莪术醇的用途 【技术领域】
本发明属于医药技术领域， 具体涉及一种中药有效成分的新用途。 本发明所述 HPV 是指人乳头瘤病毒。背景技术 中药有效成分是其发挥药效作用的物质基础， 有效物质的清晰与系统全面的质量 控制是中药现代化的关键和核心， 将中药的疗效物质药效研究清楚， 从而代替中药有效部 位或提取物， 才能保障其质量均一、 疗效稳定、 安全可控， 成为标准有效成分， 作为原料药制 备成药物， 因此， 对中药有效成分中进行深入的研究， 具有深远的意义， 有助于中药现代化、 有助于中药走向世界， 更加有利于人类的身体健康。
莪术醇是中药莪术中有效成分之一， 查阅文献 ( 莪术醇的研究进展 ； 邓嵘等 ； 辽宁 药物与临床 2001 年第 4 卷第 1 期 ) 记载了莪术醇具有抗肿瘤的作用， 特别应用于宫颈癌的 治疗。
宫颈癌的致病因素现今未研究清楚， 现研究较多的认为其发病机制主要包括人乳 头瘤病毒、 疱疹病毒、 人类免疫缺陷病毒 ( 病毒致宫颈癌发病机制的研究进展 ； 杨丽丽、 佟 秀琴 ； 内蒙古医学杂志 Inner Mongolia Med J 2009 年第 41 卷第 8 期 )， 衣原体、 细菌性感 染、 滴虫等 ( 生殖道感染与宫颈癌前病变及宫颈癌的相关性分析 ； 杨洁 ； 中国实用医药 2010 年 9 月第 5 卷第 27 期 )， 因此， 在众多导致宫颈癌因素中， 证明莪术醇对什么原因导致宫颈 癌具有治疗作用至关重要， 而这种深入的研究， 可以很好的确证莪术醇能够很好的治疗宫 颈癌这种疾病， 为莪术醇药效机理的揭示， 为莪术醇在新药研发过程中， 提供了确切的、 深 入的理论基础。
发明内容
基于上述原因， 本公司的科研人员通过实验研究， 从众多宫颈癌的致病因素中， 研 究并证明了莪术醇对 HPV 感染具有很好的治疗作用， 说明莪术醇对 HPV 感染导致的宫颈癌 具有很好的预防和治疗作用 ； 特别是含量大于等于 50％的莪术醇， 与市售莪术油比较， 具 有更好的药理作用 ； 与含量小于 50％莪术醇比较， 也具有更好的药理作用。
本发明通过下述技术方案实现的。
莪术醇在制备治疗 HPV 感染药物中的应用。
莪术醇在制备治疗 HPV 感染导致的宫颈疾病药物中的应用。
莪术醇在制备治疗 HPV 感染导致的宫颈癌药物中的应用。
其中莪术醇含量大于等于 50％小于 100％。
其中 HPV 感染为高危型人乳头瘤病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。
其中 HPV 类型为 16、 18、 26、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 66、 59、 68、 73 和 82 型中的一种或几种。
其中 HPV 类型为 6、 11、 40、 42、 43、 44、 54、 61、 70、 72、 81、 83 和 89 型一种或几种。其中莪术醇作用部位包括但不限于 HPV 中 E6 和 E7 蛋白。
其中莪术醇为活性成分的药物制剂。
其中药物制剂为口服制剂、 注射制剂、 阴道制剂或直肠制剂。
其中口服制剂为片剂、 胶囊剂、 滴丸剂或口服液 ； 其中注射制剂为注射乳剂或冻干 粉针剂 ； 其中阴道制剂为栓剂、 软胶囊、 泡腾片、 凝胶剂、 软膏剂、 阴道片、 膜剂或泡沫剂 ； 其 中直肠制剂为栓剂或软胶囊。
本发明所述 HPV 是指人乳头瘤病毒。
药理学试验
试验 1 抗人乳头瘤病毒的作用
试验试剂 ： HPV 核酸扩增 (PCR) 荧光检测试剂盒 ( 包括 DNA 提取液 1、 DNA 提取液 2、 PCR 反应液、 Taq 酶、 UNG)。其他试剂均为分析纯。
试验药物 ：
试验 1 组 ： 市售莪术油。
试验 2 组 ： 含量为 44.3％莪术醇。
试验 3 组 ： 含量为 90.5％莪术醇。 试验方法 ：
样品制备 ： 将上述试验 1 组配置成 500μg/ml 溶液 ； 试验 2 组配置成 25μg/ml 溶 液； 将试验 3 配置成 200μg/ml 溶液 ； 试验 3 组配置成 100μg/ml ； 试验 3 组配置成 50μg/ ml ； 试验 3 组配置成 25μg/ml ； 试验 3 组配置成 20μg/ml ；
HPV 感染标本制备 ： 从医院门诊确诊 HPV 感染采取的离体标本 (HPV 类型为 16、 52 混合型 )， 集中到 1 只离心管中， 称重 30mg， 用玻璃匀浆器匀浆， 再加入 5mL 生理盐水， 配成 6mg/mL 的离体混悬液， 备用。
样品处理的方法 ： 用移液枪吸取 25μL 样品液和 25μL 标本混悬液至 15mL 离心管 中， 振摇均匀， 使样品与标本能充分作用， 置 37℃水浴箱培养， 在样品处理标本 1d、 3d、 5d、 7d 后， 各取 1 组进行以下试验。
