嵌合利尿钠多肽和抑制心脏重构的方法 相关申请的交叉引用
本申请要求 2008/06/06 提交的美国专利临时申请第 61/059,576 号的优先权。
有关联邦资助的研究的声明
本发明受到来自国立卫生研究所 (National Institutes of Health) 联邦基金号 HL76611-03 和 HL36634-20 的政府资助。政府对本发明拥有某些权利。
技术领域 本申请文件涉及包含利尿钠多肽的组合物， 和利用利尿钠肽来防止、 降低和 / 或 抑制心脏重构以及防止、 降低和 / 或抑制心肌梗死 (MI) 后的缺血损伤的方法。
背景技术 利尿钠肽家族包括心激素心房利尿钠肽 (ANP)、 B- 型利尿钠肽 (BNP)、 C- 型利尿 钠肽 (CNP) 和树眼镜蛇属 (Dendroaspis) 利尿钠肽 (DNP)， 所有这些都通过充分表征的微
粒鸟苷酸环化酶受体 ( 即， NPR-A 用于 ANP 和 BNP ； NPR-B 用于 CNP) 和第二信使环 3’ 5’ 鸟 苷 单 磷 酸 (cGMP) 发 挥 作 用 (Kuhn(2003)Circ Res 93 ： 700-709 ； Tawaragi 等， (1991) Biochem Biophys Res Commun 175 ： 645-651 ； 和 Komatsu 等， (1991)Endocrinology 129 ： 1104-1106)。CNP 具有有益的血管和抗增殖特性。由于缺乏肾脏作用， CNP 降低血压的作用 小于 ANP 和 BNP， 但由于具有静脉舒张作用因此能降低心脏负载。DNP 是一种能显著降低血 压的有效的利尿钠肽和利尿肽。CNP 和 DNP 通过独立的鸟苷酸环化酶受体发挥作用。
发明概述
本申请文件部分基于鉴定出了将两种单独利尿钠肽的有益特性加以组合的嵌 合肽组合物和方法。如本文所述， CNP(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC ； SEQ ID NO ： 1) 与 DNP 的 15-AA 线性 C- 末端 (PSLRDPRPNAPSTSA ； SEQ ID NO ： 2) 融合得到了一种合成的嵌合肽 (CD-NP)， 其在体内具有利尿钠和利尿、 增强 GFR、 降低心脏负载、 抑制肾素、 以及极轻微降低 血压的特性。 此外， 在利用心脏成纤维细胞 (CF) 进行的体外研究证实， CD-NP 具有活化 cGMP 和抗增殖特性。此外， 根据本发明的描述， 可使用其他利尿钠多肽和嵌合多肽。本文披露的 发现促成了利尿钠肽药物研发领域中一项革命性的设计策略， 从而能够产生具有优于天然 利尿钠肽的特性， 同时在治疗诸如急性心力衰竭 (AHF)、 急性心肌梗死 (AMI)、 再灌注损伤、 缺血损伤和心脏重构等心肾疾病状态时具有潜在有益功效且安全的治疗肽。
一方面， 本申请文件的特征在于一种降低被鉴定为有此需要的对象的心脏重构的 方法， 所述方法包括给予所述对象包含药学上可接受的载体和能够升高所述对象尿液和血 浆 cGMP 水平的多肽的组合物， 其中， 所述组合物的给予量能使一个或多个心脏重构参数的 水平相比给予所述组合物之前所述一个或多个参数的水平有效改变至少 10 个百分点， 其 中所述一个或多个参数选自下组 ： 心脏负载降低、 肾小球滤过率升高、 醛固酮水平降低、 血 浆肾素活性降低、 血管紧张素 II 水平降低、 心脏成纤维细胞增殖降低、 左心室质量降低、 左 心室肥大减轻、 心室纤维化减轻、 射血分数升高、 左心室收缩末期内径降低、 肺毛细血管楔压降低、 右房压降低、 和平均动脉压降低。
所述多肽可以是利尿钠多肽。 所述利尿钠多肽可以是嵌合利尿钠多肽， 其包含 (a) 第一利尿钠多肽的环结构或所述第一利尿钠多肽环结构的变体， 和 (b) 第二利尿钠多肽的 氨基酸序列或所述第二利尿钠多肽所述氨基酸序列的变体。所述利尿钠多肽可以包含 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列， 但相对于 SEQ ID NO ： 3 所示序列可具有 1、 2、 3、 4、 或 5 个氨基酸 取代。所述多肽能够结合 NPR-B 受体和 NRP-A 受体。所述多肽在给予所述对象后的消除半 衰期为至少 15 分钟。
所述方法可包括以连续静脉输注方式给予所述组合物 ( 例如， 1-7 天 )。所述方法 可包括以连续静脉输注形式给予所述组合物 1-7 天， 随后皮下给予所述组合物 5-30 天。所 述方法可包括以约 0.1ng 多肽 / 千克体重 / 分钟至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 分钟的剂量 以连续静脉输注形式给予所述组合物， 随后以约 10ng 多肽 / 千克体重 / 天至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 天的剂量皮下给予所述组合物。所述方法可包括以约 0.1ng 多肽 / 千克体重 / 分钟至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 分钟的剂量以连续静脉输注形式给予所述组合物约 3 小 时至约 7 天， 随后以约 10ng 多肽 / 千克体重 / 天至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 天的剂量皮 下给予所述组合物约 5- 约 30 天。
所述对象被鉴定患有急性心力衰竭或急性心肌梗死。 所述方法可包括在再灌注开 始时或大致开始时或在再灌注开始后约 3 小时开始给予所述连续静脉输注。所述组合物可 在再灌注后约 3 小时至约 12 小时给予。所述方法可包括以约 1ng 多肽 / 千克体重 / 分钟 至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 分钟 ( 例如， 约 10ng 多肽 / 千克体重 / 分钟、 约 12.5ng 多肽 / 千克体重 / 分钟、 约 15ng 多肽 / 千克体重 / 分钟、 约 17.5ng 多肽 / 千克体重 / 分钟、 或 约 20ng 多肽 / 千克体重 / 分钟 ) 的剂量给予所述组合物。所述方法可进一步包括监测所 述对象中一个或多个心脏重构参数的水平。
另一方面， 本发明的特征在于一种包含药学上可接受的载体和多肽的组合物， 其 中所述多肽能够升高对象的尿液和血浆 cGMP 水平， 其中所述组合物当被给予鉴定为有此 需要的对象时导致心脏重构降低， 其中所述降低的或抑制的心脏重构通过选自下组的一个 或多个参数水平的改变来表示 ： 心脏负载降低、 肾小球滤过率升高、 醛固酮水平降低、 血浆 肾素活性降低、 血管紧张素 II 水平降低、 心脏成纤维细胞增殖降低、 左心室质量降低、 左心 室肥大减轻、 心室纤维化减轻、 射血分数升高、 左心室收缩末期内径降低、 肺毛细血管楔压 降低、 右房压降低、 和平均动脉压降低， 且其中所述一个或多个参数的水平相比所述给药之 前所述一个或多个参数的水平改变至少 10 个百分点。
所述多肽是利尿钠多肽。所述利尿钠多肽可以是嵌合利尿钠多肽， 其包含 (a) 第 一利尿钠多肽的环结构或所述第一利尿钠多肽环结构的变体， 和 (b) 第二利尿钠多肽的氨 基酸序列或所述第二利尿钠多肽所述氨基酸序列的变体。 所述利尿钠多肽可以包含 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列， 但相对于 SEQ ID NO ： 3 所示序列可具有 1、 2、 3、 4、 或 5 个氨基酸取 代。所述多肽能够结合 NPR-B 受体和 NRP-A 受体。所述多肽在给予所述对象后的消除半衰 期为至少 15 分钟。 所述利尿钠多肽可包含与 SEQ ID NO ： 3 所述氨基酸序列有 91-98％相同 的氨基酸序列。所述利尿钠多肽可以包含 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列， 但相对于 SEQ ID NO ： 3 所示序列可具有 1、 2、 3、 4、 或 5 个氨基酸取代。所述对象被鉴定患有急性心力衰竭或 急性心肌梗死。所述药物载体可以是生理盐水或者葡萄糖和水。除非另有限定， 在本文中使用的所有技术和科学术语具有和本领域普通技术人员 共知的相同含义。 虽然在实践本发明时可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材 料， 但是， 下面描述了合适的方法和材料。 本文中述及的所有出版物、 专利申请、 专利和其他 文献都全文参考结合于本文。在矛盾时， 以本说明书 ( 包括定义 ) 为准。此外， 材料、 方法 和例子都只是说明性的， 并不构成限制。
在附图和下述描述中详细描述了本发明的一种或多种实施方式。 通过详述和附图 以及权利要求书， 不难了解本发明的其它特征、 目的和优点。 附图说明 图 1 是 CNP(SEQ ID NO ： 1)、 DNP(SEQ ID NO ： 17)、 37-AA 嵌合利尿钠肽、 CD-NP(SEQ ID NO ： 3)、 和被称为 CNP-C 的 27-AA“转化” CNP(SEQ ID NO ： 4) 的氨基酸序列和结构的示 意图。
图 2 中的两张图显示了 DNP 的 C- 末端对正常犬 (n ＝ 6) 的钠泌尿排泄 (UNaV ； 图 2A) 和尿流量 (UV ； 图 2B) 的作用的实施例。数据表示为平均值 ±SE。C- 末端， 42ng/kg/ 分 钟静脉输注 C- 末端。* 相比基线 P ＜ 0.05。
图 3 中的一系列图显示了 CD-NP 对正常犬 (n ＝ 6) 的平均动脉压 (MAP ； 图 3A)、 右房压 (RAP ； 图 3B) 和肺毛细血管压 (PCWP ； 图 3C) 的作用的实施例。数据表示为平均值 ±SE。CD-NP 10， 剂量为 CD-NP 10ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 50， 剂量为 CD-NP 50ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 100， 剂量为 CD-NP 100ng/kg/ 分钟。* 相比基线 P ＜ 0.05。
图 4 中的一系列图显示了 CD-NP 对正常犬 (n ＝ 6) 的钠泌尿排泄 (UNaV 图 4A)、 尿 流量 (UV ； 图 4B) 和肾小球滤过率 (GFR ； 图 4C) 的作用的实施例。数据表示为平均值 ±SE。 CD-NP 10， 剂量为 CD-NP 10ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 50， 剂量为 CD-NP 50ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 100， 剂量为 CD-NP 100ng/kg/ 分钟。* 相比基线 P ＜ 0.05。
图 5 中的两张图显示了 CD-NP 对正常犬 (n ＝ 6) 的近端钠重吸收分数 (PFRNa ； 图 5A) 和远端钠重吸收分数 (DFRNa ； 图 5B) 的作用的实施例。数据表示为平均值 ±SE。CD-NP 10， 剂量为 CD-NP 10ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 50， 剂量为 CD-NP 50ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 100， 剂 量为 CD-NP 100ng/kg/ 分钟。* 相比基线 P ＜ 0.05。
图 6 中的两张图显示了两种剂量的 CD-NP 和等摩尔剂量的人 BNP 在两组正常犬 ( 每组 n ＝ 6) 中的作用的实施例。图 6A 显示了 CD-NP 对平均动脉压 (MAP) 的作用， 图 6B 显示了 CD-NP 对肾小球滤过率 (GFR) 的作用。实心条是 CD-NP， 空心条是 BNP。数据表示 为平均值 ±SE。CD-NP 10， 剂量为 CD-NP 10ng/kg/ 分钟， 或者在另一组中为等摩尔剂量的 BNP ； CD-NP 50， 剂量为 CD-NP 50ng/kg/ 分钟或者在另一组中为等摩尔剂量的 BNP。* 相比 基线 P ＜ 0.05。 两组之间的 P ＜ 0.05。
图 7 中的两张图显示了 CD-NP 对人 CF 的作用的实施例。图 7A 显示了 CD-NP 对 人 CF 中 cGMP 生成的作用。数据表示为平均值 ±SE。* 相比未处理 P ＜ 0.05 ； ** 相比 -11 -8 CP-NP 10 M P ＜ 0.05 ； + 相比 CD-NP 10 M P ＜ 0.05。图 7B 显示了 CD-NP 对人 CF 的抗增 殖作用的实施例， 如通过比色法测得的用光密度单位表示的 BrdU 摄取所示。对照， 未处理 的人心脏成纤维细胞 ； 心脏营养素 -1， 心脏营养素 -1 作用下成纤维细胞的增殖 ； 心脏营养 素 -1+CD-NP， 加入心脏营养素 -1 的 CD-NP 刺激成纤维细胞。数据表示为平均值 ±SE。* 相
比对照 P ＜ 0.05。
图 8 显示了一个实施方式中心肌梗死 (MI) 三周后大鼠的左心室 (LV) 质量。MI， 未处理 ； MI+CDNP， MI 后用 1.7x10-7g/kg/ 分钟 CD-NP 处理 2 周。
图 9A 中的一系列图显示了如图所示用 CD-NP 或 CNP 处理的犬的血浆 cGMP 水 平 ( 左图 )、 尿 cGMP 排泄 ( 中图 ) 以及 cGMP 的净肾脏生成 ( 右图 )。数值表示为平均值 ±SEM(CD-NP， n ＝ 9-10 ； CNP， n ＝ 7-9)。相比输注前进行了组内比较 ( 平均值 ±SEM， P ＜ 0.05*， )， 并进行了组间比较 时间表示清除率中值。 图 9B 中的两 张图显示了如图所示用 CD-NP 或 CNP 处理的犬的尿流量 ( 左图 ) 和尿钠排泄 ( 右图 )。数 值表示为平均值 ±SEM。相比输注前进行了组内比较 ( 平均值 ±SEM， P ＜ 0.05*， )， 并进行了组间比较 ( 率中值。
)(CD-NP， n ＝ 10 ； CNP， n ＝ 7)。时间表示清除图 10A-10D 显示了如图所示用 CD-NP 或安慰剂处理的人的血浆 cGMP 水平 ( 图 10A)、 尿 cGMP 排泄 ( 图 10B)、 尿钠排泄反应 ( 图 10C) 以及血压反应 ( 图 10D)。相比输注 前进行了组内比较 ( 平均值 ±SEM， P ＜ 0.05*， )， 并进行了组间比较图 10E 显示了在分离的犬肾小球中在不存在或存在 NPR-A 拮抗剂 (1μM) 时 cGMP 对 CD-NP 的反应。* 相比空白 P ＜ 0.05，相比空白 P ＜ 0.0001。 发明详述
化合物
本申请文件提供了利尿钠化合物， 所述化合物可用于在有此需要的对象中提高 cGMP 水平和减低心脏重构。如本文所述， 该化合物可结合 NPR-A 受体和 / 或 NPR-B 受体， 并 且， 在某些情况下结合 NPR-C 受体。此外， 在给予对象后所述化合物的消除半衰期长于天然 NP。在一些实施方式中， 本文提供的化合物可以是多肽。
例如， 本申请文件描述了示例性的分离的利尿钠多肽， 所述多肽能够抑制或降低 AHF、 AMI、 再灌注损伤、 缺血损伤和心脏重构。在一些实施方式中， 利尿钠肽可用于治疗、 抑 制、 和 / 或预防心脏重构和缺血损伤， 尤其是在 AMI 和 / 或 AHF 之后。文中， 术语 “利尿钠多 肽” 或 “NP” 包括天然 ( 天然形成的， 野生型 )NP( 例如， ANP、 BNP、 CNP、 DNP 和尿扩张素 )， 天 然 NP 的一个或多个部分， 天然 NP 的变体， 或天然 NP 的嵌合肽， 天然 NP 的部分， 或者天然 NP 或天然 NP 的部分的变体。在一些实施方式中， NP 仅包括天然 NP 成熟形式的一部分。含有 来自 CNP 和 DNP 的氨基酸序列的 NP 尤其有用， 但其他天然和嵌合 NP 也可考虑用于本文。
CNP 是一种与 ANP 和 BNP 有结构同源性但在遗传上不同的 22- 氨基酸肽。与 ANP 或 BNP 不同， CNP 缺乏 C- 末端氨基酸延伸， 这可能部分解释了它缺乏利尿钠特性的原 因 (Clavell 等， (1993)Am Heart J 1104-1106 ； 和 Hunt 等， (1994)J Clin Endocrinol Metab 78 ： 1428-1435)。CNP 主要是一种内皮细胞延伸肽 (Stingo 等， (1992)Am Heart J H1318-1321 ； Ogawa 等， (1992)Hypertension 19 ： 809-813 ； Doi 等， (2001)Arterioscler Thromb Vasc Biol 21 ： 930-936 ； Naruko 等， (2005)Atherosclerosis 181 ： 241-250 ； Horio 等， (2003)Endocrinology 144 ： 2279-2284 ； Langenickel 等， (2006)Proc Natl Acad Sci USA 103 ： 4735-4740 ； 和 Scotland 等， (2005)Proc Natl Acad Sci USA 102 ： 14452-14457)。 在分离的静脉环和动脉环中， CNP 激活静脉中的 NPR-B 受体， 而 ANP 和 BNP 同时结合动脉和 静脉内的 NPR-A 受体。这与 CNP 的降低血压的作用弱于 ANP 和 BNP 一致 (Wei 等， (1993)Am
J Physiol 264 ： H71-73 ； Igaki 等， (1998)Hypertens Res 21 ： 7-13 ； 和 LaVilla 等， (1998) Clin Sci(Lond)95 ： 595-602)。
除 了 静 脉 舒 张 特 性， CNP 在 CF 中 的 抗 增 殖 能 力 和 胶 原 抑 制 特 性 强 于 ANP 和 BNP(Horio 等， 同上 )。例如， 研究显示， 给患有 AMI 的啮齿动物连续 14 天输注 CNP 能显 著减轻心室扩张、 心脏纤维化和心肌细胞肥大 (Soeki 等， (2005)J Am Coll Cardiol 45 ： 608-616)。慢性输注 CNP 不导致降低血压的作用。
不同于 ANP 和 BNP， 当给人输注时 CNP 缺乏显著的利尿钠和利尿作用。这可以解 释 CNP 对诸如 AHF 的钠和水阻挡综合征无效， 尽管它具有突出的静脉舒张和抗纤维化特性 (Igaki 等， 同上 ； 和 La Villa 等， 同上 )。
DNP 最初分离自绿色树眼镜蛇。DNP 在体内显著利尿钠和利尿， 并具有降低心 脏 负 载 的 作 用， 但 具 有 显 著 降 低 血 压 的 特 性 (Schweitz 等， (1992)J Biol Chem 267 ： 13928-13932 ； Lisy 等， (1999)Kidney Int 56 ： 502-508 ； 和 Lisy 等， (2001)Hypertension 37 ： 1089-1094)。与 ANP 和 BNP 一样， DNP 通过 NPR-A 受体发挥作用， 即被 ANP 饱和将显著 降低 DNP 在培养的人内皮细胞内对 cGMP 的活化作用。其实， 包括利钠作用和降血压作用在 内的 DNP 的体内作用与 NPR-A 的活化一致， 这种作用密切模拟 ANP 和 BNP 的特性， 但不同于 CNP。实际上， 与 ANP 和 BNP 相比， DNP 在人心肌中已显示出对 NPR-A 受体具有较高亲和力 (Singh 等， (2006)Circ Res 99 ： 183-190)。 DNP 具有已知利尿钠肽中最长的 C- 末端， 由 15 个氨基酸构成， 相比之下 ANP 为 5 个， BNP 为 6 个， 而 CNP 没有。DNP 的长 C- 末端使得 DNP 对中性肽链内切酶 (NEP) 的降解 具有较高耐性， 因此有助于增强其利尿钠和利尿作用 (Chen 等， (2002)J Am Coll Cardiol 40 ： 1186-1191)。此外， CNP 缺乏 C- 末端也解释了在三种已知的内源利尿钠肽中 CNP 最易 于被 NEP 降解。缺乏 C- 末端也可以解释 CNP 的肾脏作用， 因为 NEP 在肾脏中具有最高表达 (Kenny 和 Stephenson(1988)FEBS Lett 232 ： 1-8)。
尿扩张素是一种具有强利尿钠和利尿活性的 NPR-A 受体的 ANP- 样激动剂。尿扩 张素定位在肾脏内， 是从与 ANP 相同的前体差异加工得到的， 并分泌到尿液中。尿扩张素的 32 氨基酸序列包括 ANP 的完整的 28 氨基酸序列， 并在其 N- 末端有 4 个氨基酸延伸。
术语 “心脏重构” 表示可与 MI、 AHF 或其他征状一起发生的对心脏的影响。其中包 括， 例如， 心脏膨胀、 肌细胞肥大和心脏纤维化 ( 即间质成纤维细胞增殖 )。本文提供的 NP 可抑制或防止与 AMI 或 AHF 一起发生的心脏重构。在一些实施方式中， 表示降低的心脏重 构的参数可包括以下一个或多个 ： 心脏负载降低 ( 即， 心脏压力降低 )， 肾小球滤过率升高 (GFR)， 血浆肾素活性降低 (PRA)， 血管紧张素 II 水平降低， 心脏成纤维细胞增殖降低， 左心 室 (LV) 肥大减轻， LV 质量降低 ( 表示纤维化和肥大减轻 )， 肺毛细血管楔压降低 (PWCP ； 左 心房压力的间接度量 )， 右房压降低， 平均动脉压降低， 醛固酮水平降低 ( 预示抗纤维化作 用 )， 心室纤维化减轻， 射血分数升高， 以及 LV 收缩末期内径减小。 为确定 NP 是否能够抑制 或降低心脏重构， 可采用本领域已知的和 / 或本文所述的方法评价这些参数中的一个或多 个 ( 例如， 在用 NP 治疗之前和之后 )。
诸如 AMI 和 AHF 等征状可导致肾损伤以及心脏损伤。在一些实施方式中， 本文提 供的 NP 还能保护肾脏免遭 AMI 和 AHF 损伤。表示肾脏保护作用的参数包括， 例如， 近端钠 重吸收分数 (PFRNa) 降低， 远端钠重吸收分数 (DFRNa) 降低， 尿钠排泄 (UNaV) 升高以及尿
流量 (UV) 增加。可评价这些参数中的任何一个或多个 ( 例如， 在给予 NP 之前和之后 ) 以 确定 NP 是否具有肾脏保护作用。评价这些参数的方法是本领域已知的， 并在本文中描述。
术语 “分离的多肽” 表示满足以下条件的多肽 ： (1) 与天然发现的蛋白质无关， (2) 不含相同来源的其他蛋白质 ( 例如， 不含人蛋白质 )， (3) 由来自不同物种的细胞表达， 或 (4) 不是天然产生的。本文提供的分离的多肽通常含有 10 个或更多 ( 例如， 12 个或更多、 15 个或更多、 或者 20 个或更多 ) 氨基酸残基。分离的多肽可以， 例如， 由 DNA 或 RNA， 包括 合成的 DNA 或 RNA， 或它们的某些组合编码。
