来自 Actinomadura namibiensis 的高度桥联的肽 文献已经记载了几种高度桥联的肽， 例如从芋螺 (cone snail) 中分离的芋螺 肽 (conopeptide)( 参 见，例 如 Terlau & Olivera， Physiol.Rev.2004， 84， 41-68 的 综 述 ) 或来自革兰氏阳性细菌来源的所谓硫醚抗生素 (lantibiotic)(Chatterjee 等， Chem. Rev.2005， 105， 633-683)。所述肽具有不同的用途。例如， 尼生素 (nisin)， 一种硫醚抗生 素， 多年以来用作食品防腐剂。
所述芋螺肽对于治疗疼痛， 糖尿病， 多发性硬化和心血管疾病是有用的， 且现在对 * 其正在进行临床前开发或临床开发。芋螺肽的实例包括 α-GI( 序列 ： ECCNPACGRHYSC*， 酰胺化， 连接 (connectivity) ： 1-3， 2-4)， 和 α-GID( 序列 ： IRγCCSNPACRVNNOHVC， 连接 ： 1-3， 2-4)， 其中 O/Hyp 是羟脯氨酸， 而所述交联表示在每个特定二硫键中所涉及的半胱氨 酸的位置， 例如， 在 α-GID 中表示第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸， 第二个与第四个半 胱氨酸 ：
最近发现了新类型的高度桥联的肽， 称为迷宫肽素 (Labyrinthopeptin)( 欧洲专 利申请 EP06020980.6)。所谓迷宫肽素遍布它们的肽链显示出独特的桥联基序 (motif)， 如 下式的化合物所示 ：
现 已 发 现 迷 宫 肽 素 类 更 加 高 度 桥 联 的 肽 可 从 微 生 物 菌 株 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 中分离。 所述化合物与专利申请 EP06020980.6 中描述的迷宫肽素 衍生物有显著的不同。
本发明的一种实施方式是式 (I) 的化合物
其中 {A} 为选自下列的基团 ：
{B} 为选自下列的基团 ：
{C} 为选自下列的基团 ：
R1 是 R1’ 基团或基团其中 R1’ 是 H， (C1-C6) 烷基 -C(O) 或 (C1-C6) 烷基 -O-C(O) ；
R2 是 OH， NH2， (C1-C6) 烷基 -NH， 苯基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH 或吡啶基 -(C1-C4) 亚烷 基 -NH ；
R3 和 R4 彼 此 独 立， 是 H， (C1-C6) 烷 基， NH2C(O)-(C1-C6) 亚 烷 基， (C1-C4) 烷 基 NHC(O)-(C1-C6) 亚烷基或 [(C1-C4) 烷基 ]2NC(O)-(C1-C6) 亚烷基，
或 R3 和 R4 与它们所连接的 S 原子一起形成二硫基团 S-S ； R5 和 R6 彼此独立， 是 H 或 OH， 或 R5 和 R6 一起为＝ O ； m 和 n 彼此独立， 是 0， 1或2； 条件是， 如果{A} 是
{B} 是
{C} 是则 R3 和 R4 可以不与它们所连接的 S 原子一起形成二硫基团 S-S。
上述化合物可为任何立体化学形式， 或任何立体化学形式以任何比例的混合物， 或其生理上可接受的盐。
优选地，
{A} 是
{B} 是
{C} 是
更优选地， {A} 是
{B} 是
{C} 是
R1 优选为基团 R1’ ， R1’ 优选为 H。R2 优选为 OH。
R3 和 R4 优选为彼此独立， 是 H， (C1-C6) 烷基， NH2C(O)-(C1-C6) 亚烷基或与它们所 连接的 S 原子一起形成二硫基团 S-S。更优选地， R3 和 R4 是 H， 或与它们所连接的 S 原子一 起形成二硫基团 S-S。最优选地， R3 和 R4 与它们所连接的 S 原子一起形成二硫基团 S-S。
R5 和 R6 优选为 H 或 OH， 其中如果 R5 是 OH， 则 R6 是 H， 而如果 R5 是 H， 则 R6 是 OH， 或 R5 和 R6 一起为＝ O。更优选地， R5 是 OH 而 R6 是 H， 或 R5 是 H 而 R6 是 OH。
优选地， 化合物 (I) 由式 (II) 化合物所表征 ：
其中 R1 是 R1’ 或基团
其中 R1’ 是 H， (C1-C6) 烷基 -C(O) 或 (C1-C6) 烷基 -O-C(O)， 优选为 H。 更优选地， 化合物 (I) 由式 (III) 化合物表征 ：
其中 R1 是 R1’ 或基团其中 R1’ 是 H， (C1-C6) 烷基 -C(O) 或 (C1-C6) 烷基 -O-C(O)， 优选为 H ；
R2 是 OH， NH2， (C1-C6)- 烷基 -NH， [(C1-C6)- 烷基 ]2N， 苯基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH 或 吡啶基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH， R2 优选为 H ； 且
R3 和 R4 彼此独立， 是 H， (C1-C6) 烷基或 NH2C(O)-(C1-C4) 亚烷基。
式 (II) 和 (III) 的化合物， 其中 R1 是 R1’ ， 在后文中命名为迷宫肽素 A1。
式 (II) 和 (III) 的化合物， 其中 R1 是基团
在后文中命名为迷宫肽素 A3。 更优选地， 化合物 (I) 是由式 (IV) 表征 ：其中
R1 是 H， (C1-C6) 烷基 -C(O) 或 (C1-C6) 烷基 -O-C(O)， 而
R2 是 OH， NH2， (C1-C6)- 烷基 -NH， N[(C1-C6)- 烷基 ]2， 苯基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH 或 吡啶基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH， 而
R3 和 R4 彼此独立， 是 H， (C1-C6) 烷基或 NH2C(O)-(C1-C4) 亚烷基。
式 (IV) 化合物命名为迷宫肽素 A2。
优选地， 在式 (I) 化合物中， m 和 n 均为 0， 或 m 和 n 均为 2， 或 m 是 0 而 n 是 2， 或 m 是 2 而 n 是 0。最优选地， m 和 n 均为 0。
本发明还涉及本发明式 (I) 化合物所有明显的化学等同物。这些等同物是仅仅显 示细微化学差异， 并具有相同药理学作用的化合物， 或在温和条件下转化为本发明化合物 的化合物。所述等同物还包括， 例如， 式 1 化合物的盐、 还原产物、 氧化产物、 部分水解处理 的 (partial hydrolytic processes) 酯、 醚、 缩醛或酰胺， 以及本领域技术人员可使用标准 方法制备的等同物， 除此之外， 还包括所有旋光对映体 (optical antipode) 和非对映异构 体 (diastereomer) 和所有的立体异构形式 (stereoisometric form)。
除非另行指出， 式 (I) 化合物的手性中心可以以 R 构型或以 S 构型的形式存在。 本 发明涉及光学上纯的化合物和立体异构混合物， 如内消旋混合物和非对映异构体混合物。
式 (I) 化合物生理上可接受的盐应理解为是其有机盐和无机盐， 如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences( 第 17 版， 1418 页 (1985)) 所描述的。由于其物理和化学稳定 性及其溶解性， 对于酸性基团， 优选钠、 钾、 钙和铵盐等等 ； 对于碱性基团， 优选盐酸、 硫酸或 磷酸的盐， 或羧酸或磺酸 ( 如乙酸、 柠檬酸、 苯甲酸、 马来酸、 富马酸、 酒石酸和对甲苯磺酸 ) 的盐等等。
更优选地， 式 (I) 到 (IV) 的化合物由式 (V) 化合物显示的立体化学所表征， 其为 式 (I) 的化合物， 其中
{A} 是
{B} 是
{C} 是
R1 是
其中 R1’ 是H； R2 是 H ； R3 和 R4 与它们所连接的硫原子一起形成二硫基团 S-S ； R5 是 H ； R6 是 OH ； 而 m和n是0：
最优选地， 如式 (VI) 所描述 ：
本发明进一步的实施方案是式 (I) 的化合物， 由式 (VII) 表征 ：
优选为由式 (VIII) 表征的化合物其中式 (V) 和 (VI) 涉及迷宫肽素 A3， 而式 (VII) 和 (VIII) 涉及迷宫肽素 A1。
为了进一步的表征本发明化合物， 将肽残基转化回它们来自核糖体肽合成的可能 的前体。残基 4 和 13 的 α， α- 二取代的氨基酸在文献中并无先例。所述氨基酸可描述为 β- 位的羟基取代的丝氨酸， 对于式 (II) 和 (III) 的化合物如下所示 ：
在关于迷宫肽素 A2 的在先欧洲专利申请 (EP06020980.6) 中， 在不清楚其生物合 成途径的情况下， 推定其核糖体前体如下所示 ：
基于对迷宫肽素生物合成的新认识 (new insight)( 参见后文 )， 式 (IV) 化合物生 物合成的前体如下所述 ：
本发明还涉及制备权利要求 1 的式 (I) 化合物的方法， 包括
a) 在合适的条件下在培养基中发酵菌株 Actinomadura namibiensis(DSM 6313)， 或其一种变体和 / 或突变体， 直至一种或多种式 (I) 的化合物在所述培养基中产生，
b) 从所述培养基分离式 (I) 化合物， 和
c) 合适时， 衍生步骤 b) 中分离的化合物， 和 / 或合适时， 将步骤 b) 中分离的化合 物或步骤 b) 中分离的化合物的衍生物转化为生理上可接受的盐。
优选地， 在步骤 b) 中分离的化合物由式 (II) 表征， 其中 m 和 n 均为 0，
R1 是 R1’ 或基团
其中 R1’ 是 H， 而
R2 是 OH。
更优选地， 在步骤 b) 中分离的化合物是迷宫肽素 A2， 其在步骤 c) 中随后衍生为式 (IV) 的化合物， 其中
m 和 n 均为 0，
R1 是 H，
R2 是 OH， 而
R3 和 R4 彼 此 独 立， 是 H， (C1-C6) 烷 基， NH2C(O)-(C1-C6) 亚 烷 基， (C1-C4) 烷 基 NHC(O)-(C1-C6) 亚烷基或 [(C1-C4) 烷基 ]2NC(O)-(C1-C6) 亚烷基。
所述培养基是营养液或固体培养基， 其含有至少一种常规的 (customary) 碳源和 至少一种常规的氮源， 以及一种或多种常规的无机盐。
本发明的方法可用于以实验室规模 ( 微升到升规模 ) 发酵和以工业规模 ( 立方米 规模 ) 发酵。
对于所述发酵合适的碳源是可同化的糖类和糖醇， 如葡萄糖、 乳糖、 蔗糖或 D- 甘 露糖， 以及含糖的自然产物， 如麦芽提取物和酵母提取物。含氮养分的实例是氨基酸、 肽和 蛋白质及其其分解产物 ( 例如酪蛋白、 蛋白胨或胰蛋白胨 )、 肉提取物、 酵母提取物、 谷蛋白 (gluten)、 磨制的种子 ( 例如， 来自玉米、 小麦、 豆类、 大豆或棉树的种子 )、 来自乙醇生产的 蒸馏残余物、 肉粉 (meat meals)、 酵母提取物、 铵盐、 硝酸盐。优选的氮源是一种或多种肽， 其通过合成或生物合成获得。无机盐的实例是碱金属、 碱土金属、 铁、 锌、 钴和锰的盐酸盐、 碳酸盐、 硫酸盐或磷酸盐。微量元素的实例是钴和锰。
特别适于形成本发明的迷宫肽素的条件如下所述 ： 酵母提取物， 从 0.05 到 5％， 优 选从 0.1 到 2.5％； 酪胨， 从 0.2 到 5.0％， 优选从 0.1 到 2％； CaCl2×2H2O， 从 0.02 到 1.0％， 优选从 0.05 到 0.5％ ； MgSO4×7H2O， 从 0.02 到 1.5％， 优选从 0.05 到 0.7％， 和 0.00001％ 到 0.001％的维生素 B12(cyanocobalamin)。给出的每一个百分比值是按营养液总重量计 的。
对微生物进行有氧培养， 即， 例如， 将其淹没在摇瓶或发酵器中同时振荡或搅拌， 或将其淹没在固体培养基上， 合适时同时通入空气或氧气。 所述微生物在从约 18 到 35℃的 温度范围培养， 优选从约 20 到 32℃， 特别是从 27 到 30℃。pH 范围应为 4 到 10， 优选 6.5 到 7.5。所述微生物通常在这些条件下培养 2 到 10 日的期间， 优选 72 到 168 小时。对所 述微生物进行多步培养是有利的， 即， 起初在液体营养培养基中制备一种或多种初步培养 物 (preliminary culture)， 然后将这些初步培养物， 例如， 以从 1 ∶ 10 到 1 ∶ 100 的体积 比接种至实际的生产培养基 ( 即， 主培养 ) 中。所述初步培养物通过下述方法获得， 例如， 将菌株以营养细胞 (vegetative cell) 或孢子的形式接种至营养液中， 并使其生长约 20 到 120 小时， 优选 48 到 96 小时。营养细胞和 / 或孢子可通过下述方法获得， 例如， 通过使所述 菌株在固体或液体营养基质 (nutrient substrate)( 如酵母琼脂 ) 上生长约 1 到 15 日， 优 选 4 到 10 日。
所述迷宫肽素衍生物可从所述培养基使用已知的方法， 并考虑到天然物质的化 学、 物理和生物性质来分离和纯化。使用 HPLC 测试各种迷宫肽素衍生物在培养基或各个分 离步骤中的浓度， 生成的物质的量可方便地与校准溶液 (calibration solution) 相比较。
对于分离， 任选地， 将培养液或与固体培养基一起的培养物冻干， 并使用有机溶剂 或水与有机溶剂的混合物 ( 优选含有 50-90％的有机溶剂 ) 从所述冻干物中萃取迷宫肽素 衍生物。有机溶剂的实例是甲醇和 2- 丙醇。有机溶剂相包含本发明的天然物质 ； 合适时， 将其在真空中浓缩并进行进一步纯化。
本发明一种或多种化合物的进一步纯化通过色谱法在合适的材料上进行， 例如， 在分子筛、 硅胶、 氧化铝、 离子交换剂上或在吸收树脂或反相 (reversed phase， RP) 上进行。色谱法用于分离所述迷宫肽素衍生物。对所述迷宫肽素衍生物使用缓冲的、 碱性或酸化的 水溶液或水溶液与有机溶液的混合物进行色谱。
水或有机溶液的混合物均应理解为与水混溶的有机溶剂， 优选为甲醇、 2- 丙醇或 丙腈， 其浓度为 5 到 99％的有机溶剂， 优选为 5 到 50％的有机溶剂， 或者所有能与有机溶剂 混溶的缓冲水溶液。须使用的缓冲剂与上面指出的相同。
将 所 述 迷 宫 肽 素 衍 生 物 基 于 其 不 同 的 极 性， 通 过 反 相 色 谱 的 手 段， 例 如， 在 MCI( 吸收树脂， Mitsubishi， Japan) 或 Amberlite XAD(TOSOHAAS)， 或其他疏水性材料上 ( 例如， 在 RP-8 或 RP-18 相上 ) 进行分离。此外， 所述分离可通过正相色谱 ( 例如在硅胶、 氧化铝和类似物上 ) 的手段进行。
缓冲的、 碱性或酸化的水溶液应理解为， 例如， 水、 磷酸盐缓冲液、 乙酸铵和柠檬酸 缓冲液， 其浓度为至多 0.5M， 以及甲酸、 乙酸、 三氟乙酸、 氨水和三乙胺， 或本领域技术人员 已知的所有市购的酸或碱， 优选其浓度为至多 1％。在缓冲水溶液的情况下， 特别优选为 0.1％乙酸铵。
色谱可使用以 100％水起始， 以 100％有机溶剂终结的梯度进行， 所述色谱优选用 5 到 95％丙腈的线性梯度运行。 或者， 也可以进行凝胶色谱或在疏水相的色谱。凝胶色谱可， 例如， 在聚丙烯酰胺 凝胶或共聚物凝胶上进行。上述色谱的顺序可以颠倒。
