鸡新城疫、 传染性支气管炎、 传染性法氏囊病三联灭活疫苗 的生产方法 技术领域 本发明是一种用于预防鸡的新城疫、 传染性支气管炎、 传染性法氏囊病三种疫病 油乳剂疫苗的制备方法， 属于兽用生物制品领域。
背景技术 鸡新城疫 (newcastle disease， ND) 具有很高的发病率和病死率， 世界各地多有发 生， 且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击， 是危害养禽业的一种主要传染病。OIE 将其 列为 A 类疫病。( 殷震、 刘景华， 1997. 动物病毒学 . 北京 . 科学出版社 )
鸡传染性支气管炎 (Infectious Bronchitis， IB) 感染可导致雏鸡、 肉鸡发育缓 慢， 产蛋鸡产蛋减少和蛋品质下降等。OIE 将其列为 B 类疫病。( 殷震、 刘景华， 1997. 动物 病毒学 . 北京 . 科学出版社 )
鸡传染性法氏囊病 (Infectious bursal disease virus， IBD) 是由双 RNA 病毒科 中的传染性法氏囊病病毒引起的一种特殊疾病， 损害幼鸡法氏囊。特征是腹泻、 衰竭， 法氏 囊先发生显著炎症和增大， 继之以萎缩， 最后患鸡死亡。本病除造成一些雏鸡死亡外， 还常 引起病愈鸡免疫抑制， 导致免疫接种失败， 增加雏鸡对鸡新城疫等许多疾病的易感性。( 殷 震、 刘景华， 1997. 动物病毒学 . 北京 . 科学出版社 )
国内外现在上市的商品化产品品种很多， 但都是很单一的传统疫苗， 多次使用疫 苗尤其是灭活疫苗， 不仅增加鸡场人力和物力负担， 同时多次抓鸡的注射应激， 还会影响生 产性能， 致使鸡群对疾病的易感性增大。 加之近年来毒株的不断变异， 使得虽然推出的多种 选择的疫苗， 但仍然出现控制不住疫情发展的局面。 所以迫使我们在以往具有不散毒、 抗体 滴度高、 免疫保护期长、 受母源抗体影响小等优点的油乳剂灭活疫苗的基础上开发出更新 更好更适合预防这三种现状流行性疾病的产品。
发明内容
本发明的目的是制备鸡新城疫、 传染性支气管炎、 传染性法氏囊病的三种抗原， 并 进行合理复配制成鸡新城疫、 传染性支气管炎、 传染性法氏囊病三种疫病油乳剂疫苗， 可以 有效预防鸡新城疫、 传染性支气管炎、 传染性法氏囊病的发生， 同时也可以大大减少人们的 劳动强度， 降低养禽业养殖户的风险， 而且保证了公众健康。
该三联苗技术的主要相关内容和所采用的技术手段 ：
(1) 选育的新毒株要经过血清学、 分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴 定工作， 最后选出效价高、 免疫原性好并能抵御鸡传染性支气管炎流行毒攻击的一株较理 想的制苗用毒株。
(2) 在传统全病毒灭活疫苗的基础上结合基因工程亚单位疫苗的复配， 并且保证 各单一病毒在联苗中均有和单苗一样的效果。
(3) 利用美国进口的 Millipore 浓缩机将抗原经过超强浓缩， 抗体产生快， 效价高， 保护期长， 降低疫病的发生及蔓延。( 浓缩机的生产厂家， 美国密理博。型号为 CUP50)。
(4) 技术方案主要包括以下步骤 ：
1) 生产用菌毒种为 La Sota 株鸡新城疫病毒、 M41 株传染性支气管炎病毒和 E.coli BL21/pET28a-VP2 株表达 IBDV VP2 蛋白的大肠杆菌基因工程菌 ；
2) 分别按常规方法用鸡胚繁殖 La Sota 株鸡新城疫病毒和 M41 株传染性支气管 炎病毒， 收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液 ； 用加卡那霉素的 LB 液体培养 基培养表达 IBDV VP2 蛋白的大肠杆菌基因工程菌 E.coli BL21/pET28a-VP2 株 ( 本发明或 简称为 “基因工程菌” )， 经过破菌、 硫酸铵提取和灭菌工艺制备成表达的传染性法氏囊病毒 VP2 蛋白 ；
3) 将以上制备的三种灭活抗原混合后按常规方法制备灭活佐剂疫苗。
本发明的详细描述
1. 疫苗生产用菌毒种的来源
