CD18 家族的一种分子结合的能力而抑制 HIV-1 感染 细胞从循环系统中迁移而出的方法。
这类粘附分子在与细胞结合的病毒或未与细胞结合的病毒的经上皮传播中的作 用尚无人提及。此前的方法和组合物都是通过阻断 ICAM-1 与 LFA-1 的相互作用而阻止病 毒从循环系统迁移至远离最初感染部位的其它部位。ICAM-1， 除了与 LFA-1 相互作用以外， 在暴露于 HIV 的部位或在病毒进入机体的部位的病毒传播中的作用， 至今无人提及。
目前需要的是用于在暴露于 HIV 的部位阻断该病毒经上皮传播的方法和组合物。
发明简述
本发明提供了用于阻止 HIV 经上皮传播至动物的方法、 组合物、 和制品。现有涉及 ICAM-1 的方法均是干扰 ICAM-1/LFA-1 结合和阻止病毒从循环系统， 穿过内皮细胞， 迁移至 机体组织中。本发明涉及在暴露于 HIV 的部位阻断该病毒的经上皮传播， 并阻止 HIV 感染 而不是在发生了感染后治疗感染。
在一个优选实施方案中， 本发明提供了在暴露于 HIV 的部位用 ICAM-1 激动剂 / 拮 抗剂阻断该病毒经上皮传播的方法。在另一优选实施方案中， 对病毒传播的阻断不需要阻 断 ICAM-1 与 LFA-1 的结合。在另一优选实施方案中， 本发明提供了用含有 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂的组合物或制品阻断该病毒跨过粘膜表面而经上皮传播的方法， 所述粘膜如生殖器 粘膜、 阴道粘膜、 直肠粘膜、 口腔粘膜、 胃肠道粘膜。本发明还提供了用能产生 ICAM-1 激动 剂 / 拮抗剂的遗传改造细菌接种粘膜表面的方法。
在另一优选实施方案中， 本发明提供了用于阻断 HIV 经上皮传播的药用组合物， 其含有 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂及一种可药用载体。在另一优选实施方案中， 本发明提供了 含有 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂和一种基体 (substrate) 的制品。优选的基体包括宫颈环、 避 孕套和宫内避孕器。
本发明的其它实施方案和优点将在下文举例说明， 并可从这些说明中显而易见， 或可通过本发明的实践而领悟。 本发明的目的和优点将通过所附权利要求书中具体指出的 方法和组合物而实现。
本发明还涉及 ：
1. 一种阻断 HIV 经上皮传播至动物体内的方法， 其包括在所述动物的暴露于所述HIV 的部位处提供一种抗 ICAM-1 抗体。
2. 项 1 的方法， 其中所述抗 ICAM-1 抗体是植物抗体。
3. 项 1 的方法， 其中所述抗 ICAM-1 抗体是抗人 ICAM-1IgG1 抗体。
4. 项 1 的方法， 其中所述 ICAM-1 抗体的量足以阻断 HIV 经上皮传播。
5. 项 4 的方法， 其中所述量为约 20μg/ml- 约 1000μg/ml。
6. 项 4 的方法， 其中所述量为约 5mg/ml- 约 10mg/ml。
7. 项 1 的方法， 其中所述动物是哺乳动物。
8. 项 1 的方法， 其中所述动物是人类。
9. 项 1 的方法， 其中所述抗 ICAM-1 抗体所用剂型选自乳膏、 泡沫剂、 口服液、 固体、 喷雾剂、 阴道洗液、 阴道冲洗剂、 栓剂、 母乳添加剂、 和婴儿配方食品。
10. 项 1 的方法， 其中所述抗 ICAM-1 抗体提供在一种载体中， 该载体含有选自下组 的物质 ： 润滑剂、 表面活性剂、 胶质、 有机溶剂、 乳化剂、 胶凝剂、 增湿剂、 稳定剂、 湿润剂、 控 释剂、 多价螯合剂、 染料、 和香料。
11. 项 1 的方法， 其中所述对 HIV 与细胞结合后传播的阻断不需要阻断 ICAM-1 与 LFA-1 的结合。 12. 项 1 的方法， 其中所述暴露位点为粘膜表面。
13. 项 12 的方法， 进一步包括在所述粘膜表面接种已经得到遗传改造的细菌， 其 中所述细菌能产生抗 ICAM-1 抗体。
14. 项 12 的方法， 其中所述粘膜表面选自生殖器、 阴道、 直肠、 口腔、 和胃肠道的表 面。
15. 一种阻断 HIV 与细胞结合后经上皮传播的方法， 其包括在动物的阴道上皮上 提供一种抗 ICAM-1 抗体， 其中所述对 HIV 与细胞结合后传播的阻断发生在所述动物的阴道 上皮处。
16. 一种能在暴露于 HIV 的经上皮位点处阻断所述 HIV 经上皮传播的组合物， 其包 含一种抗 ICAM-1 抗体和一种赋形剂， 其中所述抗 ICAM-1 抗体的量足以阻断 HIV 经上皮传 播。
17. 项 16 的组合物， 其中所述量为约 20μg/ml- 约 1000μg/ml，
18. 项 16 的组合物， 其中所述抗 ICAM-1 抗体是植物抗体。
19. 项 16 的组合物， 其中所述抗 ICAM-1 抗体是抗人 ICAM-1 IgG1 抗体。
20. 项 18 的组合物， 其中所述植物抗体的量为约 5mg/ml- 约 10mg/ml。
21. 项 16 的组合物， 其中所述组合物为母乳添加剂。
22. 项 16 的组合物， 其中所述组合物为婴儿配方食品。
23. 项 16 的组合物， 其中所述组合物为阴道洗液。
24. 项 16 的组合物， 其中所述组合物为口服液。
25. 项 16 的组合物， 其中所述组合物为栓剂。
26. 项 16 的组合物， 其中所述组合物为抗 ICAM-1 抗体， 而所述赋形剂为一种可药 用的载体。
27. 项 26 的组合物， 其中所述赋形剂选自润滑剂、 表面活性剂、 胶、 有机溶剂、 乳化 剂、 胶凝剂、 增湿剂、 稳定剂、 湿润剂、 控释剂、 多价螯合剂、 染料、 和香料。
28. 项 26 的组合物， 其中所述赋形剂为粘膜粘着剂。
29. 一种用于阻断 HIV 与细胞结合后经上皮传播的制品， 其包括一种基体和一种 抗 ICAM-1 抗体。
30. 项 29 的制品， 其中所述抗 ICAM-1 抗体浸透在所述基体中。
31. 项 29 的制品， 其中所述抗 ICAM-1 抗体涂布在所述基体表面。
32. 项 29 的制品， 其中所述基体选自海绵、 避孕套、 宫内避孕器、 宫颈环和隔膜。