在迷宫肽素以立体异构体的形式存在的情况下， 它们可以使用已知方法分离， 例 如， 通过使用手性柱 (chiral column) 的分离手段。
将 OH 基团衍生化为酯或醚衍生物使用其本身已知的方法 (J.March， Advanced Organic Chemistry， John Wiley & Sons， 第 4 版， 1992) 进 行， 例 如， 通过与酸酐反应 的手段， 或通过与碳酸二酯或硫酸二酯反应进行。将 COOH 衍生化为酯或酰胺衍生物使 用 其 本 身 已 知 的 方 法 (J.March， Advanced Organic Chemistry， John Wiley & Sons， 第 4 版， 1992) 进 行， 例 如 通 过 与 氨 反 应 生 成 相 应 的 CONH2 基 团 的 手 段， 或通过与任 选 活 化 的 烷 基 化 合 物 反 应 生 成 相 应 的 烷 基 酯 的 手 段 进 行。 将 -CH2-S-CH2- 基 团 氧 化 为 -CH2-S(O)-CH2- 或 -CH2-S(O)2-CH2- 可在将相应的迷宫肽素衍生物暴露于氧气或空气 时达成。对二硫键的还原， 以及任选地之后烷基化游离 SH 基团， 使用其本身已知的方法 (A.Henschen， Analysis of cyst(e)ine residues， disulfide bridges， and sulfhydryl groups in proteins， in ： B.Wittmann-Liebold， J.Salnikov， V.A.Erdman( 编 )， Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis， Springer， Berlin， 1986， 第 244-255 页 ) 来进行， 例如通过二硫苏糖醇进行还原和使用烷基碘进行烷基化。将硫醚 (sulfide) 还原 (C1-C6) 烷基， NH2C(O)-(C1-C6) 亚烷基， (C1-C4) 烷基 为式 (I) 化合物 ( 其中 R3 和 R4 是 H， NHC(O)-(C1-C6) 亚烷基或 [(C1-C4) 烷基 ]2NC(O)-(C1-C6) 亚烷基 )， 可以如下得到 ： 在二硫苏 糖醇存在下， 可通过将其中 R3 和 R4 与它们所连接的 S 原子一起形成二硫键的式 (I) 化合物 与 C1-C6) 卤代烷基或卤代 -(C1-C6) 亚烷基 -C(O)NH2， 卤代 -(C1-C6) 亚烷基 -C(O)NH(C1-C4) 烷基或卤代 -(C1-C6) 亚烷基 -C(O)N[(C1-C4) 烷基 ]2 反应来进行 ( 一般文献 )。卤素是 F、 Cl、 Br 或 I。
微 生 物 菌 株 Actinomadura namibiensis 的 分 离 株 由 Hoechst AG， Frankfurt， Germany 以识别参考号 (identification reference)FH-A 1198 在 1991 年 1 月 23 日， 根
据布达佩斯条约 (Budapest treaty) 以保藏号 DSM6313 保藏于德意志微生物和细胞培养物 保藏中心 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， (DSMZ)， Mascheroder Weg 1B(as of 2008 ： Inhoffenstr。7B)， 38124Braunschweig， Germany) 中。 微生物菌株 Actinomadura namibiensis 进一步由 Wink 等描述于 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2003， 53， 721-724。
除了所述菌株 Actinomadura namibiensis (DSM 6313) 之外， 还可以使用合成一 种或多种本发明化合物的其突变体和 / 或变体。
突变体是使用这样的一个或多个基因对基因组中一个或多个基因进行修饰的微 生物， 其中所述基因使所述生物能够产生本发明的化合物， 且保持功能并可以遗传。
上述突变体可以以其本身已知的方式， 使用物理手段 ( 例如辐射， 如用紫外线或 X 射线 )， 或化学诱变剂 ( 如甲磺酸乙酯 (EMS)、 2- 羟基 -4- 甲氧基二苯甲酮 (MOB) 或 N- 甲 基 -N’ - 硝 基 -N- 亚 硝 基 胍 (MNNG))， 或 如 Brock 等 在 “Biology of Microorganisms” ， Prentice Hall， 第 238-247 页 (1984) 中所述的方式产生。
变体是所述微生物的表现型。微生物具有适应其环境的能力， 并因此显示出高度 发达的生理可塑性。所述微生物的全部细胞均涉及表现型的适应， 所述变化本质上并非基 于基因， 且在条件改变时是可逆的 (H.Stolp， Microbial ecology ： organism， habitats， activities.Cambridge University Press， Cambridge， GB， 180 页， 1988)。
对合成本发明一种或多种化合物的突变体和 / 或变体的筛选通过下述方法进行 ： 任选地， 将发酵培养基冻干， 并如上所述用有机溶剂或水和有机溶剂的混合物萃取所述冻 干物或发酵液， 并通过 HPLC 或 TLC 手段或通过测试其生物学活性来进行分析。
所述发酵条件可施用于 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 及其突变体和 / 或变体。
本发明进一步的实施方案是使用如上所定义的式 (I) 的化合物用于治疗细菌感 染， 特别是由革兰氏阳性菌导致的细菌感染， 用于治疗真菌感染， 和 / 或用于治疗疼痛， 特 别是神经性疼痛或由炎症引发的疼痛。
如上所述的药物 ( 也称作药物制剂或药物组合物 ) 包含有效量的至少一种式 (I) 化合物， 如上所述， 其可为任何立体化学形式， 或任何比例的任何立体化学形式的混合物， 或药学上可接受的盐或其化学等同物， 以及至少一种药学上可接受的载体， 优选一种或多 种药学上可接受的载体物质 ( 或媒介物 (vehicle)) 和 / 或添加剂 ( 或赋形剂 )。
所述药物可经口给药， 例如以丸剂、 片剂、 包漆的片剂 (lacquered tablet)、 包衣 片剂 (coated tablet)、 颗粒剂 (granule)、 硬和软明胶胶囊、 溶液、 糖浆、 乳剂、 混悬剂或气 雾剂混合物的形式。 然而， 给药还可以经直肠进行 ( 例如以栓剂的形式 )， 或经肠道外进行， 例如静脉内、 肌肉内或皮下以注射剂或灌注液、 微囊剂、 植入物或棒 (rod) 的形式， 或经皮 进行， 或局部进行， 例如以软膏剂、 溶液或酊剂的形式， 或以其他方式， 例如以气雾剂或鼻喷 剂的形式。
本发明的药物以其本身已知， 并对于本领域技术人员熟悉的方式制备， 除了式 (I) 的化合物之外， 还使用药学上可接受的惰性无机和 / 或有机载体物质和 / 或添加剂， 所述式 (I) 的化合物如上所述， 可为任何立体化学形式， 或任何比例的任何立体化学形式的混合 物， 或生理上可接受的盐或其化学等同物。 为了产生丸剂、 片剂、 包衣片剂和硬明胶胶囊， 可以使用， 例如， 乳糖、 玉米淀粉或其衍生物、 滑石、 硬脂酸或其盐等。对于软明胶胶囊和栓剂 的载体物质是， 例如， 脂肪、 蜡、 半固体和液体多元醇、 天然油或硬化油 (hardened oil) 等。 对于制备溶液 ( 例如， 注射溶液 )、 或乳液或糖浆剂合适的载体物质是， 例如， 水、 盐水、 醇、 甘油、 多元醇、 蔗糖、 转化糖、 葡萄糖、 植物油等。对于微囊剂、 植入物或棒合适的载体物质 是， 例如， 羟基乙酸和乳酸的共聚物。 所述药物制剂通常含有按重量计约 0.5 到约 90％的式 (I) 化合物和 / 或其生理上可接受的盐和 / 或其前药 (prodrug)。如上所述， 在药物中， 为 任何立体化学形式， 或任何比例的任何立体化学形式的混合物， 或生理上可接受的盐或其 化学等同物的式 (I) 活性成分的量通常是约 0.5 到约 1000mg， 优选约 1 到约 500mg。
除了如上所述为任何立体化学形式， 或任何比例的任何立体化学形式的混合物， 或生理上可接受的盐或其化学等同物的式 (I) 活性成分以及载体之外， 所述药物制剂还可 含有一种或多种添加剂， 例如， 填充剂、 崩解剂、 粘合剂、 润滑剂、 湿润剂、 稳定剂、 乳化剂、 防 腐剂、 甜味剂、 着色剂、 调味剂 (flavoring)、 芳香剂 (aromatizer)、 增稠剂、 稀释剂、 缓冲物 质、 溶剂、 增溶剂、 达成储备作用的试剂 (agents for achieving a depot effect)、 改变渗 透压的盐、 包衣材料或抗氧化剂。其还可以含有两种或更多种式 (I) 化合物， 所述式 (I) 化 合物为任何立体化学形式， 任何比例的任何立体化学形式的混合物， 或生理上可接受的盐 或其化学等同物。如果药物制剂含有两种或更多种式 (I) 化合物， 对每个化合物的选择可 以以所述药物制剂特定的总体药理学分布 (pharmacological profile) 为目标。例如， 效 力高， 但是作用时间短的化合物可以与效力较低但长效的化合物组合。对于式 (I) 化合物 上取代基的选择所允许的可塑性使得对于所述化合物的生物学和物理化学性质的大量调 控成为可能， 并因此使得对这样期望的化合物的选择成为可能。此外， 除了至少一种式 (I) 化合物之外， 所述药物制剂还可以包含一种或多种治疗性或预防性的活性成分。
当使用式 (I) 的化合物时， 剂量可在广泛的范围内变动， 以在每个单独的病例中 适于单独的病状， 这是常规的， 并对医师而言是已知的。 例如， 其取决于使用的特定化合物， 待治疗疾病的性质和严重程度， 给药的模式和日程， 或治疗的病状是急性的还是慢性的， 或 是否进行预防。合适的剂量可使用医学领域众所周知的临床方法加以确立。一般而言， 在 重约 75kg 的成人中达成期望的结果的每日剂量为约 0.01 到约 100mg/kg， 优选约 0.1 到约 50mg/kg， 特别是约 0.1 到约 10mg/kg， ( 在每种情况下均为 mg 每 kg 体重 )。日剂量可分为 几部分， 例如 2、 3 或 4 部分给药， 特别是在施用相对较大的量时。通常， 取决于个人的状况， 可能需要将所示日剂量向上或向下调整。
实施例 1 ： 制备 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的冷冻培养物
对 100ml 培养基 (10g 淀粉， 2g 酵母提取物， 10g 葡萄糖， 10g 甘油， 2.5g 玉米浆干 粉 (cornsteep powder)， 2g 蛋白胨， 1g NaCl， 3g CaCO3 在 1 升自来水中， pH 7.2， 然后灭菌 ) 用菌株 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 在 500ml 无菌 Erlenmeyer 烧瓶中接种， 并 在 27℃， 在振荡器上以 120rpm 温育 72 小时。然后， 将 1ml 培养物与 1ml 灭菌的保藏溶液 (conservation solution)(20g 甘油， 10g 蔗糖， 70ml 去离子水 ) 混合并储藏于 -80℃。或 者， 将在琼脂上生长良好的培养物小块用 1.5ml 50％灭菌的甘油溶液转移至 Cryotubes (Vangard International) 中， 并储藏于 -196℃的液氮中。
实施例 2 ： 制备迷宫肽素
将 含 有 100ml 实 施 例 1 所 述 的 培 养 基 的 500ml 灭 菌 Erlenmeyer 烧 瓶 用Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的培养物接种， 所述菌株在琼脂平板上生长， 并 在 27 ℃， 在振荡器上以 120rpm 温育。72 小时后， 将其他含有同样含量的同样培养基的 Erlenmeyer 烧瓶各自用 2ml 的该预培养物接种， 并在相同的条件下培育 168 小时。或 者， 将 含 有 100ml 实 施 例 1 所 述 的 培 养 基 的 300ml Erlenmeyer 烧 瓶 用 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的培养物接种， 并在 25℃和 180rpm 温育。72 小时后， 将其他含有 同样含量的同样培养基的 Erlenmeyer 烧瓶均用 5ml 的该预培养物接种， 并在相同的条件下 培育 168 小时。
实施例 3 ： 迷宫肽素的固体萃取
在完成了对 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的 40L 发酵之后， 将发酵液过 滤。将组织滤过物 ( 约 30L) 加载于由约 3L CHP-20P 材料填充的柱 ( 尺寸 ： 160 x 200mm) 上。将化合物以 250ml/ 分钟的流速使用从 5％到 95％的异丙醇 / 水梯度洗脱。在 45 分钟 的期间内， 收集每 4 分钟的级分。 汇集含有迷宫肽素的级分， 并冻干 ( 级分 8 ： MW ＝ 2190Da ； 级分 9 ： MW ＝ 2190 和 2074Da ； 级分 10-12 ： MW ＝ 2074Da)
实施例 4 ： 使用 RP-18 色谱预纯化迷宫肽素 A1
将 来 自 实 施 例 3 的 级 分 10-12(670mg) 溶 解 于 500ml 甲 醇 中， 并 用 Phenomenex Luna 10μ C18(2) 预柱 ( 尺寸 ： 21.2mm x 60mm) 加载于 Phenomenex Luna 10μ C18(2) 柱 ( 尺寸 ： 50mm x 250mm) 上。将化合物用 5％到 75％丙腈 / 水梯度在 40 分钟的期间内以 190ml/ 分钟的流速洗脱 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH9.0， 使用 30％氨水溶液调整 )。收集每 分钟的级分。级分 21-22 含有所需的迷宫肽素 (MW ＝ 2074Da)。在冻干后， 获得了 332mg 粗 产物。
实施例 5 ： 迷宫肽素 A1 的终纯化
将来自实施例 4 的级分 21-22(60mg) 溶解于 50ml 甲醇中， 并用 WatersXTerra Prep MS C18 10μ 预柱 ( 尺寸 ： 19 x 10mm) 加载至 Phenomenex Luna 5μ C18(2)Axia 柱 ( 尺寸 ： 30mm x 100mm) 上。化合物用 5％到 75％丙腈 / 水的梯度在 40 分钟的期间内以 70ml/ 分钟的流速 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 4.6， 使用乙酸水溶液进行调整 ) 洗脱。将洗 脱液使用 UV- 触发 (triggering) 收集为 10ml- 级分。 汇集含迷宫肽素的级分 ( 级分 9-12)。 在冻干后， 获得了 17mg 迷宫肽素 A1。
实施例 6 ： 使用 RP-18 色谱预纯化迷宫肽素 A3
