CMET基因的SIRNA片段及其运用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110021761.1	申请日：	2011.01.19
公开号：	CN102154292A	公开日：	2011.08.17
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 15/113申请公布日:20110817\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/113申请日:20110119\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/113(2010.01)I; C12N15/63; A61K48/00; A61P35/00	主分类号：	C12N15/113
申请人：	中国人民解放军第三军医大学第三附属医院
发明人：	姬长友; 刘蓉蓉; 霍文谦; 陈继川; 李洪涛
地址：	400042 重庆市渝中区大坪长江支路10号
优先权：
专利代理机构：	北京同恒源知识产权代理有限公司 11275	代理人：	赵荣之
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内容摘要

本发明涉及基因治疗领域，特别涉及c-Met基因的siRNA片段及其运用,c-Met基因的siRNA片段如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3任一序列,c-Met基因siRNA重组质粒的序列pSilencer2.0-c-Met-shRNA2如SEQ ID NO.10所示，c-Met基因的siRNA片段及重组质粒明显降低喉癌Hep-2细胞c-Met基因在mRNA和蛋白水平的表达，显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动及侵袭用于制备治疗肿瘤药物的用途效果明显，能成为治疗喉癌的潜在药物。

权利要求书

1.c-Met基因的siRNA片段，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的任一序列。2.权利要求1所述的c-Met基因的siRNA片段用于制备治疗肿瘤药物的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，c-Met基因的siRNA片段用于制备治疗喉癌药物的用途。4.c-Met基因siRNA 重组质粒，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的c-Met基因的siRNA片段。5.根据权利要求3所述的c-Met基因siRNA 重组质粒，其特征在于，c-Met基因siRNA 重组质粒的序列pSilencer2.0-c-Met-shRNA2如SEQ ID NO.10所示。6.权利要求4所述的c-Met基因siRNA 重组质粒用于制备治疗肿瘤药物的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，c-Met基因siRNA 重组质粒用于制备治疗喉癌药物的用途。

说明书

c-Met基因的siRNA片段及其运用

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，特别涉及c-Met基因的siRNA片段及其运用。

背景技术

喉癌占全身恶性肿瘤的1%～5%，是头颈部最常见的肿瘤之一，占头颈部肿瘤的13.9％，我国部分地区发病率约为1.5～3.4/10万人，已成为严重威胁人民生命健康和生活质量的疾病，以鳞癌多见。虽然近几十年来传统的治疗方式如手术、放疗、化疗等已有很大改进，提高了患者的五年生存率，但手术治疗易使患者的喉功能严重破坏而致残；放疗仅对早期喉癌疗效好，对于大多数就诊时即为中、晚期或治疗后又出现复发、转移的患者往往效果不佳；而化疗又由于毒副作用严重常使得患者无法耐受，从而使这些治疗方式仍受到很大限制。因此，积极寻求治疗喉癌的新途径即成为耳鼻咽喉科研究者面临的新课题。

肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)是一种多功能的细胞因子，为一种多肽，其生物学活性由 c-Met 蛋白所介导。c-Met蛋白属酪氨酸激酶活性的生长因子受体，研究发现其在促进细胞增殖分化、细胞扩散、新生血管的生成方面具有重要作用。异常表达的c-Met激活下游分子导致肿瘤的发生、发展和转移。研究表明 c-Met在喉癌中强表达，与喉癌的增殖及转移关系密切。RNA 干扰技术具有特异、有效的基因沉默效应，能够简单、高效地抑制特定基因的表达，目前已成为肿瘤基因治疗研究的热点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种siRNA片段，该片段通过RNAi方法沉默c-Met基因表达，从而达到抑制HGF-c-Met信号转导系统，发挥抑制