嵌合 NP 可包括两个多个个体 NP 的氨基酸序列。在一些实施方式中， 嵌合多肽可 包括 CNP 和 DNP 的氨基酸序列。此外， 在一些情况下， 嵌合 NP 可包括环结构和半胱氨酸键 ( 例如， ANP、 BNP、 CNP 或 DNP 的环结构和半胱氨酸键 ) 与其他 NP 的一个或多个氨基酸区段 的组合。例如， 嵌合 CD-NP 可包括 CNP 的完整 22-AA 序列 (GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC ； SEQ ID NO ： 1) 以及 DNP 的 15-AA C- 末端 (PSLRDPRPNAPSTSA ； SEQ ID NO ： 2)， 因此可具有 SEQ ID NO ： 3 所述氨基酸序列 (GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA)。在一些实施方式中， 嵌合 NP 可包括 CNP 和尿扩张素的氨基酸序列。例如， 嵌合 CU-NP 可包括 CNP 的环结构和二 硫键 (CFGLKLDRIGSMSGLGC ； SEQ ID NO ： 5) 以及尿扩张素的 10 氨基酸 N- 末端 (TAPRSLRRSS ； SEQ ID NO ： 6) 和 5 氨基酸 C- 末端 (NSFRY ； SEQ ID NO ： 7)， 因此可具有序列 TAPRSLRRSSCF GLKLDRIGSMSGLGCNSFRY(SEQ ID NO ： 8)。
在一些情况下， 嵌合 NP 可在 SEQ ID NO ： 3 或 SEQ ID NO ： 8 的一个或多个位置 ( 例 如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个位置 ) 上包括突变 ( 例如， 取代、 添加或缺失 )。变体 NP， 例 如， 相对于天然 NP 氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代的变体， 可按照本文所述进行制 备和修饰。在一些情况下， 可通过选择不显著改变以下情况的取代制造氨基酸取代 ： (a) 被 取代区域的肽主链的结构， (b) 靶位点上分子的电荷或疏水性， 或 (c) 侧链的大小 (bulk)。 例如， 天然残基根据侧链特性可分成以下几组 ： (1) 疏水性氨基酸 ( 正亮氨酸、 甲硫氨酸、 丙 氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸 ) ； (2) 中性亲水性氨基酸 ( 半胱氨酸、 丝氨酸和苏氨酸 ) ； (3) 酸性氨基酸 ( 天冬氨酸和谷氨酸 ) ； (4) 碱性氨基酸 ( 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 组氨酸、 赖 氨酸和精氨酸 ) ； (5) 影响链取向的氨基酸 ( 甘氨酸和脯氨酸 ) ； 和 (6) 芳香性氨基酸 ( 色 氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸 )。 用这些基团进行的取代可被认为是保守性取代。 有用的取代的 非限制性的例子包括但不限于， 用缬氨酸取代丙氨酸， 用赖氨酸取代精氨酸， 用谷氨酰胺取 代天冬酰胺， 用谷氨酸取代天冬氨酸， 用丝氨酸取代半胱氨酸， 用天冬酰胺取代谷氨酰胺， 用天冬氨酸取代谷氨酸， 用脯氨酸取代甘氨酸， 用精氨酸取代组氨酸， 用亮氨酸取代异亮氨 酸， 用异亮氨酸取代亮氨酸， 用精氨酸取代赖氨酸， 用亮氨酸取代甲硫氨酸， 用亮氨酸取代 苯丙氨酸， 用甘氨酸取代脯氨酸， 用苏氨酸取代丝氨酸， 用丝氨酸取代苏氨酸， 用酪氨酸取 代色氨酸， 用苯丙氨酸取代酪氨酸， 和 / 或用亮氨酸取代缬氨酸。
变体 CD-NP 的非限制性例子包括 ：
PLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO ： 9)，
GISKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO ： 10)，
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTTA(SEQ ID NO ： 11)，
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSV(SEQ ID NO ： 12)，
GLTKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO ： 13)，GLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO ： 14)， GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSSSA(SEQ ID NO ： 15)， 和 GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPTTSA(SEQ ID NO ： 16). 可在 CD-NP 内任何位置进行的保守性取代的其它例子列在表 1 中。 表1 保守性氨基酸取代的例子优选取代 Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Pro Arg Leu Ile Arg Leu Leu Gly Thr Ser Tyr Phe 10Gln， His， Lys， Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn， Gln， Lys， Arg Leu， Val， Met， Ala， Phe， 正亮氨酸 Norleucine， Ile， Val， Met， Ala， Phe Arg， Gln， Asn Leu， Phe， Ile Leu， Val， Ile， Ala Gly Thr Ser Tyr Trp， Phe， Thr， Ser102143757 A CN 102143764 Val
说明书Leu8/31 页Ile， Leu， Met， Phe， Ala， 正亮氨酸在一些实施方式中， NP 可包含一个或多个非保守性取代。非保守取代通常指将一 种上述类型的成员更换为另一种类型的成员。 这种制造方法对于提供大量这种化合物或其 他实施方式是理想的。 氨基酸改变能否得到功能性多肽可通过测定肽变体的比活方便地确 定。
具有保守性和 / 或非保守性取代 ( 例如， 针对 SEQ ID NO ： 3) 的变体 NP， 以及 SEQ ID NO ： 3 的片段， SEQ ID NO ： 3 变体的片段， 以及包含 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 3 的变体或 片段或 SEQ ID NO ： 3 变体的片段的多肽， 可通过任何合适的试验 ( 包括本文所述试验 ) 筛 选它们的生物活性。例如， 如本文中实施例 1 和 3 的描述， 可通过测量对 CF 产生的 cGMP 水 平的影响或者通过检测抑制 CF 增殖的能力， 在体外评价本文所述 NP 的活性。NP 的活性也 可在体内评价， 例如， 在诱导 MI 后在动物体内检测它对以下因素的影响 ： 肺毛细血管楔压， 右房压， 平均动脉压， 尿钠排泄， 尿流量， 近端和远端钠重吸收分数， 血浆肾素活性， 血浆和 尿液 cGMP 水平， 肾小球滤过率， 以及左心室质量。这种试验描述于， 例如， 本文的实施例 1、 2 和 4。
在一些实施方式中， 由于半胱氨酸残基之间的二硫键， 本文提供的 NP 可以是环状 的 ( 参见， 例如， 图 1 中描绘的 CD-NP 结构 )。在一些实施方式中， 半胱氨酸残基上的巯基可 被其他基团 ( 例如， -CH2CH2-) 代替。为了用 -CH2- 基团代替巯基， 例如， 半胱氨酸残基可用 α- 氨基丁酸代替。这种类似的环状多肽可用， 例如， Lebl 和 Hruby(Tetrahedron Lett.， 1984， 25 ： 2067) 描述的方法制造， 或采用美国专利 4,161,521 中描述的方法制造。
此外， 将丝氨酸或苏氨酸的 OH 与天冬氨酸或谷氨酸的羧基反应可形成酯桥或酰 胺桥， 从而产生具有 -CH2CO2CH2- 结构的桥。类似地， 将赖氨酸的侧链与天冬氨酸或谷氨 酸反应可得到酰胺， 从而产生具有 -CH2C(O)NH(CH)4- 结构的桥。合成这些桥的方法是本 领 域 已 知 的 ( 参 见， 例 如， Schiller 等， (1985)Biochem.Biophy.Res.Comm.127 ： 558， 和 Schiller 等， (1985)Int.J.Peptide Protein Res.25 ： 171)。其他成桥氨基酸残基以及反 应可参见例如， 美国专利 4,935,492。包含用非肽键连接氨基酸残基的肽类似物的制备也 是本领域已知的。参见， 例如， Spatola 等， (1986)Life Sci.38 ： 1243 ； Spatola(1983)Vega Data 1(3) ； Morley(1980)Trends Pharm.Sci.463-468 ； Hudson 等， (1979)Int.J.Pept. Prot.Res.14 ： 177 ； Spatola， 选自 《氨基酸、 肽和蛋白质的化学和生物化学》 (Chemistry and Biochemistry of Amino Acid Peptides and Proteins， B.Weinstein 编， Marcel Dekker， New York， p.267(1983) ； Hann(1982)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 ： 307 ； Almquist 等， (1980)J.M 编， Chem.23 ： 1392 ； Jennings-White 等， (1982)Tetrahedron Lett.23 ： 2533 ； 欧 洲专利申请 EP 45665 ； Holladay 等， (1983)Tetrahedron Lett.24 ： 4401 ； 和 Hruby(1982) Life Sci.31 ： 189。
在一些实施方式中， NP 可包含 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列， 但具有特定数目的 氨基酸取代。例如， NP 可具有 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列并具有 1、 2、 3、 4、 或 5 个氨基酸 取代。这种氨基酸序列的例子包括， 但不限于， SEQ ID NO ： 9-16 中列出的那些。
在一些实施方式中， 本文提供的 NP 可具有与参比 NP 序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2、 或 SEQ ID NO ： 3) 有至少 85％ ( 例如、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 97.5％、 98％、 98.5％、 99.0％、 99.5％、 99.6％、 99.7％、 99.8％、 99.9％、 或 100％ ) 序列相同性的氨基酸序列。序列相同性百分数可由比对氨基酸 序列的匹配位置数确定， 用比对氨基酸序列中匹配位置的数目除以比对氨基酸的总数再乘 以 100 来计算。匹配位置表示在比对氨基酸序列的相同位置出现相同氨基酸的位置。也可 确定任意核酸序列的序列相同性百分数。
序列相同性百分数是采用独立 BLASTZ 版本 ( 包含 BLASTN 版本 2.0.14 和 BLASTP 版本 2.0.14) 的 BLAST 2 序列 (Bl2seq) 程序通过比较靶核酸或靶氨基酸序列来鉴定核酸 或氨基酸序列来确定的。这种独立 BLASTZ 版本可从 Fish & Richardson 的网址 (fr.com/ blast) 或从美国政府的生物技术信息中心的网址 (ncbi.nlm.nih.gov) 获得。如何使用 Bl2seq 程序的指令可在 BLASTZ 的 “读我” 文件中找到。
Bl2seq 采用 BLASTN 或 BLASTP 算法来比较两个序列。BLASTN 用来比较核酸序列， 而 BLASTP 用来比较氨基酸序列。为比较两个核酸序列， 各选项的设定如下 ： -i 设定成含 有要比较的第一核酸序列的文件 ( 例如， C:\seq1.txt) ； -j 设定成含有要比较的第二核酸 序列的文件 ( 例如， C:\seq2.txt) ； -p 设定成 blastn ； -o 设定成任何目标文件名 ( 例如， C:\output.txt) ； -q 设定成 -1 ； -r 设定成 2 ； 所有其他选项采用默认值。以下命令将生成 包含两个序列的比较的输出文件 ： C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastn-o c:\output.txt-q-1-r2。如果靶序列与鉴定序列的任何部分同源， 则指定的输出文件将显 示那些与比对序列同源的区域。如果靶序列与鉴定序列的任何部分不同源， 则指定的输出 文件将不显示比对序列。
比对时， 通过计算与开始于任意匹配位置并终止于任意其他匹配位置的鉴定序列 对准的靶序列中连续核苷酸的数目来确定长度。 匹配位置是同时在靶序列和鉴定序列中出 现相同核苷酸的任何位置。由于缺口中没有核苷酸， 靶序列中存在的缺口不计算在内。同 样， 由于计数的是靶序列核苷酸而非鉴定序列核苷酸， 因此鉴定序列中存在的缺口不计算 在内。
特定长度上的相同性百分数是将整个长度上匹配位置的数目除以总长度数目然 后将所得结果乘以 100 得到的。例如， 如果 (1) 将长度为 30 个氨基酸的靶序列与 SEQ ID NO ： 3 所示序列比较， (2)Bl2seq 程序显示与 SEQ ID NO ： 3 所示序列某区域对准的靶序列有 27 个氨基酸， 此时该 27 个氨基酸的区域中第一个和最后一个氨基酸是匹配的， 和 (3)27 个 对准的氨基酸中匹配的数目是 25， 则该 30 氨基酸靶序列包含长度为 27， 在该长度上的相同 性百分数为 92.6( 即， 25÷27x100 ＝ 92.6)。
应理解， 各个氨基酸或核酸靶序列内与鉴定序列对准的不同的区域可具有它们各 自的相同性百分数。注意， 相同性百分数值四舍五入到 0.1。例如， 78.11、 78.12、 78.13 和 78.14 向下四舍五入到 78.1， 而 78.15、 78.16、 78.17、 78.18 和 78.19 向上四舍五入 78.2。 还要注意长度值通常是整数。
分离的多肽可采用任何合适方法制备， 包括固相合成， 并可采用手动技术或自动 技术 ( 例如， 采用应用生物系统 (Applied BioSystems， Foster City， CA) 的肽合成仪或生 物探索公司 (Biosearch Inc.， San Rafael， CA) 的自动化肽合成仪 ) 来制造。可用 KCN 温 和氧化线性多肽在半胱氨酸残基之间引入二硫键， 如美国专利 4,757,048 所述。也可通过 重组方法制造 NP， 如下文所述。可使肽接触一个或多个当量的所需碱， 如金属氢氧化物 ( 例如， 氢氧化钠 )、 金属 碳酸盐或碳酸氢盐 ( 例如， 碳酸钠或碳酸氢钠 )、 或胺 ( 例如， 三乙胺、 三乙醇胺， 等等 ) 来制 造该多肽的羧基的盐。可使多肽接触一个或多个当量的无机酸或有机酸 ( 例如， 盐酸 ) 来 制造该多肽的酸加成盐。
可采用任何合适的将羧酸或前体转变成酯的方法 ( 例如， 本领域已知的那些方 法 ) 制备多肽的羧基酯。例如， 当采用 Merrifield 合成技术时， 一种制备本发明多肽的酯 的方法是， 根据树脂特性， 在碱性或酸性条件下在存在所需醇时从树脂上切下完整多肽。 然 后无需分离游离酸， 在从树脂上切下时直接酯化多肽的 C- 末端。
可采用将羧基或前体转化成酰胺的技术 ( 例如， 本领域已知的那些技术 ) 来制备 多肽的酰胺。一种在 C- 末端羧基形成酰胺的方法包括用合适的胺从固体支持物上切下多 肽， 或在存在醇时切割， 得到酯， 然后用合适的胺进行氨解。
制备多肽氨基的 N- 酰基衍生物时可在最后的缩合时使用 N- 酰基保护的氨基酸， 或者通过酰化保护的或未保护的肽。例如， 制备 O- 酰基衍生物时可通过酰化游离羟基肽或 肽树脂。 任何一种酰化反应可采用标准酰化试剂如酰卤、 酸酐、 酰基咪唑等进行。 如果需要， N- 和 O- 酰化反应可一起进行。
在一些实施方式中， 本文提供的 NP 的半衰期长于天然 NP 的半衰期。 例如， 尽管 CNP 的半衰期较短 ( 约 1 分钟或半分钟 )， 但 CD-NP 在给予哺乳动物后的消除半衰期为约 18.5 分钟 ( 参见， 例如， Lee 等， BMC Pharmacol.(2007)7( 增刊 1) ： P38 ； 和 Lee 等， J.Cardiac Failure(2007)13( 增刊 6) ： S144)。因此， 与天然 NP 如 CNP 相比， 本文提供的 NP 的半衰期 提高了至少 2 倍 ( 例如， 至少 2 倍， 至少 3 倍， 至少 4 倍， 至少 5 倍， 至少 6 倍， 至少 7 倍， 至 少 8 倍， 至少 9 倍， 或至少 10 倍 )。在一些实施方式中， NP 的消除半衰期为至少约 10 分钟 ( 例如， 至少约 10 分钟， 至少约 12 分钟， 至少约 15 分钟， 至少约 17 分钟， 至少约 18 分钟， 或 至少约 20 分钟 )。
本文提供的 NP 可通过一个或多个天然 NP 通过其发挥作用的鸟苷酸环化酶受体发 挥作用。例如， 在一些实施方式中， 本文提供的 NP 可结合于 ANP 和 BNP 通过其发挥作用的 NPR-A 受体并通过其发挥作用。在一些情况下， NP 可结合于 ANP 和 BNP 通过其发挥作用的 NPR-A 受体并通过其发挥作用。在一些情况下， NP 可结合于 CNP 通过其发挥作用的 NPR-B 受体并通过其发挥作用。在一些情况下， 本文提供的 NP 可结合于 NPR-C 受体并通过其发挥 作用。此外， 在一些情况下， 本文提供的 NP( 例如， 嵌合 NP 如 CD-NP) 可结合于一种以上的 鸟苷酸环化酶受体 ( 包括， 例如， NPR-A 和 NPR-B) 并通过其发挥作用。评价何种受体参与 特定 NP 的功能的方法是本领域已知的， 并包括本文实施例 5 中列出的方法。
本文提供的化合物 ( 例如， 分离的 NP) 可抑制或降低心脏重构， 例如 AMI 或 AHF 后 发生的心脏重构。能够抑制心脏重构的化合物是一种能够使一个或多个指示心脏重构受 到抑制或降低的参数改变至少 10％的化合物， 如下所述。为确定某具体化合物是否具有该 特性， 我们进行了本领域技术人员熟知的试验， 包括本文所述的那些试验。作为变体 NP 的 化合物通常具有相应野生型 NP， 或者， 如果该 NP 是嵌合 NP( 例如， CD-NP)， 则具有含有其中 所含 NP 组分的相应野生型序列的相应嵌合 NP 的生物学活性的至少约 10％ ( 例如， 至少约 10 ％， 15 ％， 20 ％， 25 ％， 33 ％， 40 ％， 50 ％， 60 ％， 67 ％， 75 ％， 80 ％， 85 ％， 90 ％， 95 ％， 100 ％， 或超过 100％ )。核酸、 载体和宿主细胞
本申请文件还描述了编码多肽 ( 例如， NP) 的示例性核酸， 以及含有该核酸的表达 载体和含有该核酸和 / 或表达载体的宿主细胞。如文中所用， 术语 “核酸” 指 RNA 或 DNA， 包 括 cDNA、 基因组 DNA 和合成 ( 例如， 化学合成的 )DNA。核酸分子可是双链或单链的 ( 即有 义链或反义链 )。核酸包括， 例如， 编码本文提供的 NP、 变体 NP 和嵌合 NP 的 cDNA。
“分离的核酸” 是独立于脊椎动物基因组内存在的其他核酸分子， 包括通常侧接在 脊椎动物基因组中该核酸一侧或两侧的核酸的核酸。 此处所用的术语″分离的″对于核酸 而言还可包括任何非 - 天然存在的核酸序列， 因为非 - 天然存在核酸序列在天然情况下不 存在， 不具有在天然存在基因组中紧密相邻的序列。
分离的核酸可以是， 例如， DNA 分子， 前提是通常在天然存在的基因组中发现直接 位于该 DNA 分子侧翼的核酸序列之一已被除去或不存在。因此， 分离的核酸包括， 但不限 于， 作为独立于其他序列的单独分子 ( 例如， 化学方法合成的核酸， 或是通过 PCR 或限制性 内切酶处理产生的 cDNA 或基因组 DNA 片段 ) 存在的 DNA 分子， 以及掺入载体、 自主复制质 粒、 病毒 ( 例如， 逆转录病毒、 慢病毒、 腺病毒或疱疹病毒 ) 或掺入原核生物或真核生物基因 组 DNA 的 DNA。 此外， 分离的核酸可包括工程构造核酸， 如作为杂交或融合核酸一部分的 DNA 分子。存在于， 例如 cDNA 文库或基因组文库或含有基因组 DNA 限制性消化产物的凝胶切片 内的成百至数百万的核酸分子中的核酸不能视为分离的核酸。例如， “分离的 CD-NP 核酸” 可以是编码 CD-NP 至少一部分的含有 9 个或更多 ( 例如， 15 个或更多、 21 个或更多、 36 个 或更多、 或者 45 个或更多 ) 连续核苷酸碱基的 RNA 或 DNA 分子， 或者是与其互补的 RNA 或 DNA。
本文还提供了在严格杂交条件下与编码 NP 的核酸分子 ( 例如， 编码具有 SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列的多肽的核酸分子 ) 选择性杂交的核 酸分子。 术语 “选择性杂交” 表示在使可检测到的非特异性核酸的结合量最小化的杂交和洗 涤条件下可检测地和特异性地结合。例如， 高严格条件可用来实现选择性杂交条件。中等 和严格杂交条件包括本领域熟知的那些。参见， 例如， Sambrook 等第 9.47-9.51 节 (1989)。 文中， 严格条件是 ： (1) 采用低离子强度和高洗涤温度， 如 0.015M NaCl/0.0015M 柠檬酸钠 (SSC)、 0.1％十二烷基硫酸钠 (SDS)、 50℃， 或 (2) 在杂交期间采用去污剂如甲酰胺， 如 50％ 甲酰胺 +0.1％牛血清白蛋白 /0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮 /50mM 磷酸钠缓冲液， pH 6.5+750mM NaCl、 75mM 柠檬酸钠， 42℃。 或者， 可使用 42℃的 50％甲酰胺， 5x SSC(0.75M NaCl， 0.075M 柠檬酸钠 )， 50mM 磷酸钠 (pH 6.8)， 0.1％磷酸钠， 5x 登哈特 (Denhardt’ s) 溶 液， 超声处理的鲑精 DNA(50Tg/ml)， 0.1％十二烷基硫酸钠 (SDS) 和 10％葡聚糖硫酸酯， 在 42℃在 0.2x SSC 和 0.1％ SDS 中洗涤。
分离的核酸分子可采用标准技术制造， 包括但不限于常规的分子克隆和化学核酸 合成技术。例如， 可使用聚合酶链式反应 (PCR) 技术来获得含有编码本文提供的 NP( 例如， CD-NP 或变体 CD-NP) 的核苷酸序列的分离核酸。PCR 指对靶核酸进行酶促扩增的方法或技 术。一般利用核酸的感兴趣区域或该区域以外的末端序列信息来设计寡核苷酸引物， 该引 物序列与有待扩增的模板的反义链上的序列相同。PCR 可用于扩增 DNA 以及 RNA 特异序列 ( 包括来自基因组总 DNA 或细胞总 RNA 的序列 )。引物长度一般为 14 到 40 个核苷酸， 但其 长度范围也可从 10 个核苷酸到数百个核苷酸。通用 PCR 技术描述于， 例如 《PCR 引物 ： 实验室手册》 (PCR Primer ： A Laboratory Manual)， Dieffenbach 和 Dveksler 编， 冷泉港实验 室出版社， 1995。当使用 RNA 作为模板源时， 可使用逆转录酶来合成互补 DNA(cDNA) 链。连 接酶链式反应、 链取代扩增、 自身维持序列复制或基于核酸序列的扩增也可用于获得分离 的核酸。参见， 例如， Lewis(1992)Genetic Engineering News 12 ： 1； Guatelli 等， (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 ： 1874-1878 ； 和 Weiss(1991)Science 254 ： 1292。