将来自实施例 3 的级分 8( ～ 850mg) 溶解于 500ml 甲醇中并用 Phenomenex Luna 10μ C18(2) 预柱 ( 尺寸 ： 21.2mm x 60mm) 加载于 Phenomenex Luna 10μ C18(2) 柱 ( 尺 寸： 50mm x 250mm)。化合物用 5％到 75％丙腈 / 水的梯度在 40 分钟的期间内 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 7.0) 以 190ml/ 分钟的流速洗脱。收集每分钟的级分。级分 19 含有所需 的迷宫肽素 (MW ＝ 2190Da)。在冻干后， 获得 48mg 粗产物。
实施例 7 ： 迷宫肽素 A3 的终纯化
将来自实施例 6 的级分 19(48mg) 溶解于 50ml 甲醇中， 并用 WatersXTerra Prep MS C18 10μ 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 加载于 Phenomenex Luna 5μ C18(2)Axia 柱 ( 尺寸 ： 30mm x 100mm)。化合物洗脱用 5％到 75％丙腈 / 水的梯度在 40 分钟的期间内以 70ml/ 分钟的流速洗脱 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 9.0， 使用 30％氨水溶液进行调整 )。将 洗脱液使用 UV- 触发收集为级分。 汇集含迷宫肽素的级分 (F9-12)。 在冻干后， 获得了 12mg迷宫肽素 A3。
实施例 8 ： 通过具有二极管阵列和质谱检测的高效液相色谱 (HPLC-DAD-MS) 鉴定 迷宫肽素 A1 和 A3
在具有 Sample Manager， Binary Solvent Manager 和 PDA( 光电二极管阵列检测 器， Photodiode Array Detector) 的 Waters Acquity UPLC System 上分析迷宫肽素 A1 和 A3。使用 Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7μ ； 2.1x100mm) 作为 UPLC 柱， 并在 0.6ml/ 分钟的流速用下述梯度洗脱 ： 在 15 分钟内从水∶丙腈 (9 ∶ 1) 变为 100％丙腈， 其中所有 的溶剂用 6.5mM 乙酸铵缓冲至 pH4.6。UV 谱由 PDA 检测器在 200 和 600nm 之间的波长来 记录。质谱用 Bruker μTOF LC MS 使用正交电喷射离子化 (orthogonal electrospray ionisation) 以 0.5Hz 的取样率和 150-1500 原子质量单位的检出限来进行记录。
实施例 9 ： 鉴定迷宫肽素 A1
迷宫肽素 A1 在 5.46 分钟 (PDA) 洗脱。UV 谱由 218nm(sh) 和 279nm 的 λmax 所表 征。
在 阴 离 子 模 式 (negative mode) 中， 在 m/z(I) 观 测 到 荷 两 个 电 荷 的 分 子 离 子： 1035.87(4539) ， 1036.37(5566) ， 1036.87(4086) ， 1037.37(2296) ， 1037.87(1034) 和 1038.37(280)。 在 阳 离 子 模 式 (positive mode) 观 察 到 具 有 下 述 m/z(I) 的 荷 两 个 电 荷 的 分 子 离 子： 1037.88(2925)， 1038.38(3252)， 1038.88(2492)， 1039.38(1396) 和 1039.88(623)。
通过高分辨率 ESI-FTICR- 质谱鉴定迷宫肽素 A1 ： 将迷宫肽素 A1/ 甲醇溶液 (c ＝ 0.2mg/ml) 通过注射泵以 2μl/ 分钟的流速引入装备了电喷射源的 Bruker Apex III FTICR MS(7T 磁体 )。图谱使用外校准 (external calibration) 以阳离子模式记录。
观察到的 m/z， Da(z ＝ 2， M+2Na+ 离子 ) 中性物质的确切单同位素分子量 [M] C92H119N23O25S4 的理论分子量 [M] 分子式
1059.8693 2073.7592 2073.7630 C92H119N23O25S4实施例 10 ： 鉴别迷宫肽素 A3 迷宫肽素 A3 在 4.79min(PDA) 洗脱。UV 谱由 218nm(sh) 和 274nm(sh) 的 λmax 所表征。 在 阴 离 子 模 式， 在 m/z(I) 观 测 到 荷 两 个 电 荷 的 分 子 离 子 ： 1093.38(1262)， 1093.88(1587)， 1094.39(1201)， 1094.89(686) 和 1095.38(195)。在阳离子模式观察到具 有下述 m/z(I) 的荷两个电荷的分子离子 ： 1095.40(365)， 1095.91(433) 和 1096.41(294)。
通过高分辨率 ESI-FTICR- 质谱鉴定迷宫肽素 A3( 方法如实施例 9 所述 ) ：
26102046652 A CN 102046656说明书1117.3847 2188.7900 2188.7900 C96H124N24O28S419/28 页观察到的 m/z， Da(z ＝ 2， M+2Na+ion) 中性物质的确切单同位素分子量 [M] C96H124N24O28S4 的理论分子量 [M] 分子式
实施例 11 ： 迷宫肽素 A1 的氨基酸分析
水解 ： 将迷宫肽素 A1(0.05mg) 在氮气气氛下用 6N HCl， 5％苯酚在 110℃水解 24 小时。将水解物在氮气流中干燥。
无 手 性 (achiral)GC-MS ： 将 水 解 物 与 二 -( 三 甲 基 甲 硅 烷 基 ) 三 氟 乙 酰 胺 (BSTFA)/ 丙腈 (1 ∶ 1) 在 150℃加热 4 小时。对于 GC-MS 实验， 使用 DB5- 熔凝硅石毛细管 (fused-silica-capilary)(l ＝ 15m×0.25μm， 涂布有二甲基 -(5％ - 苯基甲基 )- 聚硅氧 烷的熔凝硅石， df ＝ 0.10μm ； 温度程序 ： T ＝ 65° /3`/6/280℃ )。
手性 GC-MS ： 将水解物用 200μl 2N HCl/ 乙醇在 110℃酯化 30 分钟， 并干燥。 接着 将混合物用 25μl 三氟乙酸酐 (TFAA)/100μl 二氯甲烷在 110℃酰化 10 分钟， 并干燥。 对于 GC-MS 实验， 使用熔凝硅石毛细管 (l ＝ 22m×0.25μm 用 Chirasil-S-Val(Machery-Nagel) 涂铺熔凝硅石， df ＝ 0.13μm ； 温度程序 ： T ＝ 55° /3`/3,2/180℃ )。
实施例 12 ： 鉴别迷宫肽素 A1 和 A3 的结构基因
微生物 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的粘粒库由 Agowa GmbH， Berlin 基于 pWEB- 粘粒载体 (Epicentre Biotechnologies， Madison， USA) 生成。滤纸由 RZPD
GmbH， Berlin 使用描述于 Zehetner &Methods Mol.Biol.2001， 175， 169-188 的方法制备。
基于迷宫肽素 A2 的已知结构， 从 N 末端和 C 末端推导出延长的简并引物 (Fw ： 5 `-CAGGAAACAGCTATGACCGAYTGGWSNYTNTGGG-3`(SEQ ID NO ： 4) ； Rev ： 5`-TGTAAAACGACGGCC AGTRCANGANGCRAANARRC-3`(SEQ ID NO ： 5) ； Dabard 等， Appl.Environ.Microbiol.2001， 4111-4118.)。所述引物的 5’ 延长是为了增加预期的 PCR 产物的大小供更好的检测和处理 (PCR 条件 ： 3 分钟 95℃， 30x(60 秒 95℃， 30 秒 50℃， 60 秒 72℃ )， 7 分钟 72℃， Taq 聚合酶 )。 将 PCR 产物用凝胶纯化， 并克隆入载体 pDrive(Qiagen)。 测序得到来自 A2 基因中部的 18 个 核苷酸长度的序列 (AGTGCTGTAGCACGGGAA， SEQ ID NO ： 6)。 基于该 18 核苷酸长的已知片段， 通过两步 PCR 获得了更多序列信息。在第一步骤中， 用来自 A2 的 C 末端的简并反向 (rev) 引物 (5`-RCARCANGCRAANARRCTTCC-3`， SEQ ID NO ： 7) 和非特异性的正向 (fw) 引物 (5`-CACGGTACCTAGACTAGTGACCAAGTGCGCCGGTC-3`， SEQ ID NO ： 8) 进行了单特异性引物 PCR(PCR 条 件： 3 分钟 95℃； 10x(45 秒 95℃； 45 秒 38℃； 3.5min 72℃ ) ； 30x(45 秒 95℃； 45 秒 52℃； 3.5 分钟 72℃ )5 分钟 72℃ ； Taq 聚合酶 )。在进行了外切核酸酶 I 消化以消化所述引物 (5μl PCR 试样 +0.5μl 外切核酸酶 I(20U/μl) ； 15 分钟 37℃ ； 15 分钟 80℃热失活 ) 后， 将 PCR 试样用作模板进行第二 PCR(PCR 条件 ： 3 分钟 95℃ ； 30x(45 秒 95℃ ； 45 秒 56℃ ； 3.5 分钟 72℃ ) ； 5 分钟 72℃； Taq 聚合酶 )。第二 PCR 以嵌套式 (nested)PCR 的方式用由第一 PCR 中 无特异性的 fw 引物和特异性 rev 引物组成的引物对进行， 所述特异性 rev 引物包含已知的 18 个核苷酸 (5`-CTTCCCGTGCTACAGCACTCCC-3`， SEQ ID NO ： 9)。将所得的 0.4kbp 产物用凝 胶纯化， 并克隆入 pDrive。 测序显示 A2 的 C 末端的预期氨基酸序列。 从该 0.4kbp 序列通过 PCR(Fw ： 5`-ATGGACCTCGCCACGGGCTC-3`， SEQ ID NO ： 10 ； 5`-CTTCCCGTGCTACAGCACTCCC-3`， SEQ ID NO ： 11) 构建了由 Dig 标记的探针。该 Dig 标记的探针用于通过杂交和藉由用碱性 磷酸酶标记的抗 Dig 抗体进行检测的方法来筛选滤纸。以此方式， 获得了一个阳性粘粒并 对其测序。
序列数据通过局部 (local)BLAST 和 FramePlot 分析。该分析得到下列开放阅读 框 (orf)， 其包含迷宫肽素 A2 的结构基因 ：
TGACGCCCGCACACCGTTCCACCGATGAGAGGTGACAGTCCCATGGCGTCGATCCTGGAACTCCAGAA CCTGGACGTCGAGCACGCCCGCGGCGAGAACCGCTCCGACTGGAGCCTGTGGGAGTGCTGTAGCACGGGAAGCCTG TTCGCCTGCTGCTGA (SEQ ID NO ： 12)
在该 orf 内， 下述序列代表前原迷宫肽素 A2 的结构基因 ( 前导序列继以原肽编码 序列继以终止密码子 TGA) ：
ATGGCGTCGATCCTGGAACTCCAGAACCTGGACGTCGAGCACGCCCGCGGCGAGAACCGCTCCGACTGG AGCCTGTGGGAGTGCTGTAGCACGGGAAGCCTGTTCGCCTGCTGCTGA (SEQ ID NO ： 13)
示于 SEQ ID NO ： 13 的 DNA 序列的翻译得到下列前原迷宫肽素 A2(SEQ ID NO ： 14) 的氨基酸序列和原迷宫肽素 A2(SEQ ID NO ： 15) 的氨基酸序列 ：
MASILELQNLDVEHARGENR SDWSLWECCSTGSLFACC (SEQ ID NO ： 14)
SDWSLWECCSTGSLFACC (SEQ ID NO ： 15)
将所述原肽序列通过藉由微生物 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的酶进 行的翻译后修饰转化为迷宫肽素 A2。
实施例 13 ： 确定迷宫肽素 A1 和 A3 的结构
所述 A2 基因的上游区域显示另一个小 orf， 其与迷宫肽素 A2 的结构基因具有高同 源性。该开放阅读框 (orf) 包含迷宫肽素 A1 和 A3 的结构基因。迷宫肽素 A1 的 orf 具有 下列基因序列 ：
TGAACATCCACCATGGCATCCATCCTTGAGCTCCAGGACCTGGAGGTCGAGCGCGCCAGCTCGGCCGCC GACAGCAACGCCAGCGTCTGGGAGTGCTGCAGCACGGGCAGCTGGGTTCCCTTCACCTGCTGCTGA
(SEQ ID NO ： 16)
在该 orf 内， 下列序列代表前原迷宫肽素 A1 和 A3 的结构基因 ( 前导序列继以原 肽编码序列继以终止密码子 TGA) ：
ATGGCATCCATCCTTGAGCTCCAGGACCTGGAGGTCGAGCGCGCCAGCTCGGCCGCCGACAGCAACGCC AGCGTCTGGGAGTGCTGCAGCACGGGCAGCTGGGTTCCCTTCACCTGCTGCTGA (SEQ ID NO ： 17)示于 SEQ ID NO ： 17 的 DNA 序列的翻译得到下列前原迷宫肽素 A1(SEQ ID NO ： 18) 的氨基酸序列和原迷宫肽素 A1(SEQ ID NO ： 19) 的氨基酸序列 ：
MASILELQDLEVERASSAADSNASVWECCSTGSWVPFTCC(SEQ ID NO ： 18)
SNASVWECCSTGSWVPFTCC (SEQ ID NO ： 19)
该氨基酸序列与基于对迷宫肽素 A1 进行的氨基酸和 MS 分析的结果 ( 见上 ) 而预 期的迷宫肽素 A1 氨基酸组成一致。对侧链的翻译后修饰推导为与迷宫肽素 A2 相应的修饰 类似。氨基酸的立体化学取自所述氨基酸分析 ( 实施例 11)。最后， 推导出苏氨酸 (Thr) 残 基脱水成为脱氢丁酸以匹配由高分辨率 MS 计算出的经验分子式。基于类似的迷宫肽素 A2 的翻译后修饰的氨基酸的立体化学， 推出迷宫肽素 A1 为式 (VIII)。
之前的分子量分析表明迷宫肽素 A1 和 A3 的区别为一个 Asp。这由所编码的序列 证实， 其在迷宫肽素 A1 的蛋白酶剪切位点之前的 -1 位包含一个 Asp。基于下述假设， 即迷 宫肽素 A1 和 A3 由同一个基因编码， 仅仅在前导序列的蛋白酶剪切方面有所不同， 所述额外 的 Asp 在迷宫肽素 A3 的 N 末端。这样， 推出迷宫肽素 A3 为式 (V)。基于类似的迷宫肽素 A2 的翻译后修饰的氨基酸的立体化学， 推出迷宫肽素 A3 为式 (VI)。
实施例 14 ： 迷宫肽素 A1 二硫桥联的剪切和用甲基碘的后续烷基化
将迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol) 溶解于甲醇 (3ml) 并在室温添加二硫苏糖醇溶 液 (1ml， 将 75mg 二硫苏糖醇溶于 40mg NaHCO3/1ml 水溶液而新鲜制备 )。将混合物在 60℃ 搅拌 1 小时。之后， 将其冷却至室温， 并添加甲基碘 (50μl， 0.80mmol)。在室温 4 小时后， 将所述混合物过滤并通过反相 HPLC 使用配备 Waters XTerra Prep MS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μm C18(2) 柱 ( 尺寸 ： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟内运行 ( 缓冲液 ： pH 2.0， 用甲酸调整 )。流 速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV 将峰分级。合并级分 12 和 13， 在冻干后产生 23.1mg(45.5％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.46min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 217nm(sh)， 279nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1050.894
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2103.802
由 C94H125N23O25S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2103.810
分子式 ： C94H125N23O25S4
化学式量＝ 2105.44。
实施例 15 ： 迷宫肽素 A1 二硫桥联的剪切和用碘乙酰胺的后续烷基化
将迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol) 溶解于甲醇 (3ml) 并在室温添加二硫苏糖醇溶 液 (1ml， 将 75mg 二硫苏糖醇溶于 40mg NaHCO3/1ml 水溶液而新鲜制备 )。将混合物在 60℃ 搅拌 1 小时。之后， 将其冷却至室温， 并添加甲基碘 (40mg， 0.216mmol)。将所述混合物在 室温搅拌过夜。将所述化合物过滤并通过反相 HPLC 使用配备 Waters XTerra Prep MS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μm C18(2) 柱 ( 尺 寸： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟内运行 ( 缓冲液 ： 0.1％乙 酸铵， pH 用乙酸调整为 4.6)。流速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV 将峰分级。获得下列化合物 ：
二乙酰胺化迷宫肽素 A1 ：
合并级分 7 和 8， 在冻干后产生 13.3mg(25.2％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.09min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 218nm(sh)， 280nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1093.9022
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2189.819
由 C96H127N25O27S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2189.822
分子式 ： C96H127N25O27S4
化学式量＝ 2191.49。
单乙酰胺化迷宫肽素 A1 ：合并级分 10 和 11， 在冻干后产生 5.3mg(10.3％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.31min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 217nm(sh)， 280nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1065.390
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2132.794
由 C94H124N24O26S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2132.800
分子式 ： C94H124N24O26S4
化学式量＝ 2134.44。
实施例 16 ： Boc 保护的迷宫肽素 A1 的合成
在室温向迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol)/ 二甲基甲酰胺 (3ml) 添加一缩二碳酸 二 叔 丁 酯 (di-tert-butyl-dicarbonate)(11mg， 0.048mmol) 和 N- 乙 基 二 异 丙 胺 (6mg， 0.048mmol)。将混合物在室温搅拌 2 小时。之后， 将其通过反相 HPLC 使用配备 Waters XTerra Prep MS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μmC18(2) 柱 ( 尺寸 ： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟内运行 ( 缓 冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 7.0)。流速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV 将峰分级。合并级分 4-7， 并 在冻干后获得 21.4mg(40.8 ％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.30min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 219nm(sh)， 278nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1085.895
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2173.805
由 C97H127N23O27S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2173.815
分子式 ： C97H127N23O27S4
化学式量＝ 2174.49。 实施例 17 ； 迷宫肽素 A1 的苄基衍生物
在室温向迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol)/ 二甲基甲酰胺 (2ml) 添加一缩二碳酸二 叔丁酯 (10mg， 0.046mmol) 和 N- 乙基二异丙胺 (7mg， 0.054mmol)。在室温保持 1 小时后， 迷宫肽素 A1 完全消失。添加苯甲胺 (6.8mg， 0.063mmol) 和正丙基膦酸酐 (T3P 50μl， 0.072mmol， 在 DMF 中 50％ )， 将混合物在室温搅拌 2 小时。 之后， 将其通过反相 HPLC 使用配 备 Waters XTerra PrepMS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μmC18(2) 柱 ( 尺寸 ： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟 内运行 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 7.0)。流速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV(220nm) 将峰分级。 获得下列两种化合物 ：
迷宫肽素 A1 的单苄基衍生物 ：
合并级分 13 和 14， 并在冻干后获得 10.4mg(19.1％ ) 期望的化合物。所述产物通 过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 7.03min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 217nm(sh)， 275nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1130.427
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2262.868
由 C104H134N24O26S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2262.878
分子式 ： C104H134N24O26S4
化学式量＝ 2264.63。
迷宫肽素 A1 的二苄基衍生物 ：
合并级分 7 和 8， 并在冻干后获得 9.9mg(17.5％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 8.31min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 214nm(sh)， 276nm
ESI-MS(pos) ： [M+2(NH4)]2+ ＝ 1194.002
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2351.937
由 C111H141N25O25S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2351.941
分子式 ： C111H141N25O25S4
化学式量＝ 2353.77。
实施例 18 ： 在迷宫肽素 A1 的 N 末端的酰化反应
在室温向 2- 氯 -4， 6- 二甲氧基 -1， 3， 5- 三嗪 (CDMT， 5mg， 0.028mmol)/ 二甲基甲 酰胺 (2ml) 添加 N- 甲基吗啉 (8.6mg， 0.085mmol)。在室温 1 小时后， 添加正己酸 (3.3mg， 0.028mmol)。在将所述混合物搅拌 30 分钟后， 添加迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol)， 然后在 室温搅拌 2h。 将混合物通过反相 HPLC 使用配备 Waters XTerra Prep MS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μm C18(2) 柱 ( 尺寸 ： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟内运行 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 7.0)。流 速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV(220nm) 将峰分级。级分 39 在冻干后获得 2.0mg(3.8％ ) 期望 的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.41min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 216nm(sh)， 266nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1084.906
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2171.827
由 C98H129N23O26S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2171.836
分子式 ： C98H129N23O26S4
化学式量＝ 2173.52。
实施例 19 ： 迷宫肽素及其衍生物的抗菌活性
将所述化合物溶解于含 10％ MeOH 的水中， 至终浓度为 1mg/ml。对生物测定法， 使用 24 x 24cm 尺寸的灭菌 Nunc 平板。对于一个平板使用 200ml 琼脂。将琼脂在高压灭 菌后冷却至 55℃， 并在铺板前添加 2-4ml 测试生物的组织悬液。对每个平板添加 64 个 6mm 直径的滤板。向每个滤纸片 (filter plate) 添加 20μl 测试溶液， 并在 28 ℃或 37 ℃温 育 1 到 3 日。以 mm 记录抑制区。对于所述方法的详细描述， 参见 Bauer 等， Amer.J.Clin. Pathol.1966， 45， 493-496 ； Müller & Melchinger， Methoden in der Mikrobiologie， Franckhsche Verlagshandlung， Stuttgart(1964) ； Mueller & Hinton， Proc.Soc.Expt. Biol.Med.1941， 48， 330-333。
实施例 20 ： 神经性疼痛测定法在神经性疼痛的保留性神经损伤 (Spared nerve injury， SNI) 小鼠模型中研究 迷宫肽素 A1 以证实其对触觉异常疼痛 (tactile allodynia) 的活性。在全身麻醉下， 将成 体雄性 C57B6 小鼠 ( 重量 ： 22.8+/-0.35SEM) 坐骨神经的两个主要分支结扎并横切， 而使腓 肠神经 (sural nerve) 完好无损。触觉异常疼痛使用自动 von Frey 测试 (automatic von Frey test) 确定 ： 使用堆针刺 (dump needle stick)， 将其后爪的跖皮 (plantar skin) 暴 露于压力刺激， 其强度增加直至 5g。动物作出后爪收缩应答的力 ( 以克计 ) 作为触觉异常 疼痛的读数。 所述研究在神经损伤 7 日后进行， 持续 6 小时， 并在 24 小时后再次测定。 在神 经横切 2 日内， 触觉异常疼痛发展完全， 并保持稳定至少两周。将所述化合物作为单次应用 (3mg/kg) 静脉给药该化合物。 作为所述静脉内施用的溶剂载体 (vehicle)， 选择 1 ∶ 1 ∶ 18 溶剂载体 ( 乙醇∶ Solutol ∶磷酸盐缓冲盐水 )。
使用爪收缩阈值 (paw withdrawal threshold， PWT) 的测定值来计算显著的治疗 效果， 以及用于参照期间 (6 小时 ) 内的 AUC 计算和后续的％益处计算。对于统计分析而 言， 以两种方式使用同侧后爪的 PWT 值 ： 第一种基于特定时间 ( 在 24 小时的周期内 ) 的 PWT 值用双因素 ANOVA(two-way ANOVA)， 第二种对于未换算的 (non-transformed)AUC 差值 (delta AUC value)|AUC 1-6 小时 | 用单因素 ANOVA(one-way ANOVA)。
用反复测定的双因素变量分析 (two-way analysis of variance)( 重复因子 ： “时间 (TIME)” ， 分析变量 ： PWT)， 随后进行补充分析 (Complementary Analysis)( 对于每 个 “时间” 因子水平 “组 (GROUP)” 因子的作用 (Winer 分析 )， 分析变量 ： PWT) 和后续对于 TREATMENT 因子对 TIME 因子的各水平进行 Dunnett 检验 ( 双侧比较 vs 水平 VEHICLE)， 显 示每个化合物与溶剂载体组在静脉施用 1 到 6 小时中具有高度显著性的差异。该效果在 施用 24 小时后消失。使用差值 |AUC1-6 小时 | 的单因素 ANOVA 显示 p ＜ 0.0001 的 p 值。 Dunnett 分析对于迷宫肽素 A1 给出显著的治疗效果。所述治疗的益处百分比使用同侧溶 剂载体组 (0％有益率 ) 的 |AUC1-6 小时 | 值和所有三个组对侧的所有 |AUC1-6 小时 | 值 (100％益处＝最大可能的效果 ) 来评价。与这些界限相比， 迷宫肽素 A1 达到了 95％的益 处。
