来源于甘蓝油菜的启动子及其应用 【技术领域】
本发明涉及来源于甘蓝油菜的启动子及其应用。背景技术 植物中的脂肪酸又被称为植物油， 它广泛存在于植物的种子中。 植物油用途广泛， 运用生物技术改良植物体内脂肪酸的组分和含量具有重要的经济价值。其中， 遗传工程技 术所选用的操作基因必需是植物体内脂肪酸生物合成过程中的关键基因， 但是目前人们对 于植物脂肪酸生物合成的分子调控机制还不甚了解， 因此， 利用遗传工程技术提高油料作 物含油量的工作目前进展缓慢。以双子叶模式植物拟南芥为例， 植物的胚胎发生主要分为 两个阶段 ： 早期形态发生过程和晚期成熟过程。整个胚胎发育过程中伴随着淀粉、 蛋白质 和脂肪酸等贮藏物质的积累。在胚胎发育早期， 主要是淀粉的大量积累， 在组织和器官形 成以后， 淀粉被转化为蛋白质和脂肪酸。 在发育的种子中， 碳水化合物通过糖酵解途径被分 解成磷酸烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate， PEP)， PEP 被运输到质体后再转化成丙酮 酸和乙酰 CoA， 乙酰 CoA 作为底物参与脂肪酸的合成 (Ruuska， S.A.， Girke， T.， Benning， C.， and Ohlrogge， J.B.(2002).Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsis seed filling.Plant Cell 14， 1191-1206.)。
在种子发育过程中， 质体内的脂肪酸合成酶复合物中的酶类负责脂肪酸的合成， 所合成的脂肪酸被导入胞质酰基 CoA 库中以维持三酯酰甘油 (TAG) 积累。 植物种子中的 TAG 的生物合成是在内质网中进行的。TAG 的前体是甘油 -3- 磷酸和脂酰 CoA， 合成 TAG 的过 程共需要三种酰基转移酶和一种磷酸水解酶， 分别是甘油 -3- 磷酸酰基转移酶 (GPAT)， 溶 血磷脂酸酰基转移酶 (LPAT)， 二脂酰甘油酰基转移酶 (DGAT) 和磷脂磷酸水解酶 (PAPase) (Ohlrogge 等， 1979， Proc Natl Acad Sci， USA， 76 ： 1194-1198)。这三种酰基转移酶催化甘 油骨架的逐步酰基化过程。 近十余年来， 科学家们对利用遗传工程技术提高植物体内， 特别 是种子中的脂肪酸含量进行了各种有益的探索。Shintani 等在烟草中过量表达了 ACCase 的一个亚基 - 生物素羧化酶 (BC 亚基 )， 在烟草叶片中 BC 的表达水平提高了 3 倍， 其它三 个亚基的表达水平没有发生明显变化， 但脂肪酸的含量和组成也没有明显改变 (Shintani， D.， Roesler， K.， Shorrosh， B.， Savage， L.， and Ohlrogge， J.(1997).Antisenseexpression and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves.Plant Physiol 114， 881-886.)。另一项研究表明， 增加丙酰 CoA 的含量能够提高脂肪酸的含量。Roeseler 等 利用种子特异性表达启动子在油菜中过量表达拟南芥中的 HO-ACCase 基因， 结果使 ACCase 的活性明显提高， 种子中的含油量提高 3-5 ％ (Roesler， K.， Shintani， D.， Savage， L.， Boddupalli， S.， and Ohlrogge， J.(1997).Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds.Plant Physiol 113， 75-81.)。Roeseler 等的研究结果表明， 丙酰 CoA 水平能够提高脂肪酸的含量， 但提高幅度 结果使 KASIII 的酶活性提高 较小。Dechesh 等将菠菜的 KASIII 基因在烟草中过量表达， 了 100-300 倍， 但脂肪酸的含量却降低了 5-10％ (Dehesh 等， 2001， Plant Physiol.， 125 ：
1103-1114)。 上述研究结果表明， 植物体内的脂肪酸代谢是一个复杂和高度协调的过程， 通 过对脂肪酸代谢途径中的个别或单个基因进行遗传操作并不能够有效地改变脂肪酸的含 量。因此， Girke 等人预言在脂肪酸的代谢过程中， 很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因 子 ( 例如转录因子 ) 在起调控作用 (Girke， T.， Todd， J.， Ruuska， S.， White， J.， Benning， C.， and Ohlrogge， J.(2000).Microarray analysis of developing Arabidopsis seeds. Plant Physiol 124， 1570-1581.)。
目前， 已发现的参与植物脂肪酸代谢的转录因子有拟南芥的 WRI1 和 LEC1 等。其 中， WRI1 编码一个 AP2/EREB 转录因子蛋白， 它可能是植物体内由蔗糖向 TAG 转化的一个 关键的调节因子 (Cernac， A.， and Benning， C.(2004).WRINKLED1encodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compound biosynthesis in Arabidopsis.Plant J 40， 575-585.)。 LEC1 属于能结合启动子中顺式作用元件 CCAAT 盒的 一类转录因子， 调控胚胎的发生与种子成熟， 同时可能对胚胎形成过程中胚胎储存物的积 累进行调控 (Lotan， T.， Ohto， M.， Yee， K.M.， West， M.A.， Lo， R.， Kwong， R.W.， Yamagishi， K. ， Fischer ， R.L. ， Goldberg ， R.B. ， and Harada ， J.J.(1998).Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells.Cell 93， 1195-1205.)。 过量表达 LEC1 能大幅度增加转基因拟南芥幼苗中的脂肪酸含量 (Mu， J.， Tan， H.， Zheng， Q.， Fu， F.， Liang， Y.， Zhang， J.， Yang， X.， Wang， T.， Chong， K.， Wang， X.J.， et al.(2008).LEAFY COTYLEDON1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis.Plant Physiol 148， 1042-1054.)。 在拟南芥基因组中， 编码转录因子的基因占了很大一部分， 至少有 1500 个， 占整 个基因组的 5％以上 (Riechmann 等， 2000， Science， 290 ： 2110-2113)。这些转录因子大多 属于大的基因家族， 有的基因家族又包括许多亚族， 而且有些转录因子家族是植物所特有 的。对转录因子的研究结果表明， 一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节 控制， 从而有效改变植物的相关特性。CCAAT 盒是一个广泛存在于基因启动子上的顺式作 用元件， 与 CCAAT 序列结合的转录因子又称为 nuclear factor Y(NF-Y) 或 CCAAT binding factor(CBF)。NF-Y 是一个由三种不同亚基构成的异源三聚体复合物， 它特异性地识别 DNA 上的 CCAAT 序列， 并与之结合， 从而调节基因的表达。 NF-Y 的三种不同亚基分别属于 3 个亚 族： NF-YA( 又称为 HAP2 或 CBF-B)， NF-YB( 又称为 HAP3 或 CBF-A) 和 NF-YC( 又称为 HAP5 或 CBF-C)。NF-YB 和 NF-YC 的核心结构域在序列上与组蛋白 H2A 和 H2B 有很高的同源性。 NF-YB/NF-YC 形成一个紧密结合的异源二聚体复合物， NF-YA 再结合在这个复合物的表面， 形成异源三聚体复合物。 该三聚体复合物对 DNA 有很高的亲和力 (Gusmaroli， G.， Tonelli， C.， and Mantovani， R.(2002).Regulation of novel members of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits.Gene 283， 41-48. ； Romier， C.， Cocchiarella， F.， Mantovani， R.， and Moras， D.(2003).The NF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation by CCAAT factor NF-Y.J Biol Chem 278， 1336-1345)。