分离的核酸也可被化学合成为单一核酸分子 ( 例如， 使用亚磷酰胺技术以 3’ 到 5’ 方向自动合成 DNA) 或一系列寡核苷酸。例如， 可合成含有所需序列的长的一对或多对长寡 核苷酸 ( 例如， ＞ 100 个核苷酸 )， 其中每对含有短的互补性区段 ( 例如， 约 15 个核苷酸 )， 如此当寡核苷酸对退火时可形成双螺旋。 DNA 聚合酶用于延伸该寡核苷酸， 每对寡核苷酸得 到一种双链核酸分子， 然后这些核酸分子可连接进载体。
分离的核酸 ( 例如编码变体 NP 的核酸 ) 也可通过诱变获得。例如， 可采用标准技 术， 包括通过 PCR 的寡核苷酸定向诱变和 / 或定点诱变， 来突变参考序列。参见， 《分子生物 学方法速览》 (Short Protocols in Molecular Biology)， 第八章， 格林联合出版社和约含 韦利森出版社 (Green Publishing Associates and John Wiley & Sons)， Ausubel 等编， 1992。本文提供了变体 NP 的非限制性例子。 本申请文件还描述了编码除 ANP、 BNP、 CNP、 DNP 或者其嵌合体或变体之外的 NP 的 示例性核酸分子。可获得编码 NP 的核酸分子或其互补核酸的核苷酸序列的来源包括通过 本领域已知方法可从中获得 cDNA 的任何真核来源的总 RNA 或聚 A+ RNA， 包括爬虫类 ( 例 如， 蛇 ) 或哺乳动物 ( 例如， 人、 大鼠、 小鼠、 犬、 牛、 马、 绵羊、 山羊或猫 ) 细胞来源。本文提 供的核酸分子的其他来源包括任何真核细胞来源的基因组文库， 包括上述哺乳动物来源。
可采用标准方法鉴定和分离编码天然 NP 的核酸分子， 例如 Sambrook 等， 《分子克 隆实验室手册》 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual)， 冷泉港实验室出版社， 纽约 (1989)。例如， 逆转录酶 PCR(RT-PCR) 可用来从含有感兴趣 RNA 序列的分离 RNA( 例如， 从 人体组织分离的总 RNA) 中分离和克隆 NP cDNA。鉴定、 分离和克隆 NP cDNA 的其他方法包 括， 例如， 筛选 cDNA 文库。
本发明也提供含有例如上述核酸的载体。文中使用的 “载体” 是其中插入其它 DNA 片段能复制该插入片段的复制子， 例如质粒、 噬菌体或粘粒。 “表达载体” 是含有一条或多 条表达控制序列的载体， “表达控制序列” 是控制与调节其它 DNA 序列的转录和 / 或翻译的 DNA 序列。
在本文提供的表达载体中， 核酸 ( 例如， 编码 NP， 如 CD-NP 的核酸 ) 可以操作性连 接于一个或多个表达控制序列。文中使用的 “操作性连接” 指引入遗传构建物， 从而表达控 制序列可有效地控制感兴趣的编码序列的表达。表达控制序列的例子包括启动子、 增强子 和转录终止区域。启动子是由 DNA 分子的一个区域组成的表达控制序列， 该区域通常在转 录起点的上游 100-500 个核苷酸内 ( 一般接近 RNA 聚合酶 II 的起始位点 )。为使编码序列 受控于启动子， 需要将多肽翻译读框的翻译起始位点置于启动子下游 1 到约 50 个核苷酸之 间。增强子能在时间、 位置和水平方面提供表达特异性。与启动子不同， 增强子在离转录位 点不同距离的位置均可起作用。增强子也可位于转录起始位点的下游。当 RNA 聚合酶能将 编码序列转录为 mRNA， 然后该 mRNA 可翻译成由编码序列编码的蛋白质时， 该编码序列就是 “操作性连接” 于并 “受控” 于细胞的表达控制序列。因此， 表达载体可用于制造抗体和其他
多价分子。
合适的表达载体包括 ( 不限于 ) 质粒和病毒载体， 例如得自噬菌体、 杆状病毒、 烟 草花叶病毒、 疱疹病毒、 巨细胞病毒、 逆转录病毒、 痘病毒、 腺病毒和腺相关病毒的载体。许 多载体和表达系统可从以下公司市售获得， 例如诺华基 (Novagen， Madison， WI)、 克隆泰克 (Clontech， Palo Alto， CA)、 司查塔基 (Stratagene， La Jolla， CA) 和英杰 / 生命技术公司 (Invitrogen/Life Technologies， Carlsbad， CA)。
表达载体可含有标记序列， 该序列设计为有助于随后对表达的核酸序列进行操作 ( 例如， 纯化或定位 )。标记序列， 例如绿色荧光蛋白 (GFP)、 谷胱甘肽 S- 转移酶 (GST)、 聚 TM 组氨酸、 c-myc、 血凝素或 Flag 标记 ( 柯达 (Kodak， New Haven， CT)) 序列通常和编码的多 肽一起作为融合体表达。这种标记可被插入多肽内的任何位置， 包括羧基或氨基末端。
也提供了含有载体的宿主细胞。 术语 “宿主细胞” 包括可引入重组表达载体的原核 或真核细胞。文中， “转化” 和 “转染” 包括通过任何一种技术将核酸分子 ( 例如， 载体 ) 引 入细胞。 尽管不局限于具体技术， 这些技术中的许多是本领域熟知的。 可用核酸转化原核细 胞， 例如电穿孔或氯化钙介导的转化。通过包括， 例如， 磷酸钙共沉淀、 DEAE- 葡聚糖 - 介导 的转染、 脂转染、 电穿孔或显微注射在内的技术可将核酸转染入哺乳动物细胞。 转化和转染 宿主细胞的合适方法可见 Sambrook 等， 《分子克隆实验室手册》 ( 第二版 )， 冷泉港实验室， 纽约 (1989)， 转化和 / 或转染试剂是可购得的， 例如， LIPOFECTIN ( 英杰公司 ) ； FUGENE ( 罗氏 (Roche， Indianapolis， IN)) ； 和 SUPERFECT ( 凯杰公司 (Qiagen， Valencia， CA))。
组合物
本文所述化合物 ( 例如， 嵌合和变体 NP， 如 CD-NP)， 或编码本文所述多肽的核酸， 可被掺入组合物给予对象 ( 例如， AMI 或 AHF 患病对象或风险对象 )。配制以及随后给予治 疗组合物的方法是本领域熟知的。剂量通常取决于对象对化合物的反应， 疗程可持续数天 到数月， 或者直到获得合适的反应。 本领域一般技术人员通常可确定最佳剂量、 给药方法和 重复率。最佳剂量可根据抗体的相对功效发生变化， 通常根据体外和 / 或体内动物模型的 EC50 来估算。含有本文提供的化合物 ( 例如， NP) 和核酸的组合物可每天、 每周、 每月或者更 长时间给予一次， 并且可以连续给予一段时间 ( 例如， 数小时、 数天或数周 )。如本文所述， 例如， NP 或含有 NP 的组合物的给药剂量可以是， 在再灌注发生时或大致发生时每千克体重 至少约 0.01ng NP 至约 100mg NP， 或者可以在再灌注发生时或大致发生时开始给予连续输 注并持续 1-7 天 ( 例如， 剂量为约 0.01ng NP/kg/ 分钟至约 0.5μg NP/kg/ 分钟 )。
NP 和核酸可与其他分子、 分子结构、 或者化合物的混合物 ( 例如， 脂质体、 受体或 细胞靶向分子， 或者口服制剂、 局部制剂或其他制剂 ) 混合、 包封、 偶联或结合， 以帮助其摄 取、 分布和 / 或吸收。
在一些实施方式中， 组合物可含有本文提供的 NP 与药学上可接受的载体的组合。 药学上可接受的载体包括， 例如， 用来将抗体递送给对象的药学上可接受的溶剂、 悬浮剂或 任何其他药物惰性载体。药学上可接受的载体可以是液体或固体， 并且可以根据预定给药 方式进行选择， 以便在与一种或多种治疗化合物和给定的药物组合物的任何其他组分组合 提供所需体积、 硬度、 以及其他恰当的运送和化学特性。典型的药学上可接受的载体包括， 但不限于 ： 水； 盐水 ； 粘合剂 ( 例如， 聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素 ) ； 填料 ( 例如， 乳 糖或葡萄糖， 以及其他糖类、 明胶或硫酸钙 ) ； 润滑剂 ( 例如， 淀粉、 聚乙二醇或乙酸钠 ) ； 崩解剂 ( 例如， 淀粉或淀粉羟乙酸钠 ) ； 和润湿剂 ( 例如， 十二烷基硫酸钠 )。
含有本文所述分子的药物组合物可通过多种方法给予， 取决于是否需要局部或全 身治疗。给药可以是， 例如， 肠胃外给药 ( 例如， 通过皮下、 鞘内、 心室内、 肌内或腹膜内注 射， 或通过静脉内 (i.v.) 滴注 ) ； 口服给药 ； 局部给药 ( 例如， 头皮、 舌下、 眼、 或鼻内 ) ； 或 肺部给药 ( 例如， 通过吸入或喷洒粉末或气溶胶 )， 或者可以将这些方法组合。给药可以是 快速的 ( 例如， 通过注射 ) 或者可以在一段时间内发生 ( 例如， 通过缓慢输注或给予缓释制 剂 )。
供肠胃外、 鞘内或心室内给药的组合物和制剂包含无菌水溶液 ( 例如， 无菌生理 盐水 )， 还可含有缓冲剂、 稀释剂和其他合适添加剂 ( 例如， 渗透增强剂、 载体化合物和其他 药学上可接受的载体 )。
供口服给药的组合物和制剂包括， 例如， 粉末或胶囊、 用水或非水介质配制的悬浮 液或溶液、 胶囊、 囊剂、 或片剂。这种组合物也可掺入增稠剂、 调味剂、 稀释剂、 乳化剂、 分散 助剂或粘合剂。
供局部给药的制剂包括， 例如， 有菌和无菌水溶液、 用常规溶剂如醇配制的非水性 溶液、 或者用液态或固态油基料配制的溶液。 这种溶液也可含有缓冲剂、 稀释剂和其他合适 的添加剂。 供局部给药的药物组合物和制剂可包括透皮贴、 软膏剂、 洗剂、 霜剂、 凝胶、 滴剂、 栓剂、 喷雾剂、 液体、 和粉末。 常规药物载体、 水性、 粉末状或油性基料、 增稠剂等可能是有用 的。
药物组合物包括， 但不限于， 溶液、 乳剂、 水性悬浮液和含脂质体的制剂。 这些组合 物可从各种组分制造， 例如其中包括预成型液体、 自乳化固体和自乳化半固体。 乳剂因为易 于配制以及易于溶解、 吸收和生物利用度好而尤其适用于口服递送治疗组合物。脂质体因 为其特异性和长效性而特别有用。
本文提供的组合物可含有任何药学上可接受的盐、 酯、 或这些酯的盐、 或者在给予 对象后能够提供 ( 直接或间接 ) 相关化合物 ( 如 NP) 的生物活性代谢物或其残基的任何其 他化合物。因此， 例如， 本申请文件描述了 NP 的药学上可接受的盐、 前药以及该前药的药学 上可接受的盐， 以及其他生物等价物。前药是被制成非活性形式并在体内或细胞内在内源 性酶或者其他化学物质和 / 或条件的作用下转化成其活性形式 ( 即， 药物 ) 的治疗剂。 术语 “药学上可接受的盐” 表示用于本文提供的方法的 NP 的生理学上和药学上可接受的盐 ( 即 保持亲代 NP 所需生物活性但没有不需要的毒性的盐 )。药学上可接受的盐的例子包括， 但 不限于， 与阳离子 ( 例如， 钠、 钾、 钙、 或聚胺如精胺 ) 形成的盐 ； 与无机酸 ( 例如， 盐酸、 氢溴 酸、 硫酸、 磷酸或硝酸 ) 形成的酸加成盐 ； 与有机酸 ( 例如， 乙酸、 柠檬酸、 草酸、 棕榈酸或延 胡索酸 ) 形成的盐 ； 以及和元素阴离子 ( 例如， 溴离子、 碘离子或氯离子 ) 形成的盐。
组合物还可含有通常用于药物组合物的其他辅助组分。因此， 组合物还可包含相 容的药物活性材料， 如止痒药、 收敛药、 局部麻醉药或抗炎药， 或用于物理配制组合物各种 剂型的其他材料， 如染料、 调味剂、 防腐剂、 抗氧化剂、 遮光剂、 增稠剂和稳定剂。此外， 组合 物可与辅料混合， 所述辅料例如润滑剂、 防腐剂、 稳定剂、 润湿剂、 乳化剂、 影响渗透压的盐、 缓冲剂、 着色剂、 调味剂、 渗透增强剂和芳香性物质。然而， 当添加时， 这种材料应不会影响 组合物内其他组分的生物活性。
本文所述的药物制剂一般采取单位剂型， 可按照制药工业中熟知的方法制备。这种技术包括使活性剂 ( 即抗体 ) 与所需药物载体混合的步骤。 通常， 制备制剂时可将活性成 分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀地充分混合， 然后如果需要再使产品成型。如 果需要， 制剂可以是无菌的， 前提是灭菌方法不会影响制剂内所含分子的功效。
降低或抑制心脏重构的方法
本申请文件还提供了本文所述化合物 ( 例如， NP) 在治疗例如 AHF 和 AMI 以及在 抑制或降低心脏重构中的应用。因此， 本文提供的化合物和核酸分子可给予哺乳动物 ( 例 如， 人或非人哺乳动物 ) 以降低或抑制例如在 MI 之后可能发生的心脏重构。在一些实施方 式中， 术语 “给予” 在文中包括开出被哺乳动物使用以降低或抑制心脏重构的化合物或组合 物的处方。在一些实施方式中， 例如， 本文提供的 NP 或组合物可给予被诊断患有 AMI 的哺 乳动物。所述组合物或 NP 可采取任何合适剂量， 所述剂量取决于包括但不限于所选药剂、 疾病、 预防或治疗目的在内的各种因素。给药可以是局部给药或全身给药。
在一些实施方式中， NP 或含有 NP 的组合物的给药剂量为每千克体重至少约 0.01ng NP/kg 至约 100mg NP/kg( 例如， 约 10ng NP/kg 至约 50mg NP/kg， 约 20ng NP/kg 至 约 10mg NP/kg， 约 0.1ng NP/kg 至约 20ng NP/kg， 约 3ng NP/kg 至约 10ng NP/kg， 或约 50ng NP/kg 至约 100μg/kg)， 但其他剂量也可能提供有益结果。 在一些情况下， 含有 NP 如 CD-NP 或其变体的组合物可在再灌注开始时或大致开始时 ( 即， 在闭塞的动脉打开时 ) 作为连续 静脉输注给予， 并持续 1-7 天 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6 或 7 天 )。这种组合物的给药剂量可以 是， 例如， 约 0.1ng NP/kg/ 分钟至约 500ng NP/kg/ 分钟 ( 例如， 约 0.5ng NP/kg/ 分钟， 约 1ng NP/kg/ 分钟， 约 2ng NP/kg/ 分钟， 约 3ng NP/kg/ 分钟， 约 5ng NP/kg/ 分钟， 约 7.5ng NP/kg/ 分钟， 约 10ng NP/kg/ 分钟， 约 12.5ng NP/kg/ 分钟， 约 15ng NP/kg/ 分钟， 约 20ng NP/kg/ 分钟， 约 25ng NP/kg/ 分钟， 约 30ng NP/kg/ 分钟， 约 50ng NP/kg/ 分钟， 约 100ng NP/kg/ 分钟， 或约 300ngNP/kg/ 分钟 )。在一些实施方式中， 含有 NP 的组合物可以在再灌 注之前 ( 例如， 再灌注之前约 1 小时 )， 作为一个或多个单个剂量给予或作为连续输注 ( 从 再灌注之前约 1 小时开始 ) 给予。例如， 可以在再灌注之前约 1 小时、 约 45 分钟、 约 30 分 钟或约 15 分钟时开始给予组合物。在一些情况下， 本文提供的含有 NP 的组合物可在再灌 注之后 ( 例如， 在再灌注发生约 10 小时内 )， 作为一个或多个单个剂量给予或作为连续输 注 ( 在再灌注发生约 10 小时内开始 ) 给予。例如， 可在再灌注发生后约 1 小时、 约 2 小时、 约 3 小时、 约 4 小时、 约 5 小时、 约 6 小时、 约 7 小时、 约 8 小时、 约 9 小时或约 10 小时给予 组合物。
在一些实施方式中， NP 或含有 NP 的组合物可在第一时期通过第一途径 ( 例如， 静 脉内 ) 给予， 然后在第二时期通过另一途径 ( 例如， 皮下 ) 给予。例如， 含有 NP 的组合物可 静脉内给予哺乳动物 ( 例如， 人 )， 给药剂量为约 0.1ng NP/kg/ 分钟至约 300ng NP/kg/ 分 钟 ( 例如， 约 1ng NP/kg/ 分钟至约 15ng NP/kg/ 分钟， 约 3ng NP/kg/ 分钟至约 10ng NP/ kg/ 分钟， 或约 10ng NP/kg/ 分钟至约 30ng NP/kg/ 分钟 )， 为期 1-7 天 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6 或 7 天 )， 然后皮下给予哺乳动物， 给药剂量为约 10ng NP/kg/ 天至约 100ng NP/kg/ 天 ( 例 如， 约 10ng NP/kg/ 天， 约 20ng NP/kg/ 天， 约 25ng NP/kg/ 天， 约 30ng NP/kg/ 天， 约 50ng NP/kg/ 天， 或约 100ng NP/kg/ 天 )， 为期 5-30 天 ( 例如， 7、 10、 14、 18、 21、 24 或 27 天 )。
文中提供的方法可包括给予哺乳动物有效量的 NP( 例如， 嵌合或变体 NP) 或编码 NP 的核酸， 或有效量的含有这种分子的组合物。文中， 术语 “有效量” 是足以使哺乳动物受者体内表示心脏重构降低和 / 或肾脏保护的参数中的一个或多个 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个 ) 改变至少 10％ ( 例如， 10％， 15％， 20％， 25％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 75％， 80％， 85％， 90％， 95％， 99％， 或 100％ ) 的分子或组合物的用量。例如， 本文提供的 NP 的有效量是能够使射血分数、 GFR、 UNaV 或 UV 提高至少 10％， 和 / 或能够使 PRA、 LV 质 量、 CF 增殖、 PWCP、 RAP、 MAP、 醛固酮水平、 LV 肥大、 心室纤维化、 LV 收缩末期内径、 PFRNa 或 DFRNa 降低至少 10％的量， 和 / 或能够导致心脏负载降低的用量。在一些实施方式中， 本发 明方法可包括给予哺乳动物一定用量使表示心脏重构降低和 / 或肾脏保护的一个或多个 参数改变至少 50％的 NP 或组合物。
在一些实施方式中， 例如， 本文提供的 NP 的 “有效量” 可以是， 与给予 NP 之前或未 给予 NP 的哺乳动物中的参数水平 ( 例如， 在之前的 MI 发作中观察到的参数水平 ) 相比， 使 经治疗的哺乳动物的 PRA 和 MAP 降低至少 10％以及 GFR 和 UV 升高至少 10％的用量。这种 参数可以通过下述实施例中描述的方法测定。
以下实施例进一步描述了本发明， 这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范 围。 实施例 实施例 1- 材料和方法
多肽合成 ： 基于已知的 DNP 和 CNP 序列合成两种肽。首先， 合成 DNP 的线性 15-AA C- 末端序列 (PSLRDPRPNAPSTSA ； SEQ ID NO ： 2； 图 1)。该肽被称为 “C- 末端” 。然后， 合成 CNP(SEQ ID NO ： 1； 图 1) 和 DNP C- 末端的嵌合体 (GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPST SA ； SEQ ID NO ： 3)。 该 37-AA 嵌合肽被称为 “CD-NP” 。 利用梅约蛋白核心设备 (Mayo Protein Core Facility)， 采用固相方法在 ABI 431A 肽合成仪 (PE 生物系统公司 (PE Biosystems， Foster City， CA)) 中在预装载 N-Fmoc-L- 氨基酸 (SP 公司 (SynPep， Dublin， CA)) 的王氏 树脂上合成这两个肽。将各个氨基酸和连接于树脂的肽在 1- 甲基 -2- 吡咯烷酮 (NMP) 中 偶联 40 分钟。每个 Fmoc 氨基酸在 HOBT/DCC 的 NMP 溶液中活化 30 分钟。Fmoc 保护基的 去保护在 10％哌啶的 NMP 溶液中进行 20 分钟， 然后与接下来的活化的氨基酸偶联。随后， 对肽进行去保护并用 82.5％三氟乙酸 (TFA)/5％水 /5％苯甲硫醚 /2.5％乙二硫醇 /5％苯 酚的混合物室温处理 2 小时从树脂上除下。每种肽在 3x50ml 冷的甲基叔丁基醚中沉淀进 行洗涤并通过反向 HPLC 纯化， 纯化采用 Jupiter C18 柱 ( 非诺尼克斯公司 (Phenomenex， Torrance， CA))， 用 0.1％ TFA/ 水以 10-70％ B 梯度洗脱 50 分钟。
在帕金埃尔默 (Perkin/Elmer)Sciex API 165 质谱仪 ( 帕金埃尔默生物系统公司 (PE Biosystems， Foster City， CA)) 上通过电喷雾离子化 (ESI) 质量分析法验证每种肽的 身份。在 50mM 碳酸氢铵 pH 8.5 缓冲液中空气氧化过夜以便在 CD-NP 中形成二硫键。
C- 末端和 CD-NP 在正常犬中的综合体内生物活性 ： 在独立的 5 组正常麻醉的犬中 进行实验。所有研究符合美国生理学会的指南并经梅约临床动物护理和使用委员会 (Mayo Clinic Animal Care and Use Committee) 批准。
在实验前一天晚上给动物口服 300mg 碳酸锂以评价节段性肾小管功能， 然后禁食 过夜。 在急性实验当天， 所有的犬用静脉注射戊巴比妥钠麻醉 (30mg/kg)。 对犬进行机械呼 吸 ( 哈佛呼吸器， 哈佛仪器公司 (Harvard Apparatus， Millis， MA))， 以 4L/ 分钟供给氧气。
切开左侧露出肾脏。进行输尿管插管定时采集尿液， 在左肾动脉周围放置标有刻度的电磁 流量探测器并与流量计 (FM 5010 型， King， NC) 相连， 以便监测肾血流量 (RBF)。最后在右 股静脉中插入两根聚乙烯管 (PE-240)， 一根用来输注菊糖， 另一根用来输注 C- 末端。在右 股动脉插管以直接测量动脉血压和采集动脉血样品。为测量接受 CD-NP 或 BNP 的组的心脏 充盈压， 以及为测量心输出量， 在右颈静脉中插入 Swan-Ganz 管 (Edwards， Mountain View， CA)。
手术准备完成之后注射初始剂量的菊糖 (ICN 生物医学公司 (ICN Biomedicals， Cleveland， OH))， 然后恒定输注 1ml/ 分钟。不加干涉让犬平衡 60 分钟。平衡期之后进行 30 分钟基线清除 ( 基线 )。之后是 15 分钟的导入期， 期间对第一组 (n ＝ 6) 以 42ng/kg/ 分钟静脉内输注 C- 末端， 之后是第二次 30 分钟的清除期 (C- 末端 )。将静脉内盐水控制在 1ml/ 分钟 (n ＝ 6) 作为 CD-NP 组的对照。在每次清除期间记录肾血液动力学和排泄反应。 对第三组输注 30 分钟三种不同浓度 (10、 50 和 100ng/kg/ 分钟 ) 的 CD-NP， 每种剂量有 15 分钟的导入期。组 4(n ＝ 6) 和组 5(n ＝ 6) 分别接受等摩尔浓度的 10 和 50ng/kg/ 分钟的 CD-NP 或 BNP。