所述芋螺肽对于治疗疼痛， 糖尿病， 多发性硬化和心血管疾病是有用的， 且现在对 * 其正在进行临床前开发或临床开发。芋螺肽的实例包括 α-GI( 序列 ： ECCNPACGRHYSC*， 酰胺化， 连接 (connectivity) ： 1-3， 2-4)， 和 α-GID( 序列 ： IRγCCSNPACRVNNOHVC， 连接 ： 1-3， 2-4)， 其中 O/Hyp 是羟脯氨酸， 而所述交联表示在每个特定二硫键中所涉及的半胱氨 酸的位置， 例如， 在 α-GID 中表示第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸， 第二个与第四个半 胱氨酸 ：
最近发现了新类型的高度桥联的肽， 称为迷宫肽素 (Labyrinthopeptin)( 欧洲专 利申请 EP06020980.6)。所谓迷宫肽素遍布它们的肽链显示出独特的桥联基序 (motif)， 如 下式的化合物所示 ：
现 已 发 现 迷 宫 肽 素 类 更 加 高 度 桥 联 的 肽 可 从 微 生 物 菌 株 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 中分离。 所述化合物与专利申请 EP06020980.6 中描述的迷宫肽素 衍生物有显著的不同。
本发明的一种实施方式是式 (I) 的化合物
其中 {A} 为选自下列的基团 ：
{B} 为选自下列的基团 ：
{C} 为选自下列的基团 ：
R1 是 R1’ 基团或基团其中 R1’ 是 H， (C1-C6) 烷基 -C(O) 或 (C1-C6) 烷基 -O-C(O) ；
R2 是 OH， NH2， (C1-C6) 烷基 -NH， 苯基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH 或吡啶基 -(C1-C4) 亚烷 基 -NH ；
R3 和 R4 彼 此 独 立， 是 H， (C1-C6) 烷 基， NH2C(O)-(C1-C6) 亚 烷 基， (C1-C4) 烷 基 NHC(O)-(C1-C6) 亚烷基或 [(C1-C4) 烷基 ]2NC(O)-(C1-C6) 亚烷基，
或 R3 和 R4 与它们所连接的 S 原子一起形成二硫基团 S-S ； R5 和 R6 彼此独立， 是 H 或 OH， 或 R5 和 R6 一起为＝ O ； m 和 n 彼此独立， 是 0， 1或2； 条件是， 如果{A} 是
{B} 是
{C} 是则 R3 和 R4 可以不与它们所连接的 S 原子一起形成二硫基团 S-S。
上述化合物可为任何立体化学形式， 或任何立体化学形式以任何比例的混合物， 或其生理上可接受的盐。
优选地，
{A} 是
{B} 是
{C} 是
更优选地， {A} 是
{B} 是
{C} 是
R1 优选为基团 R1’ ， R1’ 优选为 H。R2 优选为 OH。
R3 和 R4 优选为彼此独立， 是 H， (C1-C6) 烷基， NH2C(O)-(C1-C6) 亚烷基或与它们所 连接的 S 原子一起形成二硫基团 S-S。更优选地， R3 和 R4 是 H， 或与它们所连接的 S 原子一 起形成二硫基团 S-S。最优选地， R3 和 R4 与它们所连接的 S 原子一起形成二硫基团 S-S。
R5 和 R6 优选为 H 或 OH， 其中如果 R5 是 OH， 则 R6 是 H， 而如果 R5 是 H， 则 R6 是 OH， 或 R5 和 R6 一起为＝ O。更优选地， R5 是 OH 而 R6 是 H， 或 R5 是 H 而 R6 是 OH。
优选地， 化合物 (I) 由式 (II) 化合物所表征 ：
其中 R1 是 R1’ 或基团
其中 R1’ 是 H， (C1-C6) 烷基 -C(O) 或 (C1-C6) 烷基 -O-C(O)， 优选为 H。 更优选地， 化合物 (I) 由式 (III) 化合物表征 ：
其中 R1 是 R1’ 或基团其中 R1’ 是 H， (C1-C6) 烷基 -C(O) 或 (C1-C6) 烷基 -O-C(O)， 优选为 H ；
R2 是 OH， NH2， (C1-C6)- 烷基 -NH， [(C1-C6)- 烷基 ]2N， 苯基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH 或 吡啶基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH， R2 优选为 H ； 且
R3 和 R4 彼此独立， 是 H， (C1-C6) 烷基或 NH2C(O)-(C1-C4) 亚烷基。
式 (II) 和 (III) 的化合物， 其中 R1 是 R1’ ， 在后文中命名为迷宫肽素 A1。
式 (II) 和 (III) 的化合物， 其中 R1 是基团
在后文中命名为迷宫肽素 A3。 更优选地， 化合物 (I) 是由式 (IV) 表征 ：其中
R1 是 H， (C1-C6) 烷基 -C(O) 或 (C1-C6) 烷基 -O-C(O)， 而
R2 是 OH， NH2， (C1-C6)- 烷基 -NH， N[(C1-C6)- 烷基 ]2， 苯基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH 或 吡啶基 -(C1-C4) 亚烷基 -NH， 而
R3 和 R4 彼此独立， 是 H， (C1-C6) 烷基或 NH2C(O)-(C1-C4) 亚烷基。
式 (IV) 化合物命名为迷宫肽素 A2。
优选地， 在式 (I) 化合物中， m 和 n 均为 0， 或 m 和 n 均为 2， 或 m 是 0 而 n 是 2， 或 m 是 2 而 n 是 0。最优选地， m 和 n 均为 0。
本发明还涉及本发明式 (I) 化合物所有明显的化学等同物。这些等同物是仅仅显 示细微化学差异， 并具有相同药理学作用的化合物， 或在温和条件下转化为本发明化合物 的化合物。所述等同物还包括， 例如， 式 1 化合物的盐、 还原产物、 氧化产物、 部分水解处理 的 (partial hydrolytic processes) 酯、 醚、 缩醛或酰胺， 以及本领域技术人员可使用标准 方法制备的等同物， 除此之外， 还包括所有旋光对映体 (optical antipode) 和非对映异构 体 (diastereomer) 和所有的立体异构形式 (stereoisometric form)。
除非另行指出， 式 (I) 化合物的手性中心可以以 R 构型或以 S 构型的形式存在。 本 发明涉及光学上纯的化合物和立体异构混合物， 如内消旋混合物和非对映异构体混合物。
式 (I) 化合物生理上可接受的盐应理解为是其有机盐和无机盐， 如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences( 第 17 版， 1418 页 (1985)) 所描述的。由于其物理和化学稳定 性及其溶解性， 对于酸性基团， 优选钠、 钾、 钙和铵盐等等 ； 对于碱性基团， 优选盐酸、 硫酸或 磷酸的盐， 或羧酸或磺酸 ( 如乙酸、 柠檬酸、 苯甲酸、 马来酸、 富马酸、 酒石酸和对甲苯磺酸 ) 的盐等等。
更优选地， 式 (I) 到 (IV) 的化合物由式 (V) 化合物显示的立体化学所表征， 其为 式 (I) 的化合物， 其中
{A} 是
{B} 是
{C} 是
R1 是
其中 R1’ 是H； R2 是 H ； R3 和 R4 与它们所连接的硫原子一起形成二硫基团 S-S ； R5 是 H ； R6 是 OH ； 而 m和n是0：
最优选地， 如式 (VI) 所描述 ：
本发明进一步的实施方案是式 (I) 的化合物， 由式 (VII) 表征 ：
优选为由式 (VIII) 表征的化合物其中式 (V) 和 (VI) 涉及迷宫肽素 A3， 而式 (VII) 和 (VIII) 涉及迷宫肽素 A1。
为了进一步的表征本发明化合物， 将肽残基转化回它们来自核糖体肽合成的可能 的前体。残基 4 和 13 的 α， α- 二取代的氨基酸在文献中并无先例。所述氨基酸可描述为 β- 位的羟基取代的丝氨酸， 对于式 (II) 和 (III) 的化合物如下所示 ：
在关于迷宫肽素 A2 的在先欧洲专利申请 (EP06020980.6) 中， 在不清楚其生物合 成途径的情况下， 推定其核糖体前体如下所示 ：
基于对迷宫肽素生物合成的新认识 (new insight)( 参见后文 )， 式 (IV) 化合物生 物合成的前体如下所述 ：
本发明还涉及制备权利要求 1 的式 (I) 化合物的方法， 包括
a) 在合适的条件下在培养基中发酵菌株 Actinomadura namibiensis(DSM 6313)， 或其一种变体和 / 或突变体， 直至一种或多种式 (I) 的化合物在所述培养基中产生，
b) 从所述培养基分离式 (I) 化合物， 和
c) 合适时， 衍生步骤 b) 中分离的化合物， 和 / 或合适时， 将步骤 b) 中分离的化合 物或步骤 b) 中分离的化合物的衍生物转化为生理上可接受的盐。
优选地， 在步骤 b) 中分离的化合物由式 (II) 表征， 其中 m 和 n 均为 0，
R1 是 R1’ 或基团
其中 R1’ 是 H， 而
R2 是 OH。
更优选地， 在步骤 b) 中分离的化合物是迷宫肽素 A2， 其在步骤 c) 中随后衍生为式 (IV) 的化合物， 其中
m 和 n 均为 0，
R1 是 H，
R2 是 OH， 而
R3 和 R4 彼 此 独 立， 是 H， (C1-C6) 烷 基， NH2C(O)-(C1-C6) 亚 烷 基， (C1-C4) 烷 基 NHC(O)-(C1-C6) 亚烷基或 [(C1-C4) 烷基 ]2NC(O)-(C1-C6) 亚烷基。
所述培养基是营养液或固体培养基， 其含有至少一种常规的 (customary) 碳源和 至少一种常规的氮源， 以及一种或多种常规的无机盐。
本发明的方法可用于以实验室规模 ( 微升到升规模 ) 发酵和以工业规模 ( 立方米 规模 ) 发酵。
对于所述发酵合适的碳源是可同化的糖类和糖醇， 如葡萄糖、 乳糖、 蔗糖或 D- 甘 露糖， 以及含糖的自然产物， 如麦芽提取物和酵母提取物。含氮养分的实例是氨基酸、 肽和 蛋白质及其其分解产物 ( 例如酪蛋白、 蛋白胨或胰蛋白胨 )、 肉提取物、 酵母提取物、 谷蛋白 (gluten)、 磨制的种子 ( 例如， 来自玉米、 小麦、 豆类、 大豆或棉树的种子 )、 来自乙醇生产的 蒸馏残余物、 肉粉 (meat meals)、 酵母提取物、 铵盐、 硝酸盐。优选的氮源是一种或多种肽， 其通过合成或生物合成获得。无机盐的实例是碱金属、 碱土金属、 铁、 锌、 钴和锰的盐酸盐、 碳酸盐、 硫酸盐或磷酸盐。微量元素的实例是钴和锰。
特别适于形成本发明的迷宫肽素的条件如下所述 ： 酵母提取物， 从 0.05 到 5％， 优 选从 0.1 到 2.5％； 酪胨， 从 0.2 到 5.0％， 优选从 0.1 到 2％； CaCl2×2H2O， 从 0.02 到 1.0％， 优选从 0.05 到 0.5％ ； MgSO4×7H2O， 从 0.02 到 1.5％， 优选从 0.05 到 0.7％， 和 0.00001％ 到 0.001％的维生素 B12(cyanocobalamin)。给出的每一个百分比值是按营养液总重量计 的。
对微生物进行有氧培养， 即， 例如， 将其淹没在摇瓶或发酵器中同时振荡或搅拌， 或将其淹没在固体培养基上， 合适时同时通入空气或氧气。 所述微生物在从约 18 到 35℃的 温度范围培养， 优选从约 20 到 32℃， 特别是从 27 到 30℃。pH 范围应为 4 到 10， 优选 6.5 到 7.5。所述微生物通常在这些条件下培养 2 到 10 日的期间， 优选 72 到 168 小时。对所 述微生物进行多步培养是有利的， 即， 起初在液体营养培养基中制备一种或多种初步培养 物 (preliminary culture)， 然后将这些初步培养物， 例如， 以从 1 ∶ 10 到 1 ∶ 100 的体积 比接种至实际的生产培养基 ( 即， 主培养 ) 中。所述初步培养物通过下述方法获得， 例如， 将菌株以营养细胞 (vegetative cell) 或孢子的形式接种至营养液中， 并使其生长约 20 到 120 小时， 优选 48 到 96 小时。营养细胞和 / 或孢子可通过下述方法获得， 例如， 通过使所述 菌株在固体或液体营养基质 (nutrient substrate)( 如酵母琼脂 ) 上生长约 1 到 15 日， 优 选 4 到 10 日。
所述迷宫肽素衍生物可从所述培养基使用已知的方法， 并考虑到天然物质的化 学、 物理和生物性质来分离和纯化。使用 HPLC 测试各种迷宫肽素衍生物在培养基或各个分 离步骤中的浓度， 生成的物质的量可方便地与校准溶液 (calibration solution) 相比较。
对于分离， 任选地， 将培养液或与固体培养基一起的培养物冻干， 并使用有机溶剂 或水与有机溶剂的混合物 ( 优选含有 50-90％的有机溶剂 ) 从所述冻干物中萃取迷宫肽素 衍生物。有机溶剂的实例是甲醇和 2- 丙醇。有机溶剂相包含本发明的天然物质 ； 合适时， 将其在真空中浓缩并进行进一步纯化。
本发明一种或多种化合物的进一步纯化通过色谱法在合适的材料上进行， 例如， 在分子筛、 硅胶、 氧化铝、 离子交换剂上或在吸收树脂或反相 (reversed phase， RP) 上进行。色谱法用于分离所述迷宫肽素衍生物。对所述迷宫肽素衍生物使用缓冲的、 碱性或酸化的 水溶液或水溶液与有机溶液的混合物进行色谱。
水或有机溶液的混合物均应理解为与水混溶的有机溶剂， 优选为甲醇、 2- 丙醇或 丙腈， 其浓度为 5 到 99％的有机溶剂， 优选为 5 到 50％的有机溶剂， 或者所有能与有机溶剂 混溶的缓冲水溶液。须使用的缓冲剂与上面指出的相同。
将 所 述 迷 宫 肽 素 衍 生 物 基 于 其 不 同 的 极 性， 通 过 反 相 色 谱 的 手 段， 例 如， 在 MCI( 吸收树脂， Mitsubishi， Japan) 或 Amberlite XAD(TOSOHAAS)， 或其他疏水性材料上 ( 例如， 在 RP-8 或 RP-18 相上 ) 进行分离。此外， 所述分离可通过正相色谱 ( 例如在硅胶、 氧化铝和类似物上 ) 的手段进行。
缓冲的、 碱性或酸化的水溶液应理解为， 例如， 水、 磷酸盐缓冲液、 乙酸铵和柠檬酸 缓冲液， 其浓度为至多 0.5M， 以及甲酸、 乙酸、 三氟乙酸、 氨水和三乙胺， 或本领域技术人员 已知的所有市购的酸或碱， 优选其浓度为至多 1％。在缓冲水溶液的情况下， 特别优选为 0.1％乙酸铵。
色谱可使用以 100％水起始， 以 100％有机溶剂终结的梯度进行， 所述色谱优选用 5 到 95％丙腈的线性梯度运行。 或者， 也可以进行凝胶色谱或在疏水相的色谱。凝胶色谱可， 例如， 在聚丙烯酰胺 凝胶或共聚物凝胶上进行。上述色谱的顺序可以颠倒。
在迷宫肽素以立体异构体的形式存在的情况下， 它们可以使用已知方法分离， 例 如， 通过使用手性柱 (chiral column) 的分离手段。