(1) 鸡新城疫病毒 La Sota 株和效检用鸡新城疫强毒北京株 (CVCC AV1611 株 ) 均 购于北京市海淀区中关村南大街 8 号中国兽医药品监察所 ；
(2) 鸡传染性支气管炎病毒 M41 株购于北京市海淀区中关村南大街 8 号中国兽医 药品监察所 ； (3) 表达 IBDV VP2 蛋白的大肠杆菌基因工程菌 E.coli BL21/pET28a-VP2 株 ( 中 国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保管， 菌株保藏编号为 M204038， 长江大学荣俊等提供， 荣 俊 .IBDVVP2 基因重组质粒 Pbv220 表达条件的优化。 《动物医学进展》 2007 年第 4 期 ； 荣 俊 . 传染性法氏囊病重组亚单位疫苗免疫效力及安全性试验 .《浙江农业科学》 2007 年第 6期)； 传染性法氏囊病病毒 BC6-85 株 (CVCC AV7 株 ) 购于北京市海淀区中关村南大街 8 号中国兽医药品监察所 ；
2. 生产用种毒的制备 ：
鸡新城疫病毒 La Sota 株生产用毒种制备 ： 将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释 -4 -5 ( 如 10 或 10 )， 尿囊腔内接种 10 日龄 SPF 鸡胚， 每胚 0.1ml。选接种后 72 ～ 120 小时死 亡且病痕明显的鸡胚， 分别收获鸡胚液 ( 尿囊液及羊水 )， 装于灭菌容器内。 将检验无菌、 对 1％鸡红细胞凝集价不低于 1 ∶ 512( 微量法 ) 的鸡胚液混合， 定量分装于无菌安瓿中， 冷冻 保存。注明收获日期、 毒种代次等。
鸡传染性支气管炎病毒 M41 株生产用毒种制备 ： 将毒种用灭菌生理盐水作适当稀 -2 -3 释 ( 如 10 ～ 10 )， 尿囊腔内接种 10 日龄 SPF 鸡胚， 每胚 0.1ml。选接种后 30 ～ 48 小时 内死亡的鸡胚及 48 小时存活的鸡胚胚液 ( 尿囊液及羊水 )， 装于无菌容器内。 将检验无菌、 6.0 病毒含量≥ 10 EID50/0.1ml、 对 1％鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合， 定量分装于无菌 安瓿中， 冷冻保存。注明收获日期、 毒种代次等。
表达鸡传染性法氏囊病病毒 VP2 蛋白的生产用菌种制备 ： 一级种子繁殖和鉴定将 各株冻干菌种分别接种于加卡那霉素的 LB 液体培养基中， 35 ～ 36℃培养 24 小时， 然后划 线接种于加卡那霉素的 LB 固体培养基上培养， 选取符合标准的典型菌落 10 个混合于少量 LB 培养液中， 接种于 LB 琼脂斜面若干支、 置 35 ～ 36℃培养 20 ～ 24 小时， 作为一级种子。 在 2 ～ 8℃保存， 不超过 14 日 ； 在培养基上传代， 应不超过 4 代。二级种子繁殖取一级种子 接种于加卡那霉素的 LB 培养液中， 35 ～ 36℃培养 20 ～ 24 小时。置 2 ～ 8℃保存， 应不超
过 3 日。 3. 制苗用病毒液的制备 ：
(1) 鸡新城疫病毒液的制备
接种取生产用毒种， 用灭菌生理盐水作适当稀释 ( 如 10-4 或 10-5)， 接种 10 ～ 11 日 龄易感鸡胚， 每胚 0.1ml， 接种后密封针孔， 置 36 ～ 37℃继续孵育， 不必翻胚。
孵育与观察鸡胚接种后， 每日照胚 1 次， 将 60 小时前死亡的鸡胚弃去。此后， 每 4 ～ 6 小时照胚 1 次， 死亡的胚随时取出， 至 96 小时， 无论死亡与否， 全部取出， 气室向上， 置 于 2 ～ 8℃冷却 12 ～ 24 小时。
收获将冷却的鸡胚取出， 收获鸡胚尿囊液 ( 先收活胚后收死胚 )。吸取胚液放于 50000ml 灭菌容器内， 抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于 1 ∶ 256( 微量法 ) 者应弃去。 同时按现行 《中国兽药典》 进行无菌检验 ( 可不移植 )， 应无菌生长。收获的胚液灭活前在 2 ～ 8℃保存， 应不超过 5 日。