通 过 火 焰 发 射 分 光 光 度 计 (IL943，火 焰 光 度 计，实 验 室 仪 器 公 司 (Instrumentation Laboratory， Lexington， MA)) 测量血浆和尿中的电解质， 包括锂。血 浆和尿菊糖浓度通过蒽酮法测量， GFR 通过菊糖的清除率测量。采用锂清除率技术来估算 PFRNa 和 DFRNa。PFRNa 是用以下公式计算的 ： [1-( 锂清除率 /GFR)]x100。DFRNa 是用以下 公式计算的 ： [( 锂清除率 - 钠清除率 )/ 锂清除率 ]x100。血浆和尿液的 cGMP 和血浆肾素 活性 (PRA) 用市售放射性免疫测定按照之前的描述测量。
有 关 CD-NP cGMP 生 成 和 对 人 心 脏 成 纤 维 细 胞 的 细 胞 增 殖 抑 制 的 体 外 研 究 ： 研 究 在 人 CF(SC 公 司 (ScienCell， San Diego， CA)) 内 按 照 之 前 描 述 的 方 法 (Tsuruda 等， (2002)Circ Res 91 ： 1127-1134) 进 行。 实 验 仅 采 用 1-4 代 的 细 胞。 使 细 胞 接 触 -11 -6 CD-NP(10 -10 M)15 分钟以测定 cGMP 活性。样品用竞争性 RIA cGMP 试剂盒 (PE 公司 (Perkin-Elmer， Boston， MA)) 测定。简言之， 将样品和标准品与抗 - 人 cGMP 单克隆抗体和 125 I - 抗原一起培育 18 小时。在样品中加入环 GMP 测定缓冲液并 2500rpm 离心 20 分钟。吸 出游离部分， 测定结合部分的数量和浓度。数值表示为 pmol/ml。与 ANP、 BNP、 CNP 或 ET 没 有交叉反应性， 与 cAMP、 GMP、 GDP、 ATP、 GTP 的交叉反应性＜ 0.001％。
为进行 CF 增殖研究， 1-4 代的 70-80％汇合细胞用 10-8M 心脏营养素 -1 处理 24 小 时以诱导细胞增殖。在心脏营养素 -1- 刺激的 CF 中加入浓度为 10-8M 的 CD-NP 以确定它对 细胞增殖的影响。未处理的成纤维细胞作为对照。按照说明进行比色溴脱氧尿苷 (BrdU) 细胞增殖 ELISA( 罗氏 (Roche， Indianapolis， IN))。简言之， 在 CO2 37℃培养箱内将 CF 用 BrdU 标记 2 小时。加入抗 -BrdU 并在室温反应 90 分钟。除去抗 -BrdU 并用洗涤溶液将 CF 洗涤三次。加入比色底物溶液并显色 30 分钟。在 SpectraMax 分光光度计 ( 分子装置公司 (Molecular Devices， Sunnyvale， CA)) 上测量 370nm 的吸光度。
统计分析 ： 定量研究结果用平均值 ± 标准差表示。 当采用斯氏检验比较一个组内 的两种清除率时， 以及当比较多种清除率时， 使用重复测量 ANOVA+ 事后邓奈特检验。用双 向 ANOVA+ 邦弗朗尼事后检验进行组间统计比较。P 值＜ 0.05 表示有统计显著性。
实施例 2-DNP 的 C- 末端和 CD-NP 的体内作用缺乏 DNP 核心环结构的 DNP 的 C- 末端是有利尿钠和利尿作用的 ( 图 2)。利尿钠 作用局限于肾单位的近端区段， 原因是观察到近端钠重吸收分数 (PFRNa) 降低， 说明肾单 位的该部分对这种小肽的肾作用有贡献 ( 表 2)。肾小球滤过率 (GFR)、 肾血流量 (RBF) 或 尿 cGMP 排泄没有显著改变。重要的是， 在与 C- 末端组一样接受 1ml/ 分盐水的时间对照组 中， 肾功能参数未改变。
图 3 说明了对 CD-NP 输注的体内反应。所有三种剂量的 CD-NP 都降低了肺毛细血 管楔压 (PCWP)， 而两种剂量降低了右房压 (RAP)。即便在输注高剂量 CD-NP 期间， 与这些心 脏负载降低反应相关的也是极轻微的平均动脉压 (MAP) 的降低。在正常犬中也观察到了 CD-NP 的强利尿钠和利尿反应 ( 图 4)。具体地说， 中等剂量和高剂量的 CD-NP 都提高了钠 泌尿排泄 (UNaV) 和尿流量 (UV)( 图 4)。尽管在输注高剂量 CD-NP 期间 MAP 略微降低， 但 GFR 升高了。
利尿钠作用和利尿作用与近端小管钠重吸收降低有关， 因为在输注中等剂量 CD-NP 期间 PFRNa 降低。此外， 观察到在输注中等剂量和高剂量 CD-NP 期间远端钠重吸收 分数 (DFRNa) 降低， 说明 CD-NP 也参与末端肾单位的活性 ( 图 5)。在 CD-NP 输注停止后这 些肾脏参数回归基线水平。这些作用也与输注低剂量和中等剂量 CD-NP 期间血浆肾素活性 (PRA) 受到抑制有关 ( 表 3)。输注结束后 PRA 回归基线水平。中等剂量和高剂量的 CD-NP 提高了血浆和尿液 cGMP( 表 3)。
剂量为 50ng/kg/ 分钟的 CD-NP 显著升高 GFR， 与接受等摩尔剂量 BNP 的组 GFR 没 有升高相反 ( 图 6)。重要的是， 这种剂量的 CD-NP 造成的血压降低弱于 BNP。
表2
输注 C- 末端引起的肾血液动力学反应和排泄反应
基线 GFR(ml/ 分钟 ) RBF(ml/ 分钟 ) PFRNa(％ ) DFRNa(％ ) UcGMPV(pmol/ 分钟 )
34±6 213±19 77.9±2.7 98.7±0.3 1674±213 C- 末端 44±6 198±27 71.0±2.6* 97.8±0.5 2275±231数据表示为平均值 ±SE ； C- 末端， 以 42ng/kg/ 分钟输注 DNP 的 C- 末端 (n ＝ 6) ； GRF， 肾小球滤过率 ； RBF， 肾血流量 ； PFRNa， 近端尿重吸收分数 ； DFRNa， 远端尿重吸收分数 ； UcGMPV， 尿 cGMP 排泄 ； * 对比基线 P ＜ 0.05。
表3
正常动物对输注 CD-NP 的神经体液反应
数据表示为平均值 ±SE ； CD-NP 10， 以 10ng/kg/ 分钟输注 CD-NP ； CD-NP 50， 以 50ng/kg/ 分钟输注 CD-NP ； CD-NP 100， 以 100ng/kg/ 分钟输注 CD-NP(n ＝ 8， 高剂量组 n ＝ * 6) ； PcGMP， 血浆 cGMP ； UcGMPV， 尿 cGMP 排泄 ； PRA， 血浆肾素活性 ； 对比基线 P ＜ 0.05。
实施例 3- 心脏成纤维细胞中 CD-NP 介导的 cGMP 生成和增殖抑制
培养的人 CF 中的体外研究证实， CD-NP 以剂量依赖性方式激活 cGMP( 图 7A)。此 外， 当 与 CNP、 BNP 和 DNP 比 较 时， CD-NP 生 成 的 cGMP 类 似 于 CNP 且 显 著 (p ＜ 0.05) 高 于 10-6M 的 DNP 和 BNP。然后用促纤维化和肥大细胞因子心脏营养素 -1 进行实验来确定 CD-NP 是否具有抗增殖作用。这种细胞因子是 CF 的强力激活剂， 并在例如 AMI 和心力衰 竭等状态下活化 (Jougasaki 等， (2000)Circulation 101 ： 14-17 ； Talwar 等， (2002)Clin Sci(Lond)102 ： 9-14 ； 和 Tsuruda 等， (2002)Circ Res 90 ： 128-134)。由 BrdU 摄取 (DNA 合 成和细胞增殖的度量 ) 可以估测 CD-NP 在人 CF 中抑制心脏营养素 -1 诱导的细胞增殖 ( 图 7B)。
实施例 4- 评价 CD-NP 对 MI 后大鼠 LV 质量的影响的体内研究
通过对 Wistar 大鼠 (150-250g) 进行冠状动脉左前降支结扎造成心肌梗死 (MI)， 并在每只大鼠的背部皮下空间插入迷你渗透泵 (2ML2 型 Alzet 渗透泵 )。以 1.7x10-7g/kg/ 分钟剂量皮下给予 CD-NP 2 周。根据急性实验前和 MI 后三周的超声心动图估算 LV 质量。 用 CD-NP 处理导致 MI 后三周的 LV 质量相比对照 MI- 未处理组降低 ( 图 8)。具体地说， MI 组的 LV 质量为 1.351±0.03764(N ＝ 10)， 而 MI+CD-NP 组的 LV 质量为 1.150±0.03651(N ＝6； p ＝ 0.0031)。
实施例 5-CD-NP 和 CNP-C 的体内作用
按照国立卫生研究院关于实验动物护理和应用指南的规定在雄性杂种犬 (n ＝ 25) 中进行动物研究。在实验前一晚对每只犬禁食， 允许随意饮水并口服给予 300mg 碳酸 锂以便第二天评价肾管功能。用戊巴比妥钠 ( 静脉内 6-20mg/kg 诱导， 静脉内 5-15mg/kg/ 小时维持 ) 和芬太尼 (0.04-0.12mg/kg i.v.， 0.04-0.18mg/kg/ 小时维持 ) 麻醉犬， 插管 并以 5L/ 分钟 O2( 潮气量 15mL/kg， 12 次 / 分钟 ) 进行机械呼吸 ( 哈佛仪器公司 )。在股 动脉中插管以监测血压和采血样， 并在股静脉中插管以输注菊糖和生理盐水。在隐静脉中 插管进行肽输注。用连有气囊的热稀释导管 (EL 公司 (Edwards Lifesciences， Irvine， CA)) 来监测血液动力学同时通过体侧切口暴露左肾， 并在输尿管中插管以定时采集尿液。 将电磁流量探测器置入肾动脉以测量肾血流量 (Burnett 等， (1984)Am J Physiol 247 ： F863-866)。推注根据体重调整过的菊糖， 然后进行输注 (1mL/ 分钟 ) 以使血浆水平达到 40-60mg/dL(Burnett 等， (1984) 同上 ； Chen 等， (2005)Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288 ： R1093-1097 ； 和 Margulies 等， (1991)J Clin Invest 88 ： 1636-1642)， 以便 通过菊糖清除率测量 GFR。
60 分钟的平衡期之后获得 30 分钟输注前清除率。之后是 75 分钟连续静脉内 (i.v.) 输注 CD-NP(50ng/kg/ 分钟 )(n ＝ 10) 或等摩尔浓度的 CNP(n ＝ 9)。连续输注期包 括 15 分钟导入和两次 30 分钟清除， 随后是 30 分钟的洗出和输注后清除。在 3 只不同的犬 中测试了连续静脉内输注 75 分钟陷阱蛋白 CNP-C(50ng/kg/ 分钟 )。列出了三个 30 分钟清 除的数据 ( 输注前、 输注 30 分钟时， 以及输注 60 分钟时 )。
血浆和尿 cGMP 水平通过放射性免疫测定测量 (RIA ； Steiner 等， (1972)J Biol Chem 247 ： 1106-1113)。测量血浆肾素活性 (Haber 等， (1969)J Clin Endocrinol Metab 29 ： 1349-1355)、 血管紧张素 II(Luchner 等， (1996)Hypertension 28 ： 472-477) 和醛固酮 (Sancho 和 Haber(1978)J Clin Endocrinol Metab 47 ： 391-396)。 血浆和尿的锂水平通过 火焰发射分光计 ( 型号 357， 实验室仪器公司 ) 测量以评估肾小管对钠的处理 (Steiner 等， 同上 )。
为评估分离的肾小球中的 cGMP 活性， 犬 (n ＝ 3) 用戊巴比妥钠麻醉， 立即取出肾 脏并按照之前描述的方法分离肾小球 (Supaporn 等， (1996)Kidney Int 50 ： 1718-1725)， 这种方法基于 Chaumet-Riffaud 等描述的方法 ((1981)Am J Physiol 241 ： F517-524)， 基 本不作修改。为量化 cGMP 对研究肽的反应， 将等分肾小球 (300μL， 悬浮于 Krebs 缓冲液 ) -5 与 CD-NP 或 CNP( 终浓度 10 M) 一起 37℃培育 10 分钟 ( 在预培育 10 分钟后 )， 培育时存在 异丁基甲基黄嘌呤 (0.3mM)， 终体积为 500μL。对照包含相同的组合物， 但用 Krebs 缓冲液 代替悬浮于 Krebs 缓冲液的肾小球。加入 300μL 冰冷的三氯乙酸 (TCA， 终浓度 6.6％ ) 中 止反应并将培育物离心。用醚萃取 800μL 上清液等分样品用于 cGMP 测定 (Steiner 等， 同 上； 和 Supaporn 等， 同上 )， 其余上清液用 1N NaOH 中和并通过蛋白质测定 (BCA 蛋白质测 定， 皮尔斯生物技术公司 (Pierce Biotechnology， Rockford， IL)) 分析。对用 NPR-A 拮抗 剂 A71915 10( 终浓度 1μM) 预处理的分离的肾小球重复上述过程。将结果折算成蛋白质 水平并用 fmol/μg 表示。
CD-NP( 瑞士克林纳法公司 (Clinalfa，Switzerland)) 和 CNP( 菲尼克斯制药公司 (Phoenix Pharmaceuticals， Inc.， Belmont， CA， USA))( 图 1) 用生理盐水重 建。 检测静脉内连续输注 75 分钟给予的 CD-NP(50.0ng/kg/ 分钟 ； 或 13.35pmol/kg/ 分钟 ) 以及等摩尔剂量的 CNP(29.3ng/kg/ 分钟 )。陷阱蛋白 CNP-C 定制合成 ( 图 1)。 这些体内研究证实 CD-NP 显著激活利尿钠肽第二信使 cGMP， 血浆和尿排泄以及肾 脏本身的净肾生成大幅升高证明了这一点， 这与对 CNP 的反应明显不同 ( 图 9A)。 近端和远 端钠重吸收分数的降低证明较强的利钠作用同时定位于近端和远端小管 ( 表 4)， 用 CD-NP 观察到增强的 GFR， 但 CNP 则没有 ( 图 9B)。 任一组均未检测到平均动脉压显著改变 ( 表 5)。 CD-NP 降低了右房压和肺毛细血管楔压， 但 CNP 不能 ( 表 5)。CD-NP 显著抑制 PRA 和血管紧 张素 II(ANG II) 水平， 而 CNP 组的改变在统计学上不显著 ( 表 6)。因此， DNP 的 C- 末端与 成熟 CNP 融合将 CNP 转变成一种具有肾脏活性、 能降低心脏负载的肽， 该肽能抑制肾素 - 血 管紧张素系统 (RAS) 但不会降低动脉压。
为 证 实 体 内 肾 和 RAS 调 节 作 用 是 否 一 定 需 要 DNP 的 C- 末 端， 设计了一种将 CNP 的 N- 末端氨基酸序列融合入 CNP 的空白 C- 末端位置的转化的 CNP。这种多肽被称 为 CNP-C， 由全长 22- 氨基酸 CNP 和融合于 CNP C- 末端的 N- 末端 5 氨基酸复制体构成 (GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCGKSLG ； SEQ ID NO ： 4)。该肽的融合不会导致血浆 cGMP、 尿 cGMP
排泄、 利尿作用、 利钠作用、 GFR、 PRA 或 ANG II 的任何显著改变。 输注 60 分钟时肺毛细血管 楔压 (4.3±0.8 到 3.4±0.8mmHg) 和平均动脉压 (132±6 到 128±5mmHg) 相比基线略微降 低 (P ＜ 0.05)。因此， DNP 的 C- 末端专门负责将 CNP 转变成一种具有肾脏活性和 RAS- 调 节作用的肽， 而 CNP-C 不能增加肾功能或抑制 RAS。 这些数据显示 CNP 转化将来有可能包括 将 CNP 与非 -CNP 肽序列融合。
尽管 NPR-B 受体存在于肾脏内， 但它们与肾小球滤过率或钠排泄的调节作用无 关。其实， 这种与利尿钠肽有关的肾脏作用与 NPR-A 受体相关。从犬分离肾小球以确定 CD-NP 的肾脏作用是否与 NPR-A(ANP、 BNP 和 DNP 的受体 ) 有关， 认为与 CNP 融合的 DNP 的 N- 末端将唯一激活肾小球中的 cGMP， NPR-A 拮抗剂的药理性拮抗作用能够将其中止。在 -5 分离的犬的肾小球中， CD-NP(10 M) 激活 cGMP 的程度大于对照安慰剂。在等摩尔浓度时 -5 (10 M)， CD-NP 激活 cGMP 的程度大于 CNP( 图 10E)。用 NPR-A 拮抗剂 (Sancho 和 Haber， 同 上 )(1μM) 预处理导致 cGMP 反应减弱， 证明 CD-NP 在肾脏中也参与 NPR-A 的活化。
实施例 6- 人临床试验结果
以下在犬类和啮齿类中进行的毒理学研究验证了 CD-NP 的安全性， 首轮人临床试 验正在正常人类志愿者中进行。
研究方案 ： 按照赫尔辛基宣言及修改条款、 美国食品药品管理局关于优良临床 试验规范的原则、 以及国际药品注册协调会议的指南进行 CD-NP 的人临床试验。该临床 试验包括两个阶段 ： 标签公开连续按比例升高剂量研究 ( 阶段 1) 和随机的双盲安慰剂 (PLB)- 对照研究 ( 阶段 2)。 在阶段 1 中， 给剂量递增研究 (10、 17.5 或 25ng/kg/ 分钟， i.v.， 4 小时 ) 招募三组、 每组 4 名对象。在阶段 2 中， 对 10 名对象随机进行双盲研究 (CD-NP 和 安慰剂 PLB 的比例为 6 ∶ 4)， 该研究评价了 CD-NP 和 PLB(i.v.， 4 小时 ) 的最大耐受剂量 (MTD， 在阶段 1 中确定 )。
主要的选择标准包括 ： 1)18-60 岁的健康男性、 绝经后女性或手术绝育女性 ； 2) 2 BMI 范围为 18-34kg/m ； 3) 能够有效交流 ； 4) 没有显著疾病或异常 ； 5)12- 导联心电图正 常； 6) 非吸烟者， 定义为在过去 6 个月内不吸烟 ； 和 7) 充分告知研究的性质和风险， 并在接 受研究药物之前得到书面知情同意书。
主要的淘汰标准包括 ： 1) 已知对 CD-NP 或其组分、 奈西立肽、 其他利尿钠肽、 或相 关化合物过敏或敏感 ； 2) 怀孕或哺乳的女性 ； 3) 任何疾病或症状 ( 内科或外科症状 )， 在研 究人员看来这些疾病或症状可能涉及血液学、 心血管、 肺部、 肾脏、 胃肠道、 肝脏或中枢神经 系统 ； 或者是可能影响研究药物吸收、 分布、 代谢或排泄， 或者可能提高对象风险的其他征 状； 4) 存在临床上显著的异常实验值 ； 5) 乙肝 ( 乙肝表面抗原 HbsAg)、 丙肝 ( 抗 HCV， 丙肝 抗体 ) 或 HIV( 抗 -HIV 1/2) 筛选呈阳性 ； 6) 在参与研究之前的 30 天内接受过试验药 ； 6) 在给予第一剂量任何研究相关治疗之前的 1 周内或 5 个半衰期之内接受过任何药物治疗。 对于任何已知会诱导或抑制肝脏药物代谢的药物这种淘汰可延伸至 4 周。在第一次给予任 何研究相关处理之前的至少 5 个半衰期内尤其禁止使用非甾类抗炎药、 磺胺类、 丙磺舒或 其他已知会改变肾或肾小管功能的药物 ； 7) 在给药前 48 小时内或在住院期间的饮酒 ； 8) 包括乙醇、 可卡因、 四氢大麻酚 (THC)、 巴比妥类、 苯丙胺类、 苯二氮卓类和阿片类在内的尿 液药物筛选呈阳性 ； 9) 在至少 2 年内有酒精滥用史、 使用违禁药品、 明显精神疾病、 对任何 阿片样物质的生理依赖性、 或任何药物滥用或成瘾史 ； 10) 献血困难史 ； 和 11) 在招募前 45天内使用捐赠的血液或血液产品。
数据分析 ： 肾、 神经体液和血液动力学数据表示为平均值 ±SEM。肽输注开始后 16-45 分钟以及 46-75 分钟的清除率分别用 “30 分钟” 和 “60 分钟” 表示。在各个组中， 采 用重复测量单向方差分析 (ANOVA)、 然后用适用的事后邓奈特多重比较检验来比较肽输注 30 和 60 分钟以及输注后的参数与输注前的值 (Chen 等， 同上 ； 和 Cataliotti 等， (2004) Circulation 109 ： 1680-1685)。采用双向 ANOVA 然后通过邦弗朗尼事后检验进行组间比 较 (Chen 等， 同上 ； 和 Cataliotti 等， 同上 )。统计显著性定义为 P ＜ 0.05。用 GraphPad Prism 4(GraphPad 软件公司， San Diego， CA) 对犬的数据进行统计分析。首次人临床试验 的统计分析采用统计分析软件 ( 版本 9) 进行。在临床试验的随机双盲阶段分析 CD-NP 组 和安慰剂 (PLB) 组的肾、 血液动力学和神经体液数据。采用参数和非参数检验进行组内比 较 ( 输注终点与基线的比较 ) 和组间比较 ( 基线比较和输注终点比较 )， 如表 7 所示。
结果 ： 确定最高耐受剂量之后给予 CD-NP(17.5ng/kg/ 分钟 ) 为期 4 小时， 并与安 慰剂进行比较。CD-NP 升高了血浆 cGMP、 尿 cGMP 排泄和尿钠排泄 ( 图 10A-10C 和表 7)。 与基线相比， CD-NP 组的尿流量升高 (1.1±0.2 到 2.3±0.4mL/ 分钟 ； PLB 1.3±0.2 到 1.6±0.4mL/ 分钟 )。两组间的平均动脉压 ( 图 10D) 和 GFR 没有差别。CD-NP 抑制血浆醛 固酮， 从 21.9±2.7 变为 9.5±3.2ng/dL(P ＜ 0.001)。
这些数据证实， 静脉舒张剂 CNP 可被转化成对血压影响甚微的肾 - 增强、 RAS- 抑 制、 并且心脏负载降低的肽， 使其成为对于治疗 AHF 有效的有吸引力的下一代治疗剂。这些 研究同时提供了两个原则 ： (1) 在 CNP 的空白 C- 末端添加 C- 末端氨基酸序列必须是特异 性的， 因为融合 DNP 的 C- 末端之外的氨基酸序列 ( 如 CNP 的 N- 末端 ) 是无效的 ； 和 (2) 添 加 DNP 的 C- 末端将 CNP 转化成不仅是 NPR-B 激活剂， 该多肽在肾脏中还激活 NPR-A。此外， 这些数据将动物和体内研究延伸至首次人体研究， 确立了 CD-NP 在人中能激活 cGMP 途径、 提高钠排泄、 以及抑制醛固酮， 同时与内源性天然肽 CNP 相比对血压的影响甚微的概念。
该研究还表明， CNP 可被转化成有效的治疗肽， 与 CNP 不同， 这种肽是利尿钠和抑 制醛固酮的， 并且与 CNP 一样几乎不会降低血压， 同时能降低心脏负载。使用具有 CNP 的 N- 末端的陷阱剂为将来的嵌合设计提供了一种思路， 并强调了特异性增加 CNP 的 C- 末端激 活肾脏中的 NPR-A。总之， DNP 的 C- 末端与全长 22-AA 肽 CNP 融合将 CNP 转化成了一种与 治疗心肾疾病综合征相关的降低心脏负载的、 肾素抑制和肾功能增强的设计肽。
表4
CD-NP 或 CNP 静脉输注引起的肾血液动力学和排泄反应
平均值 ±SEM。与输注前 ( 前 -I) 的组内比较 ( 平均值 ±SE， ) 以及组间 ‖ 比较 ( ＜ 0.001 )。GFR， 肾小球滤过率 ； RV-R， 肾血管阻力 ； I， 输注 ； PFRNa， 近端 Na+ 重吸收分数 ； DFRNa， 远端 Na+ 重吸收分数。
表5
CD-NP 或 CNP 静脉输注引起的心血管血液动力学反应
值为平均值 ±SEM。与输注前 ( 前 -I) 的组内比较 ( 平均值 ±S.E.M.， P ＜ 0.05*， ) 以及组间比较 (P ＜ 0.01§)。I， 输注 ； MAP， 平均动脉压 ； PAP， 肺动脉压 ； PCWP， 肺毛 细血管楔压 ； RAP， 右房压 ； CO， 心输出量 ； SVR， 全身血管阻力 ； PVR， 肺血管阻力。
表6
CD-NP 或 CNP 静脉输注引起的激素反应
值为平均值 ±SEM。与输注前 ( 前 -I) 的组内比较 ( 平均值 ±SEM，§ ‖) 以及组间比较 (＜ 0.01 ， ＜ 0.001 )。PRA， 血浆肾素活性 ； ANG II， 血管紧张素 II。
本申请要求 2008/06/06 提交的美国专利临时申请第 61/059,576 号的优先权。
