一种二氧化硅超声成像造影材料的制备方法 【技术领域】
本发明涉及超声成像造影材料领域， 具体为一种二氧化硅超声成像造影材料的制备方法。 背景技术 超声造影是超声技术继二维灰阶超声、 彩色多普勒超声之后的第三次革命， 它是 利用外界物质注入体腔、 管道或血管内， 根据注入物与组织间回声的不同或者声特性阻抗 间的显著差别， 从而增强对脏器或者病变的显示。随着分子生物学技术的延伸和发展以及 分子影像技术的发展和超声成像仪器性能的改进， 超声造影技术以能有效的增强各个脏器 的二维超声成像， 反映正常组织和病变组织不同的血流灌注、 造影剂分布和影像动态变化 情况， 在病变诊断和鉴别方面的优越性越来越为人们所广泛关注。
第一代微泡造影剂选用自由气体， 如空气、 氮气等， 由于在血液循环中持续时间极 短、 微泡大小不一、 不能通过肺循环等缺点， 未能在临床广泛应用 ； 第二代微泡造影剂则在 微泡外周包裹上蛋白质或者脂质体等外壳成分或者稳定剂， 比较具有代表性的为 Albunex 和 Levovist ； 第三代微泡造影剂则在弹性外壳的韧性及采用的低弥散度大分子量的气体 成分等方面做了很大的改进， 采用的气体为己烷、 全氟丙烷、 六氟化硫等， 外壳成分为聚合 物， 如聚乙烯乙二醇、 聚氰基丙烯酸酯等， 此类造影剂主要有 Ecogen、 Optison、 Sonoveue 等。
但是， 这些采用有机小分子或者聚合物进行组装而成的微泡， 其粒径不均一， 难以 控制得到均一的形态 ； 在超声波的作用下， 这种柔性囊泡极易破裂， 导致成像时间短， 无法 长期跟踪观察病变组织。此外， 功能化的脂质体或者聚合物的价格昂贵。而最近所报道的 纳米级微泡除了存在以上问题外， 在血液循环中的耐压性和稳定性还不够理想， 且其形成 的纳米空腔体积不够大， 造成回声特性较差， 增强效果不明显。
多孔二氧化硅纳米材料被广泛认为具有良好的生物相容性、 化学和热力学稳定 性， 具有较大的比表面积， 孔径可调等优点 ； 而且在其孔道和表面利用功能化的硅源极易得 到修饰有氨基、 羧基或者巯基等活性官能团， 能够进一步与药物或者发光物质等相结合， 得 到多功能的纳米材料。 另外， 利用相反电荷吸附凝聚法、 层层自组装模板法等方法制得中空 的 SiO2 微球的技术不断研究发展。但是， 目前国内外对二氧化硅微球的研究主要在药物或 者 DNA 的运输以及药物的释放等方面， 而在超声成像领域的应用研究鲜见报道， 因而有待 于我们对其进行研究。
发明内容 本发明的目的在于提供一种二氧化硅超声成像造影材料的制备方法。
本发明的新型 SiO2 超声成像造影剂材料是通过以下方法制得 ： 利用硬模板， 在水 醇体系中， 水解非功能化硅源和带有氨基的功能化硅源， 从而得到表面带氨基的硅球， 萃 取除去硬模板， 得到粒径非常均一中空的表面带氨基的 SiO2 球 ； 再通过其表面的氨基与聚
乙二醇 (PEG) 羧基相偶合进行表面修饰， 便可以在其表面修饰上生物相容性很好的聚乙二 醇， 得到分散性和生物相容性很好， 具有宜的空腔尺寸和壳层厚度， 可适用于超声成像的 SiO2 超声成像造影材料。
步骤包括 ：
(1) 将硬模板分散于水和醇的混合液中， 加入非功能化硅源和带有氨基的功能化 硅源， 两者的重量比为 8 ～ 20 ∶ 1， 用氨水调节 PH 至 8 ～ 10， 搅拌水解， 取沉淀得到表面带 氨基的 SiO2 微球 ； 所述的醇优选为异丙醇 ； 所述的非功能化硅源为正硅酸四乙酯、 四甲氧 基硅烷或乙烯基三甲氧基硅烷， 优选为正硅酸四乙酯 ； 所述的带有氨基的功能化硅源功能 化硅源为 3- 氨基丙基硅烷、 γ- 氨基丙基三乙氧基硅烷或 3- 巯基丙基三甲氧基硅烷， 优选 为 3- 氨基丙基硅烷 ；