编码 NF-Y 亚基的基因普遍存在于真核生物中， 其中在酵母与动物体中， 各种亚 基都是由单基因编码的。而在植物的基因组中， NF-Y 亚基是由多种不同基因编码的。在 拟南芥中， Gusmaroli 等人先后于 2001 年和 2002 年报道了三个 NF-Y 亚族中的共 29 个
ESTs 的序列 (Gusmaroli， G.， Tonelli， C.， and Mantovani， R.(2001).Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana.Gene 264， 173-185)，本 发 明的发明人于 2004 年完成了该家族 32 个基因 cDNA 的克隆， 其中 9 个 HAP2， 11 个 HAP3， 12 个 HAP5(Wei 等， 2004， Plant Physiol.， 135 ： 773-782)。NF-YB 亚 族 的 转 录 因 子 在 基 因内部都含有一个保守的 B 结构域， 依据 B 结构域序列的差异， 该家族被分为两类 ： LEAFY COTYLEDON1(LEC1) 类型和非 LEC1 类型 (Kwong， R.W.， Bui， A.Q.， Lee， H.， Kwong， L.W.， Fischer， R.L.， Goldberg， R.B.， and Harada， J.J.(2003).LEAFY COTYLEDON1-LIKE defines a class of regu lators essential for embryo development.Plant Cell 15， 5-18)。 LEC1 类型包括两个基因 ： LEC1 和 LEAFY COTYLEDON1-like(L1L)。这两个基因都是特异性 地在胚胎和种子发育过程中表达。LEC1 类型的转录因子的 B 结构域含有 16 个保守的氨 基酸残基， 这 16 个氨基酸残基在非 LEC1 类型的转录因子中是不存在的。B 结构域是决定 LEC1 类转录因子在功能上区别于其它非 LEC1 类转录因子的关键因素 (Hyes eung 等， 2003， Proc Natl Acad Sci， USA， 100 ： 2152-2156)。LEC1 是 HAP3 家族中功能研究的较为清楚的 一个蛋白。LEC1 是拟南芥胚胎发生过程中一个关键的调控因子。LEC1 参与了种子成熟的 多个过程， 包括种子的干燥和养分的积累。 目前， 在玉米、 向日葵和胡萝卜中， 均发现了 LEC1 基因的同源基因 (Zhang， S.， Wo ng， L.， Meng， L.， and Lemaux， P.G.(2002).Similarity of expression patterns of k nottedl and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize(Zea mays L.).Planta 215， 191-194. ； Yazawa， K.， Takahata， K.， and Kamada， H.(2004).Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledonl and expression analysis during somatic and zygotic embryogenesis.Plant Physiol Biochem 42， 215-223.)。 发明内容
本发明的目的在于提供一种启动子。
本发明提供的启动子， 其核苷酸序列是如下 1) 或 2) 或 3) ：
1) 序列表中序列 1 的自 5’ 端第 832-1145 位所示的核苷酸序列 ；
2) 在高严谨条件下与所述 1) 的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序 列；
3) 与所述 1) 的核苷酸序列具有 70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序 列。
本发明的目的在于提供另一种启动子。
所述另一种启动子的核苷酸序列是如下 1) 或 2) 或 3) ：
1) 序列表中序列 1 的自 5’ 端第 872-1145 位所示的核苷酸序列 ；
2) 在高严谨条件下与所述 1) 的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序 列；
3) 与所述 1) 的核苷酸序列具有 70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序 列。
本发明的目的在于提供又一种启动子。
所述又一种启动子的核苷酸序列是如下 1) 或 2) 或 3) ：1) 序列表中序列 1 的自 5’ 端第 891-1145 位所示的核苷酸序列 ； 2) 在高严谨条件下与所述 1) 的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序 3) 与所述 1) 的核苷酸序列具有 70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列；
列。 所 述 高 严 谨 条 件 是 指， 将 杂 交 膜 置 于 预 杂 交 液 (0.25mol/L 磷 酸 钠 缓 冲 液， pH7.2， 7 ％ SDS) 中， 65 ℃预杂交 30min ； 弃预杂交液， 加入杂交液 (0.25mol/L 磷酸钠缓 冲液， pH7.2， 7 ％ SDS， 同位素标记的核苷酸片段 )， 65 ℃杂交 12hr ； 弃杂交液， 加入洗膜 液 I(20mmol/L 磷酸钠缓冲液， pH7.2， 5 ％ SDS)， 65 ℃洗膜 2 次， 每次 30min ； 加入洗膜液 II(20mmol/L 磷酸钠缓冲液， pH7.2， 1％ SDS)， 65℃洗膜 30min。
本发明的启动子活性片段还包括与来自 SEQ ID N0.1 的片段的核苷酸序列互补的 核苷酸序列。这里使用的术语 “互补的” 系指遵循碱基配对原则产生的之意。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法， 例如定向进化和点突变的方 法， 对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的， 具有与本发明分离得 到的启动子核苷酸序列 70％或者更高同源性的核苷酸， 只要保持了表达靶基因的启动子活 性， 均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语 “同源性” 指与天然核酸序列的序列相似性。 “同源性” 包括与本发 明的启动子核苷酸序列具有优选地 75％或更高， 更优选地 85％或更高， 甚至更优选地 90％ 或更高， 以及最优选地 95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件， 两个或多个序列之间的同源性可以用百分比 (％ ) 表示， 其可 以用来评价相关序列之间的同源性。
含有任一上述的启动子的重组载体也属于本发明的保护范围之内。
上述重组载体具体是任一上述的启动子与下述 1) 或 2) 或 3) 的基因一起插入载 体 pCAMBIA-2300 的多克隆位点制成的重组表达载体 ：
1) 其核苷酸序列是序列表中的序列 2 ；
2) 其核苷酸序列是序列表中的序列 3 ；
3) 其核苷酸序列是序列表中的序列 4。
含有任一上述的启动子的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。
含有任一上述的启动子的重组菌也属于本发明的保护范围之内。
任一上述的启动子在驱动目的基因在胚胎或种子组织中特异表达中的应用也属 于本发明的保护范围之内。
上述目的基因是下述 1) 或 2) 或 3) 的基因 ：
1) 其核苷酸序列是序列表中的序列 2 ；
2) 其核苷酸序列是序列表中的序列 3 ；
3) 其核苷酸序列是序列表中的序列 4。