将 OH 基团衍生化为酯或醚衍生物使用其本身已知的方法 (J.March， Advanced Organic Chemistry， John Wiley & Sons， 第 4 版， 1992) 进 行， 例 如， 通过与酸酐反应 的手段， 或通过与碳酸二酯或硫酸二酯反应进行。将 COOH 衍生化为酯或酰胺衍生物使 用 其 本 身 已 知 的 方 法 (J.March， Advanced Organic Chemistry， John Wiley & Sons， 第 4 版， 1992) 进 行， 例 如 通 过 与 氨 反 应 生 成 相 应 的 CONH2 基 团 的 手 段， 或通过与任 选 活 化 的 烷 基 化 合 物 反 应 生 成 相 应 的 烷 基 酯 的 手 段 进 行。 将 -CH2-S-CH2- 基 团 氧 化 为 -CH2-S(O)-CH2- 或 -CH2-S(O)2-CH2- 可在将相应的迷宫肽素衍生物暴露于氧气或空气 时达成。对二硫键的还原， 以及任选地之后烷基化游离 SH 基团， 使用其本身已知的方法 (A.Henschen， Analysis of cyst(e)ine residues， disulfide bridges， and sulfhydryl groups in proteins， in ： B.Wittmann-Liebold， J.Salnikov， V.A.Erdman( 编 )， Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis， Springer， Berlin， 1986， 第 244-255 页 ) 来进行， 例如通过二硫苏糖醇进行还原和使用烷基碘进行烷基化。将硫醚 (sulfide) 还原 (C1-C6) 烷基， NH2C(O)-(C1-C6) 亚烷基， (C1-C4) 烷基 为式 (I) 化合物 ( 其中 R3 和 R4 是 H， NHC(O)-(C1-C6) 亚烷基或 [(C1-C4) 烷基 ]2NC(O)-(C1-C6) 亚烷基 )， 可以如下得到 ： 在二硫苏 糖醇存在下， 可通过将其中 R3 和 R4 与它们所连接的 S 原子一起形成二硫键的式 (I) 化合物 与 C1-C6) 卤代烷基或卤代 -(C1-C6) 亚烷基 -C(O)NH2， 卤代 -(C1-C6) 亚烷基 -C(O)NH(C1-C4) 烷基或卤代 -(C1-C6) 亚烷基 -C(O)N[(C1-C4) 烷基 ]2 反应来进行 ( 一般文献 )。卤素是 F、 Cl、 Br 或 I。
微 生 物 菌 株 Actinomadura namibiensis 的 分 离 株 由 Hoechst AG， Frankfurt， Germany 以识别参考号 (identification reference)FH-A 1198 在 1991 年 1 月 23 日， 根
据布达佩斯条约 (Budapest treaty) 以保藏号 DSM6313 保藏于德意志微生物和细胞培养物 保藏中心 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， (DSMZ)， Mascheroder Weg 1B(as of 2008 ： Inhoffenstr。7B)， 38124Braunschweig， Germany) 中。 微生物菌株 Actinomadura namibiensis 进一步由 Wink 等描述于 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2003， 53， 721-724。
除了所述菌株 Actinomadura namibiensis (DSM 6313) 之外， 还可以使用合成一 种或多种本发明化合物的其突变体和 / 或变体。
突变体是使用这样的一个或多个基因对基因组中一个或多个基因进行修饰的微 生物， 其中所述基因使所述生物能够产生本发明的化合物， 且保持功能并可以遗传。
上述突变体可以以其本身已知的方式， 使用物理手段 ( 例如辐射， 如用紫外线或 X 射线 )， 或化学诱变剂 ( 如甲磺酸乙酯 (EMS)、 2- 羟基 -4- 甲氧基二苯甲酮 (MOB) 或 N- 甲 基 -N’ - 硝 基 -N- 亚 硝 基 胍 (MNNG))， 或 如 Brock 等 在 “Biology of Microorganisms” ， Prentice Hall， 第 238-247 页 (1984) 中所述的方式产生。
变体是所述微生物的表现型。微生物具有适应其环境的能力， 并因此显示出高度 发达的生理可塑性。所述微生物的全部细胞均涉及表现型的适应， 所述变化本质上并非基 于基因， 且在条件改变时是可逆的 (H.Stolp， Microbial ecology ： organism， habitats， activities.Cambridge University Press， Cambridge， GB， 180 页， 1988)。
对合成本发明一种或多种化合物的突变体和 / 或变体的筛选通过下述方法进行 ： 任选地， 将发酵培养基冻干， 并如上所述用有机溶剂或水和有机溶剂的混合物萃取所述冻 干物或发酵液， 并通过 HPLC 或 TLC 手段或通过测试其生物学活性来进行分析。
所述发酵条件可施用于 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 及其突变体和 / 或变体。
本发明进一步的实施方案是使用如上所定义的式 (I) 的化合物用于治疗细菌感 染， 特别是由革兰氏阳性菌导致的细菌感染， 用于治疗真菌感染， 和 / 或用于治疗疼痛， 特 别是神经性疼痛或由炎症引发的疼痛。
如上所述的药物 ( 也称作药物制剂或药物组合物 ) 包含有效量的至少一种式 (I) 化合物， 如上所述， 其可为任何立体化学形式， 或任何比例的任何立体化学形式的混合物， 或药学上可接受的盐或其化学等同物， 以及至少一种药学上可接受的载体， 优选一种或多 种药学上可接受的载体物质 ( 或媒介物 (vehicle)) 和 / 或添加剂 ( 或赋形剂 )。
所述药物可经口给药， 例如以丸剂、 片剂、 包漆的片剂 (lacquered tablet)、 包衣 片剂 (coated tablet)、 颗粒剂 (granule)、 硬和软明胶胶囊、 溶液、 糖浆、 乳剂、 混悬剂或气 雾剂混合物的形式。 然而， 给药还可以经直肠进行 ( 例如以栓剂的形式 )， 或经肠道外进行， 例如静脉内、 肌肉内或皮下以注射剂或灌注液、 微囊剂、 植入物或棒 (rod) 的形式， 或经皮 进行， 或局部进行， 例如以软膏剂、 溶液或酊剂的形式， 或以其他方式， 例如以气雾剂或鼻喷 剂的形式。
本发明的药物以其本身已知， 并对于本领域技术人员熟悉的方式制备， 除了式 (I) 的化合物之外， 还使用药学上可接受的惰性无机和 / 或有机载体物质和 / 或添加剂， 所述式 (I) 的化合物如上所述， 可为任何立体化学形式， 或任何比例的任何立体化学形式的混合 物， 或生理上可接受的盐或其化学等同物。 为了产生丸剂、 片剂、 包衣片剂和硬明胶胶囊， 可以使用， 例如， 乳糖、 玉米淀粉或其衍生物、 滑石、 硬脂酸或其盐等。对于软明胶胶囊和栓剂 的载体物质是， 例如， 脂肪、 蜡、 半固体和液体多元醇、 天然油或硬化油 (hardened oil) 等。 对于制备溶液 ( 例如， 注射溶液 )、 或乳液或糖浆剂合适的载体物质是， 例如， 水、 盐水、 醇、 甘油、 多元醇、 蔗糖、 转化糖、 葡萄糖、 植物油等。对于微囊剂、 植入物或棒合适的载体物质 是， 例如， 羟基乙酸和乳酸的共聚物。 所述药物制剂通常含有按重量计约 0.5 到约 90％的式 (I) 化合物和 / 或其生理上可接受的盐和 / 或其前药 (prodrug)。如上所述， 在药物中， 为 任何立体化学形式， 或任何比例的任何立体化学形式的混合物， 或生理上可接受的盐或其 化学等同物的式 (I) 活性成分的量通常是约 0.5 到约 1000mg， 优选约 1 到约 500mg。
除了如上所述为任何立体化学形式， 或任何比例的任何立体化学形式的混合物， 或生理上可接受的盐或其化学等同物的式 (I) 活性成分以及载体之外， 所述药物制剂还可 含有一种或多种添加剂， 例如， 填充剂、 崩解剂、 粘合剂、 润滑剂、 湿润剂、 稳定剂、 乳化剂、 防 腐剂、 甜味剂、 着色剂、 调味剂 (flavoring)、 芳香剂 (aromatizer)、 增稠剂、 稀释剂、 缓冲物 质、 溶剂、 增溶剂、 达成储备作用的试剂 (agents for achieving a depot effect)、 改变渗 透压的盐、 包衣材料或抗氧化剂。其还可以含有两种或更多种式 (I) 化合物， 所述式 (I) 化 合物为任何立体化学形式， 任何比例的任何立体化学形式的混合物， 或生理上可接受的盐 或其化学等同物。如果药物制剂含有两种或更多种式 (I) 化合物， 对每个化合物的选择可 以以所述药物制剂特定的总体药理学分布 (pharmacological profile) 为目标。例如， 效 力高， 但是作用时间短的化合物可以与效力较低但长效的化合物组合。对于式 (I) 化合物 上取代基的选择所允许的可塑性使得对于所述化合物的生物学和物理化学性质的大量调 控成为可能， 并因此使得对这样期望的化合物的选择成为可能。此外， 除了至少一种式 (I) 化合物之外， 所述药物制剂还可以包含一种或多种治疗性或预防性的活性成分。
当使用式 (I) 的化合物时， 剂量可在广泛的范围内变动， 以在每个单独的病例中 适于单独的病状， 这是常规的， 并对医师而言是已知的。 例如， 其取决于使用的特定化合物， 待治疗疾病的性质和严重程度， 给药的模式和日程， 或治疗的病状是急性的还是慢性的， 或 是否进行预防。合适的剂量可使用医学领域众所周知的临床方法加以确立。一般而言， 在 重约 75kg 的成人中达成期望的结果的每日剂量为约 0.01 到约 100mg/kg， 优选约 0.1 到约 50mg/kg， 特别是约 0.1 到约 10mg/kg， ( 在每种情况下均为 mg 每 kg 体重 )。日剂量可分为 几部分， 例如 2、 3 或 4 部分给药， 特别是在施用相对较大的量时。通常， 取决于个人的状况， 可能需要将所示日剂量向上或向下调整。
实施例 1 ： 制备 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的冷冻培养物
对 100ml 培养基 (10g 淀粉， 2g 酵母提取物， 10g 葡萄糖， 10g 甘油， 2.5g 玉米浆干 粉 (cornsteep powder)， 2g 蛋白胨， 1g NaCl， 3g CaCO3 在 1 升自来水中， pH 7.2， 然后灭菌 ) 用菌株 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 在 500ml 无菌 Erlenmeyer 烧瓶中接种， 并 在 27℃， 在振荡器上以 120rpm 温育 72 小时。然后， 将 1ml 培养物与 1ml 灭菌的保藏溶液 (conservation solution)(20g 甘油， 10g 蔗糖， 70ml 去离子水 ) 混合并储藏于 -80℃。或 者， 将在琼脂上生长良好的培养物小块用 1.5ml 50％灭菌的甘油溶液转移至 Cryotubes (Vangard International) 中， 并储藏于 -196℃的液氮中。
实施例 2 ： 制备迷宫肽素
将 含 有 100ml 实 施 例 1 所 述 的 培 养 基 的 500ml 灭 菌 Erlenmeyer 烧 瓶 用Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的培养物接种， 所述菌株在琼脂平板上生长， 并 在 27 ℃， 在振荡器上以 120rpm 温育。72 小时后， 将其他含有同样含量的同样培养基的 Erlenmeyer 烧瓶各自用 2ml 的该预培养物接种， 并在相同的条件下培育 168 小时。或 者， 将 含 有 100ml 实 施 例 1 所 述 的 培 养 基 的 300ml Erlenmeyer 烧 瓶 用 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的培养物接种， 并在 25℃和 180rpm 温育。72 小时后， 将其他含有 同样含量的同样培养基的 Erlenmeyer 烧瓶均用 5ml 的该预培养物接种， 并在相同的条件下 培育 168 小时。
实施例 3 ： 迷宫肽素的固体萃取
在完成了对 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的 40L 发酵之后， 将发酵液过 滤。将组织滤过物 ( 约 30L) 加载于由约 3L CHP-20P 材料填充的柱 ( 尺寸 ： 160 x 200mm) 上。将化合物以 250ml/ 分钟的流速使用从 5％到 95％的异丙醇 / 水梯度洗脱。在 45 分钟 的期间内， 收集每 4 分钟的级分。 汇集含有迷宫肽素的级分， 并冻干 ( 级分 8 ： MW ＝ 2190Da ； 级分 9 ： MW ＝ 2190 和 2074Da ； 级分 10-12 ： MW ＝ 2074Da)
实施例 4 ： 使用 RP-18 色谱预纯化迷宫肽素 A1
将 来 自 实 施 例 3 的 级 分 10-12(670mg) 溶 解 于 500ml 甲 醇 中， 并 用 Phenomenex Luna 10μ C18(2) 预柱 ( 尺寸 ： 21.2mm x 60mm) 加载于 Phenomenex Luna 10μ C18(2) 柱 ( 尺寸 ： 50mm x 250mm) 上。将化合物用 5％到 75％丙腈 / 水梯度在 40 分钟的期间内以 190ml/ 分钟的流速洗脱 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH9.0， 使用 30％氨水溶液调整 )。收集每 分钟的级分。级分 21-22 含有所需的迷宫肽素 (MW ＝ 2074Da)。在冻干后， 获得了 332mg 粗 产物。
实施例 5 ： 迷宫肽素 A1 的终纯化
将来自实施例 4 的级分 21-22(60mg) 溶解于 50ml 甲醇中， 并用 WatersXTerra Prep MS C18 10μ 预柱 ( 尺寸 ： 19 x 10mm) 加载至 Phenomenex Luna 5μ C18(2)Axia 柱 ( 尺寸 ： 30mm x 100mm) 上。化合物用 5％到 75％丙腈 / 水的梯度在 40 分钟的期间内以 70ml/ 分钟的流速 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 4.6， 使用乙酸水溶液进行调整 ) 洗脱。将洗 脱液使用 UV- 触发 (triggering) 收集为 10ml- 级分。 汇集含迷宫肽素的级分 ( 级分 9-12)。 在冻干后， 获得了 17mg 迷宫肽素 A1。
实施例 6 ： 使用 RP-18 色谱预纯化迷宫肽素 A3
将来自实施例 3 的级分 8( ～ 850mg) 溶解于 500ml 甲醇中并用 Phenomenex Luna 10μ C18(2) 预柱 ( 尺寸 ： 21.2mm x 60mm) 加载于 Phenomenex Luna 10μ C18(2) 柱 ( 尺 寸： 50mm x 250mm)。化合物用 5％到 75％丙腈 / 水的梯度在 40 分钟的期间内 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 7.0) 以 190ml/ 分钟的流速洗脱。收集每分钟的级分。级分 19 含有所需 的迷宫肽素 (MW ＝ 2190Da)。在冻干后， 获得 48mg 粗产物。