所述的硬模板为表面带正电荷的聚合物小球， 粒径为 100nm ～ 1.2μm， 可选用聚 苯乙烯 (PS) 微球、 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 微球或聚酰胺 - 胺 (PAMAM) 微球 ；
(2) 萃取除去硬模板， 得到表面带氨基的中空 SiO2 微球 ；
述萃取除去硬模板的方法为 ： 将表面带氨基的 SiO2 微球分散在四氢呋喃中， 15 ～ 60℃下萃取 8 ～ 10 小时 ； 表面带氨基的 SiO2 微球与四氢呋喃用量比为 0.5 ～ 2mg/ml ； (3) 将聚乙二醇溶解在有机溶剂中， 加入缩合剂和连接剂， 搅拌 1 ～ 3hr， 活化羧 基， 再加入表面带氨基的中空 SiO2 微球， 搅拌 6 ～ 10hr， 洗涤取沉淀 ；
氨基与聚乙二醇的摩尔比为 1 ∶ 0.8 ～ 1.2 ；
有机溶剂可选用二甲基亚砜。
缩合剂与连接剂的摩尔比为 1 ∶ 1 ～ 3 ； 缩合剂选自 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙 基碳二亚胺 (EDC) 或 N， N， - 二环己基碳二亚胺 (DCC， Dicyclohexylcarbodiimide) ； 连接剂 选自 N- 羟基丁二酰亚胺 (NHS)。
该方法中， 先用硬模板， 在水和体系中水解硅源， 在制备表面带氨基的中空 SiO2 微 球时以聚苯乙烯微球为模板， 在水和异丙醇体系中水解硅源， 再通过萃取去除模板， 得到中 空的 SiO2 微球 ； 然后在常温下将 PEG 的羧基充分活化， 连接到由此方法得到的 SiO2 微球粒 径均一， 分散性好， 水溶性好。且所用原料具有低毒或无毒， 价格低廉等优点。
本发明所选用的表面修饰材料为聚乙二醇， 其为公认的生物相容性好的生物大分 子， 其价格适宜， 无毒， 常被用于生物医药研究中， 是一种非常优良的生物有机大分子。
该方法中， 制备聚乙二醇修饰的 SiO2 微球时， 采用的是在常温活化羧基， 再与氨基 反应的方法。 由于该实验必须将羧基活化充分， 才可让其与氨基充分完全的反应， 所以活化 羧基一步很重要。
本发明制得 SiO2 纳米微球， 粒径均一， 平均粒径为 960nm， 壳层厚度适宜， 为 30 ～ 50nm， 分散性好， 具有适宜的空腔尺寸， 适用于超声成像， 这种材料常温下非常稳定， 且生物 相容性非常好。
本发明在简单及普通的实验装置条件下， 即可制备分散性好、 粒径均匀、 空腔适 宜、 壳层恰当的中空纳米微球。反应时间短， 所需原材料易得， 价格低廉， 操作过程简单， 副 产物无公害。 该发明为纳米超声成像造影剂材料的合成制备提供了一种经济与实用的新方 法。
附图说明 图 1 为实施例 1 所制备的 SiP2 中空微球的透射电镜图。
图 2 为实施例 1 所制备的 SiO2 中空微球的场发射扫描电镜图。