HPV-DNA 的提取 ： 从温浴箱中取出经样品处理的标本混悬液， 按试剂盒步骤提取 DNA ： 加入 50μL 生理盐水， 混匀后再加入 100μLDNA 提取液， 振摇均匀， 1200r/min 离心 10min， 弃去上清液， 再加入 25μL DNA 提取液 2， 充分混匀， 100℃沸水煮 10min， 1200r/min 离心 10min， 上清液即为 HPV-DNA 模板。
DNA 扩 增 ： 取 检 测 试 剂 盒 中 的 PCR 反 应 液 37.6μL， Taq DNA 聚 合 酶 0.4μL， UNG0.03μL 于 PCR 反应管中， 再加入 HPV-DNA 模板 2μL， 扣严管盖， 置于定量 PCR 仪上循环 扩增。HPV-DNA 经高温变性、 低温退火及延伸进行循环扩增， 循环程序设置为 ： 37℃， 5min ； 94℃， 1min ； 95℃， 5sec ； 60℃， 30sec， 循环 40 次。
量标准曲线 ： 用荧光探针检测定量， 按照检测试剂盒要求， 设立 4 个系列浓度的 7 6 5 HPV-DNA 定量阳性标准品， 依次为 5×10 /mL， 5×10 /mL， 5×10 /mL， 5×104/mL， 经 PCR 检测 3 ( 其检测灵敏度为 1×10 /mL， 结果小于该浓度者判定为阴性 )。以起始拷贝数的自然对数 为横坐标， 循环阈值为纵坐标， 得到的回归直线为标准曲线， 据此对样品的扩增倍数进行定 量。
试验结果 ： 见表 1。
表 1 不同试验药物对 HPV 感染的 DNA 作用结果注： - 代表阴性。
将 HPV 感染标本换成从医院门诊确诊为 HPV 感染采取的离体标本 (HPV 为 18 型 )， 按照上述方法进行试验， 试验 3 组 (25-200μg/ml)( 莪术醇含量为 50.3％ ) 培养 1 天、 3 天、 5 天、 7 天的结果皆为阴性 ； 试验 2 组 ( 莪术醇含量为 19.7％ ) 培养时间 5 天结果为阴性， 培养时间 7 天结果阴性 ； 试验 1 组培养 7 天结果为阴性。
将 HPV 感染标本换成从医院门诊确诊为 HPV 感染采取的离体标本 (HPV 类型为 26 型 )， 按照上述方法进行试验， 试验 3 组 (25-200μg/ml)( 莪术醇含量为 87.9％ ) 培养 1 天、 3 天、 5 天、 7 天的结果皆为阴性 ； 试验 2 组 ( 莪术醇含量为 41.9％ ) 培养时间 5 天结果为阴 性， 培养时间 7 天结果阴性 ； 试验 1 组培养 7 天结果为阴性。
将 HPV 感染标本换成从医院门诊确诊为 HPV 感染采取的离体标本 (HPV 类型为 11、 40、 42 型 )， 按照上述方法进行试验， 试验 3 组 (25-200μg/ml)( 莪术醇含量 85.9％ ) 培养 1 天、 3 天、 5 天、 7 天的结果皆为阴性 ； 试验 2 组 ( 莪术醇含量为 37.3％ ) 培养时间 5 天结 果为阴性， 培养时间 7 天结果阴性 ； 试验 1 组培养 7 天结果为阴性。
试验结论 ： 上述试验数据表明试验 3 组中对不同亚型 HPV 感染的 DNA 具有很好的 抑制作用。
试验 2
对 HPV E6、 E7 基因抑制作用的影响
试验材料 ：
宫颈癌细胞系 ： 人宫颈癌 CaSKi 细胞系 (HPV16 阳性、 HPV53 阳性、 HPV83 阳性 ) ； 人 宫颈鳞状上皮永生化细胞系 H8(HPV56 阳性、 HPV66 阳性、 HPV42 阳性 )。
引物 ： 由上海生工生物工程技术服务有限公司， 应用美国 PE 公司 391 型 DNA 自动 合成仪合成， 纯化方式 ： PAGE。
培养基和血清 ： Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM) 培养基 (GIBCOBRL)， 胎牛血清 ( 天津市川页生化制品有限公司 ) ； 工具酶 ： Taq DNA 聚合酶 (Promega)， 逆转录酶 (AMV Reverse Transcriptase)(Promega).
试验药物 ：
试验 1 组 ： 市售莪术油。
试验 2 组 ： 含量为 42.1％莪术醇。
试验 3 组 ： 含量为 90.2％莪术醇。
实验方法
宫颈癌细胞系的培养 ： 人宫颈癌 CaSKi 细胞在 5％胎牛血清的 DMEM 培养基中， H8 细胞在含 2％胎牛血清的 DMEM 培养基中， 37℃， 5％ CO2 饱和湿度环境下培养。
药物浓度选择 ： 不同试验组药物浓度为 150μg/ml。
细胞形态观察 ： 活细胞照相 ： 将对数生长期的细胞接种于 6 孔板培养板， 每孔 4 10×10 个细胞， 在各实验组的 6 孔培养板中每孔放置一片盖玻片， 形成附有细胞的盖片， 第 二天细胞贴壁后更换为含药培养基， 培养三天后， 在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。