本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用， 因此， 所述被转化的植物细胞、 组织或器官既可来源于拟南芥、 油菜、 花生、 棉花、 大豆、 向日葵、 棕榈树、 橄榄树、 蓖麻、 马铃 薯或烟草等双子叶植物， 也可来源于水稻、 玉米、 小麦、 大麦、 燕麦、 黑麦、 高梁、 谷子或草坪 草等单子叶植物。
实验证明 ： 本发明的发明人构建了 3 个在种子特异并适度表达的启动子， 用于驱 动转基因油菜中 AtL1L 基因、 BnLEC1 基因和 BnL1L 基因表达。转基因实验表明能显著提高 油料作物油菜种子中的油含量， 为转基因方法提高油料作物的脂肪酸含量提供一条行之有 效的途径。这对提高植物 ( 特别是油料作物 ) 的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的 理论及实际意义， 在农业领域具有广阔的应用和市场前景。 附图说明 图 1 为 AtL1L 蛋白的保守结构域， 数字表示氨基酸残基位置， 61-126 为保守的 NF-YB 结构域。
图 2 为油菜 napin A 启动子缺失片段与 GUS 基因融合表达载体简图， +1 表示预测 的转录起始点， 箭头指示转录方向 ； 数字表示 napin A 启动子以及相应突变体 (D 系列突变 体 ) 的长度与突变的相对位置， GUS 编码区未按长度比列绘制。
图 3 为 napin A 启动子缺失片段驱动 GUS 表达酶活分析 D0、 D4、 D6 和 D7 为油菜 napin A 启动子的缺失驱动 GUS 的转基因拟南芥果荚中 GUS 酶活， 每个缺失片段启动子测 定 5 个独立家系， 以典型家系表示该缺失片段启动子驱动能力。数据为三次独立测定的平 均值。
图 4 为 D4 和 D6 启动子驱动 AtL1L 表达载体， +1 表示预测的转录起始点， 箭头指示 转录方向 ； D4、 D6 表示不同长度的 napin A 启动子突变体， 启动子按照长度比例绘制， AtL1L 基因未按长度比列绘制。
图 5 为 D4::AtL1L 转基因油菜种子中油含量， 中油 821 为非转基因油菜野生型对 照； D4::AtL1L#1、 D4::AtL1L#2、 D4::AtL1L#3、 D4::AtL1L#4 为以中油 821 为背景的转基因 油菜株系。
图 6 为 D6::AtL1L 转基因油菜种子中油含量， Westar 油菜为非转基因野生型油菜 对照 ； D6::AtL1L#1、 D6::AtL1L#2、 D6::AtL1L#3、 D6::AtL1L#4 为以 Westar 为背景的转基因 油菜株系。
图 7 为 BnLEC1 蛋白的保守结构域， 数字表示氨基酸残基位置， 59-126 为保守的 NF-YB 结构域。
图 8 为为 D7 启动子驱动 BnLEC1 表达载体， +1 表示预测的转录起始点， 箭头指示 转录方向 ； D7 表示 napin A 启动子突变体的长度， 启动子按照长度比例绘制， BnLEC1 基因未 按长度比列绘制。
图 9 为为 D7::BnLEC1 转基因油菜种子中油含量， Westar 为非转基因野生型油菜 对照 ； D7::BnLEC1#2、 D7::BnLEC1#3、 D7::BnLEC1#4、 D7::BnLEC1#5 为以 Westar 为背景的转 基因油菜株系。
图 10 为为 BnL1L 蛋白的保守结构域， 数字表示氨基酸残基位置， 56 ～ 121 为保守 的 NF-YB 结构域。
图 11 为 D7 和 D6 启动子驱动 BnL1L 表达载体简图， +1 表示预测的转录起始点， 箭 头指示转录方向 ； D0、 D6 和 D7 表示 napin A 启动子以及相应突变体的长度， 启动子按照长 度比例绘制， BnL1L 基因未按长度比列绘制。
图 12 为 D0::BnL1L 转基因油菜种子中油含量， 中油 821 为非转基因油菜野生型对
照； D0::BnL1L#1、 D0::BnL1L#2、 D0::BnL1L#3、 D0::BnL1L#4 为以中油 821 为背景的转基因 油菜株系。
图 13 为 D6::BnL1L 转基因油菜种子中油含量， 中油 821 为非转基因油菜野生型对 照； D6::BnL1L#3、 D6::BnL1L#4、 D6::BnL1L#5、 D6::BnL1L#6 为以中油 821 为背景的转基因 油菜株系。
图 14 为 D6::BnL1L 转基因油菜种子中油含量， Westar 为非转基因野生型油菜对 照； D6::BnL1L#6、 D6::BnL1L#7、 D6::BnL1L#8、 D6::BnL1L#9 为以 Westar 为背景的转基因油 菜株系。
图 15 为 D7::BnL1L 转基因油菜种子中油含量， Westar 为非转基因野生型油菜对 照； D7::BnL1L#5、 D7::BnL1L#6、 D7::BnL1L#7、 D7::BnL1L#8 为以 Westar 为背景的转基因油 菜株系。
图 16 为 D0::BnL1L 转基因拟南芥幼苗表型， Col-0 野生型对照种子和以 Col-0 为 背景的转基因种子在 MS 培养基上萌发， 培养条件为 22℃， 光照强度 80-120μE-2S-1， 16 小时 光照的温室中培养生长 12 天， 左边为 Col-0 非转基因野生型对照苗 ； 右边为 D0::BnL1L 转 基因苗 ； 转基因幼苗子叶缺乏或畸形变小， 红色箭头指示为子叶。 图 17 为 D0::BnL1L 转基因拟南芥种子中油含量， Col-0 为非转基因野生型拟南芥 对照 ； D0::BnL1L#9、 D0::BnL1L#10、 D0::BnL1L#11 为以 Col-0 为背景的转基因拟南芥株系 ； * 表示与对照比较有显著差异， P ＜ 0.01 ； 拟南芥种子中油含量测定采用 GC/MS 方法， 数据 为三次独立测定的平均值。
图 18 为 D7::BnL1L 转基因拟南芥种子中油含量， Col-0 为非转基因野生型拟南 芥对照 ； D7::BnL1L#4、 D7::BnL1L#6、 D7::BnL1L#12、 D7::BnL1L#13 为以 Col-0 为背景的转 基因拟南芥株系 ； * 表示与对照比较有显著差异， P ＜ 0.01 ； 拟南芥种子中油含量测定采用 GC/MS 方法， 数据为三次独立测定的平均值。
具体实施方式
下述实施例中， 如无特殊说明， 均为常规方法。中油 821、 Westar 油菜均由西南大 学李加纳老师在 2007 年 7 月赠送， 其原始来源不清楚。拟南芥 (Col-0) 种子由 2001 年 5 月 ABRC(http://www.arabidopsis.org) 赠送， 其原始来源不清楚。
实施例 1、 种子含油量高的转基因油菜的获得
一、 启动子的获得及其检测
1、 启动子的获得
根据 napin A 启动子的核苷酸序列 (GenBank 号 ： J02798.1)， 按照图 2 设计 napin A 启动子缺失片段引物 (F 为前端引物， R 为反向引物 )， 用于扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜 (Brassica napus L.) 中的种子胚胎特异表达的启动子， 引物序列如下 ： ( 划线为酶切位点， 前面三个碱基为保护碱基 )
D0 F ： 5′ -CGAAAGCTTTCTTCATCGGTGATTGATTC-3′ ；
D7 F ： 5′ -CGAAAGCTTCCATGCCAGAACATTAGCTACACG-3′ ；
D6 F ： 5′ -CGAAAGCTTAAGAATCGTTCATAAGATGCCATGC-3′ ；
D4 F ： 5′ -CGAAAGCTTTTTTAATTTTATGAAGTTAAGTTT-3′ ；napinA R ： 5′ -TTAGTCGACTCGTGTATGTTTTTAATCTTG-3′。
用 CTAB 法提取油菜中油 821( 谢柱存 . 中油 821 的特性与栽培 [J]. 广西农业科 学， 1991， (05) ： 213) 基因组 DNA， 在 napin A 前端引物 (D0 F、 D4 F、 D6 F 和 D7 F) 和后端 引物 napinA R 的分别引导下进行 PCR 扩增， 反应结束后， 对 PCR 扩增产物进行 1％琼脂糖凝 胶电泳检测， 用购自鼎国公司的 DNA 回收试剂盒回目的片段并对其进行纯化， 得到 D0、 D4、 D6 和 D7 扩增片段。将回收纯化的 D0、 D4、 D6 和 D7 片段连接入到载体 pGEM-Teasy(Promega 公司 ) 中。然后将连接产物用热激法转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 感受态细胞， 筛选阳 性克隆， 将其接种于含 50mg/L 氨苄青霉素的 5mL LB 液体培养基中， 在 37℃、 200rpm 下培 养 12-16 小时， 提取质粒， 得到含有回收片段的重组质粒， 分别命名为 pGEM-D0、 pGEM-D4、 pGEM-D6 和 pGEM-D7。对上述重组质粒进行 DNA 测序分析， 测序结果表明扩增得到的 4 个片 段与 napin A 启动子 (GenBank 号 ： J02798.1) 序列相对应部分相同。各个启动子序列分别 如下 ：