33. 项 29 的制品， 其中所述基体含有一种避孕用品。
附图简述
图 1A-B 显 示 与 单 核 细 胞 结 合 的 HIV-1Ba-L、 与 PBL( 外 周 血 淋 巴 细 胞 ) 结 合 的 HIVBa-L、 以及不与细胞结合的病毒跨过单层上皮细胞的能力。
图 2A-B 显示被 HIV 感染的单核细胞随时间的传播 (A) 和具有不同接种细胞数的 情况下的传播 (B)。
图 3 证实， 人的宫颈上皮细胞单层提供了一道从单核细胞结合型 HIV-1、 PBL 结合 型 HIV-1、 或非细胞结合型病毒传播非细胞结合型 HIV-1 的屏障。
图 4A-B 证实， 抗 ICAM-1 抗体阻断单核细胞结合型 HIV-1 的传播。当抗 ICAM-1 抗 体针对 LFA-1 的 β 亚单位、 E- 钙依粘连蛋白 (cadherin)、 CD103 时， 可阻断单核细胞结合 型 HIV-1 的传播 (4A)， 同种型对照不能阻断传播 (4B)。 图 5 证实， 抗 ICAM-1 抗体可体内阻止细胞结合型 HIV 通过阴道传播所致感染。在 Hu-PBL-SCID 小鼠体内， HIV 的阴道传播被抗 ICAM-1 单克隆抗体彻底阻断。
图 6A-B 证实， 293T 细胞不表达 LFA-1。既不表达 ICAM-1 又不表达 LFA-1 的 293T 细胞感染了 HIV 后， 所致的 HIV 经上皮传播可被抗 ICAM-1 抗体阻断， 说明在暴露部位阻止 HIV 传播不需要 ICAM-1 与 LFA-1 的结合。
优选实施方案详述
目前绝大多数 HIV-1 感染是性传播、 主要是异性传播所致。虽然机械屏障， 如避孕 套， 可非常有效地阻止性传播， 但这种依赖于男性的保护方法通常不被接受或使处于最大 危险的妇女无法实施。绝大多数情况下， 处于新 HIV 感染的最大危险的妇女来自发展中国 家。然而， HIV-1 感染在非洲和东南亚的快速传播已增加了对防止 STD 传播的预防性干预 的最新紧迫需求。
本发明提供了在暴露于人类免疫缺陷病毒的部位使用 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂阻 断该病毒经上皮传播的组合物和方法。术语 “ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂” 指能阻断或刺激与 ICAM-1 正常功能相关的事件的化合物或生物分子。术语 “暴露部位” 指动物机体上暴露于 HIV 的部分， 如生殖器、 口腔、 直肠、 眼组织、 耳组织、 皮肤等。 根据本发明， 对 HIV 传播的阻断 无需阻断 ICAM-1 与 LFA-1 的结合。
在一优选实施方案中， 将 ICAM 拮抗剂提供至动物的粘膜表面， 包括但不限于生 殖器、 阴道、 直肠、 口腔或胃肠道的表面。粘膜表面具有通过性接触、 母婴传播途径、 以及 其它机制而接触 HIV 的潜在部位。ICAM 激动剂 / 拮抗剂可应用于诸如避孕套或宫内避 孕器等基体表面， 或提供在各种形式， 如阴道洗液 (vaginal wash)、 润滑剂、 杀精剂、 冲洗 剂 (douche)、 栓 剂、 母 乳 添 加 剂 (breast milk supplement)、 或 婴 儿 配 方 食 品 (infant formula) 中。
抗体是多功能的预防性干预手段， 特别适用于机体的各种部位， 尤其粘膜表面。 本 发明的抗体可在 HIV 感染的流行病学中调节 ICAM-1 的功能。其它激动剂 / 拮抗剂， 如反义 核苷酸序列和核酶， 也可用于调节 ICAM-1 的功能。抗体是可在疾病的预防中应用的一种高 度特异性杀微生物剂。粘膜抗体尤其有效， 因为它们一般通过使病原体脱离上皮而发挥作 用。 此外， 抗体结构的多样性使得能产生一种几乎是无穷尽的全能型抗原结合特异性， 这对 产生针对具体病原体的特异性杀微生物剂很重要。
术语 “抗体” 在本文中指人类免疫球蛋白 (Ig)、 人源化动物免疫球蛋白、 或衍生自 植物的人源化免疫球蛋白的全部， 所述 Ig 包括但不限于 IgG， IgM， IgA， IgE， 以及单价片段、 二价片段、 和多价片段等片段。优选的抗体包括在植物中产生的二价 IgG 型和多价 IgA 型 人类单克隆抗体 (“植物抗体 (plantibody)” )。另一种优选抗体是抗人 ICAM-1 IgG1。植 物抗体系统可轻易地用于产生具有指定特异性的大量抗体。 具有特殊化合价、 类别的抗体， 以及在 IgA 的情况下含有分泌型成分的抗体， 都可在谷类植物中产生。
出于多种原因， 分泌型 IgA 聚合物在植物中的表达要优于更传统的杂交瘤技术。 sIgA 的产生在植物中是一种单细胞系统， 而在哺乳动物产生系统中需要两种不同类型的细 胞。植物抗体系统具有一种 IgA 聚合物支架， 可在该支架中插入现有成熟抗体的 cDNA。植 物抗体与产生并维持在细胞培养中的抗体相比， 还具有较高稳定性， 且较不易被诱变。 能产 生抗体的植物比传统的杂交瘤细胞系保存时间长， 可使维持成本缩减 3-6 个数量级。此外， 植物抗体可无限增产， 即从一棵植物至数千亩植物， 并且无需考虑因细胞培养中潜在的病 毒污染所带来的安全性问题。 另一类优选的抗体是 sIgA， 它是粘膜表面 ( 包括阴道和宫颈 ) 的一种常见抗体。 该抗体与 IgG 类抗体在功能上的区别是， 大多数吞噬细胞表面缺乏 IgA 的 Fc 受体， 且 sIgA 不能通过经典途径固定补体。这些特性降低了 sIgA 的前炎性潜力， 这种潜力是在诸如胃肠 道或小支气管等部位， 当炎症可能导致功能受损的情况下， 一种非常有用的特征。sIgA 的 Fc 受体较少以及补体结合能力较弱使得这类免疫球蛋白不太可能诱导与某些 HIV-1 特异 性 IgG 相关的感染恶化问题。IgA 区别于 IgG 的另一点是， 它只与上皮细胞反应， 这种反应 通过表达于上皮细胞的 basolateral 表面的聚合物式 Ig 受体来介导。 IgA 二聚体与上皮细 胞表面的这些受体结合， 这些受体允许该抗体分子， 以及与之结合的任何抗原， 穿过上皮细 胞而不被降解。该受体的一部分在 IgA 分子脱离上皮细胞后仍与 IgA 结合， 产生 IgA 的分 泌片。聚合物式 Ig 受体的功能成分在不同物种 ( 包括小鼠和人类 ) 之间高度保守。