图 3 为实施例 1 所制备的 SiO2 中空微球的红外光谱图。红外谱图， 从图上看， -1 -1 3443cm 处为 N-H 的伸缩振动特征峰， 2918cm 为 C-H 的不对称伸缩振动特征峰， 2845cm-1 为 C-H 的对称伸缩振动特征峰， 1640cm-1 为 N-H 的面内伸缩振动特征峰， 1068cm-1 为 Si-O-Si 的伸缩振动特征峰， 465cm-1 为 Si-O 的伸缩振动特征峰。由此可知， 实施例 1 所制备的微球 为表面带氨基的 SiO2 微球。
图 4 为实施例 3 所制备的 SiO2 超声成像造影剂材料的场发射扫描电镜图， 由图可 以看出， 经修饰后其形态几乎未发生明显变化。
图 5 为实施例 3 所制备的 SiO2 超声成像造影剂材料的红外光谱图。从图上看， -1 3445cm 处为 N-H 的伸缩振动特征峰， 2918cm-1 为 C-H 的不对称伸缩振动特征峰， 2845cm-1 为 C-H 的对称伸缩振动特征峰， 1640cm-1 为 N-H 的面内伸缩振动特征峰， 1070cm-1 为 Si-O-Si 的伸缩振动特征峰以及聚乙二醇中 C-O-C 的伸缩振动特征峰， 465cm-1 为 Si-O 的伸缩振动 特征峰。由此可知， 实施例 2 所制备的 SiO2 中空微球表面成功修饰上了聚乙二醇。
图 6 为实施例 3 所制备的 SiO2 超声成像造影剂材料的 Zeta 电位图， 左图 (A) 和 右图 (B) 分别为实施例 2 所制备 SiO2 中空微球和实施例 3 包裹了 PEG 的 SiO2 超声成像造 影剂材料 Zeta 电位图。修饰前的 SiO2 微球所带电荷为 29.4mV， 经修饰聚乙二醇后其表面 电荷为 22.2， 进一步说明聚乙二醇成功修饰在了 SiO2 中空微球表面。
图 7 为实施例 3 所制备的 SiO2 在造影条件下的体外超声成像图， 由图可以看出所 制备的 SiO2 超声成像造影剂材料可以在体外明显增强超声成像的对比度。
图 8 为实施例 3 所制备的 SiO2 超声成像造影剂材料在体外的二维灰阶超声成像 图。
具体实施方式
为了更好地理解发明的实质， 下面通过实施例来详细说明发明的技术内容， 但本 发明的内容并不局限于此。聚苯乙烯微球也可用聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 微球或 聚酰胺 - 胺 (PAMAM) 微球代替 ； 正硅酸四乙酯可用四甲氧基硅烷或乙烯基三甲氧基硅烷代 替， 或者 3- 氨基丙基硅烷用 γ- 氨基丙基三乙氧基硅烷或 3- 巯基丙基三甲氧基硅烷代替， 效果相同。
实施例 1
量取 0.25mL 的商用聚苯乙烯微球 ( 粒径为 1μm)(5％， wt/v)， 加入 7mL 蒸馏水， 30mL 的异丙醇， 0.1ml 正硅酸四乙酯 (TEOS)(93mg)， 0.01mL 的 3- 氨基丙基硅烷 (9.5mg) 和 0.2mL( 质量浓度为 25％～ 28％ ) 氨水将 pH 值调整为 8 ～ 10， 常温搅拌 3h， 离心， 洗涤便可 以得到表面带氨基的 SiO2 微球。
取 50mg 上述表面带氨基的 SiO2 微球， 分散在 30mL 四氢呋喃溶液中， 25℃下萃取 8 ～ 10h， 除去聚苯乙烯微球硬模板， 得到表面带氨基的 SiO2 空心微球。
通过氨基密度测试得到其氨基密度为 8.65*10-4mol/g。
投射电镜图如图 1 ； 场发射扫描电镜图如图 2 ； 红外光谱图如图 3， 从图上看，3443cm-1 处为 N-H 的伸缩振动特征峰， 2918cm-1 为 C-H 的不对称伸缩振动特征峰， 2845cm-1 为 C-H 的对称伸缩振动特征峰， 1640cm-1 为 N-H 的面内伸缩振动特征峰， 1068cm-1 为 Si-O-Si 的伸缩振动特征峰， 465cm-1 为 Si-O 的伸缩振动特征峰。由此可知， 实施例 1 所制备的微球 为表面带氨基的 SiO2 中空微球。