D0 的序列如序列表中序列 1 所示 ； D4 的序列如序列表中序列 1 的自 5’端第 832-1145 位所示 ； D6 的序列如序列表中序列 1 的自 5’ 端第 872-1145 位所示 ； D7 的序列如 序列表中序列 1 的自 5’ 端第 891-1145 位所示。
2、 启动子的检测
1)napin A 启动子缺失片段 (D 系列启动子 ) 与 GUS 编码区的融合表达载体构建
分别挑选 pGEM-D0、 pGEM-D4、 pGEM-D6 和 pGEM-D7 序列正确的阳性克隆， 大量制 备质粒 DNA， 用购于 NEB 公司的 HindIII/Sal I 双酶切得到相应启动子插入片段， 用胶回 收试剂盒 ( 购自鼎国公司 ) 回收 D0、 D4、 D6 和 D7 启动子片段， 纯化后的片段用 T4 连接酶 (Roche 公司 ) 与经过同样酶切的 pBI121( 购自 Clontech) 载体连接， 形成 pBI121-D0::GUS、 pBI121-D4::GUS、 pBI121-D6::GUS 和 pBI121-D7::GUS 的 GUS 表达载体。热激法转化大肠 杆菌 (E.coli)DH5α 菌株， 挑选阳性菌落加入到 5ml 含 50mg/L 卡那霉素的 LB 液体培养基 中， 37℃、 200rpm 培养 12-16 小时， 提取质粒， 进行 PCR 鉴定和酶切鉴定。载体的构建简图， 见图 2。
2) 转基因拟南芥中启动子驱动 GUS 蛋白表达的检测
A、 转基因拟南芥的获得
将 步 骤 1) 得 到 的 pBI121-D0::GUS、 pBI121-D4::GUS、 pBI121-D6::GUS 和 pBI121-D7::GUS 四种表达载体分别用电激转化方法转入不同的农杆菌中。挑取转基因农 杆菌单菌落接种于 20ml LB 液体培养基 ( 含卡那霉素 50mg/L， 利福平 50mg/L) 中， 28 ℃， 150rpm 振荡培养 2 天。所获菌液以 2 ％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的 300ml LB 培养基， 按照上述条件振荡培养 16-18 小时。所获菌液经 5,000rpm、 20 分钟离心收集 菌体， 菌体重悬于 250ml 含有 5 ％蔗糖和 Silwet L-77 转化液中， 慢慢摇匀。转化液转 入 250ml 烧杯中， 将已去掉花和果荚的 Col-0 野生型拟南芥 (Feng， H.， An， F.， Zhang， S.， Ji， Z.， Ling， H.Q.， and Zuo， J.(2006).Light-regulated， tissue-specific， and cell differentiation-specific expression of the Arabidopsis Fe(III)-chelate reductase gene AtFRO6.Plant Physiol 140， 1345-1354.) 倒置于烧杯中， 真空抽 20 秒为 宜。为提高转化效率， 一周后可再重复转化一次。将转化后的拟南芥培养得到种子， 将得到 的拟南芥种子在含卡那霉素的培养基中培养， 长出绿叶和根系的苗为转基因拟南芥。B、 GUS 酶活性的检测
取步骤 A 中的转基因拟南芥 T3 代的相同标记时间的同期拟南芥果荚 100mg， 用 液氮研磨成干粉， 加 500μl 提取液 (50mmol/L 磷酸钠缓冲液， pH7.0 ； 10mmol/L 巯基乙醇 ； 1mmol/L EDTA， pH8.0 ； 0.1％月桂酸肌氨酸钠 ； 0.1％ Triton X-100)， 13,000rpm 离心 10 分 钟， 上清液用于 GUS 活性及蛋白浓度测定。取 5μl 酶提取液加入到 45μl 检测液中 ( 酶 提取液中加入 2mmol/L 4- 甲基伞型酮酰 -β- 葡萄糖醛酸苷 [4-Methyl umbelliferyl β-D glucuronide， MUG])， 立即混匀， 快速取 5μl 反应混合液， 加入到 195μl 反应终止液 (0.2mol/L Na2CO3) 中， 混匀， 即酶活性测定 0 点 ； 反应混合液于 37℃保温， 一小时后取 5μl 反应混合液加入到 195μl 反应终止液中终止反应 ； 用 Tecan GENios 荧光分光光度计 ( 激 发光波长为 365nm， 发射光为 455nm) 测定每个样品的荧光强度， 计算反应生成的 4- 甲基伞 型酮 (4-methylumbelliferone， MU) 的量 ； 按照 Bradford 方法， 用 Tecan GENios 测定样品 中蛋白含量 ； 计算样品中 GUS 活性， GUS 活性＝单位时间内反应生成的 MU/ 蛋白量 ( 单位 ： -1 -1 pmolMU.mg .min )， 结果如图 3 所示， 结果表明随着启动子长度的缩短， GUS 酶活性逐渐降 低， 表明启动子的驱动 GUS 报告基因表达的能力降低。
二、 种子含油量高的转基因油菜的获得及其检测 1、 调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因 AtL1L 的克隆
根据核苷酸序列 (GenBank 号 ： AB025628.1) 设计引物 P1 和 P2， 用于扩增拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 哥伦比亚生态型 (Col-0) 中的调控植物脂肪酸代谢的转录因子 基因， 引物序列如下 ： ( 划线为酶切位点， 前面三个碱基为保护碱基 )
P1(AtL1L 上游引物 ) ： 5′ -TTAGTCGACCACAAACACAAAAGTCGTGT-3′
P2(AtL1L 下游引物 ) ： 5′ -CGAGGATCCGCAAAACTAATGCTTTATTGA-3′
用 TRIZAL 试剂 ( 购自 Invitrogen 公司 ) 并参照试剂盒说明书提取拟南芥哥伦比 亚生态型 (Col-0) 新鲜果荚的总 RNA， 然后用 Invitrogen 公司的 SuperScriptTM IIReverse Transcriptase 试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其第一链 cDNA， 再以所合成的 cDNA 为模板， 在引物 P1 和 P2 的引导下进行 PCR 扩增， 反应结束后， 对 PCR 扩增产物进行 1％琼 脂糖凝胶电泳检测， 用购自鼎国公司的 DNA 回收试剂盒回收长度约 0.8Kb 的目的片段并对 其进行纯化， 将回收片段连接入到载体 pGEM-Teasy(Promega 公司 ) 中， 再将连接产物用热 激法转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 感受态细胞， 筛选阳性克隆， 将其接种于含 50mg/L 氨苄 青霉素的 5mL LB 液体培养基中， 在 37℃、 200rpm 下培养 12-16 小时， 提质粒， 得到含有回收 片段的重组质粒， 命名为 pGEM-AtL1L， 对其进行测序， 测序结果表明扩增片段具有序列表中 的 SEQ ID NO ： 2 的序列， 序列 2 由 937 个碱基组成， 包括 38 个碱基的 5′ UTR 区， 其编码序 列为自 5′端第 39-743 位碱基， 自 5′端第 219-416 位碱基编码 NF-YB 结构域。自 5′端第 744-937 位碱基为该基因组基因的 3′非编码区。将该基因命名为 AtL1L， 将其编码蛋白命 名为 AtL1L， 该基因蛋白的框架结构图见图 1。
2、 用 D4 和 D6 启动子驱动 AtL1L 表达的转基因载体的构建
挑选步骤二的步骤 1 中的序列正确的 pGEM-AtL1L 阳性克隆， 大量制备质粒 DNA， 用 从 NEB 公司购得的 Sal I/BamH I 双酶切得到基因插入片段， 用胶回收试剂盒 ( 购自鼎国公 司 ) 回收 AtL1L 基因片段， 纯化后的片段用 T4 连接酶 (Roche 公司 ) 与经过相同酶切过的 pCAMBIA-2300( 简称 pC2300)(CAMBIA 公司， http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.