在另一优选实施方案中， 提供了一种预防性药用组合物， 其含有 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂及一种可药用载体。 “可药用载体” 指适用于粘膜表面的载体或赋形剂。可将 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂配制在任何合适的载体中， 只要拮抗剂和载体相容。拮抗剂的活性应不被 载体降低至不再阻断 HIV 传播的程度。载体可以为水性或非水性， 如含醇类或为油性， 或它 们的组合， 还可含有其它表面活性剂、 软化剂、 润滑剂、 稳定剂、 染料和活性成分如防腐剂、 抗生素、 避孕药、 杀精剂或药用试剂。所述组合物可以是乳膏、 泡沫剂、 洗剂、 软膏剂、 溶液、 固体和喷雾剂。
优选的载体适用于阴道、 口腔、 胃肠道、 及直肠。特别优选的载体为粘膜粘着 剂。适当的载体可包含有机溶剂、 乳化剂、 胶凝剂、 增湿剂 (moisturizer)、 稳定剂、 湿润剂 (wetting agent)、 控释剂、 多价螯合剂、 染料、 香料以及在粘膜给药的药用组合物中常用的
其它成分。
本发明的组合物可以是能用于阴道的阴道洗液或冲洗剂。含有 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂的母乳添加剂和婴儿配方食品优选通过口腔粘膜表面为婴儿提供 ICAM- 拮抗剂。
固体剂型包括栓剂、 粉剂、 和颗粒。在固体剂型中， 所述组合物可与至少一种惰性 稀释剂如蔗糖、 乳糖、 或淀粉混合且还可包含润滑剂、 缓冲剂、 以及本领域技术人员已知的 其它成分。
在本发明的方法、 组合物、 以及制品中， ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂的实际用量可以变 化， 以便在暴露于病毒的部位或病毒进入的部位获得具有所需预防性应答的量。 相应地， 对 剂量水平的选择取决于， 接触病毒的部位或病毒进入的部位的特点和位置， 所需的预防性 应答， 给药途径， 预防作用需要维持的时间以及其它因素。
用于本发明组合物、 制品、 和方法中的优选的激动剂 / 拮抗剂是抗 ICAM-1 抗体。 抗 体的有效浓度通常为约 20- 约 2000μg/ml， 但该浓度可根据具体情况变化。 抗 ICAM-1 植物 抗体的用量可达约 5-10mg/ml。
本发明的 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂可用任何适当的方法给药。优选将 ICAM-1 激动 剂 / 拮抗剂局部应用于粘膜表面以防止 HIV 传播。优选使抗 ICAM-1 抗体包含在一种粘膜 粘着剂赋形剂中而运送， 该赋形剂能使免疫球蛋白活性维持一至数天。
本发明的激动剂 / 拮抗剂还可通过能表达抗 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂 ( 如抗 ICAM-1 抗体、 抗 ICAM-1 反义分子、 ICAM-1 抗原、 或核酶 ) 的遗传改造型细菌来运送。 “遗传改造型” 细菌含有或转染有质粒 DNA 载体或其它载体， 如病毒载体， 裸露的 DNA 或 RNA， 它们包含编码 抗 ICAM 抗体的核苷酸， 抗 ICAM 反义核苷酸序列， 或核酶。优选的遗传改造型细菌是属于目 标粘膜 ( 即生殖道、 口腔等 ) 表面的正常菌群成员的那些。遗传改造型细菌可用任何适当 的重组 DNA 方法或本领域技术人员已知的其它方法产生。
在另一优选实施方案中， 提供了含有一种基体以及一种 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂的 制品。术语 “支持物” 指能浸透或涂布 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂并将 ICAM-1 激动剂 / 拮抗 剂运送至机体的粘膜表面的物品， 如海绵， 避孕套， 隔膜， 宫内避孕器， 或宫颈环。 例如， 避孕 套可通过喷射方式将所述拮抗剂涂布在其表面， 或在生产过程中用领域内已知的方法将所 述拮抗剂浸透在避孕套中。婴儿奶嘴也可用类似的方法涂布。在另一优选实施方案中， 将 抗 ICAM-1 抗体置于一种缓释产品中来运送， 如浸透了该抗体的宫颈环。
由于 HIV 主要通过性活动传播， 本发明的一个优选方法包括在性活动期间或之前 使本发明的激动剂 / 拮抗剂组合物与阴道上皮或其它粘膜表面接触。优选使用涂布或浸透 了 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂的避孕套等避孕用品， 或局部用药组合物如胶质或泡沫剂时， 所 用量足以防止 HIV 传播和感染。当希望强化避孕效果时， 可将所述组合物与一种杀精剂联 合使用。
在本发明的又一实施方案中， 可将 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂固定在一种固体 ( 如塑 料、 或类似材料 ) 的表面， 以便运送至暴露于 HIV 的部位。 适当的塑料有， 聚氯乙烯、 聚乙烯、 聚氨基甲酸酯或硅以及常用于容器和奶瓶的其它物质。 奶瓶， 包括配有奶嘴的奶瓶， 或其它 容器以及能装生物流体的导管可用足量的 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂涂布， 其量足以防止或阻 断与细胞结合的 HIV 的传播。所述激动剂 / 拮抗剂还可在塑料聚合物的聚合期间掺入， 然 后以控释形式从表面浸出。具体 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂和组合物阻断 HIV 经上皮传播的能力可在跨孔 (transwell) 培养系统中评估。优选的跨孔系统包含一种插件， 其能将 24 孔板的孔通过 一种可拆式网格分隔为上下两个室， 该网格含有直径 5m 的孔。将人类宫颈上皮细胞系如 ME180( 美国典型培养物保藏中心， Rockville， MD) 在该可拆式网格上培养至长满。使长满 14 的上皮细胞形成一道屏障， 该屏障不可通透 C - 菊粉， 而且相对于与外周血淋巴细胞 (PBL) 结合的病毒， 可选择性通透与巨噬细胞结合的病毒。穿过这道上皮障碍而传播的 HIV 将出 现在跨孔系统的下层小室中。因此， 可评估 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂阻断 HIV 跨过这道支持 已长满之上皮细胞屏障的网格而传播的能力。 该跨孔系统允许快速而直接地检查具有不同 特异性的 Mab 阻断与细胞结合的 HIV-1 跨过上皮细胞单层的能力。这类系统也可用于比较 抗体类别和同种型之间的相对效力。
ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂还可在具有十分接近于真实传播状况的动物模型体内进 行评估。例如， Hu/PBL-SCID 小鼠阴道传播模型是研究 HIV-1 传播的极好模型。移植到这 种小鼠体内的人类 PMBC 细胞在感染时 ( 细胞移植的 8-10 天后 )， 其活化状态类似于人的 外周血单核细胞 (PBMC) 中所见， 而明显区别于通常用于培养 HIV 的组织培养中所见。此 外， 对传播至 Hu-PBL-SCID 小鼠的变体的种系发生分析显示， 病毒传播不是随机的， 具有巨 噬细胞向性的病毒变体亚组被优选传播。这种传播模式与某些人类中的完全一样， 在这些 人体内， 只有非常有限范围的巨噬细胞向性病毒从供体传播至受体。可将 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂应用于已暴露给 HIV 的 Hu-PBL-SCID 小鼠， 以评估 ICAM-1 激动剂 / 拮抗剂阻断 HIV 体内传播的能力。 本发明的教导在具体问题或环境中的应用是在本领域技术人员通过本文之教导 而能实施的范围之内。本发明之产物及其应用方法的其它实例见于以下实施例。
实施例 1
分离无细胞的 HIV 以及被 HIV 感染的外周血淋巴细胞和单核细胞
HIV-1Ba-L(Advanced Biotechnologies Inc.， Columbia， MD) 是 HIV 的一种巨噬细 胞向性、 NSI、 CCR5- 应用型变体， 其市售产品为 1.0ml 等份试样 (1×10650％组织培养感染 剂量 (TCID50)/ml) 且保存在液氮中。应用于培养物之前将病毒原液新鲜解冻。
将已经白细胞分离术处理过的血液在 Ficoll Hypaque(Pharmacia， Piscataway， NJ) 上 离 心 而 分 离 人 的 PBMC。 将 总 PBMC 用 添 加 了 100U/ml 青 霉 素 /100mcg 链 霉 素、 10ng/ml 庆大霉素、 和 2mM L- 谷氨酰胺的 RPMI-1640( 培养基和所有添加物均来自 Life Technologies， Grand Island， NY) 稀释成 1×107/ml， 然后铺板于 75 或 150cm2 组织培养烧 瓶 (Corning ScientificProducts， Inc.， Cambridge， MA) 中。在培养的最初 12 小时内， 将 细胞重悬在添加了 20％热灭活的 FCS(56℃ 45min， Gemini Bio-Products， Inc.Calabasas， CA) 和 10 ％热灭活的 A/B 型人类血清 (HS ； Nabi， Boca Raton， FL) 的上述 RPMI-1640( 后 文 称 cRPMI) 中。 收 集 单 核 细 胞。 弃 去 未 粘 附 的 PBMC ； 将 粘 附 的 细 胞 用 冷 HBSS(Life Technologies) 从烧瓶中取出。通过测定表面抗原 CD14 的表达 (FITC- 标记的抗人 CD14 抗体， My-4 ； Coulter Immunotech， Hialeah， FL)， 确定粘附细胞中＞ 95％是单核细胞。将 6 3 单 核 细 胞 洗 涤 并 以 5×10 /ml 与 1×10 TCID50 的 HIV-1Ba-L 重 悬 于 25cm2 烧 瓶 (Corning ScientificProducts， Inc.) 中的 5ml cRPMI-10 ％ FCS 或 cRPMI-10 ％ HS 中， 于 37 ℃、 5％ CO2 中培养。24 小时后取出病毒培养液， 细胞用 cRPMI 洗涤一次， 添加新鲜的 cRPMI-10％
FCS 或 cRPMI-10％ HS。在感染后 (pi) 第 3 和第 7 天给培养物添加新鲜培养基。用冷 HBSS 或 0.02％ EDTA(Sigma Chemical Co.， St.Louis， MO) 从烧瓶中取出单核细胞， 用于在感染 后第 10 天进行的实验。
将 PBL( 外周血淋巴细胞 ) 在添加了 PHA(5μg/ml， Sigma) 的 cRPMI-10％ FCS 中 6 3 以 2×10 /ml 的密度重悬 48 小时。 用 1×10 TCID50HIV*1Ba-L 感染后， 用培养单核细胞的类似 方法培养 PBL， 区别在于 PBL 培养基含 10U/ml IL-2(Boehringer Mannheim， Indianapolis， IN)。单核细胞和 PBL 受 HIV-1 感染的程度可通过用 HIV-1 gag- 特异性引物 ( 正向引物 5 ’ -GCG-AGA-GCG-TCA-GTA-TTA-AGC-GG-3’ ， 和反向引物 5’ -TCT-GAT-AAT-GCT-GAA-AAC-ATGGG-3’ ) 以及如前述的相应标准和对照进行有限稀释 PCR 来确定。PCR 产物可通过在 1％琼 脂糖凝胶上电泳来观察。
无细胞的病毒衍生自 cRPMI-10％ FCS 或 cRPMI-10％ HS 中被 HIV-1Ba-L 感染的单核 细胞或被 HIV-1Ba-L 感染的 PBL。离心并滤过 0.2μm 的注射器滤膜 (Millipore， Bedford， MA) 使上清不含细胞。无细胞的病毒可通过 HIV p24ELISA(Dupont NEN， Boston， MA) 定量， 并通过与来自 HIV 阴性健康供体的 PBMC 共培养来确定 TCID50。
