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检测甲型 H1N1 病毒抗原的免疫检测试剂
    技术领域 本发明涉及生物技术领域， 具体地说涉及利用基因工程技术制备的 DNA 疫苗， 及 由其制备的单克隆抗体和免疫检测试剂。
     背景技术 血凝素 (hemagglutinin HA) 是流感病毒的主要外膜蛋白， HA 具有免疫原性， 能使 人体产生保护性抗体， 但其容易变异， 是流感流行的原因。 制备针对流感病毒血凝素蛋白特 异性单抗和多抗是流感病毒蛋白分型检测的基础， 目前针对 HA 的抗体制备采用常规的蛋 【1】 白免疫方法， 其中王慧娟等 在昆虫杆状病毒中表达甲型 H1N1 的 HA 蛋白用于免疫抗原和 【2】 筛选抗原。张祥斌等 (ChineseVeterinary Science 2008.38(11) ： 962-967) 用大肠杆菌 表达猪流感的 HA 经纯化用于免疫抗原和筛选抗原。
     关于甲型 H1N1 的 HA 为目标的流感分型检测试剂盒目前还未见报道， 现有的文献 工作仅仅局限于抗体制备上， 目前检测试剂主要存在问题在于由于 ELISA 试剂局限性， 而 临床样本 ( 主要咽拭子 ) 病毒含量极低， 低于 ELISA 试剂的检测限， 无法检出。如将病毒接 种细胞培养可检出病毒。该试剂如配合病毒培养可大大改善对临床样本的检出。
     发明内容
     本发明的一个目的在于提供含有甲型 H1N1 病毒血凝集素蛋白 DNA 序列的重组表 达载体和由其表达的针对甲型 H1N1 病毒抗原的 DNA 疫苗。
     本发明的另一个目的在于提供一种杂交瘤细胞， 以上述甲型 H1N1 病毒 DNA 疫苗免 疫小鼠后制备得到。
     本发明的又一个目的在于提供一种针对甲型 H1N1 病毒抗原的单克隆抗体， 由上 述杂交瘤细胞制备。
     本发明的再一个目的在于提供一种免疫诊断试剂。
     根据本发明的一方面， 本发明提供针对甲型 H1N1 病毒抗原的 DNA 疫苗， 通过将合 成的甲型 H1N1 流感病毒 A/California/04/2009HA 基因 ( 序列如 SEQ IDNO.1 所示 ) 插入 pCDNA3.1(+) 载体多克隆位点 ( 如附图 1) 构建含有甲型 H1N1 病毒 DNA 序列的重组表达载 体 pCDNA3.1/SF-HA 载体， 提取重组质粒 DNA， 即获得甲型 H1N1 病毒 DNA 疫苗。
     根据本发明的另一方面， 本发明提供针对甲型 H1N1 病毒抗原的单克隆和多克隆 抗体， 用上述甲型 H1N1 病毒 DNA 疫苗免疫小鼠， 取其脾脏细胞， 与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合 后制备杂交瘤细胞， 筛选杂交瘤细胞， 获得表达稳定分泌单克隆抗体， 二株筛选出来具有对 甲型 H1N1 流感病毒高特异性， 且表达稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为 2B1 和 3G4， 于 2010 年 9 月 27 日提交到中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏， 保藏号为 ： CCTCC 其 C201095 和 CCTCCC201096。培养上述 2B1 和 3G4 细胞株， 制备单克隆抗体， 纯化并鉴定， 分别属于 IgG2a 亚类和 IgG1 亚类。
     用上述甲型 H1N1 病毒 DNA 疫苗免疫动物， 例如兔， 制备多克隆抗体。根据本发明的又一方面， 提供检测甲型 H1N1 病毒抗原的免疫学方法和免疫检测 试剂， 这样的检测法通常包括一个或多个能够识别和结合甲型 H1N1 病毒抗原的抗体， 并且 可以在本领域技术人员公知的各种免疫学测试法中实现， 包括但不限于各种类型的放射免 疫实验、 酶联免疫吸附实验 (ELISA)、 酶联免疫荧光实验 (ELIFA) 等。
     在本发明的一个优选实施方案中， 提供一种使用 ELISA 方法检测甲型 H1N1 病毒抗 原的免疫检测试剂。