html) 连接， 形成 pC2300::AtL1L 的中间载体。
然后把步骤一中步骤 2 得到的 pGEM-D4、 pGEM-D6 正确的阳性克隆， 大量制备质 粒 DNA， 经 HindIII/Sal I 双酶切得到启动子插入片段， 用胶回收试剂盒 ( 购自鼎国公司 ) 回收 D4、 D6 启动子片段， 纯化后的片段用 T4 连接酶 (Roche 公司 ) 与经过相同酶切过的 pC2300::AtL1L 中间载体连接， 形成 pC2300-D4::AtL1L 和 pC2300-D6::AtL1L 的最终载体。
热激法转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 菌株， 挑选阳性菌落加入到 5ml 含 50mg/L 卡 那霉素的 LB 液体培养基中， 37℃、 200rpm 培养 12-16 小时， 提取质粒， 进行 PCR 鉴定和酶切 鉴定， 表达载体的构建图， 见图 4。
3、 转基因油菜的获得
1) 转化农杆菌
将步骤 2 得到的表达载体 (pC2300-D4::AtL1L 和 pC2300-D6::AtL1L) 分别用电激 转化方法转入不同的农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于 20ml LB 液体培养基 ( 含 卡那霉素 50mg/L， 利福平 50mg/L) 中， 28℃， 150rpm 振荡培养 2 天。然后， 所获菌液以 2％ 接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的 300ml LB 培养基， 按照上述条件振荡培养 16-18 小 时。 所获菌液经 5,000rpm、 20 分钟离心收集菌体， 菌体重悬于 250ml 含有 5％蔗糖和 Silwet L-77 转化液中， 慢慢摇匀， 得到含有 pC2300-D4::AtL1L 的转化液和含有 pC2300-D6::AtL1L 的转化液。 2) 转化油菜
A、 转 pC2300-D4::AtL1L 的转基因油菜
把上述含有 pC2300-D4::AtL1L 的转化液转入塑料袋中， 将已经去掉果荚和花的 中油 821 油菜花序浸泡在转化液中 ； 浸泡时间为 1 分钟为宜， 浸泡期间不停晃动浸染液。为 提高转化效率， 隔两天后可重复浸染转化一次， 共转化三次。将转化后的油菜培养， 得油菜 种子， 将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养， 长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗 )， 至此获得转 pC2300-D4::AtL1L 的转基因油菜。
B、 转 pC2300-D6::AtL1L 的转基因油菜
按 照 上 述 步 骤 A 的 方 法， 将 含 有 pC2300-D4::AtL1L 的 转 化 液 换 成 含 有 pC2300-D6::AtL1L 的转化液， 将油菜品种换成 Westar 油菜 (Chandler， S.F.， and Thorpe， T.A.(1987).Characterization of Growth， Water Relations， and Proline Accumulation inSodium Sulfate Tolerant Callus of Brassica napus L.cv Westar(Canola).Plant Physiol 84， 106-111.)， 其余操作完全相同， 得到转 pC2300-D6::AtL1L 的转基因油菜。
4、 转基因油菜的检测
A、 转 pC2300-D4::AtL1L 的转基因油菜的检测
以非转基因中油 821 为野生型对照 1。
将转基因油菜苗培养， 得到 T1 代种子， 对 T1 代种子 ( 转 pC2300-D4::AtL1L 的转 基因油菜和野生型对照 1) 进行含油量的测定与计算， 其中含油量＝种子油脂 ( 质量 )/ 种 子干重 ( 质量 )。种子油脂的质量是采用德国 BRUKE 公司的 VECTOR22/N 型傅立叶变换近红 外光谱仪测定， 运用 OPUS 5.5 软件进行分析得到的。光谱采集条件 ： 分辨率 8cm-1， 扫描次 -1 数 32 次， 谱区范围 12000-4000cm ， 室温 23-25℃。测定结果如图 5 所示， 用 D4 启动子驱动 AtL1L 过表达， 转 pC2300-D4::AtL1L 的转基因油菜的种子含油量高于野生型对照 1 的种子
含油量。 B、 转 pC2300-D6::AtL1L 的转基因油菜的检测
以非转基因 Westar 油菜为野生型对照 2。
将转基因油菜苗继代培养， 得到 T1 代种子， 对 T1 代种子 ( 转 pC2300-D6::AtL1L 的转基因油菜和野生型对照 2) 进行含油量的测定， 测定方法同上述步骤 A。测定结果如图 6 所示， 用 D6 启动子驱动 AtL1L 过表达， 转 pC2300-D6::AtL1L 的转基因油菜的种子含油量 高于野生型对照 2 的种子含油量
以上可知， D4 和 D6 启动子驱动 AtL1L 过量表达后可以提高油菜种子中的含油量。
实施例 2、 种子含油量高的转基因油菜的获得及其检测
1、 调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因 BnLEC1 的克隆
根据拟南芥 L1L 的核苷酸序列 (GenBank 号 ： AB025628) 设计引物 P3 和 P4， 用于 扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜 (Brassica napus L.) 中的调控种子脂肪酸代谢的转录因子 BnLEC1 基因基因组 DNA 序列， 引物序列如下 ：
P3(BnLEC1 上游引物 ) ： 5′ -TTAGTCGACCGAGGACGGCAGAGAAACAAT-3′
P4(BnLEC1 下游引物 ) ： 5′ -CGAGGATCCTTTACTAGTTCACTTATACTG-3′
用 CTAB 法提取油菜中油 821 基因组 DNA， 在引物 P3 和 P4 的引导下进行 PCR 扩 增。反应结束后， 对 PCR 扩增产物进行 1 ％琼脂糖凝胶电泳检测， 用购自鼎国公司的 DNA 回收试剂盒回收长度约为 1.8Kb 的目的片段并对其进行纯化， 将回收片段连接入到载体 pGEM-Teasy(Promega 公司 ) 中。 将连接产物用热激法转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 感受态 细胞， 筛选阳性克隆， 将其接种于含 50mg/L 氨苄青霉素的 5mL LB 液体培养基中， 在 37℃、 200rpm 下培养 12-16 小时， 提质粒， 得到含有回收片段的重组质粒， 命名为 pGEM-BnLEC1。 对 其进行测序， 测序结果表明扩增片段具有序列表中的 SEQ ID NO.3 的核苷酸序列， 包括 19 个碱基的 5′ UTR 区， 3′ UTR 区为 1889 到 1898 位碱基。自 5′端第 20-72 位碱基为该基 因组基因的第一个外显子， 自 5′端第 73-1246 位碱基为该基因组基因的第一个内含子， 自 5′端第 1247-1889 位碱基为该基因组基因的第二个外显子， 自 5′端第 1889-1898 位碱基 为该基因组基因的 3′非编码区。 将该基因命名为 BnLEC1， 将其编码蛋白命名为 BnLEC1， 该 基因蛋白一级结构中所含保守的 NF-YB 结构域简图， 见图 7。
2、 用 D7 启动子驱动 BnLEC1 表达的转基因载体的构建
挑选实施例 2 中步骤 1 中 pGEM-BnLEC1 序列正确的阳性克隆， 大量制备质粒 DNA， 用从 NEB 公司购得的 Sal I/BamH I 双酶切得到基因插入片段， 用胶回收试剂盒 ( 购自鼎国 公司 ) 回收 BnLEC1 基因片段， 纯化后的片段用 T4 连接酶 (Roche 公司 ) 与经过相同酶切过 的 pCAMBIA-2300( 简称 pC2300) 连接， 形成 pC2300::BnLEC1 的中间载体。
然后分别把实施例 1 中步骤一中步骤 2 得到 pGEM-D7 正确的阳性克隆， 大量制备 质粒 DNA， 经 HindIII/Sal I 双酶切得到启动子插入片段， 用胶回收试剂盒 ( 购自鼎国公 司 ) 回收 D7 启动子片段， 纯化后的片段用 T4 连接酶 (Roche 公司 ) 与经过相同酶切过的 pC2300::BnLEC1 中间载体连接， 分别形成 pC2300-D7::BnLEC1 的最终载体。
热激法转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 菌株， 挑选阳性菌落加入到 5ml 含 50mg/L 卡 那霉素的 LB 液体培养基中， 37℃、 200rpm 培养 12-16 小时， 提取质粒， 进行 PCR 鉴定和酶切 鉴定。表达载体的构建图， 见图 8。
3、 转基因油菜的获得
1) 转化农杆菌
将步骤 2 得到的表达载体 pC2300-D7::BnLEC1 用电激转化方法转入农杆菌中。挑 取转基因农杆菌单菌落接种于 20ml LB 液体培养基 ( 含卡那霉素 50mg/L， 利福平 50mg/L) 中， 28℃， 150rpm 振荡培养 2 天。然后， 所获菌液以 2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉 素的 300ml LB 培养基， 按照上述条件振荡培养 16-18 小时。所获菌液经 5,000rpm、 20 分钟 离心收集菌体， 菌体重悬于 250ml 含有 5％蔗糖和 Silwet L-77 转化液中， 慢慢摇匀， 得到含 有 pC2300-D7::BnLEC1 的转化液。