有关联邦资助的研究的声明
本发明受到来自国立卫生研究所 (National Institutes of Health) 联邦基金号 HL76611-03 和 HL36634-20 的政府资助。政府对本发明拥有某些权利。
技术领域 本申请文件涉及包含利尿钠多肽的组合物， 和利用利尿钠肽来防止、 降低和 / 或 抑制心脏重构以及防止、 降低和 / 或抑制心肌梗死 (MI) 后的缺血损伤的方法。
背景技术 利尿钠肽家族包括心激素心房利尿钠肽 (ANP)、 B- 型利尿钠肽 (BNP)、 C- 型利尿 钠肽 (CNP) 和树眼镜蛇属 (Dendroaspis) 利尿钠肽 (DNP)， 所有这些都通过充分表征的微
粒鸟苷酸环化酶受体 ( 即， NPR-A 用于 ANP 和 BNP ； NPR-B 用于 CNP) 和第二信使环 3’ 5’ 鸟 苷 单 磷 酸 (cGMP) 发 挥 作 用 (Kuhn(2003)Circ Res 93 ： 700-709 ； Tawaragi 等， (1991) Biochem Biophys Res Commun 175 ： 645-651 ； 和 Komatsu 等， (1991)Endocrinology 129 ： 1104-1106)。CNP 具有有益的血管和抗增殖特性。由于缺乏肾脏作用， CNP 降低血压的作用 小于 ANP 和 BNP， 但由于具有静脉舒张作用因此能降低心脏负载。DNP 是一种能显著降低血 压的有效的利尿钠肽和利尿肽。CNP 和 DNP 通过独立的鸟苷酸环化酶受体发挥作用。
发明概述
本申请文件部分基于鉴定出了将两种单独利尿钠肽的有益特性加以组合的嵌 合肽组合物和方法。如本文所述， CNP(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC ； SEQ ID NO ： 1) 与 DNP 的 15-AA 线性 C- 末端 (PSLRDPRPNAPSTSA ； SEQ ID NO ： 2) 融合得到了一种合成的嵌合肽 (CD-NP)， 其在体内具有利尿钠和利尿、 增强 GFR、 降低心脏负载、 抑制肾素、 以及极轻微降低 血压的特性。 此外， 在利用心脏成纤维细胞 (CF) 进行的体外研究证实， CD-NP 具有活化 cGMP 和抗增殖特性。此外， 根据本发明的描述， 可使用其他利尿钠多肽和嵌合多肽。本文披露的 发现促成了利尿钠肽药物研发领域中一项革命性的设计策略， 从而能够产生具有优于天然 利尿钠肽的特性， 同时在治疗诸如急性心力衰竭 (AHF)、 急性心肌梗死 (AMI)、 再灌注损伤、 缺血损伤和心脏重构等心肾疾病状态时具有潜在有益功效且安全的治疗肽。
一方面， 本申请文件的特征在于一种降低被鉴定为有此需要的对象的心脏重构的 方法， 所述方法包括给予所述对象包含药学上可接受的载体和能够升高所述对象尿液和血 浆 cGMP 水平的多肽的组合物， 其中， 所述组合物的给予量能使一个或多个心脏重构参数的 水平相比给予所述组合物之前所述一个或多个参数的水平有效改变至少 10 个百分点， 其 中所述一个或多个参数选自下组 ： 心脏负载降低、 肾小球滤过率升高、 醛固酮水平降低、 血 浆肾素活性降低、 血管紧张素 II 水平降低、 心脏成纤维细胞增殖降低、 左心室质量降低、 左 心室肥大减轻、 心室纤维化减轻、 射血分数升高、 左心室收缩末期内径降低、 肺毛细血管楔压降低、 右房压降低、 和平均动脉压降低。
所述多肽可以是利尿钠多肽。 所述利尿钠多肽可以是嵌合利尿钠多肽， 其包含 (a) 第一利尿钠多肽的环结构或所述第一利尿钠多肽环结构的变体， 和 (b) 第二利尿钠多肽的 氨基酸序列或所述第二利尿钠多肽所述氨基酸序列的变体。所述利尿钠多肽可以包含 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列， 但相对于 SEQ ID NO ： 3 所示序列可具有 1、 2、 3、 4、 或 5 个氨基酸 取代。所述多肽能够结合 NPR-B 受体和 NRP-A 受体。所述多肽在给予所述对象后的消除半 衰期为至少 15 分钟。
所述方法可包括以连续静脉输注方式给予所述组合物 ( 例如， 1-7 天 )。所述方法 可包括以连续静脉输注形式给予所述组合物 1-7 天， 随后皮下给予所述组合物 5-30 天。所 述方法可包括以约 0.1ng 多肽 / 千克体重 / 分钟至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 分钟的剂量 以连续静脉输注形式给予所述组合物， 随后以约 10ng 多肽 / 千克体重 / 天至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 天的剂量皮下给予所述组合物。所述方法可包括以约 0.1ng 多肽 / 千克体重 / 分钟至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 分钟的剂量以连续静脉输注形式给予所述组合物约 3 小 时至约 7 天， 随后以约 10ng 多肽 / 千克体重 / 天至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 天的剂量皮 下给予所述组合物约 5- 约 30 天。
所述对象被鉴定患有急性心力衰竭或急性心肌梗死。 所述方法可包括在再灌注开 始时或大致开始时或在再灌注开始后约 3 小时开始给予所述连续静脉输注。所述组合物可 在再灌注后约 3 小时至约 12 小时给予。所述方法可包括以约 1ng 多肽 / 千克体重 / 分钟 至约 30ng 多肽 / 千克体重 / 分钟 ( 例如， 约 10ng 多肽 / 千克体重 / 分钟、 约 12.5ng 多肽 / 千克体重 / 分钟、 约 15ng 多肽 / 千克体重 / 分钟、 约 17.5ng 多肽 / 千克体重 / 分钟、 或 约 20ng 多肽 / 千克体重 / 分钟 ) 的剂量给予所述组合物。所述方法可进一步包括监测所 述对象中一个或多个心脏重构参数的水平。
另一方面， 本发明的特征在于一种包含药学上可接受的载体和多肽的组合物， 其 中所述多肽能够升高对象的尿液和血浆 cGMP 水平， 其中所述组合物当被给予鉴定为有此 需要的对象时导致心脏重构降低， 其中所述降低的或抑制的心脏重构通过选自下组的一个 或多个参数水平的改变来表示 ： 心脏负载降低、 肾小球滤过率升高、 醛固酮水平降低、 血浆 肾素活性降低、 血管紧张素 II 水平降低、 心脏成纤维细胞增殖降低、 左心室质量降低、 左心 室肥大减轻、 心室纤维化减轻、 射血分数升高、 左心室收缩末期内径降低、 肺毛细血管楔压 降低、 右房压降低、 和平均动脉压降低， 且其中所述一个或多个参数的水平相比所述给药之 前所述一个或多个参数的水平改变至少 10 个百分点。
所述多肽是利尿钠多肽。所述利尿钠多肽可以是嵌合利尿钠多肽， 其包含 (a) 第 一利尿钠多肽的环结构或所述第一利尿钠多肽环结构的变体， 和 (b) 第二利尿钠多肽的氨 基酸序列或所述第二利尿钠多肽所述氨基酸序列的变体。 所述利尿钠多肽可以包含 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列， 但相对于 SEQ ID NO ： 3 所示序列可具有 1、 2、 3、 4、 或 5 个氨基酸取 代。所述多肽能够结合 NPR-B 受体和 NRP-A 受体。所述多肽在给予所述对象后的消除半衰 期为至少 15 分钟。 所述利尿钠多肽可包含与 SEQ ID NO ： 3 所述氨基酸序列有 91-98％相同 的氨基酸序列。所述利尿钠多肽可以包含 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列， 但相对于 SEQ ID NO ： 3 所示序列可具有 1、 2、 3、 4、 或 5 个氨基酸取代。所述对象被鉴定患有急性心力衰竭或 急性心肌梗死。所述药物载体可以是生理盐水或者葡萄糖和水。除非另有限定， 在本文中使用的所有技术和科学术语具有和本领域普通技术人员 共知的相同含义。 虽然在实践本发明时可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材 料， 但是， 下面描述了合适的方法和材料。 本文中述及的所有出版物、 专利申请、 专利和其他 文献都全文参考结合于本文。在矛盾时， 以本说明书 ( 包括定义 ) 为准。此外， 材料、 方法 和例子都只是说明性的， 并不构成限制。
在附图和下述描述中详细描述了本发明的一种或多种实施方式。 通过详述和附图 以及权利要求书， 不难了解本发明的其它特征、 目的和优点。 附图说明 图 1 是 CNP(SEQ ID NO ： 1)、 DNP(SEQ ID NO ： 17)、 37-AA 嵌合利尿钠肽、 CD-NP(SEQ ID NO ： 3)、 和被称为 CNP-C 的 27-AA“转化” CNP(SEQ ID NO ： 4) 的氨基酸序列和结构的示 意图。
图 2 中的两张图显示了 DNP 的 C- 末端对正常犬 (n ＝ 6) 的钠泌尿排泄 (UNaV ； 图 2A) 和尿流量 (UV ； 图 2B) 的作用的实施例。数据表示为平均值 ±SE。C- 末端， 42ng/kg/ 分 钟静脉输注 C- 末端。* 相比基线 P ＜ 0.05。
图 3 中的一系列图显示了 CD-NP 对正常犬 (n ＝ 6) 的平均动脉压 (MAP ； 图 3A)、 右房压 (RAP ； 图 3B) 和肺毛细血管压 (PCWP ； 图 3C) 的作用的实施例。数据表示为平均值 ±SE。CD-NP 10， 剂量为 CD-NP 10ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 50， 剂量为 CD-NP 50ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 100， 剂量为 CD-NP 100ng/kg/ 分钟。* 相比基线 P ＜ 0.05。
图 4 中的一系列图显示了 CD-NP 对正常犬 (n ＝ 6) 的钠泌尿排泄 (UNaV 图 4A)、 尿 流量 (UV ； 图 4B) 和肾小球滤过率 (GFR ； 图 4C) 的作用的实施例。数据表示为平均值 ±SE。 CD-NP 10， 剂量为 CD-NP 10ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 50， 剂量为 CD-NP 50ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 100， 剂量为 CD-NP 100ng/kg/ 分钟。* 相比基线 P ＜ 0.05。
图 5 中的两张图显示了 CD-NP 对正常犬 (n ＝ 6) 的近端钠重吸收分数 (PFRNa ； 图 5A) 和远端钠重吸收分数 (DFRNa ； 图 5B) 的作用的实施例。数据表示为平均值 ±SE。CD-NP 10， 剂量为 CD-NP 10ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 50， 剂量为 CD-NP 50ng/kg/ 分钟 ； CD-NP 100， 剂 量为 CD-NP 100ng/kg/ 分钟。* 相比基线 P ＜ 0.05。
图 6 中的两张图显示了两种剂量的 CD-NP 和等摩尔剂量的人 BNP 在两组正常犬 ( 每组 n ＝ 6) 中的作用的实施例。图 6A 显示了 CD-NP 对平均动脉压 (MAP) 的作用， 图 6B 显示了 CD-NP 对肾小球滤过率 (GFR) 的作用。实心条是 CD-NP， 空心条是 BNP。数据表示 为平均值 ±SE。CD-NP 10， 剂量为 CD-NP 10ng/kg/ 分钟， 或者在另一组中为等摩尔剂量的 BNP ； CD-NP 50， 剂量为 CD-NP 50ng/kg/ 分钟或者在另一组中为等摩尔剂量的 BNP。* 相比 基线 P ＜ 0.05。 两组之间的 P ＜ 0.05。
图 7 中的两张图显示了 CD-NP 对人 CF 的作用的实施例。图 7A 显示了 CD-NP 对 人 CF 中 cGMP 生成的作用。数据表示为平均值 ±SE。* 相比未处理 P ＜ 0.05 ； ** 相比 -11 -8 CP-NP 10 M P ＜ 0.05 ； + 相比 CD-NP 10 M P ＜ 0.05。图 7B 显示了 CD-NP 对人 CF 的抗增 殖作用的实施例， 如通过比色法测得的用光密度单位表示的 BrdU 摄取所示。对照， 未处理 的人心脏成纤维细胞 ； 心脏营养素 -1， 心脏营养素 -1 作用下成纤维细胞的增殖 ； 心脏营养 素 -1+CD-NP， 加入心脏营养素 -1 的 CD-NP 刺激成纤维细胞。数据表示为平均值 ±SE。* 相
比对照 P ＜ 0.05。
图 8 显示了一个实施方式中心肌梗死 (MI) 三周后大鼠的左心室 (LV) 质量。MI， 未处理 ； MI+CDNP， MI 后用 1.7x10-7g/kg/ 分钟 CD-NP 处理 2 周。
图 9A 中的一系列图显示了如图所示用 CD-NP 或 CNP 处理的犬的血浆 cGMP 水 平 ( 左图 )、 尿 cGMP 排泄 ( 中图 ) 以及 cGMP 的净肾脏生成 ( 右图 )。数值表示为平均值 ±SEM(CD-NP， n ＝ 9-10 ； CNP， n ＝ 7-9)。相比输注前进行了组内比较 ( 平均值 ±SEM， P ＜ 0.05*， )， 并进行了组间比较 时间表示清除率中值。 图 9B 中的两 张图显示了如图所示用 CD-NP 或 CNP 处理的犬的尿流量 ( 左图 ) 和尿钠排泄 ( 右图 )。数 值表示为平均值 ±SEM。相比输注前进行了组内比较 ( 平均值 ±SEM， P ＜ 0.05*， )， 并进行了组间比较 ( 率中值。
)(CD-NP， n ＝ 10 ； CNP， n ＝ 7)。时间表示清除图 10A-10D 显示了如图所示用 CD-NP 或安慰剂处理的人的血浆 cGMP 水平 ( 图 10A)、 尿 cGMP 排泄 ( 图 10B)、 尿钠排泄反应 ( 图 10C) 以及血压反应 ( 图 10D)。相比输注 前进行了组内比较 ( 平均值 ±SEM， P ＜ 0.05*， )， 并进行了组间比较图 10E 显示了在分离的犬肾小球中在不存在或存在 NPR-A 拮抗剂 (1μM) 时 cGMP 对 CD-NP 的反应。* 相比空白 P ＜ 0.05，相比空白 P ＜ 0.0001。 发明详述
化合物
本申请文件提供了利尿钠化合物， 所述化合物可用于在有此需要的对象中提高 cGMP 水平和减低心脏重构。如本文所述， 该化合物可结合 NPR-A 受体和 / 或 NPR-B 受体， 并 且， 在某些情况下结合 NPR-C 受体。此外， 在给予对象后所述化合物的消除半衰期长于天然 NP。在一些实施方式中， 本文提供的化合物可以是多肽。
例如， 本申请文件描述了示例性的分离的利尿钠多肽， 所述多肽能够抑制或降低 AHF、 AMI、 再灌注损伤、 缺血损伤和心脏重构。在一些实施方式中， 利尿钠肽可用于治疗、 抑 制、 和 / 或预防心脏重构和缺血损伤， 尤其是在 AMI 和 / 或 AHF 之后。文中， 术语 “利尿钠多 肽” 或 “NP” 包括天然 ( 天然形成的， 野生型 )NP( 例如， ANP、 BNP、 CNP、 DNP 和尿扩张素 )， 天 然 NP 的一个或多个部分， 天然 NP 的变体， 或天然 NP 的嵌合肽， 天然 NP 的部分， 或者天然 NP 或天然 NP 的部分的变体。在一些实施方式中， NP 仅包括天然 NP 成熟形式的一部分。含有 来自 CNP 和 DNP 的氨基酸序列的 NP 尤其有用， 但其他天然和嵌合 NP 也可考虑用于本文。
CNP 是一种与 ANP 和 BNP 有结构同源性但在遗传上不同的 22- 氨基酸肽。与 ANP 或 BNP 不同， CNP 缺乏 C- 末端氨基酸延伸， 这可能部分解释了它缺乏利尿钠特性的原 因 (Clavell 等， (1993)Am Heart J 1104-1106 ； 和 Hunt 等， (1994)J Clin Endocrinol Metab 78 ： 1428-1435)。CNP 主要是一种内皮细胞延伸肽 (Stingo 等， (1992)Am Heart J H1318-1321 ； Ogawa 等， (1992)Hypertension 19 ： 809-813 ； Doi 等， (2001)Arterioscler Thromb Vasc Biol 21 ： 930-936 ； Naruko 等， (2005)Atherosclerosis 181 ： 241-250 ； Horio 等， (2003)Endocrinology 144 ： 2279-2284 ； Langenickel 等， (2006)Proc Natl Acad Sci USA 103 ： 4735-4740 ； 和 Scotland 等， (2005)Proc Natl Acad Sci USA 102 ： 14452-14457)。 在分离的静脉环和动脉环中， CNP 激活静脉中的 NPR-B 受体， 而 ANP 和 BNP 同时结合动脉和 静脉内的 NPR-A 受体。这与 CNP 的降低血压的作用弱于 ANP 和 BNP 一致 (Wei 等， (1993)Am
J Physiol 264 ： H71-73 ； Igaki 等， (1998)Hypertens Res 21 ： 7-13 ； 和 LaVilla 等， (1998) Clin Sci(Lond)95 ： 595-602)。
除 了 静 脉 舒 张 特 性， CNP 在 CF 中 的 抗 增 殖 能 力 和 胶 原 抑 制 特 性 强 于 ANP 和 BNP(Horio 等， 同上 )。例如， 研究显示， 给患有 AMI 的啮齿动物连续 14 天输注 CNP 能显 著减轻心室扩张、 心脏纤维化和心肌细胞肥大 (Soeki 等， (2005)J Am Coll Cardiol 45 ： 608-616)。慢性输注 CNP 不导致降低血压的作用。
不同于 ANP 和 BNP， 当给人输注时 CNP 缺乏显著的利尿钠和利尿作用。这可以解 释 CNP 对诸如 AHF 的钠和水阻挡综合征无效， 尽管它具有突出的静脉舒张和抗纤维化特性 (Igaki 等， 同上 ； 和 La Villa 等， 同上 )。
DNP 最初分离自绿色树眼镜蛇。DNP 在体内显著利尿钠和利尿， 并具有降低心 脏 负 载 的 作 用， 但 具 有 显 著 降 低 血 压 的 特 性 (Schweitz 等， (1992)J Biol Chem 267 ： 13928-13932 ； Lisy 等， (1999)Kidney Int 56 ： 502-508 ； 和 Lisy 等， (2001)Hypertension 37 ： 1089-1094)。与 ANP 和 BNP 一样， DNP 通过 NPR-A 受体发挥作用， 即被 ANP 饱和将显著 降低 DNP 在培养的人内皮细胞内对 cGMP 的活化作用。其实， 包括利钠作用和降血压作用在 内的 DNP 的体内作用与 NPR-A 的活化一致， 这种作用密切模拟 ANP 和 BNP 的特性， 但不同于 CNP。实际上， 与 ANP 和 BNP 相比， DNP 在人心肌中已显示出对 NPR-A 受体具有较高亲和力 (Singh 等， (2006)Circ Res 99 ： 183-190)。 DNP 具有已知利尿钠肽中最长的 C- 末端， 由 15 个氨基酸构成， 相比之下 ANP 为 5 个， BNP 为 6 个， 而 CNP 没有。DNP 的长 C- 末端使得 DNP 对中性肽链内切酶 (NEP) 的降解 具有较高耐性， 因此有助于增强其利尿钠和利尿作用 (Chen 等， (2002)J Am Coll Cardiol 40 ： 1186-1191)。此外， CNP 缺乏 C- 末端也解释了在三种已知的内源利尿钠肽中 CNP 最易 于被 NEP 降解。缺乏 C- 末端也可以解释 CNP 的肾脏作用， 因为 NEP 在肾脏中具有最高表达 (Kenny 和 Stephenson(1988)FEBS Lett 232 ： 1-8)。
尿扩张素是一种具有强利尿钠和利尿活性的 NPR-A 受体的 ANP- 样激动剂。尿扩 张素定位在肾脏内， 是从与 ANP 相同的前体差异加工得到的， 并分泌到尿液中。尿扩张素的 32 氨基酸序列包括 ANP 的完整的 28 氨基酸序列， 并在其 N- 末端有 4 个氨基酸延伸。
术语 “心脏重构” 表示可与 MI、 AHF 或其他征状一起发生的对心脏的影响。其中包 括， 例如， 心脏膨胀、 肌细胞肥大和心脏纤维化 ( 即间质成纤维细胞增殖 )。本文提供的 NP 可抑制或防止与 AMI 或 AHF 一起发生的心脏重构。在一些实施方式中， 表示降低的心脏重 构的参数可包括以下一个或多个 ： 心脏负载降低 ( 即， 心脏压力降低 )， 肾小球滤过率升高 (GFR)， 血浆肾素活性降低 (PRA)， 血管紧张素 II 水平降低， 心脏成纤维细胞增殖降低， 左心 室 (LV) 肥大减轻， LV 质量降低 ( 表示纤维化和肥大减轻 )， 肺毛细血管楔压降低 (PWCP ； 左 心房压力的间接度量 )， 右房压降低， 平均动脉压降低， 醛固酮水平降低 ( 预示抗纤维化作 用 )， 心室纤维化减轻， 射血分数升高， 以及 LV 收缩末期内径减小。 为确定 NP 是否能够抑制 或降低心脏重构， 可采用本领域已知的和 / 或本文所述的方法评价这些参数中的一个或多 个 ( 例如， 在用 NP 治疗之前和之后 )。
诸如 AMI 和 AHF 等征状可导致肾损伤以及心脏损伤。在一些实施方式中， 本文提 供的 NP 还能保护肾脏免遭 AMI 和 AHF 损伤。表示肾脏保护作用的参数包括， 例如， 近端钠 重吸收分数 (PFRNa) 降低， 远端钠重吸收分数 (DFRNa) 降低， 尿钠排泄 (UNaV) 升高以及尿
流量 (UV) 增加。可评价这些参数中的任何一个或多个 ( 例如， 在给予 NP 之前和之后 ) 以 确定 NP 是否具有肾脏保护作用。评价这些参数的方法是本领域已知的， 并在本文中描述。
术语 “分离的多肽” 表示满足以下条件的多肽 ： (1) 与天然发现的蛋白质无关， (2) 不含相同来源的其他蛋白质 ( 例如， 不含人蛋白质 )， (3) 由来自不同物种的细胞表达， 或 (4) 不是天然产生的。本文提供的分离的多肽通常含有 10 个或更多 ( 例如， 12 个或更多、 15 个或更多、 或者 20 个或更多 ) 氨基酸残基。分离的多肽可以， 例如， 由 DNA 或 RNA， 包括 合成的 DNA 或 RNA， 或它们的某些组合编码。
嵌合 NP 可包括两个多个个体 NP 的氨基酸序列。在一些实施方式中， 嵌合多肽可 包括 CNP 和 DNP 的氨基酸序列。此外， 在一些情况下， 嵌合 NP 可包括环结构和半胱氨酸键 ( 例如， ANP、 BNP、 CNP 或 DNP 的环结构和半胱氨酸键 ) 与其他 NP 的一个或多个氨基酸区段 的组合。例如， 嵌合 CD-NP 可包括 CNP 的完整 22-AA 序列 (GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC ； SEQ ID NO ： 1) 以及 DNP 的 15-AA C- 末端 (PSLRDPRPNAPSTSA ； SEQ ID NO ： 2)， 因此可具有 SEQ ID NO ： 3 所述氨基酸序列 (GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA)。在一些实施方式中， 嵌合 NP 可包括 CNP 和尿扩张素的氨基酸序列。例如， 嵌合 CU-NP 可包括 CNP 的环结构和二 硫键 (CFGLKLDRIGSMSGLGC ； SEQ ID NO ： 5) 以及尿扩张素的 10 氨基酸 N- 末端 (TAPRSLRRSS ； SEQ ID NO ： 6) 和 5 氨基酸 C- 末端 (NSFRY ； SEQ ID NO ： 7)， 因此可具有序列 TAPRSLRRSSCF GLKLDRIGSMSGLGCNSFRY(SEQ ID NO ： 8)。