肿瘤功能。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

c-Met基因的siRNA片段，具有如下任一序列：

序列1：

正义链(RNAi-1F)：

5'-GATCCGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGTCAAGAGCGGTGAA

GTTGGGAAGCTGATACTTTTTA -3’；

反义链(RNAi-1R)：

3′-GCATAGTCGAAGGGTTGAAGTGGCAGTTCTCGCCACTTCAACC

CTTCGACTATGAAAAATTCGA-5′；

序列2：

正义链(RNAi-2F)：

5′-GATCCGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCATCAAGAGTGGTTCGGC

AGAATCTGGCTTGCTTTTTA-3′；

反义链(RNAi-2R)：

3′-GCGTTCGGTCTAAGACGGCTTGGTAGTTCTCACCAAGCCGTCTTA

GACCGAACGAAAAATTCGA -5′；

序列3：

正义链(RNAi-3F)：

5′-GATCCGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTCAAGAGCATATGGT

CAGCCTTGTCCCTCCTTTTTA-3′；

反义链(RNAi-3R)：

3′-GCCTCCCTGTTCCGACTGGTATACAGTTCTCGTATACCAGTCGG

AACAGGGAGGAAAAATTCGA-5′。

本发明的目的之二在于提供一种siRNA 重组质粒，其根据 Genbank 中报道的c-Met基因核苷酸序列，参考 siRNA 设计原则设计并构建的重组质粒。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

c-Met基因siRNA 重组质粒，其含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3任一序列的c-Met基因的siRNA片段。

进一步，c-Met基因siRNA 重组质粒pSilencer2.0-c-Met-shRNA2如SEQ ID NO.10所示。

本发明的另一目的在于提供c-Met基因的siRNA片段的用途，该用途为抗肿瘤提供了一种新思路。

具体方案为：

c-Met基因的siRNA片段用于制备治疗肿瘤药物的用途。

进一步，c-Met基因的siRNA片段用于制备治疗喉癌药物的用途。

本发明的目的之四提供了c-Met基因siRNA 重组质粒的用途，该用途为抗肿瘤提供了一种新思路。

其具体方案为：

c-Met基因siRNA 重组质粒用于制备治疗肿瘤药物的用途。

进一步，c-Met基因siRNA 重组质粒用于制备治疗喉癌药物的用途。

本发明的有益效果在于：本研究根据 Genbank 中报道的c-Met基因核苷酸序列，参考 siRNA 设计原则设计出了三条阻断c-Met基因表达的 RNAi 序列，并成功构建了c-Met基因siRNA 重组质粒pSilencer2.0-c-Met-shRNA1、pSilencer2.0-c-Met-shRNA2 、pSilencer2.0-c- Met-shRNA3。通过脂质体介导转染喉癌Hep-2细胞，观察其对Hep-2细胞 c-Met基因表达的影响，并通过MTT法、运动实验及侵袭实验比较转染前后Hep-2细胞的生长、运动及侵袭能力。得到如下结论：

1．成功构建了c-Met基因siRNA 重组质粒 pSilencer2.0-c-Met-shRNA1、pSilencer2.0-c-Met-shRNA2 、pSilencer2.0-c-Met-shRNA3。

2．重组质粒pSilencer2.0-c-Met-shRNA2可显著降低Hep-2细胞 c-Met mRNA及蛋白的表达。

3．重组质粒pSilencer2.0-c-Met-shRNA2在体外显著抑制了喉癌Hep-2细胞的生物学活性。

4．siRNA重组质粒介导的基因治疗有可能成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略，为喉癌的临床治疗提供了实验基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为Psilencer2.0-U6质粒物理图谱；

图2为pSilencer2.0/c-Met-shRNA酶切电泳图片，其中M：分子量标准;Si-1、Si-2、Si-3、Si-c分别表示靶序列1、2、3、随机对照序列的pSilencer2.0重组质粒；

图3为RT-PCR检测目的基因c-Met mRNA在靶细胞中的转录，3-A中M：分子量标准；1：未转染组；2：空载体组(转染了空质粒pSilencer2.0的Hep-2细胞)；3：随机序列组(转染了随机对照序列的Hep-2细胞)；4：Si-1组(转染了pSilencer2.0/c-Met-shRNA1的Hep-2细胞)；5：Si-2组(转染了pSilencer2.0/c-Met-shRNA2的Hep-2细胞)；6： Si-3组(转染了pSilencer2.0/c-Met-shRNA3的Hep-2细胞)。3-B为分析图，其中纵坐标为c-Met与GAPDH光度DU比值。

图4为Western-Blot检测各组细胞c-Met蛋白的表达分析图，其中1：未转染组；2：空载体组；3：随机序列组；4：Si-1组；5：Si-2组；6： Si-3组。