2) 转化油菜
转 pC2300-D7::BnLEC1 的转基因油菜
把含有 pC2300-D7::BnLEC1 的转化液转入塑料袋中， 将已经去掉果荚和花的油菜 花序 ( 该油菜是 Westar) 浸泡在转化液中， 浸泡 1 分钟为宜， 浸泡期间不停晃动浸染液。为 提高转化效率， 隔两天后可重复浸染转化一次， 共转化三次。将转化后的油菜培养， 得油菜 种子， 将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养， 长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗， 至 此获得转 pC2300-D7::BnLEC1 的转基因油菜。
4、 转基因油菜的检测
以非转基因油菜 Westar 为野生型对照。
将转基因油菜苗培养， 得到 T1 代种子， 对 T1 代种子 ( 转 pC2300-D7::BnLEC1 的转 基因油菜和野生型对照 ) 进行含油量的测定与计算， 其中含油量＝种子油脂 ( 质量 )/ 种子 干重 ( 质量 )。种子油脂的质量是采用德国 BRUKE 公司的 VECTOR22/N 型傅立叶变换近红外 光谱仪测定， 运用 OPUS 5.5 软件进行分析得到的。 光谱采集条件 ： 分辨率 8cm-1， 扫描次数 32 -1 次， 谱区范围 12000-4000cm ， 室温 23-25℃。测定结果如图 9 所示， D7 启动子驱动 BnLEC1 过表达， 转 pC2300-D7::BnLEC1 的转基因油菜种子含油量高于 Westar 野生型对照种子含油 量， 说明 D7 启动子驱动 BnLEC1 过量表达后可以提高油菜种子中的含油量。
实施例 3、 种子含油量高的转基因拟南芥和转基因油菜的获得及其检测
1、 调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因 BnL1L 的克隆
根据拟南芥 L1L 的核苷酸序列 (GenBank 号 ： AB025628) 设计引物 P5 和 P6， 用于 扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜 (Brassica napus L.) 中的调控种子脂肪酸代谢的转录因子 BnL1L 基因基因组 DNA 序列， 引物序列如下 ： ( 酶切位点划线为酶切位点， 前面三个碱基为保 护碱基 )
P5(BnL1L 上游引物 ) ： 5′ -TTAGTCGACAGGGTTTGGTGATTGGGATC-3′
P6(BnL1L 下游引物 ) ： 5′ -CGAGGATCCGGTATGCGTTGAAGCTCCTC-3′
用 CTAB 法提取油菜中油 821 基因组 DNA， 在引物 P5 和 P6 的引导下进行 PCR 扩 增。反应结束后， 对 PCR 扩增产物进行 1 ％琼脂糖凝胶电泳检测， 用购自鼎国公司的 DNA 回收试剂盒回收长度约为 1.1Kb 的目的片段并对其进行纯化， 将回收片段连接入到载体 pGEM-Teasy(Promega 公司 ) 中。 将连接产物用热激法转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 感受态 细胞， 筛选阳性克隆， 将其接种于含 50mg/L 氨苄青霉素的 5mL LB 液体培养基中， 在 37℃、 200rpm 下培养 12-16 小时， 提质粒， 得到含有回收片段的重组质粒， 命名为 pGEM-BnL1L。对 其进行测序， 测序结果表明扩增片段具有序列表中的 SEQ ID NO.4 的核苷酸序列， 包括 260个碱基的 5′端非编码区， 3′端非编码区为 911 到 1170 位碱基。自 5′端第 216-276 位碱 基为该基因组基因的第一个外显子， 自 5′端第 277-341 位碱基为该基因组基因的第一个 内含子， 自 5′端第 342-910 位碱基为该基因组基因的第二个外显子， 自 5′端第 911-1170 位碱基为该基因组基因 3′非编码区。 将该基因命名为 BnL1L， 将其编码蛋白命名为 BnL1L， 该基因蛋白一级结构中所含保守的 NF-YB 结构域简图， 见图 10。
2、 用 D0、 D6 和 D7 启动子驱动 BnL1L 表达的转基因载体的构建
挑选实施例 3 中步骤 1 中 pGEM-BnL1L 序列正确的阳性克隆， 大量制备质粒 DNA， 用从 NEB 公司购得的 Sal I/BamH I 双酶切得到基因插入片段， 用胶回收试剂盒 ( 购自鼎国 公司 ) 回收 BnL1L 基因片段， 纯化后的片段用 T4 连接酶 (Roche 公司 ) 与经过 Sal I/BamH I( 购于 NEB 公司 ) 双酶切过的 pCAMBIA-2300( 简称 pC2300) 连接， 形成 pC2300::BnL1L 的 中间载体。
然后分别把实施例 1 中步骤一中步骤 2 得到 pGEM-D0、 pGEM-D6 和 pGEM-D7 正确 的阳性克隆， 大量制备质粒 DNA， 经 HindIII/Sal I 双酶切得到启动子插入片段， 用胶回收 试剂盒 ( 购自鼎国公司 ) 回收 D0、 D6 和 D7 启动子片段， 纯化后的片段用 T4 连接酶 (Roche 公司 ) 与经过相同酶切过的 pC2300::BnL1L 中间载体连接， 分别形成 pC2300-D0::BnL1L、 pC2300-D6::BnL1L 和 pC2300-D7::BnL1L 的最终载体。
热激法转化大肠杆菌 (E.coli)DH5α 菌株， 挑选阳性菌落加入到 5ml 含 50mg/L 卡 那霉素的 LB 液体培养基中， 37℃、 200rpm 培养 12-16 小时， 提取质粒， 进行 PCR 鉴定和酶切 鉴定。表达载体的构建图， 见图 11。
3、 种子含油量高的转基因油菜的获得
1) 转化农杆菌
将 步 骤 2 得 到 的 表 达 载 体 (pC2300-D0::BnL1L、 pC2300-D6::BnL1L 和 pC2300-D7::BnL1L) 用电激转化方法转入农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于 20mlLB 液 体 培 养 基 ( 含 卡 那 霉 素 50mg/L， 利 福 平 50mg/L) 中， 28 ℃， 150rpm 振 荡 培 养 2 天。然后， 所获菌液以 2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的 300ml LB 培养基， 按照 上述条件振荡培养 16-18 小时。所获菌液经 5,000rpm、 20 分钟离心收集菌体， 菌体重悬于 250ml 含有 5％蔗糖和 Silwet L-77 转化液中， 慢慢摇匀， 分别得到含有 pC2300-D0::BnL1L、 pC2300-D6::BnL1L 和 pC2300-D7::BnL1L 的转化液。
2) 转基因油菜中油 821 的获得
本步骤所指的油菜品种是中油 821。
把含有 pC2300-D0::BnL1L 的转化液和含有 pC2300-D6::BnL1L 的转化液分别转入 塑料袋中， 将已经去掉果荚和花的油菜花序浸泡在转化液中， 浸泡 1 分钟为宜， 浸泡期间不 停晃动浸染液。为提高转化效率， 隔两天后可重复浸染转化一次， 共转化三次。将转化后的 油菜培养， 得油菜种子， 将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养， 长出绿叶和根系的苗为 转基因油菜苗， 至此获得转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因油菜和转 pC2300-D6::BnL1L 的转 基因油菜。
a、 转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因油菜种子含量检测
以非转基因油菜中油 821 为野生型对照。
将转基因油菜苗继代培养， 得到 T1 代种子， 对 T1 代种子 ( 转 pC2300-D0::BnL1L的转基因油菜和野生型对照 ) 进行含油量的测定与计算， 其中含油量＝种子油脂 ( 质量 )/ 种子干重 ( 质量 )。种子油脂的质量是采用德国 BRUKE 公司的 VECTOR22/N 型傅立叶变换近 红外光谱仪测定， 运用 OPUS 5.5 软件进行分析得到的。光谱采集条件 ： 分辨率 8cm-1， 扫描 -1 次数 32 次， 谱区范围 12000-4000cm ， 室温 23-25℃。
测定结果如图 12 所示， D0 启动子驱动 BnL1L 表达， 由于 BnL1L 表达量过高， 使得 转基因油菜种子中的油含量低于非转基因野生型对照中油 821。
b、 转 pC2300-D6::BnL1L 的转基因油菜种子含量检测
将转 pC2300-D6::BnL1L 的转基因油菜和野生型对照的 T1 代种子按照上述的测定 方法进行含油量的测定， 测定结果如图 13 所示， 用 D6 启动子驱动 BnL1L 过表达， 转基因油 菜种子含油量高于中油 821 野生型对照的种子含油量。
3) 转基因油菜 Westar 的获得及其种子含油量的检测
本步骤所指的油菜品种是 Westar。
按照步骤 2) 中获得转基因油菜中油 821 的方法， 制备转 pC2300-D6::BnL1L 的转 基因油菜 Westar 和转 pC2300-D7::BnL1L 的转基因油菜 Westar。