实施例 7 ： 迷宫肽素 A3 的终纯化
将来自实施例 6 的级分 19(48mg) 溶解于 50ml 甲醇中， 并用 WatersXTerra Prep MS C18 10μ 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 加载于 Phenomenex Luna 5μ C18(2)Axia 柱 ( 尺寸 ： 30mm x 100mm)。化合物洗脱用 5％到 75％丙腈 / 水的梯度在 40 分钟的期间内以 70ml/ 分钟的流速洗脱 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 9.0， 使用 30％氨水溶液进行调整 )。将 洗脱液使用 UV- 触发收集为级分。 汇集含迷宫肽素的级分 (F9-12)。 在冻干后， 获得了 12mg迷宫肽素 A3。
实施例 8 ： 通过具有二极管阵列和质谱检测的高效液相色谱 (HPLC-DAD-MS) 鉴定 迷宫肽素 A1 和 A3
在具有 Sample Manager， Binary Solvent Manager 和 PDA( 光电二极管阵列检测 器， Photodiode Array Detector) 的 Waters Acquity UPLC System 上分析迷宫肽素 A1 和 A3。使用 Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7μ ； 2.1x100mm) 作为 UPLC 柱， 并在 0.6ml/ 分钟的流速用下述梯度洗脱 ： 在 15 分钟内从水∶丙腈 (9 ∶ 1) 变为 100％丙腈， 其中所有 的溶剂用 6.5mM 乙酸铵缓冲至 pH4.6。UV 谱由 PDA 检测器在 200 和 600nm 之间的波长来 记录。质谱用 Bruker μTOF LC MS 使用正交电喷射离子化 (orthogonal electrospray ionisation) 以 0.5Hz 的取样率和 150-1500 原子质量单位的检出限来进行记录。
实施例 9 ： 鉴定迷宫肽素 A1
迷宫肽素 A1 在 5.46 分钟 (PDA) 洗脱。UV 谱由 218nm(sh) 和 279nm 的 λmax 所表 征。
在 阴 离 子 模 式 (negative mode) 中， 在 m/z(I) 观 测 到 荷 两 个 电 荷 的 分 子 离 子： 1035.87(4539) ， 1036.37(5566) ， 1036.87(4086) ， 1037.37(2296) ， 1037.87(1034) 和 1038.37(280)。 在 阳 离 子 模 式 (positive mode) 观 察 到 具 有 下 述 m/z(I) 的 荷 两 个 电 荷 的 分 子 离 子： 1037.88(2925)， 1038.38(3252)， 1038.88(2492)， 1039.38(1396) 和 1039.88(623)。
通过高分辨率 ESI-FTICR- 质谱鉴定迷宫肽素 A1 ： 将迷宫肽素 A1/ 甲醇溶液 (c ＝ 0.2mg/ml) 通过注射泵以 2μl/ 分钟的流速引入装备了电喷射源的 Bruker Apex III FTICR MS(7T 磁体 )。图谱使用外校准 (external calibration) 以阳离子模式记录。
观察到的 m/z， Da(z ＝ 2， M+2Na+ 离子 ) 中性物质的确切单同位素分子量 [M] C92H119N23O25S4 的理论分子量 [M] 分子式
1059.8693 2073.7592 2073.7630 C92H119N23O25S4实施例 10 ： 鉴别迷宫肽素 A3 迷宫肽素 A3 在 4.79min(PDA) 洗脱。UV 谱由 218nm(sh) 和 274nm(sh) 的 λmax 所表征。 在 阴 离 子 模 式， 在 m/z(I) 观 测 到 荷 两 个 电 荷 的 分 子 离 子 ： 1093.38(1262)， 1093.88(1587)， 1094.39(1201)， 1094.89(686) 和 1095.38(195)。在阳离子模式观察到具 有下述 m/z(I) 的荷两个电荷的分子离子 ： 1095.40(365)， 1095.91(433) 和 1096.41(294)。
通过高分辨率 ESI-FTICR- 质谱鉴定迷宫肽素 A3( 方法如实施例 9 所述 ) ：
26102046652 A CN 102046656说明书1117.3847 2188.7900 2188.7900 C96H124N24O28S419/28 页观察到的 m/z， Da(z ＝ 2， M+2Na+ion) 中性物质的确切单同位素分子量 [M] C96H124N24O28S4 的理论分子量 [M] 分子式
实施例 11 ： 迷宫肽素 A1 的氨基酸分析
水解 ： 将迷宫肽素 A1(0.05mg) 在氮气气氛下用 6N HCl， 5％苯酚在 110℃水解 24 小时。将水解物在氮气流中干燥。
无 手 性 (achiral)GC-MS ： 将 水 解 物 与 二 -( 三 甲 基 甲 硅 烷 基 ) 三 氟 乙 酰 胺 (BSTFA)/ 丙腈 (1 ∶ 1) 在 150℃加热 4 小时。对于 GC-MS 实验， 使用 DB5- 熔凝硅石毛细管 (fused-silica-capilary)(l ＝ 15m×0.25μm， 涂布有二甲基 -(5％ - 苯基甲基 )- 聚硅氧 烷的熔凝硅石， df ＝ 0.10μm ； 温度程序 ： T ＝ 65° /3`/6/280℃ )。
手性 GC-MS ： 将水解物用 200μl 2N HCl/ 乙醇在 110℃酯化 30 分钟， 并干燥。 接着 将混合物用 25μl 三氟乙酸酐 (TFAA)/100μl 二氯甲烷在 110℃酰化 10 分钟， 并干燥。 对于 GC-MS 实验， 使用熔凝硅石毛细管 (l ＝ 22m×0.25μm 用 Chirasil-S-Val(Machery-Nagel) 涂铺熔凝硅石， df ＝ 0.13μm ； 温度程序 ： T ＝ 55° /3`/3,2/180℃ )。
实施例 12 ： 鉴别迷宫肽素 A1 和 A3 的结构基因
微生物 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的粘粒库由 Agowa GmbH， Berlin 基于 pWEB- 粘粒载体 (Epicentre Biotechnologies， Madison， USA) 生成。滤纸由 RZPD
GmbH， Berlin 使用描述于 Zehetner &Methods Mol.Biol.2001， 175， 169-188 的方法制备。
基于迷宫肽素 A2 的已知结构， 从 N 末端和 C 末端推导出延长的简并引物 (Fw ： 5 `-CAGGAAACAGCTATGACCGAYTGGWSNYTNTGGG-3`(SEQ ID NO ： 4) ； Rev ： 5`-TGTAAAACGACGGCC AGTRCANGANGCRAANARRC-3`(SEQ ID NO ： 5) ； Dabard 等， Appl.Environ.Microbiol.2001， 4111-4118.)。所述引物的 5’ 延长是为了增加预期的 PCR 产物的大小供更好的检测和处理 (PCR 条件 ： 3 分钟 95℃， 30x(60 秒 95℃， 30 秒 50℃， 60 秒 72℃ )， 7 分钟 72℃， Taq 聚合酶 )。 将 PCR 产物用凝胶纯化， 并克隆入载体 pDrive(Qiagen)。 测序得到来自 A2 基因中部的 18 个 核苷酸长度的序列 (AGTGCTGTAGCACGGGAA， SEQ ID NO ： 6)。 基于该 18 核苷酸长的已知片段， 通过两步 PCR 获得了更多序列信息。在第一步骤中， 用来自 A2 的 C 末端的简并反向 (rev) 引物 (5`-RCARCANGCRAANARRCTTCC-3`， SEQ ID NO ： 7) 和非特异性的正向 (fw) 引物 (5`-CACGGTACCTAGACTAGTGACCAAGTGCGCCGGTC-3`， SEQ ID NO ： 8) 进行了单特异性引物 PCR(PCR 条 件： 3 分钟 95℃； 10x(45 秒 95℃； 45 秒 38℃； 3.5min 72℃ ) ； 30x(45 秒 95℃； 45 秒 52℃； 3.5 分钟 72℃ )5 分钟 72℃ ； Taq 聚合酶 )。在进行了外切核酸酶 I 消化以消化所述引物 (5μl PCR 试样 +0.5μl 外切核酸酶 I(20U/μl) ； 15 分钟 37℃ ； 15 分钟 80℃热失活 ) 后， 将 PCR 试样用作模板进行第二 PCR(PCR 条件 ： 3 分钟 95℃ ； 30x(45 秒 95℃ ； 45 秒 56℃ ； 3.5 分钟 72℃ ) ； 5 分钟 72℃； Taq 聚合酶 )。第二 PCR 以嵌套式 (nested)PCR 的方式用由第一 PCR 中 无特异性的 fw 引物和特异性 rev 引物组成的引物对进行， 所述特异性 rev 引物包含已知的 18 个核苷酸 (5`-CTTCCCGTGCTACAGCACTCCC-3`， SEQ ID NO ： 9)。将所得的 0.4kbp 产物用凝 胶纯化， 并克隆入 pDrive。 测序显示 A2 的 C 末端的预期氨基酸序列。 从该 0.4kbp 序列通过 PCR(Fw ： 5`-ATGGACCTCGCCACGGGCTC-3`， SEQ ID NO ： 10 ； 5`-CTTCCCGTGCTACAGCACTCCC-3`， SEQ ID NO ： 11) 构建了由 Dig 标记的探针。该 Dig 标记的探针用于通过杂交和藉由用碱性 磷酸酶标记的抗 Dig 抗体进行检测的方法来筛选滤纸。以此方式， 获得了一个阳性粘粒并 对其测序。
序列数据通过局部 (local)BLAST 和 FramePlot 分析。该分析得到下列开放阅读 框 (orf)， 其包含迷宫肽素 A2 的结构基因 ：
TGACGCCCGCACACCGTTCCACCGATGAGAGGTGACAGTCCCATGGCGTCGATCCTGGAACTCCAGAA CCTGGACGTCGAGCACGCCCGCGGCGAGAACCGCTCCGACTGGAGCCTGTGGGAGTGCTGTAGCACGGGAAGCCTG TTCGCCTGCTGCTGA (SEQ ID NO ： 12)
在该 orf 内， 下述序列代表前原迷宫肽素 A2 的结构基因 ( 前导序列继以原肽编码 序列继以终止密码子 TGA) ：
ATGGCGTCGATCCTGGAACTCCAGAACCTGGACGTCGAGCACGCCCGCGGCGAGAACCGCTCCGACTGG AGCCTGTGGGAGTGCTGTAGCACGGGAAGCCTGTTCGCCTGCTGCTGA (SEQ ID NO ： 13)
示于 SEQ ID NO ： 13 的 DNA 序列的翻译得到下列前原迷宫肽素 A2(SEQ ID NO ： 14) 的氨基酸序列和原迷宫肽素 A2(SEQ ID NO ： 15) 的氨基酸序列 ：
MASILELQNLDVEHARGENR SDWSLWECCSTGSLFACC (SEQ ID NO ： 14)
SDWSLWECCSTGSLFACC (SEQ ID NO ： 15)
将所述原肽序列通过藉由微生物 Actinomadura namibiensis(DSM 6313) 的酶进 行的翻译后修饰转化为迷宫肽素 A2。
实施例 13 ： 确定迷宫肽素 A1 和 A3 的结构
所述 A2 基因的上游区域显示另一个小 orf， 其与迷宫肽素 A2 的结构基因具有高同 源性。该开放阅读框 (orf) 包含迷宫肽素 A1 和 A3 的结构基因。迷宫肽素 A1 的 orf 具有 下列基因序列 ：
TGAACATCCACCATGGCATCCATCCTTGAGCTCCAGGACCTGGAGGTCGAGCGCGCCAGCTCGGCCGCC GACAGCAACGCCAGCGTCTGGGAGTGCTGCAGCACGGGCAGCTGGGTTCCCTTCACCTGCTGCTGA
(SEQ ID NO ： 16)
在该 orf 内， 下列序列代表前原迷宫肽素 A1 和 A3 的结构基因 ( 前导序列继以原 肽编码序列继以终止密码子 TGA) ：
ATGGCATCCATCCTTGAGCTCCAGGACCTGGAGGTCGAGCGCGCCAGCTCGGCCGCCGACAGCAACGCC AGCGTCTGGGAGTGCTGCAGCACGGGCAGCTGGGTTCCCTTCACCTGCTGCTGA (SEQ ID NO ： 17)示于 SEQ ID NO ： 17 的 DNA 序列的翻译得到下列前原迷宫肽素 A1(SEQ ID NO ： 18) 的氨基酸序列和原迷宫肽素 A1(SEQ ID NO ： 19) 的氨基酸序列 ：
MASILELQDLEVERASSAADSNASVWECCSTGSWVPFTCC(SEQ ID NO ： 18)
SNASVWECCSTGSWVPFTCC (SEQ ID NO ： 19)
该氨基酸序列与基于对迷宫肽素 A1 进行的氨基酸和 MS 分析的结果 ( 见上 ) 而预 期的迷宫肽素 A1 氨基酸组成一致。对侧链的翻译后修饰推导为与迷宫肽素 A2 相应的修饰 类似。氨基酸的立体化学取自所述氨基酸分析 ( 实施例 11)。最后， 推导出苏氨酸 (Thr) 残 基脱水成为脱氢丁酸以匹配由高分辨率 MS 计算出的经验分子式。基于类似的迷宫肽素 A2 的翻译后修饰的氨基酸的立体化学， 推出迷宫肽素 A1 为式 (VIII)。
之前的分子量分析表明迷宫肽素 A1 和 A3 的区别为一个 Asp。这由所编码的序列 证实， 其在迷宫肽素 A1 的蛋白酶剪切位点之前的 -1 位包含一个 Asp。基于下述假设， 即迷 宫肽素 A1 和 A3 由同一个基因编码， 仅仅在前导序列的蛋白酶剪切方面有所不同， 所述额外 的 Asp 在迷宫肽素 A3 的 N 末端。这样， 推出迷宫肽素 A3 为式 (V)。基于类似的迷宫肽素 A2 的翻译后修饰的氨基酸的立体化学， 推出迷宫肽素 A3 为式 (VI)。
实施例 14 ： 迷宫肽素 A1 二硫桥联的剪切和用甲基碘的后续烷基化
将迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol) 溶解于甲醇 (3ml) 并在室温添加二硫苏糖醇溶 液 (1ml， 将 75mg 二硫苏糖醇溶于 40mg NaHCO3/1ml 水溶液而新鲜制备 )。将混合物在 60℃ 搅拌 1 小时。之后， 将其冷却至室温， 并添加甲基碘 (50μl， 0.80mmol)。在室温 4 小时后， 将所述混合物过滤并通过反相 HPLC 使用配备 Waters XTerra Prep MS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μm C18(2) 柱 ( 尺寸 ： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟内运行 ( 缓冲液 ： pH 2.0， 用甲酸调整 )。流 速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV 将峰分级。合并级分 12 和 13， 在冻干后产生 23.1mg(45.5％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.46min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 217nm(sh)， 279nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1050.894