浓缩将收获的胚液在 2 ～ 8℃条件下， 用超滤浓缩机浓缩， 至少浓缩 4 倍， 抽样测 定红细胞凝集价， 凝集价不低于 1 ∶ 2048( 微量法 ) 时停止浓缩， 按中华人民共和国兽药 典 ( 中国兽药典委员会 . 中华人民共和国兽药典二○○五年版 三部 . 中国农业出版社， 2005， 本发明以下简称为 《中国兽药典》 ) 规定的方法进行无菌检验 ( 可不移植 )， 应无菌生 长， 并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。
灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内， 计量加入 10％甲醛溶液， 开启搅拌机搅拌， 使其充分混合， 甲醛的最终浓度为 0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中， 以避免罐口附 近粘附的病毒未能接触灭活剂。 37℃灭活 16 小时 ( 以罐内温度达到 37℃开始计时， 开启搅 拌机连续搅拌 ) 后取出， 放 2 ～ 8℃保存， 应不超过 1 个月。
(2) 鸡传染性支气管炎病毒液的制备
接种取生产用毒种， 用灭菌生理盐水作适当稀释 ( 如 10-2 或 10-3)， 接种 10 ～ 11 日 龄易感鸡胚， 每胚 0.1ml， 接种后密封针孔， 置 36 ～ 37℃继续孵育， 不必翻胚。
孵育和观察鸡胚接种后 24 小时照胚 1 次， 弃去死胚。此后每 4 小时照胚 1 次， 死 亡的鸡胚随时取出， 直至 48 小时， 无论死亡与否， 全部取出， 气室向上直立， 置于 2 ～ 8℃中 冷却 12 ～ 24 小时。
收获 将冷却的鸡胚取出， 收获鸡胚尿囊液 ( 先收活胚后收死胚 )。吸取胚液放 于 50000ml 灭菌容器内， 抽样检测病毒含量， 应≥ 106.0EID50/0.1ml。同时按现行 《中国兽药 典》 进行无菌检验 ( 可不移植 )， 应无菌生长。收获的胚液灭活前在 2 ～ 8℃保存， 应不超过 5 日。
浓缩 将收获的胚液在 2 ～ 8℃条件下， 用超滤浓缩机浓缩， 至少浓缩 4 倍， 同时按 《中国兽药典》 进行无菌检验 ( 可不移植 )， 应无菌生长， 并留样备测毒价。浓缩后的胚液随 即进行灭活。
灭活 将传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内， 计量加入 10％甲醛溶液， 开启搅 拌机搅拌， 使其充分混合， 甲醛的最终浓度为 0.1％。 加甲醛溶液后导入另一灭活罐中， 以避 免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活 16 小时 ( 以罐内温度达到 37℃开始计 时， 开启搅拌机连续搅拌 ) 后取出， 放 2 ～ 8℃保存， 应不超过 1 个月。
(3) 鸡传染性法氏囊病病毒 VP2 蛋白的制备
菌液培养用培养罐通气培养， 按容积装入 70％培养基 ( 加卡那霉素的 LB 液体培养 基 ) 及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的 2％～ 4％接种二级种子菌液， 37℃培养， 待菌 液的 OD600 值达到 0.6 ～ 1.0， 加入 0.2mol/L α- 乳糖， 使终浓度达到 0.02mol/L， 再继续 培养 5 ～ 8h。开始小量通气， 逐渐增大气量。
破菌 培养结束后， 离心收集菌体。收集的菌体用 PBS 液清洗 2 次， 将收集的菌体 加适量 PBS 液进行重悬， 在 4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液， 3000r/min， 离心 30min， 收 集上清液。经硫酸铵沉淀后， 收集 VP2 蛋白液随即进行灭活。
灭菌将收集的上清液中按比例加入 10％的甲醛溶液， 开启搅拌机搅拌， 使其充分 混合， 甲醛溶液的最终浓度为 0.2％， 然后将胚液导入另一灭活罐内， 37℃灭活 12 小时 ( 以 罐内液体温度达到 37℃开始计时 )， 以灭活残存的大肠杆菌及毒素。2 ～ 8℃保存， 不超过 7日； -15℃以下保存， 不超过 60 日。