纵坐标：c-Met与β-actin光度DU比值。

图5为MTT实验的生长曲线绘制图。

图6为各组细胞侵袭能力的比较分析图，其中1．空白治疗组；2．阴性治疗组；3．阳性治疗组。

图7为细胞趋化运动实验细胞图，A为空白对照组，B为阴性组，C为阳性治疗组。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1 c-Met基因的siRNA片段、重组质粒的制备

一、实验方法

1. 靶向c-Met的shRNA的设计

从GenBank中找出c-Met mRNA序列(登录号NM-_000245), 经Ambion 公司网址https://www.Genscript.com/ssl-bin/app/rnai 寻找人c-Met的RNAi靶点序列并设计对应的寡核苷酸序列。针对c-Met筛选的23个碱基的3个靶序列如下:

5′-GTATCAGCTTCCCAACTTCACCG-3′(编码区119～141位)、

5′-GCAAGCCAGATTCTG CCGAACCA-3′(编码区1045～1067位)、

5′-GGAGGGACAAGGCTGACCATATG-3′(编码区1728～1750位)，

经Blast基因同源性分析以确保基因抑制的特异性。并设置一随机对照序列5′-GGACTGTGCTAATGCTCCAGTAGC-3′，经Blast基因同源性分析，此序列不与任何人类基因序列同源。针对靶点序列，参考siRNA的设计策略：

BamHⅠ酶切位点＋正义链＋Loop＋反义链＋终止信号＋HindⅢ酶切位点

分别设计四对shRNA(short hairpin RNA，shRNA)序列(3对干扰序列及1对随机对照序列)如下：

序列1：

正义链(RNAi-1F)：

5'- GATCCGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGTCAAGAGCGGTGAAG

TTGGGAAGCTGATACTTTTTA -3’

反义链(RNAi-1R)：

3′-GCATAGTCGAAGGGTTGAAGTGGCAGTTCTCGCCACTTCAACCC

TTCGACTATGAAAAATTCGA-5′

序列2：

正义链(RNAi-2F)：

5′-GATCCGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCATCAAGAGTGGTTCGGCAGA

ATCTGGCTTGCTTTTTA-3′；

反义链(RNAi-2R)：

3′-GCGTTCGGTCTAAGACGGCTTGGTAGTTCTCACCAAGCCGTCTTAGAC

CGAACGAAAAATTCGA -5′。

序列3：

正义链(RNAi-3F)：

5′-GATCCGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTCAAGAGCATATGGTCAGCC

TTGTCCCTCCTTTTTA-3′；

反义链(RNAi-3R)：

3′-GCCTCCCTGTTCCGACTGGTATACAGTTCTCGTATACCAGTCGGAACA

GGGAGGAAAAATTCGA-5′。

对照序列：

正义链(Control-F)：

5′-GATCCGTCAGCACTCTCGAATCAGATGCTCAAGAGGCATCTGATTCGAG

AGTGCTGACTTTTTA-3′；

反义链(Control-R)：

3′- GCAGTCGTGAGAGCTTAGTCTACGAGTTCTCGCTAGACTAAGCTCTCAC

GACTGAAAAATTCGA -5′。

引物及双链寡核苷酸由金思特科技有限公司代理合成。

2.重组质粒的构建及鉴定

pSilencer2.0载体是利用RNA polymerase(polⅢ)类启动子的siRNA表达用质粒载体，其结构见图1。在polⅢ类启动子下游处插入与U型(hairpin型)RNA相对应的Oligo DNA序列后，便可以构建成siRNA表达质粒，将得到的质粒导入细胞可以进行RNAi实验。