     本发明进一步提供为以上的检测应用的试剂盒。 试剂盒中包含酶联免疫所需的针 对甲型 H1N1 病毒抗原的单克隆和多克隆抗体， 试剂盒也包含与抗原或抗体结合的酶结合 物和 / 或含报告分子的试剂， 所述报告分子例如生物素结合蛋白质、 例如抗生物素蛋白或 链霉素抗生物素蛋白， 例如酶、 荧光素或放射性同位素标记物。此外， 试剂盒中还包含阳性 和阴性对照物以及其他必要时可以包含在其中的缓冲液、 稀释剂、 滤器、 针、 注射器和试剂 盒的使用说明书。
     本发明在抗体制备的基础上利用生物素 - 亲和素放大系统进一步研制特异性检 测甲型 H1N1ELISA 检测试剂盒， 直接用 DNA 疫苗做免疫原， 筛选抗原用 WHO 提供的甲型 H1N1 【3】 裂解疫苗株 ( 上海生物制品所提供 )。其优点在于 ： 1) 在单抗制备上 ： 利用核酸疫苗进行免疫， 避免了用全病毒蛋白做基础免疫蛋白 成分过多、 过杂的缺点， 大大提高了免疫效率。同时， 核酸疫苗在动物真核细胞中表达也避 免了用基因表达单一抗原免疫造成许多空间位点缺失的缺点。同时用全病毒甲型 H1N1 疫 【3】 苗株 做筛选抗原， 普通流感裂解疫苗 H1N1/H3N1( 购自赛诺菲巴斯德公司 ) 做对照筛选抗 原， 该方法获得抗单一组分蛋白 (HA) 特异性好、 亲和力高的单抗细胞株和多克隆抗体， 这 为后面免疫检测提供了质量非常好的抗体来源， 对试剂盒灵敏度和特异性的提高起了关键 的作用。
     2)DNA 免疫较常规蛋白免疫强而持久， 因此用 DNA 免疫制备单克隆抗体和多克隆 抗体可以省时省力。
     3) 检测方法上用生物素 - 亲和素放大系统， 大幅度提高提高试剂的灵敏度。
     附图说明 图 1 为 pcDNA3.1(+) 载体结构图。
     生物材料的保藏
     分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为 2B1 和 3G4， 于 2010 年 9 月 27 日提交到中 国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏， 保藏号为 ： CCTCC C201095 和 CCTCC C201096。
     具体实施方式
     以下实施例以举例的方式描述本发明， 其不应视为对本发明的限制。所使用的实 验材料如无特别说明， 均为市售购买。
     【实施例 1】 DNA 疫苗的制备
     甲型 H1N1 流感病毒 A/California/04/2009HA 基因序列如 SEQ ID NO.1 所示， HA 序列经上海生工合成后双酶切 (XhoI/ApaI) 插入 pCDNA3.1(+) 载体多克隆位点， 构建成 pCDNA3.1/SF-HA 载体。质粒 DNA 的大量制备
     按照 QIAGEN 公司生产的 QIAGEN Plasmid Maxi Kit 的步骤， 提取重组质粒 DNA， 将所得 DNA 溶于 TE 溶液， 在紫外分光光度计上测定所制备的质粒 DNA 的 OD260 值和 OD280 值， 按照计算 DNA 的纯度及浓度的公式算出 DNA 的纯度和浓度。根据其初始浓度稀释至终 浓度为 1μg/μl， 作电泳鉴定， 其余置 -20℃冰箱保存备用。
     【实施例 2】 鼠抗 H1N1 病毒抗原单克隆抗体的制备
     1. 免疫方法和程序 ：
     免疫途径采用股四头肌肌肉注射法， 每只 6-8 周龄 BALB/c 小鼠注射 DNA 的量为 50μg， 注射后在接种位点两侧 5mm 加入正反各 3 次的电击 (100V 电压， 电击时间为 50ms)， 初次免疫后 3 周进行加强免疫一次。
     2. 单抗制备 ：
     2.1 细胞融合 ：
     2.1.1 处死小鼠， 无菌操作下取出脾脏， 将脾脏放于 5ML RPMI-1640 的培养皿中 ( 不加血清 )， 切成 2 半， 然后用灭菌器材将细胞挤压出来。
     2.1.2 将细胞吸到 1 支无菌塑料管中， 静置 5 分钟使组织块沉降下来， 将细胞移入 另一支无菌试管并于 300XG 离心 10 分钟。
     2.1.3 洗下培养中 SP2/0(Ag14) 细胞在同样的离心机中沉淀。