4. 灭活疫苗的制备 ：
经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备。
油相制备 取优质注射用白油 94 份， 硬脂酸铝 2 份， 在油相制备罐中混合均匀并 加热至 80℃后， 再加司本 -80 6 份， 至温度达到 125℃时维持 30 分钟， 冷却后备用。 水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、 传染性支气管炎病毒液、 鸡传染性法氏 囊病病毒 VP2 蛋白等量混合， 含有使 0.1ml 水相中鸡新城疫病毒含量不低于 108.0EID50， M41 6.0 株传染性支气管炎病毒含量不低于 10 EID50 ； 水相中传染性法氏囊病毒 VP2 蛋白效价按与 鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价计算不低于 1 ∶ 16。取灭菌后的吐温 -80 4 份， 加入配液罐中， 同时加混合抗原液 96 份， 充分振摇， 开动搅拌电机搅拌 20 ～ 30 分钟， 使 吐温 -80 完全溶解。
乳化取油相 3 份放入乳化罐中， 开动电机， 慢速转动搅拌， 同时徐徐加入水相 1 份 后， 再以 4000r/min 搅拌 30 ～ 40 分钟， 在终止搅拌前加入 1％硫柳汞溶液， 使其最终浓度为 0.01％。乳化后， 取疫苗 10ml 加入离心管中， 以 3000r/min 离心 15 分钟， 管底析出的水相 应≤ 0.5ml。
本发明采用的技术与现有技术的区别在于 ：
1. 表达鸡传染性法氏囊病病毒 VP2 蛋白的大肠杆菌基因工程菌 E.coli BL21/ pET28a-VP2 株 ( 生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗用的工程菌种 ) 是用分子生物 学的方法克隆的一株在我国流行的 IBDV 超强毒株的 VP2 基因， 对基因序列进行适当修饰后 加载到表达质粒载体 pET28a 上， 转化大肠杆菌 BL21 后制成的。此重组菌株可表达传染性 法氏囊病病毒的 VP2 蛋白， 提取 VP2 蛋白制备成疫苗， 免疫效果好、 生产工艺操作简单、 生产 成本低、 纯度高、 使用安全， 跟以往的制苗过程不一样， 并且将传统全病毒灭活疫苗的基础 上结合了基因工程亚单位疫苗的复配， 同时保证各单一病毒在联苗中均有和单苗一样的效 果。
2. 本发明所采用的浓缩工艺是利用美国进口的 Millipore 浓缩机浓缩， 虽然目前 国内外的一些厂家都采用此类浓缩技术， 但是我们在本产品的浓缩工艺环节中加大了抗原 浓缩倍数， 经过超强浓缩后的抗原， 制备疫苗后抗体产生快， 效价高， 保护期长， 降低了疫病 的发生及蔓延。
本发明的积极意义
本发明涉及一种鸡新城疫、 传染性支气管炎、 传染性法氏囊病三联灭活疫苗的生 产方法。本发明采用新城疫病毒 La Sota 株、 传染性支气管炎病毒 M41 株和表达鸡传染性 法氏囊病病毒 VP2 蛋白的大肠杆菌基因工程菌 E.coli BL21/pET28a-VP2 株作为生产菌毒 种， 超强浓缩工艺和优质佐剂制备成灭活疫苗， 免疫动物后抗体产生快， 效价高， 保护期长， 降低了疫病的发生及蔓延。 附图说明 ：
图 1 本发明工艺流程图
A1 熏蒸消毒 ： 是指消毒剂采用熏蒸的方法对培养鸡胚的孵化器进行彻底消毒。
A3 NDV、 IBV 接种鸡胚 ： 指鸡胚在孵化至 10 ～ 11 日龄时接种鸡新城疫、 传染性支 气管炎在鸡 胚内进行繁殖。
A4 收毒 ： 在培养到规定的时期， 将鸡胚中繁殖的鸡胚液病毒进行收获。
A5 病毒浓缩 ： 将收获的含毒鸡胚液在 2 ～ 8℃条件下采用美国 Millipore 超滤 浓缩机进行抗原的浓缩， 使其提高抗原含量， 并同时对抗原做了进一步的纯化。
A6 测毒价 ： 测其抗原的血凝价。 B5 破碎 ： 指传染性法氏囊的 VP2 蛋白离心后收集菌体， 加适量的 PBS 液进行重 悬， 在 4℃下用超声波破碎， 使其菌体内的蛋白充分释放出来。