2.1 单链目的基因片段c-Met-shRNA的制备

(1) 将化学合成的c-Met-shRNA单链用165μLTE buffer溶解。

(2) 上链和下链各取4.5μL于PCRtube中，而后加1μL T₄DNA Ligation buffer，混匀。

(3) 在PCR仪上进行以下循环：95℃2min，68℃5min，37℃10min，4℃5min，共计3h。

(4) 合成的片段储存于-20℃以备用。

2.2 pSilencer2.0载体的制备

(1) pSilencer2.0的酶切，按下列组分加样：

(2)琼脂糖凝胶电泳，提纯较大的片段作为构建重组质粒的载体使用(pSilencer/BH)。

2.3线性化pSilencer2.0载体“pSilencer/BH”与c-Met-shRNA片段的连接

(1)在PCR管中配制下列连接反应体系，全量为10μL：

(2) 16℃反应12h。

(3) 取4μL做细菌转化实验，其余4℃保存。

2.4 连接液转化DH5а感受菌

各取 4ul 过夜连接产物转化感受态细菌 DH5а，涂布于分别含Ampr抗性的 LB 平板上，37℃恒温倒置培养过夜。

2.5 重组克隆pSilencer2.0-c-Met-shRNA质粒的筛选

从每个培养皿上各挑取2个单克隆菌落接种于5ml 分别Ampr抗性的 LB 培养液中，37℃恒温摇床振荡培养过夜。

2.6 pSilencer2.0-c-Met-shRNA质粒的提取，并做酶切鉴定

用试剂盒小量提取质粒，pSilencer2.0-c-Met-shRNA质粒用BamHⅠ/HindⅢ作双酶切鉴定：

二结果

1、酶切鉴定重组质粒：质粒pSilencer2.0里面是没有BamHⅠ及HindⅢ酶切位点的，而在我们的插入序列里设计了BamHⅠ及HindⅢ的酶切位点，如果插入正确，就应该能被BamHⅠ及HindⅢ所酶切；质粒能被BamHⅠ及HindⅢ酶切，即均为插入正确的质粒(见图2)。

2、重组质粒序列测定：挑取酶切鉴定正确的已转化质粒菌液去大连宝生物公司测序。经测序，测序结果均与目的序列相同，符合设计要求。测序图见附图。

实施例2 c-Met基因的siRNA片段、重组质粒对Hep-2细胞株c-Met

达的抑制

一实验方法

1细胞培养：Hep-2细胞生长于含有 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基，置 37℃、5%CO₂ 混合气体的孵箱中培养。

2、实验分组

共设立6组：

Ⅰ组空白对照组：仅予以培养液处理；

Ⅱ组正常对照组：pSilencer2.0+阳离子脂质体Lipofectamine+ 1640培养液；

Ⅲ组阴性治疗组：pSilencer2.0/c-Met-shRNA-control+ Lipofectamine + 1640培养液；

Ⅳ组阳性治疗组Ⅰ：pSilencer2.0/c-Met-shRNA-1 +Lipofectamine+ 1640培养液；

Ⅴ组阳性治疗组Ⅱ：pSilencer2.0/c-Met-shRNA-2 + Lipofectamine + 1640培养液；

Ⅵ组阳性治疗组Ⅲ：pSilencer2.0/c-Met-shRNA-3 +Lipofectamine + 1640培养液。

3、基因转染

采用阳离子脂质体Lipofectamine转染法。

4、RT-PCR检测c-Met mRNA表达

⑴ 细胞总 RNA 的提取

采用Trizol法提取细胞总RNA，按照Trizol试剂盒所提供的操作说明书进行。

(2) RNA 含量及纯度的测定：

紫外分光光度计测定 260nm、280nm 处的吸光值(OD)。

(3) RT-PCR:

c-Met RT-PCR 引物根据 GeneBank 中 cDNA 序列设计为：

上游：5′-GAGGTTCACTGCATATTCTCC-3′

下游：5′-GTCTGAG CATCTAGAGTTTCC-3′

c-Met扩增的片段长度为 350bp

阳性对照人GAPDH内参RT-PCR 引物根据 GenBank 中 cDNA 序列设计为：

上游：5′-CACCAGGGCTGCTTTTAACTC-3′

下游：5′-GATGATGACCCTTTTGGCTCC -3′

PCR扩增：

4) 琼脂糖凝胶电泳：

电泳条件：0.5×TBE 电解质液，1.2%琼脂糖，电压120V，电流15mA

以GAPDH mRNA 作为内参照。反应完成后各取 5μl PCR 反应液，经含有EB的 1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用 DNA Marker 作分子量标准。电泳完毕后用凝胶成像分析系统并用密度扫描分析 PCR 产物带。为消除系统及定量误差，c-Met mRNA的表达水平以相对表达量即 c-Met/GAPDH的比率计算。