实施例 2 人类宫颈上皮细胞跨孔培养
将自发转化的人类宫颈上皮细胞系 ME-180(ATCC， Rockville， MD) 培养在 75cm2 烧 瓶中的 cRPMI-10％ FCS 中， 每 3 天通过用 0.05％胰蛋白酶 -EDTA(Life Technologies) 处 理细胞而常规传代。将 ME-180 细胞以 2×105/0.1ml cRPMI-10％ FCS 或 -10％ HS/5.0μm 铺在 12mm 直径的跨孔插件 (insert)(Corning Scientific Products， Inc.) 上。将跨孔中 的 ME-180 细胞维持在 37℃， 5％ CO2 下。每 2-3 天换培养基。7 天后， 细胞在跨孔插件上形 成极化的完整单层， 这可利用欧姆计 (ohmmeter)(Millipore) 监控横跨上皮的阻抗和用荧 光染料标记的抗 ZO1 抗体染色来证实， 其中所述 ZO1 是一种在上皮细胞紧密连接处发现的 蛋白 (20)(1 ∶ 50 稀释， Zymed， San Francisco， CA)。插件上的 ME-180 单层随时可用于在 培养至第 7- 第 10 天时进行实验。
实施例 3
经上皮迁移和 HIV-1 的传播
如 Bomsel 所述进行经上皮迁移试验， 有几处改动。简短说， 将 1×106 被 HIV-1Ba-L 感染的单核细胞、 1×106 被 HIV-1Ba-L 感染的 PBL、 或单核细胞或 PBL 培养上清中的无细胞 HIV-1 添加至上皮细胞单层的顶侧 (apical side)。进行时间过程的分析， 在将已感染的细 胞添加至插件后的 1-48 小时之间收集顶侧和基侧 (basal side) 的培养基。在 24 小时的 时候横跨单层的传播接近最大值， 选此时间点进行所有后续实验。单核细胞和 PBL 的活力 通过台盼兰 (Sigma) 排除法来评估， 然后将细胞添加至跨孔中， 传播 24 小时后， 结果总是＞ 90％。用 HIV-1 p24 抗原 ELISA 试验 (Dupont NEN) 定量顶侧和基侧上清液中 HIV-1p24 抗 原的量 ( 灵敏度为 12.5pg/ml-350pg/ml)。
实施例 4
传播阻断研究
将小鼠抗人 ICAM-1 抗体 (20μg/ml ； 及其稀释液 ； HA58(IgG1)， Pharmingen)， 抗 人 E- 钙依粘连蛋白抗体 (20μg/ml ； 67A4(IgG1)CoulterImmunotech， 和 E4.6(IgG1))、 抗人
CD103 抗体 (20μg/ml ； 2G5(IgG2a)， CoulterImmunotech， 和 αE7-1(IgG2a)、 αE7-2(IgG1) 和 αE7-3(IgG1))、 以及抗人 CD18 抗体 (20μg/ml ； L130(IgG1)， Becton Dickinson)、 或它 6 们各自的同种型对照添加至 1×10 被 HIV 感染的单核细胞或被 HIV 感染的 293T 细胞 ( 含 或不含 ICAM-1)， 然后将它们迅速添加至 ME-180 跨孔培养中。根据 AIDS ClinicalTrials Group(ACTG)Antibody Selection Working Group 为证实某种抗体在低至体内可获得的浓 度 (20-25μg/ml) 时的效力而建立的标准， 选择抗体的最高浓度 (20μg/ml)。 37℃， 5％ CO2 下培养 24 小时后， 收集顶侧和基侧的上清液。用 ELISA 定量 HIV-1 p24 抗原。
实施例 5
与单核细胞结合的 HIV-1 比与 PBL 结合的 HIV-1 或无细胞病毒更有效地跨过人的 宫颈上皮细胞
HIV-1 感染的单核细胞、 HIV-1 感染的 PBL、 或衍生自单核细胞或 PBL 培养的无细 胞的病毒 (cfv)， 将它们各自的 cRPMI-10％ FCS 溶液， 置于含有 ME-180 上皮细胞的铺满单 层的跨孔培养物的顶端 (apical) 小室中。评估与单核细胞结合的、 与 PBL 结合的、 或无细 胞的 HIV-1 跨过完整的人类宫颈上皮单层的程度 ( 图 1A)。(cRPMI-10％ FCS 培养基 (n ＝ 8 个供体， 比较单核细胞和 PBL 以及 PBL 和 cfv 之间 ap ＜ 0.05 ； 比较单核细胞和 cfv 之间 bp ＜ 0.001))。结果表示为来自 ME-180 跨孔培养物的基底 (basal) 上清液和各种接种物 的 HIV-1 p24 抗原浓度 (pg/ml)。 与单核细胞结合的病毒比与 PBL 结合的病毒跨过宫颈上皮的效力高约 5 倍。衍生 自任一种细胞类型的无细胞型病毒不能有效跨过该上皮单层， 且通常在 p24ELISA 试验中 低于可检测的极限。
为明确无细胞的 HIV-1 是否能被 Kage 及其同事提到的 FCS( 胎牛血清 ) 中的糖蛋 白抑制而不能跨过上皮单层， 用已在含 10％ HS 的 cRPMI 中培养的被 HIV-1 感染的单核细胞 或 cfv( 无细胞的病毒 ) 进行研究。在这些实验中， 培养在 cRPMI-10％ HS 中的单核细胞结 合型 HIV-1， 比培养在 cRPMI-10％ FCS 中的单核细胞结合型病毒更有效地跨过该上皮， 也比 培养在 cRPMI-10％ FCS 或 cRPMI-10％ HS 中的 cfv 更有效 ( 图 1B)(cRPMI-10％ FCS 或 HS 培养基 ( 每一实验中 n ＝ 3， 比较单核细胞 (mono)FCS 和 mono HS 之间 ap ＜ 0.5， 比较 cfv FCS 和 cfv HS 之间 bp ＜ 0.05， 比较 mono HS 和 cfv HS 之间 cp ＜ 0.005))。相对于在 10％ FCS 中测得的经上皮传播， 培养在 cRPMI-10％ HS 中的 cfv 能跨过完整上皮， 但水平显著低 于与细胞结合的病毒 (P ＜ 0.005)( 图 1B)。