a、 转 pC2300-D6::BnL1L 的转基因油菜种子含油量检测 转基因油菜 Westar 的含油量检测
以非转基因油菜 Westar 为野生型对照。
将转 pC2300-D6::BnL1L 的转基因油菜和野生型对照的 T1 代种子按照步骤 2) 的 测定方法进行含油量的测定， 测定结果如图 14 所示， 用 D6 启动子驱动 BnL1L 过表达， 转基 因油菜种子含油量高于野生型对照的种子含油量。
b、 转 pC2300-D7::BnL1L 的转基因油菜种子含油量检测
将转 pC2300-D7::BnL1L 的转基因油菜和野生型对照的 T1 代种子按照步骤 2) 的 测定方法进行含油量的测定， 测定结果如图 15 所示， 用 D7 启动子驱动 BnL1L 过表达， 转基 因油菜种子含油量高于野生型对照的种子含油量。
4、 种子含油量高的转基因拟南芥的获得
将实施例 3 的步骤 2 得到的 pC2300-D0::BnL1L 和 pC2300-D7::BnL1L 按照步骤一 的步骤 2 的步骤 2) 提供的方法导入拟南芥 Col-0， 制备出转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因拟 南芥和转 pC2300-D7::BnL1L 的转基因拟南芥。
1) 转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因拟南芥的检测
a、 转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因拟南芥的幼苗表型
将转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因拟南芥种子进行卡那霉素筛选， 得到阳性转基 因植株， 将阳性植株的种子播在 MS 培养基上， 以 Col-0 非转基因野生型种子作为对照， 在培 -2 -1 养条件为 22℃， 光照强度 80-120μE S ， 16 小时光照的温室中培养。转基因拟南芥种子在 MS 培养基上萌发生长 12 天的表型为发育相对迟缓， 幼苗相对弱小， 幼苗期没有子叶或子叶 变小， 见图 16。说明转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因拟南芥种子胚胎在发育时受到影响， 导 致胚胎发育异常， 从而影响幼苗的生长发育， 导致子叶消失或子叶变得短小。
b、 种子含油量测定
以非转基因 Col-0 为野生型对照。
分别取同批次转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因拟南芥和野生型对照种子各 100 毫
克， 在液氮中研磨成干粉， 然后转移到带密封盖的试管中， 加入 3ml 甲醇 ( 含 2.5％， v/v)， 在 80℃水浴加热 90 分钟 . 再加入 4.5ml 0.9％ NaCl 和 1ml 正己烷， 混匀， 4,000rpm 离心 10 分钟， 收集正己烷相。真空抽干正己烷， 用 100μl 乙酸乙酯溶解真空干燥残留物， 取 1μl 上样分析。所用 GC/MS 仪为 TurboMass(Perkin Elmer 公司 )， 所用 GC 柱为 30m×0.25mm BPX-70 柱， GC 升温程序为 ： 初始温度 120℃， 保持 1 分钟， 以每分钟 10℃的速率升至 150℃， 然后以每分钟 4℃的速率升温至 230℃， 保持 10 分钟 . 以 C17:0 的三酯酰甘油作内标。
结果如图 17 所示， D0::BnL1L 转基因拟南芥种子含油量明显低于 Col-0 非转基因 野生型种子含油量。
2) 转 pC2300-D7::BnL1L 的转基因拟南芥的检测
以非转基因 Col-0 为野生型对照。
按照步骤 4 中测转 pC2300-D0::BnL1L 的转基因拟南芥种子含油量的方法， 测定转 pC2300-D7::BnL1L 的转基因拟南芥和野生型对照中种子的含油量。
结果如图 18 所示， 转 pC2300-D7::BnL1L 的转基因拟南芥的种子含油量明显高于 Col-0 非转基因野生型种子含油量。
上述结果表明 D7 启动子驱动 BnL1L 适度过量表达后可以显著提高拟南芥种子的 含油量， 而 D0 启动子驱动 BnL1L 由于表达量过高反而使得拟南芥种子中的含油量下降。
序列表 <110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所 <120> 来源于甘蓝油菜的启动子及其应用 <160>4 <210>1 <211>1145 <212>DNA <213> 甘蓝油菜 (Brassica napus) <400>1 aagctttctt catcggtgat tgattccttt aaagacttat ggcaagtatt cagttaccag ttaccactta tattctggac tttccaacat tttaaatttc actattggct gaatgcttct cagatggcag aaatgtatca accaatgcat atatacaaat atctatcgga tggttccatt tgctttgtca tccaattagt tcctctttat tactattttc atgcgaggtt gccatgtaca gctattgagc gtttttcttc aattttcttt attttagaca gagttgggtt gaatgagata tacgttcaag tgaagtggca gacctaccca ttcttgagac aaatgttaca ttttagtatc aactcaaatt cgattgacat gtatccattc aacataaaat tccacatttc aagtattttc aaaccgttcg gctcctatcc ttccgaattt ggaagatttt gactcaaatt cccaatttat ctttaacttc tataattctg attaagctcc caatttatat aaatttatag actctcatcc ccttttaaac caacttagta16gtttcttatc tttctgactg tctttgagga gtacctcttg gactacttta ttatatttgt tgggtatgaa taccgttctc agagtaaaat taaaccagcc accgggtgta attgaccgtg tcccaacggc aacgttttttttgcttctga catcctcatt agaaacaatt ttctcaaaac tattattcac aaggattgac atgtgtgtta gagtaaggat gtgtacctat tgcacctgca acaagacgga actaaatcaa actacctcca tttttaattt60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840102071193 A CN 102071197
说明书tcataagatg attgtttttc acacacatac ttatagccta caaacaagat ccatgccaga ttcgccactt aatcacatgc taaattaact taaaaacata15/17 页tatgaagtta agtttttacc ttgtttttaa aaagaatcgt acattagcta cacgttacac atagcatgca gccgcggaga gtcactccct tcaaacacct aagagcttct ctctcacagc gtgcatgcat tattacacgt gatcgccatg caaatctcct catccgcttc actctttact caaaccaaaa ctcatcaata cacga <210>2 <211>937 <212>DNA <213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) <400>2 cacaaacaca aaagtcgtgt atttagaaca agaaagatat gctaccgcaa gctgtccgtg aacaacacca ctccttctcc ttctgatggc agagggcagt atgcgtcctc cagaattcaa atggtggtga ggaggagtgc acggtgaggg agcaagacag tgatacggat catgcggagg atcttacctg ctcacgccaa agacgatcca agagtgtgtt tcggagtaca tcagcttcat ggtgccagcg ggaacagcgc aagaccatca ctgctgagga agctcggttt tgatgactac atcgaacccc tcacgttgta tggaaggtga aagaggggtt agctgcagtg ctgggtccgt tggtcaagag gcctaatggg accatgaccg agtatggagc ttcacatggc gcagtaccat tatcgtcatc agaacgggtt ctaattctaa gatgagtggt tcatcttcag gagcaagtgg cgactcaaca acataagtac tgagaacaat ggctaataac taactgttag taggtgcaag ctgtagctta tgaattcaag ctttttcttt gtttattatc tatctagttg aaagaacatt cttgtggtaa agtatgtcaa