在一些情况下， 嵌合 NP 可在 SEQ ID NO ： 3 或 SEQ ID NO ： 8 的一个或多个位置 ( 例 如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个位置 ) 上包括突变 ( 例如， 取代、 添加或缺失 )。变体 NP， 例 如， 相对于天然 NP 氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代的变体， 可按照本文所述进行制 备和修饰。在一些情况下， 可通过选择不显著改变以下情况的取代制造氨基酸取代 ： (a) 被 取代区域的肽主链的结构， (b) 靶位点上分子的电荷或疏水性， 或 (c) 侧链的大小 (bulk)。 例如， 天然残基根据侧链特性可分成以下几组 ： (1) 疏水性氨基酸 ( 正亮氨酸、 甲硫氨酸、 丙 氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸 ) ； (2) 中性亲水性氨基酸 ( 半胱氨酸、 丝氨酸和苏氨酸 ) ； (3) 酸性氨基酸 ( 天冬氨酸和谷氨酸 ) ； (4) 碱性氨基酸 ( 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 组氨酸、 赖 氨酸和精氨酸 ) ； (5) 影响链取向的氨基酸 ( 甘氨酸和脯氨酸 ) ； 和 (6) 芳香性氨基酸 ( 色 氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸 )。 用这些基团进行的取代可被认为是保守性取代。 有用的取代的 非限制性的例子包括但不限于， 用缬氨酸取代丙氨酸， 用赖氨酸取代精氨酸， 用谷氨酰胺取 代天冬酰胺， 用谷氨酸取代天冬氨酸， 用丝氨酸取代半胱氨酸， 用天冬酰胺取代谷氨酰胺， 用天冬氨酸取代谷氨酸， 用脯氨酸取代甘氨酸， 用精氨酸取代组氨酸， 用亮氨酸取代异亮氨 酸， 用异亮氨酸取代亮氨酸， 用精氨酸取代赖氨酸， 用亮氨酸取代甲硫氨酸， 用亮氨酸取代 苯丙氨酸， 用甘氨酸取代脯氨酸， 用苏氨酸取代丝氨酸， 用丝氨酸取代苏氨酸， 用酪氨酸取 代色氨酸， 用苯丙氨酸取代酪氨酸， 和 / 或用亮氨酸取代缬氨酸。
变体 CD-NP 的非限制性例子包括 ：
PLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO ： 9)，
GISKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO ： 10)，
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTTA(SEQ ID NO ： 11)，
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSV(SEQ ID NO ： 12)，
GLTKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO ： 13)，GLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO ： 14)， GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSSSA(SEQ ID NO ： 15)， 和 GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPTTSA(SEQ ID NO ： 16). 可在 CD-NP 内任何位置进行的保守性取代的其它例子列在表 1 中。 表1 保守性氨基酸取代的例子优选取代 Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Pro Arg Leu Ile Arg Leu Leu Gly Thr Ser Tyr Phe 10Gln， His， Lys， Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn， Gln， Lys， Arg Leu， Val， Met， Ala， Phe， 正亮氨酸 Norleucine， Ile， Val， Met， Ala， Phe Arg， Gln， Asn Leu， Phe， Ile Leu， Val， Ile， Ala Gly Thr Ser Tyr Trp， Phe， Thr， Ser102143757 A CN 102143764 Val
说明书Leu8/31 页Ile， Leu， Met， Phe， Ala， 正亮氨酸在一些实施方式中， NP 可包含一个或多个非保守性取代。非保守取代通常指将一 种上述类型的成员更换为另一种类型的成员。 这种制造方法对于提供大量这种化合物或其 他实施方式是理想的。 氨基酸改变能否得到功能性多肽可通过测定肽变体的比活方便地确 定。
具有保守性和 / 或非保守性取代 ( 例如， 针对 SEQ ID NO ： 3) 的变体 NP， 以及 SEQ ID NO ： 3 的片段， SEQ ID NO ： 3 变体的片段， 以及包含 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 3 的变体或 片段或 SEQ ID NO ： 3 变体的片段的多肽， 可通过任何合适的试验 ( 包括本文所述试验 ) 筛 选它们的生物活性。例如， 如本文中实施例 1 和 3 的描述， 可通过测量对 CF 产生的 cGMP 水 平的影响或者通过检测抑制 CF 增殖的能力， 在体外评价本文所述 NP 的活性。NP 的活性也 可在体内评价， 例如， 在诱导 MI 后在动物体内检测它对以下因素的影响 ： 肺毛细血管楔压， 右房压， 平均动脉压， 尿钠排泄， 尿流量， 近端和远端钠重吸收分数， 血浆肾素活性， 血浆和 尿液 cGMP 水平， 肾小球滤过率， 以及左心室质量。这种试验描述于， 例如， 本文的实施例 1、 2 和 4。
在一些实施方式中， 由于半胱氨酸残基之间的二硫键， 本文提供的 NP 可以是环状 的 ( 参见， 例如， 图 1 中描绘的 CD-NP 结构 )。在一些实施方式中， 半胱氨酸残基上的巯基可 被其他基团 ( 例如， -CH2CH2-) 代替。为了用 -CH2- 基团代替巯基， 例如， 半胱氨酸残基可用 α- 氨基丁酸代替。这种类似的环状多肽可用， 例如， Lebl 和 Hruby(Tetrahedron Lett.， 1984， 25 ： 2067) 描述的方法制造， 或采用美国专利 4,161,521 中描述的方法制造。
此外， 将丝氨酸或苏氨酸的 OH 与天冬氨酸或谷氨酸的羧基反应可形成酯桥或酰 胺桥， 从而产生具有 -CH2CO2CH2- 结构的桥。类似地， 将赖氨酸的侧链与天冬氨酸或谷氨 酸反应可得到酰胺， 从而产生具有 -CH2C(O)NH(CH)4- 结构的桥。合成这些桥的方法是本 领 域 已 知 的 ( 参 见， 例 如， Schiller 等， (1985)Biochem.Biophy.Res.Comm.127 ： 558， 和 Schiller 等， (1985)Int.J.Peptide Protein Res.25 ： 171)。其他成桥氨基酸残基以及反 应可参见例如， 美国专利 4,935,492。包含用非肽键连接氨基酸残基的肽类似物的制备也 是本领域已知的。参见， 例如， Spatola 等， (1986)Life Sci.38 ： 1243 ； Spatola(1983)Vega Data 1(3) ； Morley(1980)Trends Pharm.Sci.463-468 ； Hudson 等， (1979)Int.J.Pept. Prot.Res.14 ： 177 ； Spatola， 选自 《氨基酸、 肽和蛋白质的化学和生物化学》 (Chemistry and Biochemistry of Amino Acid Peptides and Proteins， B.Weinstein 编， Marcel Dekker， New York， p.267(1983) ； Hann(1982)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 ： 307 ； Almquist 等， (1980)J.M 编， Chem.23 ： 1392 ； Jennings-White 等， (1982)Tetrahedron Lett.23 ： 2533 ； 欧 洲专利申请 EP 45665 ； Holladay 等， (1983)Tetrahedron Lett.24 ： 4401 ； 和 Hruby(1982) Life Sci.31 ： 189。
在一些实施方式中， NP 可包含 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列， 但具有特定数目的 氨基酸取代。例如， NP 可具有 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列并具有 1、 2、 3、 4、 或 5 个氨基酸 取代。这种氨基酸序列的例子包括， 但不限于， SEQ ID NO ： 9-16 中列出的那些。
在一些实施方式中， 本文提供的 NP 可具有与参比 NP 序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2、 或 SEQ ID NO ： 3) 有至少 85％ ( 例如、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 97.5％、 98％、 98.5％、 99.0％、 99.5％、 99.6％、 99.7％、 99.8％、 99.9％、 或 100％ ) 序列相同性的氨基酸序列。序列相同性百分数可由比对氨基酸 序列的匹配位置数确定， 用比对氨基酸序列中匹配位置的数目除以比对氨基酸的总数再乘 以 100 来计算。匹配位置表示在比对氨基酸序列的相同位置出现相同氨基酸的位置。也可 确定任意核酸序列的序列相同性百分数。
序列相同性百分数是采用独立 BLASTZ 版本 ( 包含 BLASTN 版本 2.0.14 和 BLASTP 版本 2.0.14) 的 BLAST 2 序列 (Bl2seq) 程序通过比较靶核酸或靶氨基酸序列来鉴定核酸 或氨基酸序列来确定的。这种独立 BLASTZ 版本可从 Fish & Richardson 的网址 (fr.com/ blast) 或从美国政府的生物技术信息中心的网址 (ncbi.nlm.nih.gov) 获得。如何使用 Bl2seq 程序的指令可在 BLASTZ 的 “读我” 文件中找到。
Bl2seq 采用 BLASTN 或 BLASTP 算法来比较两个序列。BLASTN 用来比较核酸序列， 而 BLASTP 用来比较氨基酸序列。为比较两个核酸序列， 各选项的设定如下 ： -i 设定成含 有要比较的第一核酸序列的文件 ( 例如， C:\seq1.txt) ； -j 设定成含有要比较的第二核酸 序列的文件 ( 例如， C:\seq2.txt) ； -p 设定成 blastn ； -o 设定成任何目标文件名 ( 例如， C:\output.txt) ； -q 设定成 -1 ； -r 设定成 2 ； 所有其他选项采用默认值。以下命令将生成 包含两个序列的比较的输出文件 ： C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastn-o c:\output.txt-q-1-r2。如果靶序列与鉴定序列的任何部分同源， 则指定的输出文件将显 示那些与比对序列同源的区域。如果靶序列与鉴定序列的任何部分不同源， 则指定的输出 文件将不显示比对序列。
比对时， 通过计算与开始于任意匹配位置并终止于任意其他匹配位置的鉴定序列 对准的靶序列中连续核苷酸的数目来确定长度。 匹配位置是同时在靶序列和鉴定序列中出 现相同核苷酸的任何位置。由于缺口中没有核苷酸， 靶序列中存在的缺口不计算在内。同 样， 由于计数的是靶序列核苷酸而非鉴定序列核苷酸， 因此鉴定序列中存在的缺口不计算 在内。
特定长度上的相同性百分数是将整个长度上匹配位置的数目除以总长度数目然 后将所得结果乘以 100 得到的。例如， 如果 (1) 将长度为 30 个氨基酸的靶序列与 SEQ ID NO ： 3 所示序列比较， (2)Bl2seq 程序显示与 SEQ ID NO ： 3 所示序列某区域对准的靶序列有 27 个氨基酸， 此时该 27 个氨基酸的区域中第一个和最后一个氨基酸是匹配的， 和 (3)27 个 对准的氨基酸中匹配的数目是 25， 则该 30 氨基酸靶序列包含长度为 27， 在该长度上的相同 性百分数为 92.6( 即， 25÷27x100 ＝ 92.6)。
应理解， 各个氨基酸或核酸靶序列内与鉴定序列对准的不同的区域可具有它们各 自的相同性百分数。注意， 相同性百分数值四舍五入到 0.1。例如， 78.11、 78.12、 78.13 和 78.14 向下四舍五入到 78.1， 而 78.15、 78.16、 78.17、 78.18 和 78.19 向上四舍五入 78.2。 还要注意长度值通常是整数。
分离的多肽可采用任何合适方法制备， 包括固相合成， 并可采用手动技术或自动 技术 ( 例如， 采用应用生物系统 (Applied BioSystems， Foster City， CA) 的肽合成仪或生 物探索公司 (Biosearch Inc.， San Rafael， CA) 的自动化肽合成仪 ) 来制造。可用 KCN 温 和氧化线性多肽在半胱氨酸残基之间引入二硫键， 如美国专利 4,757,048 所述。也可通过 重组方法制造 NP， 如下文所述。可使肽接触一个或多个当量的所需碱， 如金属氢氧化物 ( 例如， 氢氧化钠 )、 金属 碳酸盐或碳酸氢盐 ( 例如， 碳酸钠或碳酸氢钠 )、 或胺 ( 例如， 三乙胺、 三乙醇胺， 等等 ) 来制 造该多肽的羧基的盐。可使多肽接触一个或多个当量的无机酸或有机酸 ( 例如， 盐酸 ) 来 制造该多肽的酸加成盐。
可采用任何合适的将羧酸或前体转变成酯的方法 ( 例如， 本领域已知的那些方 法 ) 制备多肽的羧基酯。例如， 当采用 Merrifield 合成技术时， 一种制备本发明多肽的酯 的方法是， 根据树脂特性， 在碱性或酸性条件下在存在所需醇时从树脂上切下完整多肽。 然 后无需分离游离酸， 在从树脂上切下时直接酯化多肽的 C- 末端。
可采用将羧基或前体转化成酰胺的技术 ( 例如， 本领域已知的那些技术 ) 来制备 多肽的酰胺。一种在 C- 末端羧基形成酰胺的方法包括用合适的胺从固体支持物上切下多 肽， 或在存在醇时切割， 得到酯， 然后用合适的胺进行氨解。
制备多肽氨基的 N- 酰基衍生物时可在最后的缩合时使用 N- 酰基保护的氨基酸， 或者通过酰化保护的或未保护的肽。例如， 制备 O- 酰基衍生物时可通过酰化游离羟基肽或 肽树脂。 任何一种酰化反应可采用标准酰化试剂如酰卤、 酸酐、 酰基咪唑等进行。 如果需要， N- 和 O- 酰化反应可一起进行。
在一些实施方式中， 本文提供的 NP 的半衰期长于天然 NP 的半衰期。 例如， 尽管 CNP 的半衰期较短 ( 约 1 分钟或半分钟 )， 但 CD-NP 在给予哺乳动物后的消除半衰期为约 18.5 分钟 ( 参见， 例如， Lee 等， BMC Pharmacol.(2007)7( 增刊 1) ： P38 ； 和 Lee 等， J.Cardiac Failure(2007)13( 增刊 6) ： S144)。因此， 与天然 NP 如 CNP 相比， 本文提供的 NP 的半衰期 提高了至少 2 倍 ( 例如， 至少 2 倍， 至少 3 倍， 至少 4 倍， 至少 5 倍， 至少 6 倍， 至少 7 倍， 至 少 8 倍， 至少 9 倍， 或至少 10 倍 )。在一些实施方式中， NP 的消除半衰期为至少约 10 分钟 ( 例如， 至少约 10 分钟， 至少约 12 分钟， 至少约 15 分钟， 至少约 17 分钟， 至少约 18 分钟， 或 至少约 20 分钟 )。
本文提供的 NP 可通过一个或多个天然 NP 通过其发挥作用的鸟苷酸环化酶受体发 挥作用。例如， 在一些实施方式中， 本文提供的 NP 可结合于 ANP 和 BNP 通过其发挥作用的 NPR-A 受体并通过其发挥作用。在一些情况下， NP 可结合于 ANP 和 BNP 通过其发挥作用的 NPR-A 受体并通过其发挥作用。在一些情况下， NP 可结合于 CNP 通过其发挥作用的 NPR-B 受体并通过其发挥作用。在一些情况下， 本文提供的 NP 可结合于 NPR-C 受体并通过其发挥 作用。此外， 在一些情况下， 本文提供的 NP( 例如， 嵌合 NP 如 CD-NP) 可结合于一种以上的 鸟苷酸环化酶受体 ( 包括， 例如， NPR-A 和 NPR-B) 并通过其发挥作用。评价何种受体参与 特定 NP 的功能的方法是本领域已知的， 并包括本文实施例 5 中列出的方法。
本文提供的化合物 ( 例如， 分离的 NP) 可抑制或降低心脏重构， 例如 AMI 或 AHF 后 发生的心脏重构。能够抑制心脏重构的化合物是一种能够使一个或多个指示心脏重构受 到抑制或降低的参数改变至少 10％的化合物， 如下所述。为确定某具体化合物是否具有该 特性， 我们进行了本领域技术人员熟知的试验， 包括本文所述的那些试验。作为变体 NP 的 化合物通常具有相应野生型 NP， 或者， 如果该 NP 是嵌合 NP( 例如， CD-NP)， 则具有含有其中 所含 NP 组分的相应野生型序列的相应嵌合 NP 的生物学活性的至少约 10％ ( 例如， 至少约 10 ％， 15 ％， 20 ％， 25 ％， 33 ％， 40 ％， 50 ％， 60 ％， 67 ％， 75 ％， 80 ％， 85 ％， 90 ％， 95 ％， 100 ％， 或超过 100％ )。核酸、 载体和宿主细胞
本申请文件还描述了编码多肽 ( 例如， NP) 的示例性核酸， 以及含有该核酸的表达 载体和含有该核酸和 / 或表达载体的宿主细胞。如文中所用， 术语 “核酸” 指 RNA 或 DNA， 包 括 cDNA、 基因组 DNA 和合成 ( 例如， 化学合成的 )DNA。核酸分子可是双链或单链的 ( 即有 义链或反义链 )。核酸包括， 例如， 编码本文提供的 NP、 变体 NP 和嵌合 NP 的 cDNA。
“分离的核酸” 是独立于脊椎动物基因组内存在的其他核酸分子， 包括通常侧接在 脊椎动物基因组中该核酸一侧或两侧的核酸的核酸。 此处所用的术语″分离的″对于核酸 而言还可包括任何非 - 天然存在的核酸序列， 因为非 - 天然存在核酸序列在天然情况下不 存在， 不具有在天然存在基因组中紧密相邻的序列。
分离的核酸可以是， 例如， DNA 分子， 前提是通常在天然存在的基因组中发现直接 位于该 DNA 分子侧翼的核酸序列之一已被除去或不存在。因此， 分离的核酸包括， 但不限 于， 作为独立于其他序列的单独分子 ( 例如， 化学方法合成的核酸， 或是通过 PCR 或限制性 内切酶处理产生的 cDNA 或基因组 DNA 片段 ) 存在的 DNA 分子， 以及掺入载体、 自主复制质 粒、 病毒 ( 例如， 逆转录病毒、 慢病毒、 腺病毒或疱疹病毒 ) 或掺入原核生物或真核生物基因 组 DNA 的 DNA。 此外， 分离的核酸可包括工程构造核酸， 如作为杂交或融合核酸一部分的 DNA 分子。存在于， 例如 cDNA 文库或基因组文库或含有基因组 DNA 限制性消化产物的凝胶切片 内的成百至数百万的核酸分子中的核酸不能视为分离的核酸。例如， “分离的 CD-NP 核酸” 可以是编码 CD-NP 至少一部分的含有 9 个或更多 ( 例如， 15 个或更多、 21 个或更多、 36 个 或更多、 或者 45 个或更多 ) 连续核苷酸碱基的 RNA 或 DNA 分子， 或者是与其互补的 RNA 或 DNA。
本文还提供了在严格杂交条件下与编码 NP 的核酸分子 ( 例如， 编码具有 SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 所示氨基酸序列的多肽的核酸分子 ) 选择性杂交的核 酸分子。 术语 “选择性杂交” 表示在使可检测到的非特异性核酸的结合量最小化的杂交和洗 涤条件下可检测地和特异性地结合。例如， 高严格条件可用来实现选择性杂交条件。中等 和严格杂交条件包括本领域熟知的那些。参见， 例如， Sambrook 等第 9.47-9.51 节 (1989)。 文中， 严格条件是 ： (1) 采用低离子强度和高洗涤温度， 如 0.015M NaCl/0.0015M 柠檬酸钠 (SSC)、 0.1％十二烷基硫酸钠 (SDS)、 50℃， 或 (2) 在杂交期间采用去污剂如甲酰胺， 如 50％ 甲酰胺 +0.1％牛血清白蛋白 /0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮 /50mM 磷酸钠缓冲液， pH 6.5+750mM NaCl、 75mM 柠檬酸钠， 42℃。 或者， 可使用 42℃的 50％甲酰胺， 5x SSC(0.75M NaCl， 0.075M 柠檬酸钠 )， 50mM 磷酸钠 (pH 6.8)， 0.1％磷酸钠， 5x 登哈特 (Denhardt’ s) 溶 液， 超声处理的鲑精 DNA(50Tg/ml)， 0.1％十二烷基硫酸钠 (SDS) 和 10％葡聚糖硫酸酯， 在 42℃在 0.2x SSC 和 0.1％ SDS 中洗涤。
分离的核酸分子可采用标准技术制造， 包括但不限于常规的分子克隆和化学核酸 合成技术。例如， 可使用聚合酶链式反应 (PCR) 技术来获得含有编码本文提供的 NP( 例如， CD-NP 或变体 CD-NP) 的核苷酸序列的分离核酸。PCR 指对靶核酸进行酶促扩增的方法或技 术。一般利用核酸的感兴趣区域或该区域以外的末端序列信息来设计寡核苷酸引物， 该引 物序列与有待扩增的模板的反义链上的序列相同。PCR 可用于扩增 DNA 以及 RNA 特异序列 ( 包括来自基因组总 DNA 或细胞总 RNA 的序列 )。引物长度一般为 14 到 40 个核苷酸， 但其 长度范围也可从 10 个核苷酸到数百个核苷酸。通用 PCR 技术描述于， 例如 《PCR 引物 ： 实验室手册》 (PCR Primer ： A Laboratory Manual)， Dieffenbach 和 Dveksler 编， 冷泉港实验 室出版社， 1995。当使用 RNA 作为模板源时， 可使用逆转录酶来合成互补 DNA(cDNA) 链。连 接酶链式反应、 链取代扩增、 自身维持序列复制或基于核酸序列的扩增也可用于获得分离 的核酸。参见， 例如， Lewis(1992)Genetic Engineering News 12 ： 1； Guatelli 等， (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 ： 1874-1878 ； 和 Weiss(1991)Science 254 ： 1292。