在多个时间点评估顶部上清液中 HIV-1 p24 抗原， 以便确定病毒从接种至上皮顶 侧的被感染的单核细胞或 PBL 中释放出的程度。培养在 FCS 或 HS 中的被 HIV- 感染的单核 细胞和被 HIV- 感染的 PBL， 它们的上清液中 p24 抗原的浓度在整个感染期间保持彼此相当 的水平， 未出现显著差异 ( 数据未显示 )。
我们发现， 在基底 (basilar) 上清中测得的 HIV-1( 用 p24 浓度表示 ) 当与未被感 染的单核细胞或受 PHA 刺激的 PBL 混合培养时具有感染性， 随时间的推移， 培养物中 p24 抗 原的量增加 ( 数据未显示 )。
实施例 6
单核细胞以时间 - 依赖性且剂量 - 依赖性方式跨过宫颈上皮
制备带有 ME-180 的跨孔培养物， 将 cRPMI-10％ HS 中 1×106 个被 HIV- 感染的单
核细胞添加至该上皮的顶部侧以分析经上皮传播的动力学。被感染的单核细胞早在 4 小时 的时候就可以测到经上皮的迁移和 / 或经上皮的 HIV-1 传播 ( 图 2A)， 伴有基底 p24 水平的 6 升高， 直至 48 小时达到顶峰。类似地， 将 1×10 个细胞， 或其 5 倍稀释液， 添加至该上皮的 顶侧， 取基底侧上清液样品检测 p24 抗原的存在以确定能在上皮的基底侧检测到病毒所需 的最小细胞接种量。当应用 5,000 个被 HIV 感染的单核细胞时， 在基底培养基中一直能检 测到 HIV p24 抗原。如 LD-PCR 所测， 其中 1-5％的细胞被 HIV-1 感染 ( 数据未显示 )， 因此 这意味着少至 500 个被感染细胞就可持续传播 HIV-1。在跨孔的顶侧加入少至 1,000 个的 单核细胞 ( 感染率同样为 1-5％ )， 就可在基底侧上清液中检测到 p24( 图 2B)。
图 2 所示实验使用被 HIVBa-L- 感染的单核细胞在 cRPMI-10％ HS 中的溶液进行。 结果表示为基底上清中 HIV-1 p24 抗原的浓度 (pg/ml)。图中分别显示了随时间变化的实 验 (n ＝ 4) 和随接种量变化的实验 (n ＝ 2)。+ 基底 p24 介于 100-1,000pg/ml 之间 ； ++ 基 底 p24 介于 1,001-5,000pg/ml 之间 ； +++ 基底 p24 介于 5,001-30,000pg/ml 之间 ； - 基底 p24 低于检测的极限 (12.5pg/ml)。
实施例 7
完整的人类宫颈上皮限制了 HIV-1 的传播
此前曾显示， 位于跨孔插件中的人类宫颈上皮细胞单层形成了一种完整的极性表 面， 并提供了一种针对无细胞的 HIV-1 的明确屏障。以下实验用于确定宫颈上皮单层和将 跨孔小室分隔开的膜是否能提供一种限制 HIV-1 经上皮传播的屏障。为此， 测定跨孔下层 小室培养基中无 ME-180 存在时的 p24 抗原浓度。与由 HIV- 感染的单核细胞或 HIV- 感染 的 PBL 所传播的基底 HIV-1 p24 抗原的不同水平 ( 如图 1 所示 ) 相比， 在没有宫颈上皮细胞 的情况下， 下层小室的跨孔培养物中测得的 p24 抗原的量在单核细胞结合型 HIV-1、 PBL- 结 合型 HIV-1、 或无细胞型病毒之间无显著差异 (p ＞ 0.005)( 图 3)。这些数据表明， 膜的组 成和孔径大小不能限制 HIV-1 的传播， 反而是上皮细胞层的紧密连接以及被 HIV- 感染的细 胞与上皮之间的假定相互作用决定了经上皮传播 HIV-1 的程度。
图 3 所示数据分别表示为， 插件膜上有或没有 ME-180 上皮细胞时， 跨孔培养物的 基底侧或下层小室上清液中的 p24 抗原 (pg/ml)。图中还显示了另一个试验 (n ＝ 3)， 有或 没有 ME-180 的接种组之间的比较 p ＜ 0.05， 没有 ME-180 的接种组之间的比较 p ＞ 0.05。
实施例 8
抗 ICAM-1 抗体阻断单核细胞结合型 HIV-1 的传播
为了检查被 HIV 感染的单核细胞与上皮细胞之间的粘附作用是否经上皮迁移和 HIV-1 传播的关键， 将针对数种粘附分子的抗体添加至跨孔培养物中。 在被 HIV 感染的单核 细胞以及培养中剩余的细胞进行实验的同时添加针对 ICAM-1、 CD18、 E- 钙依粘连蛋白、 或 αE-β7 整合蛋白 (CD103) 的抗体 (1-20μg/ml)。所选抗体能靶向已显示参与免疫细胞与 上皮细胞之结合的特异性配体 - 受体相互作用。
ICAM-1 在被 HIV 感染的单核细胞和上皮细胞上表达。抗 ICAM-1 抗体阻断单核细 胞结合型 HIV-1 的传播， 如上皮细胞单层基底侧的 p24 抗原量所示 ( 图 4A)。CD18 分子是 淋巴细胞功能相关性抗原 LFA-1 的 β 亚单位， 其结合 ICAM-1 并参与 HIV 诱导的合胞体形 成。抗 CD18 抗体及其同种型对照不能阻断 HIV-1 的经上皮传播 ( 图 4A)。
为了测定对经上皮传播的抑制作用是否特异性针对 ICAM:LFA-1 相互作用， 检验了抗 E- 钙依粘连蛋白和 CD103 的抗体在跨孔系统中抑制 HIV-1 传播的能力。 E- 钙依粘连蛋 白表达在上皮细胞表面， 其配体 CD103 表达在单核细胞以及一个 PBL 亚类的表面。抗 E- 钙 依粘连蛋白抗体、 抗 CD103 抗体、 以及它们各自的同种型对照不能阻断 HIV-1 的经上皮传播 ( 图 4， A 和 B)。经测定， 被 HIV 感染的单核细胞与这些实验中使用的抗体一起保温不改变 从被感染细胞释放出的病毒量， 如保温 24 小时后顶部上清液中所测 ( 数据未显示 )。将抗 E- 钙依粘连蛋白 (20mg/ml)、 抗 CD103(20mg/ml)、 抗 CD18(LFA-1)(20mg/ml)、 鼠 IgG1(20mg/ ml) 和鼠 IgG2a(20mg/ml) 抗体与被感染的单核细胞一起添加至跨孔培养物中， 对 HIV-1 的 经上皮传播没有影响。图 4 的结果表示为基底侧上清液中的 HIV-1 p24 抗原， p ＜ 0.05。
实施例 9
抗 ICAM-1 MAB 抑制 HIV-1 在 HU-PBL-SCID 小鼠中的阴道传播