     2.14 将此 2 个沉淀悬浮在 5ml RPMI-1640( 不加血清 ) 中， 彼此混合并在 300XG 离 心 10 分钟。
     2.15 轻轻敲打管子使沉淀分散， 并置管于 37℃水浴。
     2.16 将预热的 50％聚乙二醇 (PEG) 和 RPMI-1640( 不加血清 ) 带到准备融合的操 作箱内。
     2.17 于 1 分钟内在细胞沉淀中滴加入 0.8ml 50％ PEG。保持 37℃， 立即滴加入 2ml 预热的 RPMI-1640( 无血清 )， 12 分钟左右， 然后在 3 分钟内加入 8mlRPMI-1640。
     2.18 细胞在 300XG 离心 10 分钟。轻轻悬浮在所需容量的 RPM-1640-20％ FCS 中， 并接种到 96 孔板上。 。
     2.19 培养板置 于 37 ℃ 5 ％ CO2 孵温 箱内 培养， 24 小时 后， 每 孔加 入等 体积 的 RPMI-1640-2XHAT-20％ FCS 培养液。然后培养板放在孵温箱内直至出现杂交瘤细胞集落， 早期杂交瘤细胞培养物。直至集落达 2-3MM 时需要筛选上清液中抗体的活性。经鉴定适合 于进一步克隆的杂交瘤细胞， 用无菌巴斯德管吸出于 24 孔培养板中并进一步克隆。直至形 成稳定的分泌抗体的细胞株。 【3】
     2.2 细胞株筛选 ： 全病毒甲型 H1N1 疫苗株 包被进行 ELISA 筛选， 同时用普通流感 裂解疫苗 H1N1/H3N1( 购自赛诺菲巴斯德公司 ) 做对照筛选抗原， 筛选出单抗只是特异性针 对甲型 H1N1 病毒反应， 与普通流感不反应。用这种方式我们筛选到亲和力高特异性好的两 株抗甲型 H1N1 流感病毒抗原的单克隆抗体， 分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为 2B1 和 3G4， 于 2010 年 9 月 27 日提交到中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏， 保藏号为 ： CCTCC C201095 和 CCTCC C201096。
     2.3 单抗制备 ： 每株细胞扩大培养注射到降植烷处理 BALB/C 小鼠腹腔制备腹水， 经 PROTEIN-A 亲和纯化， 抗体纯度用 SDS-PAGE 鉴定， 要求上样蛋白质在 25KD 和 50KD 出现清晰两条带。纯度在 90％
     以上。克隆编号及亚类如表 1 ：
     表1： 克隆编号和对应的亚类
     克隆号 2B1 3G4
     亚类 IgG2a IgG1【实施例 3】 兔抗 H1N1 病毒抗原多克隆抗体的制备
     1、 兔多抗制备 ： 兔子免疫采用 3 月龄的家兔股四头肌肌肉注射法， 注射 DNA 的量为 100μg， 注射后在接种位点两侧 5mm 加入正反各 3 次的电击 (100V 电压， 电击时间为 50ms)， 初 次免疫后 3 周进行加强免疫一次。最后一次加强后 10 天杀兔放血， 分离血清放 -20℃保存。
     2、 兔多抗纯化 ： 采用盐析法粗提， 再经 DEAE- 纤维素离子交换层析纯化。 抗体纯度 用 SDS-PAGE 鉴定， 要求上样蛋白质在 25KD 和 50KD 出现清晰两条带， 纯度在 90％以上。
     3、 兔多抗生物素标记 ： 生物素购自 SIGMA 公司 (H1759)， 严格按照生物素使用说明 书， 将兔抗 P24 多抗抗体进行生物素标记， 充分透析后加入等体积甘油， -20℃保存。
     【实施例 4】 检测 H1N1 病毒抗原的免疫检测试剂和方法的建立
     1、 单抗包被板的制备 ： 以上两株纯化的单抗 2B1、 3G4 进行蛋白定量， 按 5μg/ml 浓 度包被过夜， 洗板封闭制成干板。
     2、 反应步骤如下 ： 将待测经适当稀释 H1N1 阳性样品 (1 ∶ 6400) 加入到已包被好 单克隆抗体的微孔板中， 再加入生物素标记的兔抗 H1N1 多抗， 37℃反应 60 分钟后洗板， 加 入经过适当浓度稀释的酶标链亲和素 (SA-HRP)， 37℃反应 30 分钟， 再次洗板， 加入 TMB 底物 显色 10 分钟， 加硫酸终止读数。其结果见表 2 ：