分离的核酸也可被化学合成为单一核酸分子 ( 例如， 使用亚磷酰胺技术以 3’ 到 5’ 方向自动合成 DNA) 或一系列寡核苷酸。例如， 可合成含有所需序列的长的一对或多对长寡 核苷酸 ( 例如， ＞ 100 个核苷酸 )， 其中每对含有短的互补性区段 ( 例如， 约 15 个核苷酸 )， 如此当寡核苷酸对退火时可形成双螺旋。 DNA 聚合酶用于延伸该寡核苷酸， 每对寡核苷酸得 到一种双链核酸分子， 然后这些核酸分子可连接进载体。
分离的核酸 ( 例如编码变体 NP 的核酸 ) 也可通过诱变获得。例如， 可采用标准技 术， 包括通过 PCR 的寡核苷酸定向诱变和 / 或定点诱变， 来突变参考序列。参见， 《分子生物 学方法速览》 (Short Protocols in Molecular Biology)， 第八章， 格林联合出版社和约含 韦利森出版社 (Green Publishing Associates and John Wiley & Sons)， Ausubel 等编， 1992。本文提供了变体 NP 的非限制性例子。 本申请文件还描述了编码除 ANP、 BNP、 CNP、 DNP 或者其嵌合体或变体之外的 NP 的 示例性核酸分子。可获得编码 NP 的核酸分子或其互补核酸的核苷酸序列的来源包括通过 本领域已知方法可从中获得 cDNA 的任何真核来源的总 RNA 或聚 A+ RNA， 包括爬虫类 ( 例 如， 蛇 ) 或哺乳动物 ( 例如， 人、 大鼠、 小鼠、 犬、 牛、 马、 绵羊、 山羊或猫 ) 细胞来源。本文提 供的核酸分子的其他来源包括任何真核细胞来源的基因组文库， 包括上述哺乳动物来源。
可采用标准方法鉴定和分离编码天然 NP 的核酸分子， 例如 Sambrook 等， 《分子克 隆实验室手册》 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual)， 冷泉港实验室出版社， 纽约 (1989)。例如， 逆转录酶 PCR(RT-PCR) 可用来从含有感兴趣 RNA 序列的分离 RNA( 例如， 从 人体组织分离的总 RNA) 中分离和克隆 NP cDNA。鉴定、 分离和克隆 NP cDNA 的其他方法包 括， 例如， 筛选 cDNA 文库。
本发明也提供含有例如上述核酸的载体。文中使用的 “载体” 是其中插入其它 DNA 片段能复制该插入片段的复制子， 例如质粒、 噬菌体或粘粒。 “表达载体” 是含有一条或多 条表达控制序列的载体， “表达控制序列” 是控制与调节其它 DNA 序列的转录和 / 或翻译的 DNA 序列。
在本文提供的表达载体中， 核酸 ( 例如， 编码 NP， 如 CD-NP 的核酸 ) 可以操作性连 接于一个或多个表达控制序列。文中使用的 “操作性连接” 指引入遗传构建物， 从而表达控 制序列可有效地控制感兴趣的编码序列的表达。表达控制序列的例子包括启动子、 增强子 和转录终止区域。启动子是由 DNA 分子的一个区域组成的表达控制序列， 该区域通常在转 录起点的上游 100-500 个核苷酸内 ( 一般接近 RNA 聚合酶 II 的起始位点 )。为使编码序列 受控于启动子， 需要将多肽翻译读框的翻译起始位点置于启动子下游 1 到约 50 个核苷酸之 间。增强子能在时间、 位置和水平方面提供表达特异性。与启动子不同， 增强子在离转录位 点不同距离的位置均可起作用。增强子也可位于转录起始位点的下游。当 RNA 聚合酶能将 编码序列转录为 mRNA， 然后该 mRNA 可翻译成由编码序列编码的蛋白质时， 该编码序列就是 “操作性连接” 于并 “受控” 于细胞的表达控制序列。因此， 表达载体可用于制造抗体和其他
多价分子。
合适的表达载体包括 ( 不限于 ) 质粒和病毒载体， 例如得自噬菌体、 杆状病毒、 烟 草花叶病毒、 疱疹病毒、 巨细胞病毒、 逆转录病毒、 痘病毒、 腺病毒和腺相关病毒的载体。许 多载体和表达系统可从以下公司市售获得， 例如诺华基 (Novagen， Madison， WI)、 克隆泰克 (Clontech， Palo Alto， CA)、 司查塔基 (Stratagene， La Jolla， CA) 和英杰 / 生命技术公司 (Invitrogen/Life Technologies， Carlsbad， CA)。
表达载体可含有标记序列， 该序列设计为有助于随后对表达的核酸序列进行操作 ( 例如， 纯化或定位 )。标记序列， 例如绿色荧光蛋白 (GFP)、 谷胱甘肽 S- 转移酶 (GST)、 聚 TM 组氨酸、 c-myc、 血凝素或 Flag 标记 ( 柯达 (Kodak， New Haven， CT)) 序列通常和编码的多 肽一起作为融合体表达。这种标记可被插入多肽内的任何位置， 包括羧基或氨基末端。
也提供了含有载体的宿主细胞。 术语 “宿主细胞” 包括可引入重组表达载体的原核 或真核细胞。文中， “转化” 和 “转染” 包括通过任何一种技术将核酸分子 ( 例如， 载体 ) 引 入细胞。 尽管不局限于具体技术， 这些技术中的许多是本领域熟知的。 可用核酸转化原核细 胞， 例如电穿孔或氯化钙介导的转化。通过包括， 例如， 磷酸钙共沉淀、 DEAE- 葡聚糖 - 介导 的转染、 脂转染、 电穿孔或显微注射在内的技术可将核酸转染入哺乳动物细胞。 转化和转染 宿主细胞的合适方法可见 Sambrook 等， 《分子克隆实验室手册》 ( 第二版 )， 冷泉港实验室， 纽约 (1989)， 转化和 / 或转染试剂是可购得的， 例如， LIPOFECTIN ( 英杰公司 ) ； FUGENE ( 罗氏 (Roche， Indianapolis， IN)) ； 和 SUPERFECT ( 凯杰公司 (Qiagen， Valencia， CA))。
组合物
本文所述化合物 ( 例如， 嵌合和变体 NP， 如 CD-NP)， 或编码本文所述多肽的核酸， 可被掺入组合物给予对象 ( 例如， AMI 或 AHF 患病对象或风险对象 )。配制以及随后给予治 疗组合物的方法是本领域熟知的。剂量通常取决于对象对化合物的反应， 疗程可持续数天 到数月， 或者直到获得合适的反应。 本领域一般技术人员通常可确定最佳剂量、 给药方法和 重复率。最佳剂量可根据抗体的相对功效发生变化， 通常根据体外和 / 或体内动物模型的 EC50 来估算。含有本文提供的化合物 ( 例如， NP) 和核酸的组合物可每天、 每周、 每月或者更 长时间给予一次， 并且可以连续给予一段时间 ( 例如， 数小时、 数天或数周 )。如本文所述， 例如， NP 或含有 NP 的组合物的给药剂量可以是， 在再灌注发生时或大致发生时每千克体重 至少约 0.01ng NP 至约 100mg NP， 或者可以在再灌注发生时或大致发生时开始给予连续输 注并持续 1-7 天 ( 例如， 剂量为约 0.01ng NP/kg/ 分钟至约 0.5μg NP/kg/ 分钟 )。
NP 和核酸可与其他分子、 分子结构、 或者化合物的混合物 ( 例如， 脂质体、 受体或 细胞靶向分子， 或者口服制剂、 局部制剂或其他制剂 ) 混合、 包封、 偶联或结合， 以帮助其摄 取、 分布和 / 或吸收。
在一些实施方式中， 组合物可含有本文提供的 NP 与药学上可接受的载体的组合。 药学上可接受的载体包括， 例如， 用来将抗体递送给对象的药学上可接受的溶剂、 悬浮剂或 任何其他药物惰性载体。药学上可接受的载体可以是液体或固体， 并且可以根据预定给药 方式进行选择， 以便在与一种或多种治疗化合物和给定的药物组合物的任何其他组分组合 提供所需体积、 硬度、 以及其他恰当的运送和化学特性。典型的药学上可接受的载体包括， 但不限于 ： 水； 盐水 ； 粘合剂 ( 例如， 聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素 ) ； 填料 ( 例如， 乳 糖或葡萄糖， 以及其他糖类、 明胶或硫酸钙 ) ； 润滑剂 ( 例如， 淀粉、 聚乙二醇或乙酸钠 ) ； 崩解剂 ( 例如， 淀粉或淀粉羟乙酸钠 ) ； 和润湿剂 ( 例如， 十二烷基硫酸钠 )。
含有本文所述分子的药物组合物可通过多种方法给予， 取决于是否需要局部或全 身治疗。给药可以是， 例如， 肠胃外给药 ( 例如， 通过皮下、 鞘内、 心室内、 肌内或腹膜内注 射， 或通过静脉内 (i.v.) 滴注 ) ； 口服给药 ； 局部给药 ( 例如， 头皮、 舌下、 眼、 或鼻内 ) ； 或 肺部给药 ( 例如， 通过吸入或喷洒粉末或气溶胶 )， 或者可以将这些方法组合。给药可以是 快速的 ( 例如， 通过注射 ) 或者可以在一段时间内发生 ( 例如， 通过缓慢输注或给予缓释制 剂 )。
供肠胃外、 鞘内或心室内给药的组合物和制剂包含无菌水溶液 ( 例如， 无菌生理 盐水 )， 还可含有缓冲剂、 稀释剂和其他合适添加剂 ( 例如， 渗透增强剂、 载体化合物和其他 药学上可接受的载体 )。
供口服给药的组合物和制剂包括， 例如， 粉末或胶囊、 用水或非水介质配制的悬浮 液或溶液、 胶囊、 囊剂、 或片剂。这种组合物也可掺入增稠剂、 调味剂、 稀释剂、 乳化剂、 分散 助剂或粘合剂。
供局部给药的制剂包括， 例如， 有菌和无菌水溶液、 用常规溶剂如醇配制的非水性 溶液、 或者用液态或固态油基料配制的溶液。 这种溶液也可含有缓冲剂、 稀释剂和其他合适 的添加剂。 供局部给药的药物组合物和制剂可包括透皮贴、 软膏剂、 洗剂、 霜剂、 凝胶、 滴剂、 栓剂、 喷雾剂、 液体、 和粉末。 常规药物载体、 水性、 粉末状或油性基料、 增稠剂等可能是有用 的。
药物组合物包括， 但不限于， 溶液、 乳剂、 水性悬浮液和含脂质体的制剂。 这些组合 物可从各种组分制造， 例如其中包括预成型液体、 自乳化固体和自乳化半固体。 乳剂因为易 于配制以及易于溶解、 吸收和生物利用度好而尤其适用于口服递送治疗组合物。脂质体因 为其特异性和长效性而特别有用。
本文提供的组合物可含有任何药学上可接受的盐、 酯、 或这些酯的盐、 或者在给予 对象后能够提供 ( 直接或间接 ) 相关化合物 ( 如 NP) 的生物活性代谢物或其残基的任何其 他化合物。因此， 例如， 本申请文件描述了 NP 的药学上可接受的盐、 前药以及该前药的药学 上可接受的盐， 以及其他生物等价物。前药是被制成非活性形式并在体内或细胞内在内源 性酶或者其他化学物质和 / 或条件的作用下转化成其活性形式 ( 即， 药物 ) 的治疗剂。 术语 “药学上可接受的盐” 表示用于本文提供的方法的 NP 的生理学上和药学上可接受的盐 ( 即 保持亲代 NP 所需生物活性但没有不需要的毒性的盐 )。药学上可接受的盐的例子包括， 但 不限于， 与阳离子 ( 例如， 钠、 钾、 钙、 或聚胺如精胺 ) 形成的盐 ； 与无机酸 ( 例如， 盐酸、 氢溴 酸、 硫酸、 磷酸或硝酸 ) 形成的酸加成盐 ； 与有机酸 ( 例如， 乙酸、 柠檬酸、 草酸、 棕榈酸或延 胡索酸 ) 形成的盐 ； 以及和元素阴离子 ( 例如， 溴离子、 碘离子或氯离子 ) 形成的盐。
组合物还可含有通常用于药物组合物的其他辅助组分。因此， 组合物还可包含相 容的药物活性材料， 如止痒药、 收敛药、 局部麻醉药或抗炎药， 或用于物理配制组合物各种 剂型的其他材料， 如染料、 调味剂、 防腐剂、 抗氧化剂、 遮光剂、 增稠剂和稳定剂。此外， 组合 物可与辅料混合， 所述辅料例如润滑剂、 防腐剂、 稳定剂、 润湿剂、 乳化剂、 影响渗透压的盐、 缓冲剂、 着色剂、 调味剂、 渗透增强剂和芳香性物质。然而， 当添加时， 这种材料应不会影响 组合物内其他组分的生物活性。
本文所述的药物制剂一般采取单位剂型， 可按照制药工业中熟知的方法制备。这种技术包括使活性剂 ( 即抗体 ) 与所需药物载体混合的步骤。 通常， 制备制剂时可将活性成 分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀地充分混合， 然后如果需要再使产品成型。如 果需要， 制剂可以是无菌的， 前提是灭菌方法不会影响制剂内所含分子的功效。
降低或抑制心脏重构的方法
本申请文件还提供了本文所述化合物 ( 例如， NP) 在治疗例如 AHF 和 AMI 以及在 抑制或降低心脏重构中的应用。因此， 本文提供的化合物和核酸分子可给予哺乳动物 ( 例 如， 人或非人哺乳动物 ) 以降低或抑制例如在 MI 之后可能发生的心脏重构。在一些实施方 式中， 术语 “给予” 在文中包括开出被哺乳动物使用以降低或抑制心脏重构的化合物或组合 物的处方。在一些实施方式中， 例如， 本文提供的 NP 或组合物可给予被诊断患有 AMI 的哺 乳动物。所述组合物或 NP 可采取任何合适剂量， 所述剂量取决于包括但不限于所选药剂、 疾病、 预防或治疗目的在内的各种因素。给药可以是局部给药或全身给药。
在一些实施方式中， NP 或含有 NP 的组合物的给药剂量为每千克体重至少约 0.01ng NP/kg 至约 100mg NP/kg( 例如， 约 10ng NP/kg 至约 50mg NP/kg， 约 20ng NP/kg 至 约 10mg NP/kg， 约 0.1ng NP/kg 至约 20ng NP/kg， 约 3ng NP/kg 至约 10ng NP/kg， 或约 50ng NP/kg 至约 100μg/kg)， 但其他剂量也可能提供有益结果。 在一些情况下， 含有 NP 如 CD-NP 或其变体的组合物可在再灌注开始时或大致开始时 ( 即， 在闭塞的动脉打开时 ) 作为连续 静脉输注给予， 并持续 1-7 天 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6 或 7 天 )。这种组合物的给药剂量可以 是， 例如， 约 0.1ng NP/kg/ 分钟至约 500ng NP/kg/ 分钟 ( 例如， 约 0.5ng NP/kg/ 分钟， 约 1ng NP/kg/ 分钟， 约 2ng NP/kg/ 分钟， 约 3ng NP/kg/ 分钟， 约 5ng NP/kg/ 分钟， 约 7.5ng NP/kg/ 分钟， 约 10ng NP/kg/ 分钟， 约 12.5ng NP/kg/ 分钟， 约 15ng NP/kg/ 分钟， 约 20ng NP/kg/ 分钟， 约 25ng NP/kg/ 分钟， 约 30ng NP/kg/ 分钟， 约 50ng NP/kg/ 分钟， 约 100ng NP/kg/ 分钟， 或约 300ngNP/kg/ 分钟 )。在一些实施方式中， 含有 NP 的组合物可以在再灌 注之前 ( 例如， 再灌注之前约 1 小时 )， 作为一个或多个单个剂量给予或作为连续输注 ( 从 再灌注之前约 1 小时开始 ) 给予。例如， 可以在再灌注之前约 1 小时、 约 45 分钟、 约 30 分 钟或约 15 分钟时开始给予组合物。在一些情况下， 本文提供的含有 NP 的组合物可在再灌 注之后 ( 例如， 在再灌注发生约 10 小时内 )， 作为一个或多个单个剂量给予或作为连续输 注 ( 在再灌注发生约 10 小时内开始 ) 给予。例如， 可在再灌注发生后约 1 小时、 约 2 小时、 约 3 小时、 约 4 小时、 约 5 小时、 约 6 小时、 约 7 小时、 约 8 小时、 约 9 小时或约 10 小时给予 组合物。
在一些实施方式中， NP 或含有 NP 的组合物可在第一时期通过第一途径 ( 例如， 静 脉内 ) 给予， 然后在第二时期通过另一途径 ( 例如， 皮下 ) 给予。例如， 含有 NP 的组合物可 静脉内给予哺乳动物 ( 例如， 人 )， 给药剂量为约 0.1ng NP/kg/ 分钟至约 300ng NP/kg/ 分 钟 ( 例如， 约 1ng NP/kg/ 分钟至约 15ng NP/kg/ 分钟， 约 3ng NP/kg/ 分钟至约 10ng NP/ kg/ 分钟， 或约 10ng NP/kg/ 分钟至约 30ng NP/kg/ 分钟 )， 为期 1-7 天 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6 或 7 天 )， 然后皮下给予哺乳动物， 给药剂量为约 10ng NP/kg/ 天至约 100ng NP/kg/ 天 ( 例 如， 约 10ng NP/kg/ 天， 约 20ng NP/kg/ 天， 约 25ng NP/kg/ 天， 约 30ng NP/kg/ 天， 约 50ng NP/kg/ 天， 或约 100ng NP/kg/ 天 )， 为期 5-30 天 ( 例如， 7、 10、 14、 18、 21、 24 或 27 天 )。
文中提供的方法可包括给予哺乳动物有效量的 NP( 例如， 嵌合或变体 NP) 或编码 NP 的核酸， 或有效量的含有这种分子的组合物。文中， 术语 “有效量” 是足以使哺乳动物受者体内表示心脏重构降低和 / 或肾脏保护的参数中的一个或多个 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个 ) 改变至少 10％ ( 例如， 10％， 15％， 20％， 25％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 75％， 80％， 85％， 90％， 95％， 99％， 或 100％ ) 的分子或组合物的用量。例如， 本文提供的 NP 的有效量是能够使射血分数、 GFR、 UNaV 或 UV 提高至少 10％， 和 / 或能够使 PRA、 LV 质 量、 CF 增殖、 PWCP、 RAP、 MAP、 醛固酮水平、 LV 肥大、 心室纤维化、 LV 收缩末期内径、 PFRNa 或 DFRNa 降低至少 10％的量， 和 / 或能够导致心脏负载降低的用量。在一些实施方式中， 本发 明方法可包括给予哺乳动物一定用量使表示心脏重构降低和 / 或肾脏保护的一个或多个 参数改变至少 50％的 NP 或组合物。
在一些实施方式中， 例如， 本文提供的 NP 的 “有效量” 可以是， 与给予 NP 之前或未 给予 NP 的哺乳动物中的参数水平 ( 例如， 在之前的 MI 发作中观察到的参数水平 ) 相比， 使 经治疗的哺乳动物的 PRA 和 MAP 降低至少 10％以及 GFR 和 UV 升高至少 10％的用量。这种 参数可以通过下述实施例中描述的方法测定。
以下实施例进一步描述了本发明， 这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范 围。 实施例 实施例 1- 材料和方法
多肽合成 ： 基于已知的 DNP 和 CNP 序列合成两种肽。首先， 合成 DNP 的线性 15-AA C- 末端序列 (PSLRDPRPNAPSTSA ； SEQ ID NO ： 2； 图 1)。该肽被称为 “C- 末端” 。然后， 合成 CNP(SEQ ID NO ： 1； 图 1) 和 DNP C- 末端的嵌合体 (GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPST SA ； SEQ ID NO ： 3)。 该 37-AA 嵌合肽被称为 “CD-NP” 。 利用梅约蛋白核心设备 (Mayo Protein Core Facility)， 采用固相方法在 ABI 431A 肽合成仪 (PE 生物系统公司 (PE Biosystems， Foster City， CA)) 中在预装载 N-Fmoc-L- 氨基酸 (SP 公司 (SynPep， Dublin， CA)) 的王氏 树脂上合成这两个肽。将各个氨基酸和连接于树脂的肽在 1- 甲基 -2- 吡咯烷酮 (NMP) 中 偶联 40 分钟。每个 Fmoc 氨基酸在 HOBT/DCC 的 NMP 溶液中活化 30 分钟。Fmoc 保护基的 去保护在 10％哌啶的 NMP 溶液中进行 20 分钟， 然后与接下来的活化的氨基酸偶联。随后， 对肽进行去保护并用 82.5％三氟乙酸 (TFA)/5％水 /5％苯甲硫醚 /2.5％乙二硫醇 /5％苯 酚的混合物室温处理 2 小时从树脂上除下。每种肽在 3x50ml 冷的甲基叔丁基醚中沉淀进 行洗涤并通过反向 HPLC 纯化， 纯化采用 Jupiter C18 柱 ( 非诺尼克斯公司 (Phenomenex， Torrance， CA))， 用 0.1％ TFA/ 水以 10-70％ B 梯度洗脱 50 分钟。
在帕金埃尔默 (Perkin/Elmer)Sciex API 165 质谱仪 ( 帕金埃尔默生物系统公司 (PE Biosystems， Foster City， CA)) 上通过电喷雾离子化 (ESI) 质量分析法验证每种肽的 身份。在 50mM 碳酸氢铵 pH 8.5 缓冲液中空气氧化过夜以便在 CD-NP 中形成二硫键。
C- 末端和 CD-NP 在正常犬中的综合体内生物活性 ： 在独立的 5 组正常麻醉的犬中 进行实验。所有研究符合美国生理学会的指南并经梅约临床动物护理和使用委员会 (Mayo Clinic Animal Care and Use Committee) 批准。
在实验前一天晚上给动物口服 300mg 碳酸锂以评价节段性肾小管功能， 然后禁食 过夜。 在急性实验当天， 所有的犬用静脉注射戊巴比妥钠麻醉 (30mg/kg)。 对犬进行机械呼 吸 ( 哈佛呼吸器， 哈佛仪器公司 (Harvard Apparatus， Millis， MA))， 以 4L/ 分钟供给氧气。
切开左侧露出肾脏。进行输尿管插管定时采集尿液， 在左肾动脉周围放置标有刻度的电磁 流量探测器并与流量计 (FM 5010 型， King， NC) 相连， 以便监测肾血流量 (RBF)。最后在右 股静脉中插入两根聚乙烯管 (PE-240)， 一根用来输注菊糖， 另一根用来输注 C- 末端。在右 股动脉插管以直接测量动脉血压和采集动脉血样品。为测量接受 CD-NP 或 BNP 的组的心脏 充盈压， 以及为测量心输出量， 在右颈静脉中插入 Swan-Ganz 管 (Edwards， Mountain View， CA)。
手术准备完成之后注射初始剂量的菊糖 (ICN 生物医学公司 (ICN Biomedicals， Cleveland， OH))， 然后恒定输注 1ml/ 分钟。不加干涉让犬平衡 60 分钟。平衡期之后进行 30 分钟基线清除 ( 基线 )。之后是 15 分钟的导入期， 期间对第一组 (n ＝ 6) 以 42ng/kg/ 分钟静脉内输注 C- 末端， 之后是第二次 30 分钟的清除期 (C- 末端 )。将静脉内盐水控制在 1ml/ 分钟 (n ＝ 6) 作为 CD-NP 组的对照。在每次清除期间记录肾血液动力学和排泄反应。 对第三组输注 30 分钟三种不同浓度 (10、 50 和 100ng/kg/ 分钟 ) 的 CD-NP， 每种剂量有 15 分钟的导入期。组 4(n ＝ 6) 和组 5(n ＝ 6) 分别接受等摩尔浓度的 10 和 50ng/kg/ 分钟的 CD-NP 或 BNP。
通 过 火 焰 发 射 分 光 光 度 计 (IL943，火 焰 光 度 计，实 验 室 仪 器 公 司 (Instrumentation Laboratory， Lexington， MA)) 测量血浆和尿中的电解质， 包括锂。血 浆和尿菊糖浓度通过蒽酮法测量， GFR 通过菊糖的清除率测量。采用锂清除率技术来估算 PFRNa 和 DFRNa。PFRNa 是用以下公式计算的 ： [1-( 锂清除率 /GFR)]x100。DFRNa 是用以下 公式计算的 ： [( 锂清除率 - 钠清除率 )/ 锂清除率 ]x100。血浆和尿液的 cGMP 和血浆肾素 活性 (PRA) 用市售放射性免疫测定按照之前的描述测量。