taaagcatta gttttgc <210>3 <211>1898 <212>DNA <213> 甘蓝油菜 (Brassica napus L.) <400>3 cgaggacggc agagaaacaa tggaacgtgg agctcctctc atctaactct ggtaatcaaa taataagtgc ctatttatgt tatactcacg aatcataaac ttgttttgag attttttgta ctttcatgtc ttcttaaaac agtagagatt tttatttctt agaagagtct actcacatgc aagacgctta tatatatatg atatctatat atttatttgc atattcgtgt atacatccaa caaatatttc gtgatatggt atataagaac aatttttaat17900 960 1020 1080 1140 1145ggaacgtgga accaggatta ccagcctaac gttcatgcct gatctcagat aacaggggag cgtcttgtgg cctccaccgc tagtatgacc ctacgggcct tgttttcagt cgccagagtt atagacagct tttaagcgaa gtgtttttcaggcttccatg gcagcgaatt aaaaccagta attgccaacg gactccaagg gctaatgagc gcaatgagca tacagagagt aacggcttgg gtgccaggga ggtaacgaac gaagtatttc gacagagtca aacaatgctg tctgatctgt60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 937tctcactatc atatacgtgc tatcaacaaa agattttttt catgcatgaa gcaggaacca gggggatgatagctacccaa ctgcactatg gaactagaga aaaggtacgg tgagtttgat atccttaatt agatcttcat60 120 180 240 300 360 420102071193 A CN 102071197
说明书attgagtttc gaggtgggaa aatttatttt cgctttactg ctgatttgga tattgtaaac cacaggggat gttaaccaat gctagaaatt caagtatttc acgtcaagaa ttattggtta taaatccgct aacaggactg tgcatgcgac gcaagaccaa acacgccaaa cagcttcgtg tgctgaagat caacgtgttc tgagtcatca accgggttct ctaccataac tatgaatgga gatttctttt ttgtatgtgt caattggaaa taacggttgt aatatccaat tcctctattt gaaatcgttt aaccaacttt tgacaaagaa gagaagtgga tctgaacagt ggacttaact ttctaaaaat aacttggacc gacaagaaca tacatgccaa atctctgacg accggtgaag atcctttggg attaaccggt tttaaaccgg tatggttatg ggatcgggtc atgccggtta16/17 页atgtttgtcc attgacaata ccggtgcatg cacaagaaat tctatctttt agatttatat tctggctttt taaaaatata tggtttagtt taaaggccga ctcaaaatct aaaaaaactt tattaaatta ctcttatgat attttcttta ttagtttatt tttttttttc gtttcaaaac gaaattctcg tttgtccaac gaatctaaat acacttttta gccaaatata atataaatac aaagccaaaa aagtaatata aatatattgt aattctagtt cacctaatcc aaatcgtttt attaattagt aaaagaattg aattcttttt aagtaataaa acaaattttg aattaagcaa aattgggaat acgcgctgta cttgtaaaat catcaaattt aagatccttt tgactttttc gttctatgaa tgtaaacgta ctacataatg gaaccgggac ctgtaaactt atcttttatc aagcacgtgt cttcacttga tagtcctcgt tttcaactat gtaatttcat ttagtattcc aaacaacttc aatttatgta agcacaacaa ctcaatcccg acaatgaccg gctccatcgg agactatctt gccgcagcaa caaccaagca tgcctcgtga tcgcaaacgt gataaggatc atgcgtaaaa tcttaccgcc acgcaaaaga aacgattcaa gaatgcgtct ccgagtacat ctaacgagcg ttgccaacgt gagcaacgta agacaataac caatgagcaa acttgggttc gatgattacg ttggaccact accgtgagtt cgagaccgat cgtgggtgtt cacttagagg tctatggagg aagtggtatg gggtttcacg gcccacctcc gtatgttgga tcagtctatg gtcatgggtg gtggtcggta cggatggatc agtaggtggt ggcggtggat cttcctcttc attatgacca gtatggtcag tataagtgaa ctagtaaa <210>4 <211>1170 <212>DNA <213> 甘蓝油菜 (Brassica napus L.) <400>4 agggtttggt gattgggatc ttgtaacgcc tgtgggagac tcgactgtga ctgacacgtt cttgagcttg tgaggtctgc gccaaaaaaa ttttagtttt attctttcta tctctcttta gcacaaacac aagctcgtgg ctttgaagaa aggatatgga acggcaagtt ctccctcaac accaccacca atccaggtaa gaaaacattc tctcatgttg taattcttcc aatgttacca gagcggcatg cagctaccag aacccaacca gcctaccaaa ggagtgcacg gtgagagagc aagacaggtt catgcctatc gcggaggatc ttacctgctc acgccaagat ctctgacgac18480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1898gaaaaggatc aattacatat tcttcttgtt acgtggaggc tgttatttta gggaagcttt accgctaacg gccaacgtga tccaaggagaatcggttaca gctgacactt ttcttcaaat ttccatggct agttgcatgt tgatggcaga gcggccaaga tacggatcat cgatccaaga60 120 180 240 300 360 420 480 540102071193 A CN 102071197
说gagtacatca accatcactg gaacccttaa tgcggtgttg atggccgagt tttgcttaca acacaaagtt cgaacctagt ttccaaacag aattcaaatt gaggagcttc明书aatgagcgtt atgagcaagc agagagttgg ggcatggtgc gcgccgtacc aaaatgggtg tgctttgtct tgtgataaac aacataaata gcataatctt gccagcggga tcggttttga agggtgatag tcaagaggcc gttatcatca gttcatcatc ctatgtatct tgtgtcaata aaaggactta catttagcta17/17 页gtgtgtctcc acagcgcaag tgattacatc aggagtaaac taatggtacc tcagaacggg tagtttttga tctccttgaa aagcattagg aaacattcaa ccactttccagcttcgtaac ccgaggatgt cattgtatct gatccgttag atggtcccta gtggtaacga ttcaagcaaa gttttcattt cacgattgtg ctcagctaca aacgcataccaggggaggcc cttgtgggca ccaccgctac tatgaccaat cgggactatg ccctaattct aaaacaatga gatcttttca atcttgactc gaacagatat600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1170