C 灭活 ： 将 A 组和 B 组的抗原液都用适量的甲醛溶液进行灭活， 灭活掉抗原活性 及外毒素。
D 半成品检验 ： 是指要进行灭活检验、 VP2 蛋白含量检测、 无菌检验、 内毒素检 验， 使其各个指标在半成品时合格， 才能进行下一步。
E 抗原配比 ： 指鸡新城疫、 传染性支气管炎、 传染性法氏囊 3 组的水相的抗原配比 是 1 ∶ 1 ∶ 1。
F 乳化 ： 指将含有抗原的水相和油相按照一定的配比方法充分的混合在一起， 即 成为成品的疫苗状态。
最佳实施方式 ：
实施例 1
( 一 ) 抗原制备以及半成品检验 ：
1. 鸡新城疫病毒液的制备
(1) 接种取生产用毒种， 用灭菌生理盐水作适当稀释 ( 如 10-4 或 10-5)， 接种 10 ～ 11 日龄易感鸡胚， 每胚 0.1ml， 接种后密封针孔， 置 36 ～ 37℃继续孵育， 不必翻胚。
(2) 孵育与观察鸡胚接种后， 每日照胚 1 次， 将 60 小时前死亡的鸡胚弃去。此后， 每 4 ～ 6 小时照胚 1 次， 死亡的胚随时取出， 至 96 小时， 无论死亡与否， 全部取出， 气室向上， 置于 2 ～ 8℃冷却 12 ～ 24 小时。
(3) 收获将冷却的鸡胚取出， 收获鸡胚尿囊液 ( 先收活胚后收死胚 )。吸取胚液放 于 50000ml 灭菌容器内， 抽样测定红细胞凝集价。 凝集价低于 1 ∶ 256( 微量法 ) 者应弃去。 按现行 《中国兽药典》 进行无菌检验 ( 可不移植 )， 应无菌生长。收获的胚液灭活前在 2 ～ 8℃保存， 应不超过 5 日。
(4) 浓缩将收获的胚液在 2 ～ 8℃条件下， 用超滤浓缩机浓缩， 至少浓缩 4 倍， 抽样
测定红细胞凝集价， 凝集价不低于 1 ∶ 2048( 微量法 ) 时停止浓缩， 按 《中国兽药典》 进行 无菌检验 ( 可不移植 )， 应无菌生长， 并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。
(5) 灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内， 计量加入 10％甲醛溶液， 开启搅拌机 搅拌， 使其充分混合， 甲醛的最终浓度为 0.1％。 加甲醛溶液后导入另一灭活罐中， 以避免罐 口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。 37℃灭活 16 小时 ( 以罐内温度达到 37℃开始计时， 开 启搅拌机连续搅拌 ) 后取出， 放 2 ～ 8℃保存， 应不超过 1 个月。
2. 鸡传染性支气管炎病毒液的制备
(1) 接种 取生产用毒种， 用灭菌生理盐水作适当稀释 ( 如 10-2 或 10-3)， 接种 10 ～ 11 日龄易感鸡胚， 每胚 0.1ml， 接种后密封针孔， 置 36 ～ 37℃继续孵育， 不必翻胚。
(2) 孵育和观察 鸡胚接种后 24 小时照胚 1 次， 弃去死胚。此后每 4 小时照胚 1 次， 死亡的鸡胚随时取出， 直至 48 小时， 无论死亡与否， 全部取出， 气室向上直立， 置于 2 ～ 8℃中冷却 12 ～ 24 小时。
(3) 收获将冷却的鸡胚取出， 收获鸡胚尿囊液 ( 先收活胚后收死胚 )。吸取胚液放 于 50000ml 灭菌容器内， 抽样检测病毒含量， 应≥ 106.0EID50/0.1ml。按现行 《中国兽药典》 进行无菌检验 ( 可不移植 )， 应无菌生长。收获的胚液灭活前在 2 ～ 8℃保存， 应不超过 5 日。 (4) 浓缩将收获的胚液在 2 ～ 8℃条件下， 用超滤浓缩机浓缩， 至少浓缩 4 倍， 按 《中国兽药典》 进行无菌检验 ( 可不移植 )， 应无菌生长， 并留样备测毒价。浓缩后的胚液随 即进行灭活。
(5) 灭活将传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内， 计量加入 10％甲醛溶液， 开启 搅拌机搅拌， 使其充分混合， 甲醛的最终浓度为 0.1％。 加甲醛溶液后导入另一灭活罐中， 以 避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活 16 小时 ( 以罐内温度达到 37℃开始 计时， 开启搅拌机连续搅拌 ) 后取出， 放 2 ～ 8℃保存， 应不超过 1 个月。