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2103.802
由 C94H125N23O25S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2103.810
分子式 ： C94H125N23O25S4
化学式量＝ 2105.44。
实施例 15 ： 迷宫肽素 A1 二硫桥联的剪切和用碘乙酰胺的后续烷基化
将迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol) 溶解于甲醇 (3ml) 并在室温添加二硫苏糖醇溶 液 (1ml， 将 75mg 二硫苏糖醇溶于 40mg NaHCO3/1ml 水溶液而新鲜制备 )。将混合物在 60℃ 搅拌 1 小时。之后， 将其冷却至室温， 并添加甲基碘 (40mg， 0.216mmol)。将所述混合物在 室温搅拌过夜。将所述化合物过滤并通过反相 HPLC 使用配备 Waters XTerra Prep MS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μm C18(2) 柱 ( 尺 寸： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟内运行 ( 缓冲液 ： 0.1％乙 酸铵， pH 用乙酸调整为 4.6)。流速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV 将峰分级。获得下列化合物 ：
二乙酰胺化迷宫肽素 A1 ：
合并级分 7 和 8， 在冻干后产生 13.3mg(25.2％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.09min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 218nm(sh)， 280nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1093.9022
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2189.819
由 C96H127N25O27S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2189.822
分子式 ： C96H127N25O27S4
化学式量＝ 2191.49。
单乙酰胺化迷宫肽素 A1 ：合并级分 10 和 11， 在冻干后产生 5.3mg(10.3％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.31min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 217nm(sh)， 280nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1065.390
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2132.794
由 C94H124N24O26S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2132.800
分子式 ： C94H124N24O26S4
化学式量＝ 2134.44。
实施例 16 ： Boc 保护的迷宫肽素 A1 的合成
在室温向迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol)/ 二甲基甲酰胺 (3ml) 添加一缩二碳酸 二 叔 丁 酯 (di-tert-butyl-dicarbonate)(11mg， 0.048mmol) 和 N- 乙 基 二 异 丙 胺 (6mg， 0.048mmol)。将混合物在室温搅拌 2 小时。之后， 将其通过反相 HPLC 使用配备 Waters XTerra Prep MS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μmC18(2) 柱 ( 尺寸 ： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟内运行 ( 缓 冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 7.0)。流速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV 将峰分级。合并级分 4-7， 并 在冻干后获得 21.4mg(40.8 ％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.30min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 219nm(sh)， 278nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1085.895
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2173.805
由 C97H127N23O27S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2173.815
分子式 ： C97H127N23O27S4
化学式量＝ 2174.49。 实施例 17 ； 迷宫肽素 A1 的苄基衍生物
在室温向迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol)/ 二甲基甲酰胺 (2ml) 添加一缩二碳酸二 叔丁酯 (10mg， 0.046mmol) 和 N- 乙基二异丙胺 (7mg， 0.054mmol)。在室温保持 1 小时后， 迷宫肽素 A1 完全消失。添加苯甲胺 (6.8mg， 0.063mmol) 和正丙基膦酸酐 (T3P 50μl， 0.072mmol， 在 DMF 中 50％ )， 将混合物在室温搅拌 2 小时。 之后， 将其通过反相 HPLC 使用配 备 Waters XTerra PrepMS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μmC18(2) 柱 ( 尺寸 ： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟 内运行 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 7.0)。流速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV(220nm) 将峰分级。 获得下列两种化合物 ：
迷宫肽素 A1 的单苄基衍生物 ：
合并级分 13 和 14， 并在冻干后获得 10.4mg(19.1％ ) 期望的化合物。所述产物通 过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 7.03min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 217nm(sh)， 275nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1130.427
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2262.868
由 C104H134N24O26S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2262.878
分子式 ： C104H134N24O26S4
化学式量＝ 2264.63。
迷宫肽素 A1 的二苄基衍生物 ：
合并级分 7 和 8， 并在冻干后获得 9.9mg(17.5％ ) 期望的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 8.31min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 214nm(sh)， 276nm
ESI-MS(pos) ： [M+2(NH4)]2+ ＝ 1194.002
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2351.937
由 C111H141N25O25S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2351.941
分子式 ： C111H141N25O25S4
化学式量＝ 2353.77。
实施例 18 ： 在迷宫肽素 A1 的 N 末端的酰化反应
在室温向 2- 氯 -4， 6- 二甲氧基 -1， 3， 5- 三嗪 (CDMT， 5mg， 0.028mmol)/ 二甲基甲 酰胺 (2ml) 添加 N- 甲基吗啉 (8.6mg， 0.085mmol)。在室温 1 小时后， 添加正己酸 (3.3mg， 0.028mmol)。在将所述混合物搅拌 30 分钟后， 添加迷宫肽素 A1(50mg， 0.024mmol)， 然后在 室温搅拌 2h。 将混合物通过反相 HPLC 使用配备 Waters XTerra Prep MS C18 10μm 预柱 ( 尺寸 ： 19mm x 10mm) 的 Phenomenex Luna Axia 5μm C18(2) 柱 ( 尺寸 ： 100mm x 30mm) 纯化。梯度从 5％到 95％丙腈 / 水在 30 分钟内运行 ( 缓冲液 ： 0.1％乙酸铵， pH 7.0)。流 速为 60ml/ 分钟， 并通过 UV(220nm) 将峰分级。级分 39 在冻干后获得 2.0mg(3.8％ ) 期望 的化合物。所述产物通过 UV 光谱法和质谱 (Bruker Daltonics MicroTof) 表征。
RTmin ＝ 5.41min(PDA ； LC- 法， 如实施例 8)
UV(λmax) ： 216nm(sh)， 266nm
ESI-MS(neg) ： [M-2H]2 ＝ 1084.906
实验测得的中性单同位素分子量， [M] ＝ 2171.827
由 C98H129N23O26S4 计算出的中性单同位素分子量 ： 2171.836
分子式 ： C98H129N23O26S4
化学式量＝ 2173.52。
实施例 19 ： 迷宫肽素及其衍生物的抗菌活性
将所述化合物溶解于含 10％ MeOH 的水中， 至终浓度为 1mg/ml。对生物测定法， 使用 24 x 24cm 尺寸的灭菌 Nunc 平板。对于一个平板使用 200ml 琼脂。将琼脂在高压灭 菌后冷却至 55℃， 并在铺板前添加 2-4ml 测试生物的组织悬液。对每个平板添加 64 个 6mm 直径的滤板。向每个滤纸片 (filter plate) 添加 20μl 测试溶液， 并在 28 ℃或 37 ℃温 育 1 到 3 日。以 mm 记录抑制区。对于所述方法的详细描述， 参见 Bauer 等， Amer.J.Clin. Pathol.1966， 45， 493-496 ； Müller & Melchinger， Methoden in der Mikrobiologie， Franckhsche Verlagshandlung， Stuttgart(1964) ； Mueller & Hinton， Proc.Soc.Expt. Biol.Med.1941， 48， 330-333。
实施例 20 ： 神经性疼痛测定法在神经性疼痛的保留性神经损伤 (Spared nerve injury， SNI) 小鼠模型中研究 迷宫肽素 A1 以证实其对触觉异常疼痛 (tactile allodynia) 的活性。在全身麻醉下， 将成 体雄性 C57B6 小鼠 ( 重量 ： 22.8+/-0.35SEM) 坐骨神经的两个主要分支结扎并横切， 而使腓 肠神经 (sural nerve) 完好无损。触觉异常疼痛使用自动 von Frey 测试 (automatic von Frey test) 确定 ： 使用堆针刺 (dump needle stick)， 将其后爪的跖皮 (plantar skin) 暴 露于压力刺激， 其强度增加直至 5g。动物作出后爪收缩应答的力 ( 以克计 ) 作为触觉异常 疼痛的读数。 所述研究在神经损伤 7 日后进行， 持续 6 小时， 并在 24 小时后再次测定。 在神 经横切 2 日内， 触觉异常疼痛发展完全， 并保持稳定至少两周。将所述化合物作为单次应用 (3mg/kg) 静脉给药该化合物。 作为所述静脉内施用的溶剂载体 (vehicle)， 选择 1 ∶ 1 ∶ 18 溶剂载体 ( 乙醇∶ Solutol ∶磷酸盐缓冲盐水 )。
使用爪收缩阈值 (paw withdrawal threshold， PWT) 的测定值来计算显著的治疗 效果， 以及用于参照期间 (6 小时 ) 内的 AUC 计算和后续的％益处计算。对于统计分析而 言， 以两种方式使用同侧后爪的 PWT 值 ： 第一种基于特定时间 ( 在 24 小时的周期内 ) 的 PWT 值用双因素 ANOVA(two-way ANOVA)， 第二种对于未换算的 (non-transformed)AUC 差值 (delta AUC value)|AUC 1-6 小时 | 用单因素 ANOVA(one-way ANOVA)。
用反复测定的双因素变量分析 (two-way analysis of variance)( 重复因子 ： “时间 (TIME)” ， 分析变量 ： PWT)， 随后进行补充分析 (Complementary Analysis)( 对于每 个 “时间” 因子水平 “组 (GROUP)” 因子的作用 (Winer 分析 )， 分析变量 ： PWT) 和后续对于 TREATMENT 因子对 TIME 因子的各水平进行 Dunnett 检验 ( 双侧比较 vs 水平 VEHICLE)， 显 示每个化合物与溶剂载体组在静脉施用 1 到 6 小时中具有高度显著性的差异。该效果在 施用 24 小时后消失。使用差值 |AUC1-6 小时 | 的单因素 ANOVA 显示 p ＜ 0.0001 的 p 值。 Dunnett 分析对于迷宫肽素 A1 给出显著的治疗效果。所述治疗的益处百分比使用同侧溶 剂载体组 (0％有益率 ) 的 |AUC1-6 小时 | 值和所有三个组对侧的所有 |AUC1-6 小时 | 值 (100％益处＝最大可能的效果 ) 来评价。与这些界限相比， 迷宫肽素 A1 达到了 95％的益 处。
总之， 在所述神经性疼痛 SNI 小鼠模型中， 式 (I) 的化合物显著降低了触觉异常疼 痛。36102046652 A CN 102046656
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