     表2
     从结果看 ： 2B1 的灵敏度比 3G4 好。 因此我们选择 2B1 用于检测 H1N1 用包被抗体。
     3. 该试剂最终灵敏度的确定 ： 用 2B1 包被板， 用纯化的 H1N1 疫苗株， 测其蛋白含 量为 150 微克 / 毫升。从 1 ∶ 3200 开始测其效价， 结果如表 3 ：
     表3
     稀释滴度 OD 值 1 ∶ 3200 0.83 1 ∶ 6400 0.63 1 ∶ 12800 0.31 1 ∶ 25600 0.15 1 ∶ 51200 0.15 1 ∶ 10 万 0.10 1 ∶ 20 万 0.08 阴性 0.05其 CUTOFF 值为 0.10， 该试剂对 H1N1 疫苗株灵敏度在 ：
     150 微克 / 毫升 /51200 ＝ 0.0029 微克 / 毫升＝ 2.9 纳克 / 毫升
     4、 试剂特异性考核 ：
     取季节流感疫苗株 H1N1、 H3N1( 购自赛诺菲巴斯德公司 )、 禽流感 H5N1\H7N1\ H9N2( 购自哈尔滨兽医研究所 ) 用该试剂盒检测全部为阴性。
     【实施例 5】 检测试剂盒
     试剂盒组份 ( 规格 ) ： 96 份样品
     操作方法
     1、 加样 ： 将 预 包 被 板 条 固 定 于 板 架 上。 每 孔 加 入 生 物 素 标 记 物 ( 抗 H1N1 多 抗 )25ul。每次试验设阴性对照 2 孔、 阳性对照 2 孔， 然后分别加入阴、 阳性对照 75ul ； 设空 白对照 1 孔 ； 其余孔加待测样品 75ul。
     2、 温育 ： 振荡混匀， 置 37℃温育 60 分钟。
     3、 洗涤 ： 弃去孔内液体， 将稀释后的洗液注满各孔， 静置 30-60 秒， 弃去孔内洗液， 扣干。重复洗 5 次。
     4、 加酶 ： 空白对照孔不加酶， 其余孔加入亲和素酶结合物 100ul。
     5、 温育 ： 置 37℃温育 30 分钟。
     6、 洗涤 ： 弃去孔内酶标记物， 重复洗 5 次 ( 同操作步骤 3)。
     7、 显色 ： 每孔加入底物缓冲液 50ul(1 滴 )， 再加入底物液 50ul(1 滴 )， 振荡混匀， 置 37℃温育 10 分钟。
     8、 终止 ： 每孔加入终止液 50ul(2M 硫酸 )(1 滴 )， 轻拍混匀。在单波长 450nm 或双 波长 450nm/630nm 下， 用空白孔校零， 再读取各孔 OD 值。
     结果判定
     1、 临界值 (C.O.) 计算 ： 临界值 (C.O.) ＝ 2.1× 阴性对照平均 OD 值 备注 ： 阴性对照平均 OD 值小于 0.05 按 0.05 计算， 大于 0.05 按实际值计算。 2、 结果判断 ： 样品 OD 值≥临界值 (C.O.) 为 H1N1 抗原阳性 ； 样品 OD 值＜临界值 (C.O.) 为 H1N1 抗原阴性。 注意事项 实验准备 从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方可打开使用。 未使用完的预包被板条应置于有干燥剂的封口袋中密封保存。 若 20 倍浓缩洗液出现结晶， 请置于 37℃至溶解后再使用。 不同批号的试剂组份不可混用。 本试剂盒应按含有传染性材料对待。 实验操作 试剂使用前应充分摇匀。洗涤时各孔均需加满洗液， 以防止孔口有游离酶标记物未被洗净。
     结果判读请在反应终止后 15 分钟内完成。
     以上对本发明的详细描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以对本发明作出各 种改变和变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明的权利要求所限定的范围。
     注解 ：
     【1】 LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.21No.1Jan ； 2010
     【2】 Chinese Veterinary Science 2008.38(11) ： 962-967