3. 鸡传染性法氏囊病病毒 VP2 蛋白的制备
(1) 菌液培养用培养罐通气培养， 按容积装入 70％培养基 ( 加卡那霉素的 LB 液体 培养基 ) 及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的 2％～ 4％接种二级种子菌液， 37℃培养， 待菌液的 OD600 值达到 0.6 ～ 1.0， 加入 0.2mol/L α- 乳糖， 使终浓度达到 0.02mol/L， 再 继续培养 5 ～ 8h。开始小量通气， 逐渐增大气量。
(2) 破菌培养结束后， 离心收集菌体。收集的菌体用 PBS 液清洗 2 次， 将收集的菌 体加适量 PBS 液进行重悬， 在 4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液， 3000r/min， 离心 30min， 收集上清液。经硫酸铵沉淀后， 收集 VP2 蛋白液随即进行灭活。
(3) 灭菌将收集的上清液中按比例加入 10％的甲醛溶液， 开启搅拌机搅拌， 使其 充分混合， 甲醛溶液的最终浓度为 0.2％， 然后将胚液导入另一灭活罐内， 37℃灭活 12 小时 ( 以罐内液体温度达到 37℃开始计时 )， 以灭活残存的大肠杆菌及毒素。 2 ～ 8℃保存， 不超 过7日； -15℃以下保存， 不超过 60 日。
4. 半成品检验
(1) 鸡新城疫病毒液
1) 病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行 10 倍系列稀释， 取 10-7、 10-8、 10-9 3 个稀释度， 各尿囊腔内接种 10 ～ 11 日龄 SPF 鸡胚 5 个， 每胚 0.1ml， 置 36 ～ 37 ℃
继续孵育， 每日照胚 2 次， 观察 5 日， 无论死胚、 活胚均应测定红细胞凝集价， 凝集价不低于 8.7 1 ∶ 128( 微量法 ) 者， 判为感染， 计算 EID50， 每 0.1ml 病毒含量≥ 10 EID50 的胚液， 方可 用于制苗。
2) 红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液， 按现行 《中国兽药典》 进行测定， 其 凝集价不低于 1 ∶ 2048( 微量法 ) 者， 方可用于制苗。
3) 灭活检验 取 10 日龄 SPF 鸡胚 6 个， 尿囊腔内接种灭活病毒液， 每个 0.2ml， 置 36 ～ 37℃继续孵育， 每日照胚 2 次， 观察 5 日， 鸡胚非特异死亡应不超过 1 个。对所有胚液 分别测定红细胞凝集价， 均应不出现凝集， 将胚液收获再盲传一代， 仍无凝集价时， 认为灭 活完全。
4) 无菌检验 取灭活的胚液按现行 《中国兽药典》 进行检验， 应无菌生长。
(2) 传染性支气管炎病毒液
1) 病毒含量测定 将浓缩后灭活前取出的胚液进行 10 倍系列稀释， 取 10-5、 10-6 和 10-7 3 个稀释度， 分别尿囊腔内接种 10 日龄 SPF 鸡胚 5 个， 每胚 0.1ml， 每日照胚 2 次， 观察 6 日。6 日后收取鸡胚， 无论死胚、 活胚 ( 接种后 24 小时内死亡者除外 ) 均称重观察鸡 胚病变， 其胎儿具有失水、 卷缩、 发育小 ( 接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少 2 克以上 ) 等特异性病痕者， 判为感染， 计算 EID50。每 0.1ml 病毒含量≥ 106.7EID50， 方可用于制苗。
2) 无菌检验取灭活的病毒液， 按现行 《中国兽药典》 进行检验， 应无菌生长。
3) 灭活检验 取 10 日龄 SPF 鸡胚 6 个， 尿囊腔内接种灭活病毒液， 每个 0.2ml， 置 36 ～ 37℃继续孵育， 每日照胚 2 次， 观察 5 日， 鸡胚非特异性死亡应不超过 1 个。对所有鸡 胚进行检验， 应均不出现失水、 卷缩、 发育小等现象。将胚液收获再盲传一代， 仍不出现失 水、 蜷缩、 发育小等现象时， 认为灭活完全。