单克隆抗体在 Hu-PBL-SCID 小鼠中可提供对抗 HIV-1 的保护作用， 如此前的三项 研究所示。但是， 这些研究无一涉及抗 ICAM-1 抗体或提到对抗病毒之阴道传播的保护作 用。在所有例子中， Mab 可有效对抗携有其所针对的特异性表位的病毒， 但不能对抗异源 HIV-1 变体而提供交叉保护。
如表 1 所示， 阴道中应用抗 ICAM-1 的 Mab 彻底阻断了 SCID 小鼠模型中细胞结合 型 HIV-1 的阴道传播。结果具有统计学显著性 (p ＝ 0.03， 单侧 Fisher 真实性 (exact) 检 验； p ＝ 0.06， 双侧 Fisher 真实性检验 )。
表1
细胞攻击之前所给与的 Mab 抗 ICAM-1 对照 IgG1 Mab
被感染的小鼠 / 被攻击的小鼠 0/6 4/6实施例 10
对细胞结合型 HIV 的经上皮传播的阻断不需要阻断 ICAM-1 与 LFA-1 的结合
对并不在其表面表达 ICAM-1 的 293T 细胞进行转染， 以确定对细胞结合型 HIV 的 经上皮传播的阻断是否需要阻断 ICAM-1 与 LFA-1 的结合。结果表明， 被感染的 293T 细胞 能够跨过上皮细胞屏障传播 HIV-1， 而这种传播 ( 如跨孔系统的基底小室中 HIV-1 p24 抗原 的浓度所测 ) 可被抗 ICAM-1 抗体阻断 ( 表 2)。
表2
被转染的细胞抗 ICAM-1 抗体24h 后跨孔的下层小室中的 p24(pg/ml±SD) 9087.5±303.35* 2075±50.91*293T- 无 ICAM-1 293T- 无 ICAM-1
*无 20μg/mlp ＜ 0.001， 比较 p24 浓度的差异由于 ICAM-1 不在 293T 细胞表面表达 ( 数据未显示 )， 抗 ICAM-1 抗体阻断传播的 能力必须通过与 ME180 宫颈上皮细胞系 ( 已知其表达 ICAM-1) 表面的 ICAM-1 的相互作用。 流式细胞仪分析表明， 293T 细胞不表达 LFA-1( 图 6A-B)。由于 293T 细胞缺乏 LFA-1， 抗 ICAM-1 抗体不能通过阻断 ICAM-1 与其对应受体 LFA-1 之间的相互作用而阻断传播。
实施例 11
抗 ICAM-1 MAB 不引起阴道炎性应答
有一种潜在的担心是， 阴道内给与能针对免疫应答中起作用的配体的抗体可能激 发局部炎性应答。为了了解该问题， 我们每天 2 次， 连续 14 天在正常 BALB/c 小鼠阴道内给 与 20mg/ml 抗小鼠 ICAM-1 的 IgG2a 型 Mab、 20mg/ml 无关的 IgG2a 型 Mab、 或 5mg 伤寒沙门 菌 (Salmonella typhimirium) 脂多糖。抗 ICAM-1 Mab 在所处理的小鼠阴道上皮中未显示 毒性。
实施例 12
MAB 均未从阴道内给药处被吸收至血清中
Mab 均未从阴道内给药处被吸收至血清中。这一点可能使针对宿主抗原的 Mab 具 有潜在的临床应用意义。三只 SCID 小鼠每天 2 次接种 20mg 正常小鼠 IgG， 共 10 天。在第 4 天、 第 7 天、 和第 10 天注射后的刚刚 2 小时后， 用灵敏度为 0.1mg/ml 的 ELISA 试验分析小 鼠血清中小鼠 Ig 浓度的增加。小鼠 Ig 的基线值范围为 0-4mg/ml。在任何一只小鼠中， 在 所分析的任何时间点， 均未观察到小鼠抗体浓度的增加。 参考文献
1.Fultz， P.N.， H.M.McClure， H.Daugharty， A.Brodie， C.R.McGrath， B.Swenson， 和 D.P.Francis.1986. 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 经阴道传播至黑猩猩， J.Infect.Dis.154 ： 896.
2.Burkhard， M.J.， L.A.Obert， L.O“Neil， L.J.Diehl， 和 E.A.Hoover.1997. 细胞 结合型及无细胞型猫科动物免疫缺陷病毒的粘膜传播， AIDS Res.Hum.Retrovir.13 ： 347.
3.Miller ，C.J. ，N.J.Alexander ，S.Sutjipto ，A.A.Lackner ，A.Gettie ， A.G.Hendrickx， L.J.Lowenstein， M.Jennings， 和 P.A.Marx.1989. 猴免疫缺陷病毒的生殖 器粘膜传播 ： 人类免疫缺陷病毒异性传播的动物模型， 病毒学杂志 (J.Virol.)63 ： 4277.
4.Zacharopoulos， V.R， M.-E.Perotti， 和 D.M.Phillips.1997. 细胞迁移在 HIV-1 性传播中的作用， Curr.Biol.7 ： R534.
5.Fortin， J.-F.， R Cantin， G.Lamontagne， 和 M.Tremblay.1997. 掺入在 I 型人 类免疫缺陷病毒中的宿主衍生性 ICAM-1 糖蛋白具有生物学活性并能增强病毒的感染力， 病毒学杂志 71 ： 3588.
6.Fortin， J.-F.， R， ， R Cantin， 和 M.Tremblay.1998. 表达活化型 LFA-1 的 T 细 胞更易被携有宿主编码的 ICAM-1 的 I 型人类免疫缺陷病毒颗粒感染， 病毒学杂志 72 ： 2105
7.Rizzuto， C.D.， 和 J.G.Sodroski.1997. 病毒体 ICAM-1 对人类免疫缺陷病毒的 感染力以及其对中和作用的敏感性的贡献， 病毒学杂志 71 ： 4847.
8.Bomsel， M.1997. 感染性人类免疫缺陷病毒跨过致密的人类上皮细胞系屏障的 跨细胞作用 (transcytosis)， Nat.Med.3 ： 42.
9.D′ Souza， M.P.， D.Livnat， J.A.Bradac， 和 S.H.Bridges.1997. 通过中和试验
评估 I 型人类免疫缺陷病毒原代分离物的单克隆抗体 ： 筛选临床试验候选抗体时的性能标 准， J.Infect.Dis.175 ： 1056.