     背景技术 血凝素 (hemagglutinin HA) 是流感病毒的主要外膜蛋白， HA 具有免疫原性， 能使 人体产生保护性抗体， 但其容易变异， 是流感流行的原因。 制备针对流感病毒血凝素蛋白特 异性单抗和多抗是流感病毒蛋白分型检测的基础， 目前针对 HA 的抗体制备采用常规的蛋 【1】 白免疫方法， 其中王慧娟等 在昆虫杆状病毒中表达甲型 H1N1 的 HA 蛋白用于免疫抗原和 【2】 筛选抗原。张祥斌等 (ChineseVeterinary Science 2008.38(11) ： 962-967) 用大肠杆菌 表达猪流感的 HA 经纯化用于免疫抗原和筛选抗原。
     关于甲型 H1N1 的 HA 为目标的流感分型检测试剂盒目前还未见报道， 现有的文献 工作仅仅局限于抗体制备上， 目前检测试剂主要存在问题在于由于 ELISA 试剂局限性， 而 临床样本 ( 主要咽拭子 ) 病毒含量极低， 低于 ELISA 试剂的检测限， 无法检出。如将病毒接 种细胞培养可检出病毒。该试剂如配合病毒培养可大大改善对临床样本的检出。
     发明内容
     本发明的一个目的在于提供含有甲型 H1N1 病毒血凝集素蛋白 DNA 序列的重组表 达载体和由其表达的针对甲型 H1N1 病毒抗原的 DNA 疫苗。
     本发明的另一个目的在于提供一种杂交瘤细胞， 以上述甲型 H1N1 病毒 DNA 疫苗免 疫小鼠后制备得到。
     本发明的又一个目的在于提供一种针对甲型 H1N1 病毒抗原的单克隆抗体， 由上 述杂交瘤细胞制备。
     本发明的再一个目的在于提供一种免疫诊断试剂。
     根据本发明的一方面， 本发明提供针对甲型 H1N1 病毒抗原的 DNA 疫苗， 通过将合 成的甲型 H1N1 流感病毒 A/California/04/2009HA 基因 ( 序列如 SEQ IDNO.1 所示 ) 插入 pCDNA3.1(+) 载体多克隆位点 ( 如附图 1) 构建含有甲型 H1N1 病毒 DNA 序列的重组表达载 体 pCDNA3.1/SF-HA 载体， 提取重组质粒 DNA， 即获得甲型 H1N1 病毒 DNA 疫苗。
     根据本发明的另一方面， 本发明提供针对甲型 H1N1 病毒抗原的单克隆和多克隆 抗体， 用上述甲型 H1N1 病毒 DNA 疫苗免疫小鼠， 取其脾脏细胞， 与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合 后制备杂交瘤细胞， 筛选杂交瘤细胞， 获得表达稳定分泌单克隆抗体， 二株筛选出来具有对 甲型 H1N1 流感病毒高特异性， 且表达稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为 2B1 和 3G4， 于 2010 年 9 月 27 日提交到中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏， 保藏号为 ： CCTCC 其 C201095 和 CCTCCC201096。培养上述 2B1 和 3G4 细胞株， 制备单克隆抗体， 纯化并鉴定， 分别属于 IgG2a 亚类和 IgG1 亚类。
     用上述甲型 H1N1 病毒 DNA 疫苗免疫动物， 例如兔， 制备多克隆抗体。根据本发明的又一方面， 提供检测甲型 H1N1 病毒抗原的免疫学方法和免疫检测 试剂， 这样的检测法通常包括一个或多个能够识别和结合甲型 H1N1 病毒抗原的抗体， 并且 可以在本领域技术人员公知的各种免疫学测试法中实现， 包括但不限于各种类型的放射免 疫实验、 酶联免疫吸附实验 (ELISA)、 酶联免疫荧光实验 (ELIFA) 等。
     在本发明的一个优选实施方案中， 提供一种使用 ELISA 方法检测甲型 H1N1 病毒抗 原的免疫检测试剂。
     本发明进一步提供为以上的检测应用的试剂盒。 试剂盒中包含酶联免疫所需的针 对甲型 H1N1 病毒抗原的单克隆和多克隆抗体， 试剂盒也包含与抗原或抗体结合的酶结合 物和 / 或含报告分子的试剂， 所述报告分子例如生物素结合蛋白质、 例如抗生物素蛋白或 链霉素抗生物素蛋白， 例如酶、 荧光素或放射性同位素标记物。此外， 试剂盒中还包含阳性 和阴性对照物以及其他必要时可以包含在其中的缓冲液、 稀释剂、 滤器、 针、 注射器和试剂 盒的使用说明书。