(3) 鸡传染性法氏囊病病毒 VP2 蛋白
1)VP2 含量检测将制苗用 VP2 蛋白液对鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清 ( 购自中 国兽医药品监察所 ) 按常规方法进行琼脂扩散试验， 上清液中表达产物 VP2 的滴度 (AGP 效 价 ) 不低于 1 ∶ 64 者， 方可用于制苗。
2) 无菌检验按 《中国兽药典》 进行， 应无菌生长。
3) 内毒素检测 将灭菌后的 VP2 蛋白液按 “附注” 方法进行内毒素检测， 内毒素 含量不高于 1000EU/ml 者 ( 用内毒素＜ 0.125EU/ml 的氯化钠注射液将 VP2 蛋白稀释 1000 倍， 鲎试剂盒检测为阴性 )， 方可用于制苗。
( 二 ) 疫苗制备 ：
(1) 油相制备 取优质注射用白油 94 份， 硬脂酸铝 2 份， 在油相制备罐中混合均匀 并加热至 80℃后， 再加司本 -80 6 份， 至温度达到 125℃时维持 30 分钟， 冷却后备用。
(2) 水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、 传染性支气管炎病毒液、 鸡传染性法 8.0 氏囊病病毒 VP2 蛋白等量混合， 使 0.1ml 水相中鸡新城疫病毒含量不低于 10 EID50， 鸡传染 6.0 性支气管炎病毒含量不低于 10 EID50 ； 水相中传染性法氏囊病毒 VP2 蛋白效价按与鸡传染 性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价计不低于 1 ∶ 16。取灭菌后的吐温 -80 4 份， 加入 配液罐中， 同时加混合抗原液 96 份， 充分振摇， 开动搅拌电机搅拌 20 ～ 30 分钟， 使吐温 -80 完全溶解。
(3) 乳化 取油相 3 份放入乳化罐中， 开动电机， 慢速转动搅拌， 同时徐徐加入水相 1 份后， 再以 4000r/min 搅拌 30 ～ 40 分钟， 在终止搅拌前加入 1％硫柳汞溶液， 使其最终 浓度为 0.01％。乳化后， 取疫苗 10ml 加入离心管中， 以 3000r/min 离心 15 分钟， 管底析出 的水相应≤ 0.5ml。
(4) 分装定量分装， 加盖密封。
实施例 2
成品检验
1. 性状
外观 乳白色乳剂。
剂型 油包水型。取一清洁吸管， 吸取少量疫苗滴入冷水中， 除第 1 滴外， 均应不 扩散。
稳定性吸取疫苗 10ml 加入离心管中， 以 3000r/min 离心 15 分钟， 管底析出的水相 应≤ 0.5ml。
粘度用 1ml 吸管 ( 下口内径为 1.2mm， 上口内径为 2.7mm) 吸取 25 ℃左右的疫苗 1ml， 令其垂直自然流出， 记录流出 0.4ml 所需的时间， 应在 6 秒以内。
2. 无菌检验 按现行 《中国兽药典》 进行， 应无菌生长。 3. 安全检验 用 7 ～ 14 日龄 SPF 鸡 10 只， 每只肌肉或颈部皮下注射疫苗 1ml， 观 察 14 日， 应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
4. 效力检验
(1) 鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验， 结果不符合规定时， 可采用 免疫攻毒法进行检验。
1) 血清学方法 用 30 ～ 60 日龄 SPF 鸡 15 只， 10 只各皮下或肌肉注射疫苗 20μl， 另 5 只不免疫作对照。接种后 21 ～ 28 日， 每只鸡分别采血， 分离血清， 按现行 《中国兽药 典》 进行 HI 抗体效价测定。免疫组 HI 抗体效价的几何平均值应不低于 1 ∶ 16( 微量法 )， 未免疫对照组 HI 抗体效价的几何平均值应不高于 1 ∶ 4( 微量法 )。