实施例 2
正硅酸四乙酯 (TEOS) 的用量为 0.2ml(186mg)， 其余同实施例 1。经红外光谱、 投 射电镜和场发射扫描电镜检测， 所制备的微球为表面带氨基的 SiO2 中空微球。通过氨基密 度测试得到其氨基密度为 4.85*10-4mol/g。
实施例 3
取 6mg(3.46*10-5mol)PEG2000， 溶 解 在 20mL 的 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 中， 按照 PEG ∶ EDC ∶ NHS ＝ 1 ∶ 1 ∶ 2.5 的摩尔比加入 EDC(5mg) 和 NHS(10mg)， 搅拌 1 ～ 3h， 用以 活化羧基。
加入 40mg 实施例 1 所合成的表面带氨基的 SiO2 中空微球 ( 其表面氨基与 PEG 羧 基的摩尔比为 1 ∶ 1)， 室温缓慢搅拌 6-10h， 洗涤、 离心， 冷冻干燥， 即可得到生物相容性非 常好的， 表面修饰上聚乙二醇的中空 SiO2 微球， 以用于超声成像中。粒径均一， 平均粒径为 960nm， 壳层厚度适宜， 为 30 ～ 50nm。 场发射扫描电镜图如图 4， 可以看出， 经修饰后其形态几乎未发生明显变化。
红外光谱图如图 5。从图上看， 3445cm-1 处为 N-H 的伸缩振动特征峰， 2918cm-1 为 C-H 的不对称伸缩振动特征峰， 2845cm-1 为 C-H 的对称伸缩振动特征峰， 1640cm-1 为 N-H 的 面内伸缩振动特征峰， 1070cm-1 为 Si-O-Si 的伸缩振动特征峰以及聚乙二醇中 C-O-C 的伸 缩振动特征峰， 465cm-1 为 Si-O 的伸缩振动特征峰。由此可知， 实施例 2 所制备的 SiO2 中空 微球表面成功修饰上了聚乙二醇。
Zeta 电位图如图 6， 左图 (A) 和右图 (B) 分别为实施例 2 所制备 SiO2 中空微球和 实施例 3 包裹了 PEG 的 SiO2 超声成像造影剂材料 Zeta 电位图。修饰前的 SiO2 微球所带 电荷为 29.4mV， 经修饰聚乙二醇后其表面电荷为 22.2， 进一步说明聚乙二醇成功修饰在了 SiO2 中空微球表面。
在造影条件下的体外超声成像图如图 7， 由图可以看出所制备的 SiO2 微球可以在 体外明显增强超声成像的对比度。在体外的二维灰阶超声成像图如图 8。
实施例 4
取 6mg(3.46*10-5mol)PEG2000， 溶 解 在 20mL 的 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 中， 按照 PEG ∶ EDC ∶ NHS ＝ 1 ∶ 1 ∶ 2.5 的摩尔比加入 EDC(5mg) 和 NHS(10mg)， 搅拌 1 ～ 3h， 用以 活化羧基。
加入 71mg 实施例 3 所合成的表面带氨基的 SiO2 中空微球 ( 其表面氨基与 PEG 羧 基的摩尔比为 1 ∶ 1)， 其余步骤同实施例 3。
结果显示， 得到表面修饰上聚乙二醇的中空 SiO2 微球， 可用于超声成像中。粒径 均一， 平均粒径为 960nm， 壳层厚度适宜， 为 30 ～ 50nm。