     本发明在抗体制备的基础上利用生物素 - 亲和素放大系统进一步研制特异性检 测甲型 H1N1ELISA 检测试剂盒， 直接用 DNA 疫苗做免疫原， 筛选抗原用 WHO 提供的甲型 H1N1 【3】 裂解疫苗株 ( 上海生物制品所提供 )。其优点在于 ： 1) 在单抗制备上 ： 利用核酸疫苗进行免疫， 避免了用全病毒蛋白做基础免疫蛋白 成分过多、 过杂的缺点， 大大提高了免疫效率。同时， 核酸疫苗在动物真核细胞中表达也避 免了用基因表达单一抗原免疫造成许多空间位点缺失的缺点。同时用全病毒甲型 H1N1 疫 【3】 苗株 做筛选抗原， 普通流感裂解疫苗 H1N1/H3N1( 购自赛诺菲巴斯德公司 ) 做对照筛选抗 原， 该方法获得抗单一组分蛋白 (HA) 特异性好、 亲和力高的单抗细胞株和多克隆抗体， 这 为后面免疫检测提供了质量非常好的抗体来源， 对试剂盒灵敏度和特异性的提高起了关键 的作用。
     2)DNA 免疫较常规蛋白免疫强而持久， 因此用 DNA 免疫制备单克隆抗体和多克隆 抗体可以省时省力。
     3) 检测方法上用生物素 - 亲和素放大系统， 大幅度提高提高试剂的灵敏度。
    附图说明 图 1 为 pcDNA3.1(+) 载体结构图。
     生物材料的保藏
     分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为 2B1 和 3G4， 于 2010 年 9 月 27 日提交到中 国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏， 保藏号为 ： CCTCC C201095 和 CCTCC C201096。
    具体实施方式
     以下实施例以举例的方式描述本发明， 其不应视为对本发明的限制。所使用的实 验材料如无特别说明， 均为市售购买。
     【实施例 1】 DNA 疫苗的制备
     甲型 H1N1 流感病毒 A/California/04/2009HA 基因序列如 SEQ ID NO.1 所示， HA 序列经上海生工合成后双酶切 (XhoI/ApaI) 插入 pCDNA3.1(+) 载体多克隆位点， 构建成 pCDNA3.1/SF-HA 载体。质粒 DNA 的大量制备
     按照 QIAGEN 公司生产的 QIAGEN Plasmid Maxi Kit 的步骤， 提取重组质粒 DNA， 将所得 DNA 溶于 TE 溶液， 在紫外分光光度计上测定所制备的质粒 DNA 的 OD260 值和 OD280 值， 按照计算 DNA 的纯度及浓度的公式算出 DNA 的纯度和浓度。根据其初始浓度稀释至终 浓度为 1μg/μl， 作电泳鉴定， 其余置 -20℃冰箱保存备用。
     【实施例 2】 鼠抗 H1N1 病毒抗原单克隆抗体的制备
     1. 免疫方法和程序 ：
     免疫途径采用股四头肌肌肉注射法， 每只 6-8 周龄 BALB/c 小鼠注射 DNA 的量为 50μg， 注射后在接种位点两侧 5mm 加入正反各 3 次的电击 (100V 电压， 电击时间为 50ms)， 初次免疫后 3 周进行加强免疫一次。
     2. 单抗制备 ：
     2.1 细胞融合 ：
     2.1.1 处死小鼠， 无菌操作下取出脾脏， 将脾脏放于 5ML RPMI-1640 的培养皿中 ( 不加血清 )， 切成 2 半， 然后用灭菌器材将细胞挤压出来。
     2.1.2 将细胞吸到 1 支无菌塑料管中， 静置 5 分钟使组织块沉降下来， 将细胞移入 另一支无菌试管并于 300XG 离心 10 分钟。
     2.1.3 洗下培养中 SP2/0(Ag14) 细胞在同样的离心机中沉淀。
     2.14 将此 2 个沉淀悬浮在 5ml RPMI-1640( 不加血清 ) 中， 彼此混合并在 300XG 离 心 10 分钟。
     2.15 轻轻敲打管子使沉淀分散， 并置管于 37℃水浴。
     2.16 将预热的 50％聚乙二醇 (PEG) 和 RPMI-1640( 不加血清 ) 带到准备融合的操 作箱内。