2) 免疫攻毒法 用 30 ～ 60 日龄 SPF 鸡 15 只， 10 只各皮下或肌肉注射疫苗 20μl， 另 5 只不免疫作对照。接种后 21 ～ 28 日， 每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒 5.0 (CVCC AV1611 株 )10 ELD50， 观察 14 日。对照组应全部死亡， 免疫组应保护至少 7 只。
(2) 鸡传染性支气管炎部分用 14 ～ 42 日龄 SPF 鸡 25 只， 其中 20 只各点眼、 滴鼻 接种传染性支气管炎活疫苗 (H120 株 )1 羽份 (0.05ml)， 另 5 只不接种作为对照。接种后 21 ～ 28 日， 分别采血， 分离血清， 同时免疫鸡再分别肌肉接种三联灭活疫苗 0.3ml， 二免后 21 ～ 28 日再将免疫鸡和对照鸡分别采血， 分离血清。将两次血清分别测 HI 抗体效价。免 疫组二免血清 HI 抗体效价的几何平均值应比首免血清高 4 倍以上， 未免疫对照组血清 HI 抗体效价的几何平均值应不高于 1 ∶ 8( 微量法 )。
(3) 鸡传染性法氏囊病部分效力检验 以下方法任择其一。
1) 血清学方法 取 21 ～ 28 日龄 SPF 鸡 20 只， 其中 10 只各肌肉或颈部皮下注射 疫苗 0.2ml， 另外 10 只不免疫作为对照， 同群饲养。接种后 21 ～ 28 日， 每只鸡分别采血， 分 离血清， 做琼脂免疫扩散试验。免疫鸡应至少有 8 只琼扩效价不低于 1 ∶ 8， 对照鸡应全部 阴性。
2) 免疫攻毒法 取 21 ～ 28 日龄 SPF 鸡 20 只， 其中 10 只各肌肉或颈部皮下注射疫
苗 0.2ml， 另外 10 只不免疫作为对照， 同条件下隔离饲养。 接种后 21 ～ 28 日， 所有免疫鸡和 对照鸡， 每只点眼途径接种 100 倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒 BC6-85 株毒液 0.1ml( 实 含毒量≥ 100 个 BID)。攻毒后， 每天观察鸡只的临床表现， 记录发病和死亡鸡数， 至 72 ～ 96 小时， 扑杀存活鸡， 逐只剖解， 观察法氏囊等病变。 免疫鸡应至少 8 只正常， 不出现法氏囊 病变 ； 对照鸡应至少 8 只发病， 出现明显的法氏囊病变 ( 如胸肌或腿肌条状出血、 法氏囊肿 大或萎缩、 发黄、 内有胶冻样分泌物等一种以上病变 )。
5. 甲醛、 汞类防腐剂残留量测定按现行 《中国兽药典》 进行测定， 符合 “兽用生物 制品通则的规定” 。
附注 ：
凝胶法检查细菌内毒素
Pyrosate 内毒素快速检测试剂盒
Pyrosate 凝胶法内毒素快速检测试剂盒作为世界上唯一的凝胶法内毒素快速检 测试剂， 主要用于水、 裂解液、 透析液等终产品的内毒素的快速检测。
【成分】 样品检测管 (SPL) ： 管内壁有鲎试剂
样品阳性检测对照管 (PPC) ： 管内壁有内毒素 吸管
【特异性】 Pyrosate 凝胶法内毒素快速检测试剂盒只对内毒素产生特异性， 并排除 了 (1， 3)-β-D-glucans 引起的假阳性结果。
【敏感性】 本试剂盒的灵敏度为 1EU/ml。
【作用与用途】 用于水、 裂解液、 透析液等终产品的内毒素检测。
【贮藏】 室温保存， 有效期为 120 个月。
【规格】 10 次 / 盒。
操作述式 ：
(1) 在 37℃温箱中预热所用器具。
(2) 将供试品用氯化钠注射液 ( 内毒素＜ 0.125EU/ml) 适当稀释成不同倍数， 待 测。
(3) 将 0.5ml 稀释不同倍数的供试品小心加入样品检测管 (SPL)， 并轻轻混匀。
(4) 用无热原的吸管小心地从样品检测管中吸取 0.25ml 的供试品加入样品阳性 检测管 (PPC)， 轻轻混合 60 秒， 即可。
(5) 将完全混匀后的样品检测管和样品阳性检测管放置于 37℃培养 30min。
(6) 倒置样品检测管和样品阳性检测管， 观察有无凝集。
(7) 当阳性对照检测管 (PPC) 完全凝集判试验成立。
(8) 若样品检测管有凝集反应， 说明该稀释度的供试品中内毒素的含量≥ 1.0EU/ ml ； 若样品检测管中无凝集反应， 说明该稀释度的供试品中内毒素含量＜ 1.0EU/ml。根据 稀释度计算原供试品中内毒素含量。