有 关 CD-NP cGMP 生 成 和 对 人 心 脏 成 纤 维 细 胞 的 细 胞 增 殖 抑 制 的 体 外 研 究 ： 研 究 在 人 CF(SC 公 司 (ScienCell， San Diego， CA)) 内 按 照 之 前 描 述 的 方 法 (Tsuruda 等， (2002)Circ Res 91 ： 1127-1134) 进 行。 实 验 仅 采 用 1-4 代 的 细 胞。 使 细 胞 接 触 -11 -6 CD-NP(10 -10 M)15 分钟以测定 cGMP 活性。样品用竞争性 RIA cGMP 试剂盒 (PE 公司 (Perkin-Elmer， Boston， MA)) 测定。简言之， 将样品和标准品与抗 - 人 cGMP 单克隆抗体和 125 I - 抗原一起培育 18 小时。在样品中加入环 GMP 测定缓冲液并 2500rpm 离心 20 分钟。吸 出游离部分， 测定结合部分的数量和浓度。数值表示为 pmol/ml。与 ANP、 BNP、 CNP 或 ET 没 有交叉反应性， 与 cAMP、 GMP、 GDP、 ATP、 GTP 的交叉反应性＜ 0.001％。
为进行 CF 增殖研究， 1-4 代的 70-80％汇合细胞用 10-8M 心脏营养素 -1 处理 24 小 时以诱导细胞增殖。在心脏营养素 -1- 刺激的 CF 中加入浓度为 10-8M 的 CD-NP 以确定它对 细胞增殖的影响。未处理的成纤维细胞作为对照。按照说明进行比色溴脱氧尿苷 (BrdU) 细胞增殖 ELISA( 罗氏 (Roche， Indianapolis， IN))。简言之， 在 CO2 37℃培养箱内将 CF 用 BrdU 标记 2 小时。加入抗 -BrdU 并在室温反应 90 分钟。除去抗 -BrdU 并用洗涤溶液将 CF 洗涤三次。加入比色底物溶液并显色 30 分钟。在 SpectraMax 分光光度计 ( 分子装置公司 (Molecular Devices， Sunnyvale， CA)) 上测量 370nm 的吸光度。
统计分析 ： 定量研究结果用平均值 ± 标准差表示。 当采用斯氏检验比较一个组内 的两种清除率时， 以及当比较多种清除率时， 使用重复测量 ANOVA+ 事后邓奈特检验。用双 向 ANOVA+ 邦弗朗尼事后检验进行组间统计比较。P 值＜ 0.05 表示有统计显著性。
实施例 2-DNP 的 C- 末端和 CD-NP 的体内作用缺乏 DNP 核心环结构的 DNP 的 C- 末端是有利尿钠和利尿作用的 ( 图 2)。利尿钠 作用局限于肾单位的近端区段， 原因是观察到近端钠重吸收分数 (PFRNa) 降低， 说明肾单 位的该部分对这种小肽的肾作用有贡献 ( 表 2)。肾小球滤过率 (GFR)、 肾血流量 (RBF) 或 尿 cGMP 排泄没有显著改变。重要的是， 在与 C- 末端组一样接受 1ml/ 分盐水的时间对照组 中， 肾功能参数未改变。
图 3 说明了对 CD-NP 输注的体内反应。所有三种剂量的 CD-NP 都降低了肺毛细血 管楔压 (PCWP)， 而两种剂量降低了右房压 (RAP)。即便在输注高剂量 CD-NP 期间， 与这些心 脏负载降低反应相关的也是极轻微的平均动脉压 (MAP) 的降低。在正常犬中也观察到了 CD-NP 的强利尿钠和利尿反应 ( 图 4)。具体地说， 中等剂量和高剂量的 CD-NP 都提高了钠 泌尿排泄 (UNaV) 和尿流量 (UV)( 图 4)。尽管在输注高剂量 CD-NP 期间 MAP 略微降低， 但 GFR 升高了。
利尿钠作用和利尿作用与近端小管钠重吸收降低有关， 因为在输注中等剂量 CD-NP 期间 PFRNa 降低。此外， 观察到在输注中等剂量和高剂量 CD-NP 期间远端钠重吸收 分数 (DFRNa) 降低， 说明 CD-NP 也参与末端肾单位的活性 ( 图 5)。在 CD-NP 输注停止后这 些肾脏参数回归基线水平。这些作用也与输注低剂量和中等剂量 CD-NP 期间血浆肾素活性 (PRA) 受到抑制有关 ( 表 3)。输注结束后 PRA 回归基线水平。中等剂量和高剂量的 CD-NP 提高了血浆和尿液 cGMP( 表 3)。
剂量为 50ng/kg/ 分钟的 CD-NP 显著升高 GFR， 与接受等摩尔剂量 BNP 的组 GFR 没 有升高相反 ( 图 6)。重要的是， 这种剂量的 CD-NP 造成的血压降低弱于 BNP。
表2
输注 C- 末端引起的肾血液动力学反应和排泄反应
基线 GFR(ml/ 分钟 ) RBF(ml/ 分钟 ) PFRNa(％ ) DFRNa(％ ) UcGMPV(pmol/ 分钟 )
34±6 213±19 77.9±2.7 98.7±0.3 1674±213 C- 末端 44±6 198±27 71.0±2.6* 97.8±0.5 2275±231数据表示为平均值 ±SE ； C- 末端， 以 42ng/kg/ 分钟输注 DNP 的 C- 末端 (n ＝ 6) ； GRF， 肾小球滤过率 ； RBF， 肾血流量 ； PFRNa， 近端尿重吸收分数 ； DFRNa， 远端尿重吸收分数 ； UcGMPV， 尿 cGMP 排泄 ； * 对比基线 P ＜ 0.05。
表3
正常动物对输注 CD-NP 的神经体液反应
数据表示为平均值 ±SE ； CD-NP 10， 以 10ng/kg/ 分钟输注 CD-NP ； CD-NP 50， 以 50ng/kg/ 分钟输注 CD-NP ； CD-NP 100， 以 100ng/kg/ 分钟输注 CD-NP(n ＝ 8， 高剂量组 n ＝ * 6) ； PcGMP， 血浆 cGMP ； UcGMPV， 尿 cGMP 排泄 ； PRA， 血浆肾素活性 ； 对比基线 P ＜ 0.05。
实施例 3- 心脏成纤维细胞中 CD-NP 介导的 cGMP 生成和增殖抑制
培养的人 CF 中的体外研究证实， CD-NP 以剂量依赖性方式激活 cGMP( 图 7A)。此 外， 当 与 CNP、 BNP 和 DNP 比 较 时， CD-NP 生 成 的 cGMP 类 似 于 CNP 且 显 著 (p ＜ 0.05) 高 于 10-6M 的 DNP 和 BNP。然后用促纤维化和肥大细胞因子心脏营养素 -1 进行实验来确定 CD-NP 是否具有抗增殖作用。这种细胞因子是 CF 的强力激活剂， 并在例如 AMI 和心力衰 竭等状态下活化 (Jougasaki 等， (2000)Circulation 101 ： 14-17 ； Talwar 等， (2002)Clin Sci(Lond)102 ： 9-14 ； 和 Tsuruda 等， (2002)Circ Res 90 ： 128-134)。由 BrdU 摄取 (DNA 合 成和细胞增殖的度量 ) 可以估测 CD-NP 在人 CF 中抑制心脏营养素 -1 诱导的细胞增殖 ( 图 7B)。
实施例 4- 评价 CD-NP 对 MI 后大鼠 LV 质量的影响的体内研究
通过对 Wistar 大鼠 (150-250g) 进行冠状动脉左前降支结扎造成心肌梗死 (MI)， 并在每只大鼠的背部皮下空间插入迷你渗透泵 (2ML2 型 Alzet 渗透泵 )。以 1.7x10-7g/kg/ 分钟剂量皮下给予 CD-NP 2 周。根据急性实验前和 MI 后三周的超声心动图估算 LV 质量。 用 CD-NP 处理导致 MI 后三周的 LV 质量相比对照 MI- 未处理组降低 ( 图 8)。具体地说， MI 组的 LV 质量为 1.351±0.03764(N ＝ 10)， 而 MI+CD-NP 组的 LV 质量为 1.150±0.03651(N ＝6； p ＝ 0.0031)。
实施例 5-CD-NP 和 CNP-C 的体内作用
按照国立卫生研究院关于实验动物护理和应用指南的规定在雄性杂种犬 (n ＝ 25) 中进行动物研究。在实验前一晚对每只犬禁食， 允许随意饮水并口服给予 300mg 碳酸 锂以便第二天评价肾管功能。用戊巴比妥钠 ( 静脉内 6-20mg/kg 诱导， 静脉内 5-15mg/kg/ 小时维持 ) 和芬太尼 (0.04-0.12mg/kg i.v.， 0.04-0.18mg/kg/ 小时维持 ) 麻醉犬， 插管 并以 5L/ 分钟 O2( 潮气量 15mL/kg， 12 次 / 分钟 ) 进行机械呼吸 ( 哈佛仪器公司 )。在股 动脉中插管以监测血压和采血样， 并在股静脉中插管以输注菊糖和生理盐水。在隐静脉中 插管进行肽输注。用连有气囊的热稀释导管 (EL 公司 (Edwards Lifesciences， Irvine， CA)) 来监测血液动力学同时通过体侧切口暴露左肾， 并在输尿管中插管以定时采集尿液。 将电磁流量探测器置入肾动脉以测量肾血流量 (Burnett 等， (1984)Am J Physiol 247 ： F863-866)。推注根据体重调整过的菊糖， 然后进行输注 (1mL/ 分钟 ) 以使血浆水平达到 40-60mg/dL(Burnett 等， (1984) 同上 ； Chen 等， (2005)Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288 ： R1093-1097 ； 和 Margulies 等， (1991)J Clin Invest 88 ： 1636-1642)， 以便 通过菊糖清除率测量 GFR。
60 分钟的平衡期之后获得 30 分钟输注前清除率。之后是 75 分钟连续静脉内 (i.v.) 输注 CD-NP(50ng/kg/ 分钟 )(n ＝ 10) 或等摩尔浓度的 CNP(n ＝ 9)。连续输注期包 括 15 分钟导入和两次 30 分钟清除， 随后是 30 分钟的洗出和输注后清除。在 3 只不同的犬 中测试了连续静脉内输注 75 分钟陷阱蛋白 CNP-C(50ng/kg/ 分钟 )。列出了三个 30 分钟清 除的数据 ( 输注前、 输注 30 分钟时， 以及输注 60 分钟时 )。
血浆和尿 cGMP 水平通过放射性免疫测定测量 (RIA ； Steiner 等， (1972)J Biol Chem 247 ： 1106-1113)。测量血浆肾素活性 (Haber 等， (1969)J Clin Endocrinol Metab 29 ： 1349-1355)、 血管紧张素 II(Luchner 等， (1996)Hypertension 28 ： 472-477) 和醛固酮 (Sancho 和 Haber(1978)J Clin Endocrinol Metab 47 ： 391-396)。 血浆和尿的锂水平通过 火焰发射分光计 ( 型号 357， 实验室仪器公司 ) 测量以评估肾小管对钠的处理 (Steiner 等， 同上 )。
为评估分离的肾小球中的 cGMP 活性， 犬 (n ＝ 3) 用戊巴比妥钠麻醉， 立即取出肾 脏并按照之前描述的方法分离肾小球 (Supaporn 等， (1996)Kidney Int 50 ： 1718-1725)， 这种方法基于 Chaumet-Riffaud 等描述的方法 ((1981)Am J Physiol 241 ： F517-524)， 基 本不作修改。为量化 cGMP 对研究肽的反应， 将等分肾小球 (300μL， 悬浮于 Krebs 缓冲液 ) -5 与 CD-NP 或 CNP( 终浓度 10 M) 一起 37℃培育 10 分钟 ( 在预培育 10 分钟后 )， 培育时存在 异丁基甲基黄嘌呤 (0.3mM)， 终体积为 500μL。对照包含相同的组合物， 但用 Krebs 缓冲液 代替悬浮于 Krebs 缓冲液的肾小球。加入 300μL 冰冷的三氯乙酸 (TCA， 终浓度 6.6％ ) 中 止反应并将培育物离心。用醚萃取 800μL 上清液等分样品用于 cGMP 测定 (Steiner 等， 同 上； 和 Supaporn 等， 同上 )， 其余上清液用 1N NaOH 中和并通过蛋白质测定 (BCA 蛋白质测 定， 皮尔斯生物技术公司 (Pierce Biotechnology， Rockford， IL)) 分析。对用 NPR-A 拮抗 剂 A71915 10( 终浓度 1μM) 预处理的分离的肾小球重复上述过程。将结果折算成蛋白质 水平并用 fmol/μg 表示。
CD-NP( 瑞士克林纳法公司 (Clinalfa，Switzerland)) 和 CNP( 菲尼克斯制药公司 (Phoenix Pharmaceuticals， Inc.， Belmont， CA， USA))( 图 1) 用生理盐水重 建。 检测静脉内连续输注 75 分钟给予的 CD-NP(50.0ng/kg/ 分钟 ； 或 13.35pmol/kg/ 分钟 ) 以及等摩尔剂量的 CNP(29.3ng/kg/ 分钟 )。陷阱蛋白 CNP-C 定制合成 ( 图 1)。 这些体内研究证实 CD-NP 显著激活利尿钠肽第二信使 cGMP， 血浆和尿排泄以及肾 脏本身的净肾生成大幅升高证明了这一点， 这与对 CNP 的反应明显不同 ( 图 9A)。 近端和远 端钠重吸收分数的降低证明较强的利钠作用同时定位于近端和远端小管 ( 表 4)， 用 CD-NP 观察到增强的 GFR， 但 CNP 则没有 ( 图 9B)。 任一组均未检测到平均动脉压显著改变 ( 表 5)。 CD-NP 降低了右房压和肺毛细血管楔压， 但 CNP 不能 ( 表 5)。CD-NP 显著抑制 PRA 和血管紧 张素 II(ANG II) 水平， 而 CNP 组的改变在统计学上不显著 ( 表 6)。因此， DNP 的 C- 末端与 成熟 CNP 融合将 CNP 转变成一种具有肾脏活性、 能降低心脏负载的肽， 该肽能抑制肾素 - 血 管紧张素系统 (RAS) 但不会降低动脉压。
为 证 实 体 内 肾 和 RAS 调 节 作 用 是 否 一 定 需 要 DNP 的 C- 末 端， 设计了一种将 CNP 的 N- 末端氨基酸序列融合入 CNP 的空白 C- 末端位置的转化的 CNP。这种多肽被称 为 CNP-C， 由全长 22- 氨基酸 CNP 和融合于 CNP C- 末端的 N- 末端 5 氨基酸复制体构成 (GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCGKSLG ； SEQ ID NO ： 4)。该肽的融合不会导致血浆 cGMP、 尿 cGMP
排泄、 利尿作用、 利钠作用、 GFR、 PRA 或 ANG II 的任何显著改变。 输注 60 分钟时肺毛细血管 楔压 (4.3±0.8 到 3.4±0.8mmHg) 和平均动脉压 (132±6 到 128±5mmHg) 相比基线略微降 低 (P ＜ 0.05)。因此， DNP 的 C- 末端专门负责将 CNP 转变成一种具有肾脏活性和 RAS- 调 节作用的肽， 而 CNP-C 不能增加肾功能或抑制 RAS。 这些数据显示 CNP 转化将来有可能包括 将 CNP 与非 -CNP 肽序列融合。
尽管 NPR-B 受体存在于肾脏内， 但它们与肾小球滤过率或钠排泄的调节作用无 关。其实， 这种与利尿钠肽有关的肾脏作用与 NPR-A 受体相关。从犬分离肾小球以确定 CD-NP 的肾脏作用是否与 NPR-A(ANP、 BNP 和 DNP 的受体 ) 有关， 认为与 CNP 融合的 DNP 的 N- 末端将唯一激活肾小球中的 cGMP， NPR-A 拮抗剂的药理性拮抗作用能够将其中止。在 -5 分离的犬的肾小球中， CD-NP(10 M) 激活 cGMP 的程度大于对照安慰剂。在等摩尔浓度时 -5 (10 M)， CD-NP 激活 cGMP 的程度大于 CNP( 图 10E)。用 NPR-A 拮抗剂 (Sancho 和 Haber， 同 上 )(1μM) 预处理导致 cGMP 反应减弱， 证明 CD-NP 在肾脏中也参与 NPR-A 的活化。
实施例 6- 人临床试验结果
以下在犬类和啮齿类中进行的毒理学研究验证了 CD-NP 的安全性， 首轮人临床试 验正在正常人类志愿者中进行。
研究方案 ： 按照赫尔辛基宣言及修改条款、 美国食品药品管理局关于优良临床 试验规范的原则、 以及国际药品注册协调会议的指南进行 CD-NP 的人临床试验。该临床 试验包括两个阶段 ： 标签公开连续按比例升高剂量研究 ( 阶段 1) 和随机的双盲安慰剂 (PLB)- 对照研究 ( 阶段 2)。 在阶段 1 中， 给剂量递增研究 (10、 17.5 或 25ng/kg/ 分钟， i.v.， 4 小时 ) 招募三组、 每组 4 名对象。在阶段 2 中， 对 10 名对象随机进行双盲研究 (CD-NP 和 安慰剂 PLB 的比例为 6 ∶ 4)， 该研究评价了 CD-NP 和 PLB(i.v.， 4 小时 ) 的最大耐受剂量 (MTD， 在阶段 1 中确定 )。
主要的选择标准包括 ： 1)18-60 岁的健康男性、 绝经后女性或手术绝育女性 ； 2) 2 BMI 范围为 18-34kg/m ； 3) 能够有效交流 ； 4) 没有显著疾病或异常 ； 5)12- 导联心电图正 常； 6) 非吸烟者， 定义为在过去 6 个月内不吸烟 ； 和 7) 充分告知研究的性质和风险， 并在接 受研究药物之前得到书面知情同意书。
主要的淘汰标准包括 ： 1) 已知对 CD-NP 或其组分、 奈西立肽、 其他利尿钠肽、 或相 关化合物过敏或敏感 ； 2) 怀孕或哺乳的女性 ； 3) 任何疾病或症状 ( 内科或外科症状 )， 在研 究人员看来这些疾病或症状可能涉及血液学、 心血管、 肺部、 肾脏、 胃肠道、 肝脏或中枢神经 系统 ； 或者是可能影响研究药物吸收、 分布、 代谢或排泄， 或者可能提高对象风险的其他征 状； 4) 存在临床上显著的异常实验值 ； 5) 乙肝 ( 乙肝表面抗原 HbsAg)、 丙肝 ( 抗 HCV， 丙肝 抗体 ) 或 HIV( 抗 -HIV 1/2) 筛选呈阳性 ； 6) 在参与研究之前的 30 天内接受过试验药 ； 6) 在给予第一剂量任何研究相关治疗之前的 1 周内或 5 个半衰期之内接受过任何药物治疗。 对于任何已知会诱导或抑制肝脏药物代谢的药物这种淘汰可延伸至 4 周。在第一次给予任 何研究相关处理之前的至少 5 个半衰期内尤其禁止使用非甾类抗炎药、 磺胺类、 丙磺舒或 其他已知会改变肾或肾小管功能的药物 ； 7) 在给药前 48 小时内或在住院期间的饮酒 ； 8) 包括乙醇、 可卡因、 四氢大麻酚 (THC)、 巴比妥类、 苯丙胺类、 苯二氮卓类和阿片类在内的尿 液药物筛选呈阳性 ； 9) 在至少 2 年内有酒精滥用史、 使用违禁药品、 明显精神疾病、 对任何 阿片样物质的生理依赖性、 或任何药物滥用或成瘾史 ； 10) 献血困难史 ； 和 11) 在招募前 45天内使用捐赠的血液或血液产品。
数据分析 ： 肾、 神经体液和血液动力学数据表示为平均值 ±SEM。肽输注开始后 16-45 分钟以及 46-75 分钟的清除率分别用 “30 分钟” 和 “60 分钟” 表示。在各个组中， 采 用重复测量单向方差分析 (ANOVA)、 然后用适用的事后邓奈特多重比较检验来比较肽输注 30 和 60 分钟以及输注后的参数与输注前的值 (Chen 等， 同上 ； 和 Cataliotti 等， (2004) Circulation 109 ： 1680-1685)。采用双向 ANOVA 然后通过邦弗朗尼事后检验进行组间比 较 (Chen 等， 同上 ； 和 Cataliotti 等， 同上 )。统计显著性定义为 P ＜ 0.05。用 GraphPad Prism 4(GraphPad 软件公司， San Diego， CA) 对犬的数据进行统计分析。首次人临床试验 的统计分析采用统计分析软件 ( 版本 9) 进行。在临床试验的随机双盲阶段分析 CD-NP 组 和安慰剂 (PLB) 组的肾、 血液动力学和神经体液数据。采用参数和非参数检验进行组内比 较 ( 输注终点与基线的比较 ) 和组间比较 ( 基线比较和输注终点比较 )， 如表 7 所示。
结果 ： 确定最高耐受剂量之后给予 CD-NP(17.5ng/kg/ 分钟 ) 为期 4 小时， 并与安 慰剂进行比较。CD-NP 升高了血浆 cGMP、 尿 cGMP 排泄和尿钠排泄 ( 图 10A-10C 和表 7)。 与基线相比， CD-NP 组的尿流量升高 (1.1±0.2 到 2.3±0.4mL/ 分钟 ； PLB 1.3±0.2 到 1.6±0.4mL/ 分钟 )。两组间的平均动脉压 ( 图 10D) 和 GFR 没有差别。CD-NP 抑制血浆醛 固酮， 从 21.9±2.7 变为 9.5±3.2ng/dL(P ＜ 0.001)。
这些数据证实， 静脉舒张剂 CNP 可被转化成对血压影响甚微的肾 - 增强、 RAS- 抑 制、 并且心脏负载降低的肽， 使其成为对于治疗 AHF 有效的有吸引力的下一代治疗剂。这些 研究同时提供了两个原则 ： (1) 在 CNP 的空白 C- 末端添加 C- 末端氨基酸序列必须是特异 性的， 因为融合 DNP 的 C- 末端之外的氨基酸序列 ( 如 CNP 的 N- 末端 ) 是无效的 ； 和 (2) 添 加 DNP 的 C- 末端将 CNP 转化成不仅是 NPR-B 激活剂， 该多肽在肾脏中还激活 NPR-A。此外， 这些数据将动物和体内研究延伸至首次人体研究， 确立了 CD-NP 在人中能激活 cGMP 途径、 提高钠排泄、 以及抑制醛固酮， 同时与内源性天然肽 CNP 相比对血压的影响甚微的概念。
该研究还表明， CNP 可被转化成有效的治疗肽， 与 CNP 不同， 这种肽是利尿钠和抑 制醛固酮的， 并且与 CNP 一样几乎不会降低血压， 同时能降低心脏负载。使用具有 CNP 的 N- 末端的陷阱剂为将来的嵌合设计提供了一种思路， 并强调了特异性增加 CNP 的 C- 末端激 活肾脏中的 NPR-A。总之， DNP 的 C- 末端与全长 22-AA 肽 CNP 融合将 CNP 转化成了一种与 治疗心肾疾病综合征相关的降低心脏负载的、 肾素抑制和肾功能增强的设计肽。
表4
CD-NP 或 CNP 静脉输注引起的肾血液动力学和排泄反应
平均值 ±SEM。与输注前 ( 前 -I) 的组内比较 ( 平均值 ±SE， ) 以及组间 ‖ 比较 ( ＜ 0.001 )。GFR， 肾小球滤过率 ； RV-R， 肾血管阻力 ； I， 输注 ； PFRNa， 近端 Na+ 重吸收分数 ； DFRNa， 远端 Na+ 重吸收分数。
表5
CD-NP 或 CNP 静脉输注引起的心血管血液动力学反应
值为平均值 ±SEM。与输注前 ( 前 -I) 的组内比较 ( 平均值 ±S.E.M.， P ＜ 0.05*， ) 以及组间比较 (P ＜ 0.01§)。I， 输注 ； MAP， 平均动脉压 ； PAP， 肺动脉压 ； PCWP， 肺毛 细血管楔压 ； RAP， 右房压 ； CO， 心输出量 ； SVR， 全身血管阻力 ； PVR， 肺血管阻力。
表6
CD-NP 或 CNP 静脉输注引起的激素反应
值为平均值 ±SEM。与输注前 ( 前 -I) 的组内比较 ( 平均值 ±SEM，§ ‖) 以及组间比较 (＜ 0.01 ， ＜ 0.001 )。PRA， 血浆肾素活性 ； ANG II， 血管紧张素 II。
其它实施方式 应理解， 虽然结合详述描述了本发明， 但上述描述旨在说明而非限制本发明的范围， 本发明范围由所附权利要求书的范围确定。 其它方面、 优点和修改属于所附权利要求书 的范围。34102143757 A CN 102143764
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