     2.17 于 1 分钟内在细胞沉淀中滴加入 0.8ml 50％ PEG。保持 37℃， 立即滴加入 2ml 预热的 RPMI-1640( 无血清 )， 12 分钟左右， 然后在 3 分钟内加入 8mlRPMI-1640。
     2.18 细胞在 300XG 离心 10 分钟。轻轻悬浮在所需容量的 RPM-1640-20％ FCS 中， 并接种到 96 孔板上。 。
     2.19 培养板置 于 37 ℃ 5 ％ CO2 孵温 箱内 培养， 24 小时 后， 每 孔加 入等 体积 的 RPMI-1640-2XHAT-20％ FCS 培养液。然后培养板放在孵温箱内直至出现杂交瘤细胞集落， 早期杂交瘤细胞培养物。直至集落达 2-3MM 时需要筛选上清液中抗体的活性。经鉴定适合 于进一步克隆的杂交瘤细胞， 用无菌巴斯德管吸出于 24 孔培养板中并进一步克隆。直至形 成稳定的分泌抗体的细胞株。 【3】
     2.2 细胞株筛选 ： 全病毒甲型 H1N1 疫苗株 包被进行 ELISA 筛选， 同时用普通流感 裂解疫苗 H1N1/H3N1( 购自赛诺菲巴斯德公司 ) 做对照筛选抗原， 筛选出单抗只是特异性针 对甲型 H1N1 病毒反应， 与普通流感不反应。用这种方式我们筛选到亲和力高特异性好的两 株抗甲型 H1N1 流感病毒抗原的单克隆抗体， 分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为 2B1 和 3G4， 于 2010 年 9 月 27 日提交到中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏， 保藏号为 ： CCTCC C201095 和 CCTCC C201096。
     2.3 单抗制备 ： 每株细胞扩大培养注射到降植烷处理 BALB/C 小鼠腹腔制备腹水， 经 PROTEIN-A 亲和纯化， 抗体纯度用 SDS-PAGE 鉴定， 要求上样蛋白质在 25KD 和 50KD 出现清晰两条带。纯度在 90％
     以上。克隆编号及亚类如表 1 ：
     表1： 克隆编号和对应的亚类
    克隆号 2B1 3G4
    亚类 IgG2a IgG1【实施例 3】 兔抗 H1N1 病毒抗原多克隆抗体的制备
     1、 兔多抗制备 ： 兔子免疫采用 3 月龄的家兔股四头肌肌肉注射法， 注射 DNA 的量为 100μg， 注射后在接种位点两侧 5mm 加入正反各 3 次的电击 (100V 电压， 电击时间为 50ms)， 初 次免疫后 3 周进行加强免疫一次。最后一次加强后 10 天杀兔放血， 分离血清放 -20℃保存。
     2、 兔多抗纯化 ： 采用盐析法粗提， 再经 DEAE- 纤维素离子交换层析纯化。 抗体纯度 用 SDS-PAGE 鉴定， 要求上样蛋白质在 25KD 和 50KD 出现清晰两条带， 纯度在 90％以上。
     3、 兔多抗生物素标记 ： 生物素购自 SIGMA 公司 (H1759)， 严格按照生物素使用说明 书， 将兔抗 P24 多抗抗体进行生物素标记， 充分透析后加入等体积甘油， -20℃保存。
     【实施例 4】 检测 H1N1 病毒抗原的免疫检测试剂和方法的建立
     1、 单抗包被板的制备 ： 以上两株纯化的单抗 2B1、 3G4 进行蛋白定量， 按 5μg/ml 浓 度包被过夜， 洗板封闭制成干板。
     2、 反应步骤如下 ： 将待测经适当稀释 H1N1 阳性样品 (1 ∶ 6400) 加入到已包被好 单克隆抗体的微孔板中， 再加入生物素标记的兔抗 H1N1 多抗， 37℃反应 60 分钟后洗板， 加 入经过适当浓度稀释的酶标链亲和素 (SA-HRP)， 37℃反应 30 分钟， 再次洗板， 加入 TMB 底物 显色 10 分钟， 加硫酸终止读数。其结果见表 2 ：
     表2
    从结果看 ： 2B1 的灵敏度比 3G4 好。 因此我们选择 2B1 用于检测 H1N1 用包被抗体。
     3. 该试剂最终灵敏度的确定 ： 用 2B1 包被板， 用纯化的 H1N1 疫苗株， 测其蛋白含 量为 150 微克 / 毫升。从 1 ∶ 3200 开始测其效价， 结果如表 3 ：