四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同药物对 CaSKi 细胞和 H8 细胞生长抑制情况 ： 将 细胞接种于 96 孔细胞培养板， 每孔 3000 个细胞， 第二天加入不同药液， 每个浓度平行 5 孔， 37℃， 5％ CO2 培养 24 小时后每孔加入 5mg/ml 四甲基偶氮唑蓝 (MTT)20μl， 继续培养 4 小 时， 弃去上清液， 每孔加入二甲基亚砜 150μl， 培养 20 分钟后酶标仪 492nm 测定 OD 值。
细胞周期检测 ： 同前法在六孔培养板中以含不同浓度药物的培养基培养五天， 每 个药物浓度平行 3 孔， 收集细胞， 制备单细胞悬液， PBS 清洗 2 次， 预冷 70％乙醇固定， 4℃保 存待检。经 0.01％ RNA 酶处理胞浆 RNA、 50mg/L 碘化丙锭 (popidium iodide， PI)DNA 染色 30min 后， 经 300 目筛过滤除去成团细胞， 应用 COULTER EPICS XL 流式细胞仪检测细胞周期 中不同时相的细胞调亡率。每份标本测定 5000 个细胞， 根据 DNA 含量区分细胞所处细胞周 期时相。 mDNA 表达检测 ： 收集培养第五天的细胞， TRIZOL 处理后提取 RNA， 逆转录为 cDNA， 扩增 HPVE6、 E7， 同时扩增 β-action 作为内参照， HPVE6、 E7 引物 (616bp) ：
上游 5`-TGACTTTGCTTTTCGGGGATT-3`，
下游 5`GAGAACAGATGGGGCACAC-3`。
β-action(552bp) 引 物 序 列 ： 上游： 5`-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3`， 下游 5`CATGGTGGTGCCGCCGCCAGACAG-3`。
扩增参数为 ： 94℃预变性 5min ； 94℃变性 45s， 50℃复性 45s， 72℃延伸 1min， 扩增 30 个循环 ； 72℃延伸加时 5min ； PCR 产物 4℃保存 ； 2％琼脂糖凝胶电泳观察结果， 电压 40V。 应用 Scion Image 4.0(NIH) 软件进行电泳条带图象灰值的半定量分析。待测基因电泳条 带灰度比值＝待测条带灰度值 / 同一份标本内参照 β-action 条带灰度值。
应用 SPSS 13.0.0 统计软件， 进行单因素方差分析 (ANOVA)、 t 检验等。
表 2 对 CaSki 细胞的生长抑制作用 (OD， n ＝ 5) 吸光度值 (OD)
注： 与 control 组比较 #P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01 ； 与试验 1 组比较 *P ＜ 0.05 ； 与试 验 2 组比较△ P ＜ 0.05。
表 3 对 H8 细胞的生长抑制作用 (OD， n ＝ 5) 吸光度值 (OD)
注： 与 control 组比较 #P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01 ； 与试验 1 组比较 *P ＜ 0.05 ； 与试 验 2 组比较△ P ＜ 0.05。
表 4 对 HPVE6、 E7 基因表达的影响 (CaSKi 细胞周期分布和细胞凋亡率 )
注： 与 control 组比较 #P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01。 表 5 对 HPVE6、 E7 基因表达的影响 (H8 细胞周期分布和细胞凋亡率 )
注： 与 control 组比较 #P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01。 表 6RT-PCR 产物电泳条带灰度值注： 与 control 组比较 #P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01。
试验结论 ： 上述试验 1 和试验 2 证明了莪术醇对 HPV 感染具有很好抑制作用， 对 HPV 不同亚型感染具有很好的抑制作用， 主要作用其 E6、 E7 蛋白 ； 与莪术油比较具有更好的 药理作用 ； 与含量低于 50％的莪术醇比较具有更好的药理作用。 实施例 实施例 1
莪术醇为活性成分制备的片剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包括但不 限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 99.8％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 2
莪术醇为活性成分制备的胶囊剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包括但 不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 50.3％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 3
莪术醇为活性成分制备的注射乳剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包括 但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 74.4％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 4
莪术醇为活性成分制备的冻干粉针剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包 括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 66.2％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 5
莪术醇为活性成分制备的阴道栓剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包括 但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 84.1％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 6
莪术醇为活性成分成为制备的阴道泡沫剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾 病， 包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 92.8％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 7
莪术醇为活性成分制备的阴道泡腾片， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包 括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 55.7％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 8
莪术醇为活性成分制备的直肠栓剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包括 但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 90.0％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 9
莪术醇为活性成分制备的阴道凝胶剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包 括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 37.4％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 10
莪术醇为活性成分制备的阴道软膏剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包 括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 54.3％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 11
莪术醇为活性成分制备的阴道膜剂， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包括 但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 67.2％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 12
莪术醇为活性成分制备的阴道软胶囊， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包 括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 92.2％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
实施例 13
莪术醇为活性成分制备的直肠软胶囊， 该制剂用于治疗 HPV 感染导致的疾病， 包 括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。
其中莪术醇含量 72.7％。 其中 HPV 感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低 危型人乳头瘤病毒亚型。
上述实施例包括但不限于所述。9