10.Kage， A.， E.Shoolian， K.Rokos， M.TMzel， R.Nuck， W.Reutter， E.K” ttgen， 和 G.Pauli.1998. 无细胞的 I 型人类免疫缺陷病毒以及 gp 120 包被的微粒的上皮吸收和转 运， 病毒学杂志 72 ： 4231.
11.Fais ，S. ，P.Borghi ，G.Gherardi ，M.Logozzi ，F.Belardelli ， 和 S.Gossani.1996.I 型人类免疫缺陷病毒在人类原代单核细胞中诱导细胞极化、 细胞间粘附 分子 -1 的再分配和多形核巨细胞的产生， 但不在单核细胞衍生的巨噬细胞中诱导上述结 果， Lab.Invest.75 ： 783.
12.Vermot-Desroches ， C. ，D.Rigal ，S.Escaich ，J.Bernaud ，C.Pichoud ， J.P.Lamelin， 和 C.Trepo.1991. 参与 HIV-1 诱导的合胞体形成的人类 CD11a/CD18 分子 (LFA-1， 淋巴细胞功能相关抗原 -1) 的功能性表位分析， Scand J.Immunol.34 ： 461.
13.Anderson， D.J.， 和 E.J.Yunis.1983.AIDS 中的 “特洛伊木马 (TrojanHorse)” 白细胞， N.Engl.J.Med.309 ： 984.
14.Levy， J.A.1988.AIDS 的传播 ： 感染细胞的情况 (the case of theinfected cell).J.A.M.A.259 ： 3037. 15.Collins， K.B.， B.K.Patterson， G.J.Naus， D.V.Landers 和 P. Gupta.2000. 开 发一种体外器官培养模型以便研究 HIV-1 在女性生殖道中的传播， Nat.Med.6 ： 475.
16.Agracetus.1994. 植物生物反应器系统， Agraceuts， Inc.
17.Bomsel ， M. ， M.Heyman ， H.Hocini ， S.Lagaye ， L.Belec ， C.Dupont ， 和 C.Desgranges.1998. 抗 HIV 包膜蛋白 dIgA 或 IgM 对 HIV 跨过致密上皮屏障的跨细胞作用 的胞内中和效应， 免疫 (Immunity).9 ： 277-287.
18.Bourinbaiar， A.S.， 和 D.M.Phillips.1991. 人类免疫缺陷病毒从单核细胞向 上皮的传播， J Acquir Immune Defic Syndr.4 ： 56-63.
19.Butini， L.， A.R.De Fougerolles， M.Vaccarezza， C.Graziosi， D.I.Cohen， M.Montroni， T.A.Springer， G.Pantaleo， 和 A.S.Fauci.1994. 细胞间粘附分子 (ICAM)-1 ICAM-2 和 ICAM-3 在人类免疫缺陷病毒介导的合胞体形成中作为淋巴细胞功能相关分子 1 的对应受体而发挥作用， 欧洲免疫学杂志 (EurJ Immunol).24 ： 2191-5.
20.de Fougerolles， A.R.， X.Qin， 和 T.A.Springer.1994. 免 疫 应 答 中 细 胞 间 粘附分子 (ICAM)-3 的功能鉴定以及与 ICAM-1 和 ICAM-2 的比较， 实验医学杂志 (J Exp Med).179 ： 619-29.
21.de Fougerolles， A.R， 和 T.A.Springer.1992. 细胞间粘附分子 3， 即静息态 淋巴细胞上淋巴细胞功能相关分子 1 的粘附作用的第三种对应受体， 实验医学杂志 175 ： 185-90.
22.Dustin， M.L.， O.Carpen， 和 T.A.Springer.1992.LFA-1 与 ICAM-1 受体对移动 及细胞与细胞间接触区域的调节， 免疫学杂志 (J Immunol.)148 ： 2654-63.
23.Fiedler， U.， 和 U.Conrad.1995. 转基因烟草种子中工程化抗体的高水平产生 和长期保存， 生物技术 (Biotechnology).13 ： 1090-1093.
24.Fortin， J.F.， R.Cantin， G.Lamontagne， 和 M.Tremblay.1997. 掺入在 I 型人
类免疫缺陷病毒中的宿主衍生性 ICAM-1 糖蛋白具有生物学活性并能增强病毒的感染力， 病毒学杂志 71 ： 3588-96.
25.Gauduin ，M.C. ，P.W.Parren ，R.Weir ，C.F.Barbas ，D.R.Burton ， 和 R.A.Koup.1997. 用人类单克隆抗体进行被动免疫可保护 hu-PBL-SCID 小鼠抵抗 HIV-1 原代 分离物的攻击， Nat Med.3 ： 1389-93.
26.Gauduin， M.C.， J.T.Safrit， R.Weir， M.S.Fung， 和 R.A.Koup.1995. 单克隆抗 体介导的针对 I 型人类免疫缺陷病毒感染的暴露前和暴露后保护作用， J Infect Dis.171 ： 1203-9.
27.Hiatt， A.， R.Caffertey， 和 K.Bowdish.1989. 抗体在转基因植物中的生成， 自 然 342 ： 76-78.
28.Hiatt， A.， 和 J.K.-C.Ma.1992. 通过工程化方法整合至植物中的单克隆抗体， FEBS Letters.307 ： 71-75.
2 9 . M a ，J . K . - C . ，A . H i a t t ，M . H e i n ，N . D . V i n e ，F . W a n g ，P . S t a b i l a ， C.vanDolleweerd， K.Mostov， 和 T.Lehner.1995. 分泌型抗体在植物中的产生和装配， 科学 268 ： 716-719.
30.Markham， R.B.， D.H.Schwartz， A.Templeton， J.B.Margolick， H.Farzadegan， D.Vlahov， 和 X.F.Yu.1996.I 型人类免疫缺陷病毒变体选择性传播至已经用人类外周血单 克隆细胞重建的 SCID 小鼠， 病毒学杂志 70 ： 6947-54.
31.Marlin， S.D.， 和 T.A.Springer.1987. 纯化的细胞间粘附分子 (ICAM-1) 是淋 巴细胞功能相关抗原 1(LFA-1) 的配体， 细胞 (cell)51 ： 813-9.
32.Milman， G.，和 O.Sharma.1994.HIV/SIV 粘 膜 传 播 的 机 制， AIDSRes Hum Retroviruses.10 ： 1305-12.
上述说明和实施例仅为举例说明实现本发明的目标、 特征和优势的优选实施方 案， 并非意图将本发明限制在该范围内。落在后续权利要求书的精神和范畴之内的本发明 任何修饰可以被认为是本发明的部分。