     表3
    
    稀释滴度 OD 值 1 ∶ 3200 0.83 1 ∶ 6400 0.63 1 ∶ 12800 0.31 1 ∶ 25600 0.15 1 ∶ 51200 0.15 1 ∶ 10 万 0.10 1 ∶ 20 万 0.08 阴性 0.05其 CUTOFF 值为 0.10， 该试剂对 H1N1 疫苗株灵敏度在 ：
     150 微克 / 毫升 /51200 ＝ 0.0029 微克 / 毫升＝ 2.9 纳克 / 毫升
     4、 试剂特异性考核 ：
     取季节流感疫苗株 H1N1、 H3N1( 购自赛诺菲巴斯德公司 )、 禽流感 H5N1\H7N1\ H9N2( 购自哈尔滨兽医研究所 ) 用该试剂盒检测全部为阴性。
     【实施例 5】 检测试剂盒
     试剂盒组份 ( 规格 ) ： 96 份样品
    操作方法
     1、 加样 ： 将 预 包 被 板 条 固 定 于 板 架 上。 每 孔 加 入 生 物 素 标 记 物 ( 抗 H1N1 多 抗 )25ul。每次试验设阴性对照 2 孔、 阳性对照 2 孔， 然后分别加入阴、 阳性对照 75ul ； 设空 白对照 1 孔 ； 其余孔加待测样品 75ul。
     2、 温育 ： 振荡混匀， 置 37℃温育 60 分钟。
     3、 洗涤 ： 弃去孔内液体， 将稀释后的洗液注满各孔， 静置 30-60 秒， 弃去孔内洗液， 扣干。重复洗 5 次。
     4、 加酶 ： 空白对照孔不加酶， 其余孔加入亲和素酶结合物 100ul。
     5、 温育 ： 置 37℃温育 30 分钟。
     6、 洗涤 ： 弃去孔内酶标记物， 重复洗 5 次 ( 同操作步骤 3)。
     7、 显色 ： 每孔加入底物缓冲液 50ul(1 滴 )， 再加入底物液 50ul(1 滴 )， 振荡混匀， 置 37℃温育 10 分钟。
    8、 终止 ： 每孔加入终止液 50ul(2M 硫酸 )(1 滴 )， 轻拍混匀。在单波长 450nm 或双 波长 450nm/630nm 下， 用空白孔校零， 再读取各孔 OD 值。
     结果判定
     1、 临界值 (C.O.) 计算 ： 临界值 (C.O.) ＝ 2.1× 阴性对照平均 OD 值 备注 ： 阴性对照平均 OD 值小于 0.05 按 0.05 计算， 大于 0.05 按实际值计算。 2、 结果判断 ： 样品 OD 值≥临界值 (C.O.) 为 H1N1 抗原阳性 ； 样品 OD 值＜临界值 (C.O.) 为 H1N1 抗原阴性。 注意事项 实验准备 从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方可打开使用。 未使用完的预包被板条应置于有干燥剂的封口袋中密封保存。 若 20 倍浓缩洗液出现结晶， 请置于 37℃至溶解后再使用。 不同批号的试剂组份不可混用。 本试剂盒应按含有传染性材料对待。 实验操作 试剂使用前应充分摇匀。洗涤时各孔均需加满洗液， 以防止孔口有游离酶标记物未被洗净。
     结果判读请在反应终止后 15 分钟内完成。
     以上对本发明的详细描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以对本发明作出各 种改变和变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明的权利要求所限定的范围。
     注解 ：
     【1】 LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.21No.1Jan ； 2010
     【2】 Chinese Veterinary Science 2008.38(11) ： 962-967
     【3】 A/reassortant/NYMC X-179A(Califomia/07/2009x NYMC X-157)8102041265 A CN 102041268
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