6、Western blot 检测c-Met蛋白的表达

⑴ 细胞总蛋白的提取

(2) 蛋白浓度检测：

用紫外分光光度计测定提取液的蛋白浓度(按仪器操作说明进行)。

(3) SDS-PAGE 电泳：按常规方法。

(4) 免疫检测：

1) PVDF 膜放入封闭液中(5%的脱脂奶粉,用PBST配制)，常温孵育4h。

2) 于脱色摇床上用PBST洗膜，10min×3次。

3) 以 1:250 的稀释度配制一抗(β-actin按1:1000配制)，将膜浸入其中，4℃放置过夜。

4) 弃一抗液，同上洗膜。

5) 以 1:5000 的稀释度配制二抗，将膜浸入其中，室温孵育1h。

6) 弃二抗液，同上洗膜。

(5) 显色：

1) 化学发光试剂A和B以1:1比例混匀，将PVDF膜浸入其中发光5min。

2) 将 PVDF 膜放入暗室中压片10min。

3) 显影后清水漂洗，再定影。

4) 将 PVDF 膜上的目的蛋白条带在凝胶成像系统上分析处理，c-Met蛋白含量以光密度 INT×面积表示。以β-actin作为内参照，c-Met蛋白的表达水平以相对表达量即 c-Met/β-actin的比率计算。

二结果

1、RT-PCR 电泳结果

c-Met的RT-PCR 结果进行计算机图象分析，用ANOVA/Holm-Sidak分析软件计算各条带的积分光密度值(integral optical density，IOD)，目的基因 IOD 与GAPDH IOD 比值代表目的基因 mRNA 表达水平，即标准化积分光密度值(normalized integrated intensity，NII)，计算 NII×100%，以 NII%为单位，比较RT-PCR 结果。RT-PCR 结果见表 1 和图 3。

2、Western-Blot检测c-Met蛋白表达的变化

Western blot 检测结果显示，用兔抗人c-Met多克隆抗体检测到各组细胞中均有c-Met蛋白的表达，在相对分子质量大约为145KD处显示一条特异的条带，但是表达量不同。将c-Met蛋白的Western blot 结果进行计算机图象分析，同样用ANOVA/Holm-Sidak分析软件计算各条带的积分光密度值(IOD)，目的蛋白IOD 与β-actin IOD 比值代表目的蛋白表达水平，比较Western blot结果。与未转染组细胞相比，转染空质粒组及随机对照序列组细胞c-Met的表达量未见明显改变； pSilencer2.0/c-Met-shRNA1、2、3组c-Met蛋白的表达均有所下降，Silencer2.0/c-Met-shRNA1、3组下降不明显(P值分别为0.216、0.227)，Silencer2.0/c-Met-shRNA2组下降显著(P=0.02)。Western-Blot结果见表 2 和图 4。

实施例3 c-Met基因的siRNA片段、重组质粒对Hep-2细胞株的影响

一、实验方法

1、转染法：脂质体Lipofectamine转染方法

2、实验分组

Ⅰ组空白对照组：仅予以培养液处理

Ⅱ组阴性治疗组：pSilencer2.0+阳离子脂质体Lipofectamine+ 1640培养液

Ⅲ组阳性治疗组：pSilencer2.0/c-Met-shRNA-2 + Lipofectamine + 1640培养液

3、MTT 试验

1) 接种细胞。取对数生长期的Hep-2细胞用 0.25%胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁴/ml。

2) 取 96 孔板 4 个，每板共设6组孔，每组设5个复孔，4个观察时间点。每孔接种 150μl，即每孔细胞数为 0.3×10⁴。做好分组标志。

3) 37 ⁰C、5%CO₂ 条件下培养。

4) 培养24h后，实验1～5组分别准备A液与B液。A液：取500μL无血清及无抗生素的1640培养液于1.5mlEP管后再依次分别加入16μL(0.25μg/μL)空质粒pSilencer2.0 DNA，4μL、8μL、12μL、16μL质粒(0.25μg/μL)pSilencer2.0/c-Met-shRNA2 DNA；B液：取490μL无血清及无抗生素的1640培养液于1.5mlEP管后再分别加入10μL，2.5μL、5μL、7.5μL、10μL脂质体Lipofectamine2000。

5) 将A液移入B液中，轻轻吹打混匀，室温放置20min。

6) 实验各孔分别加入相应的混合液50μL。实验6组各孔加入50μL无血清及无抗生素的1640培养液。质粒转染后1d换液1次。

7) 分别于转染后第1、2、3、4d的前4h加入MTT(5mg/ml)20μL，继续培养4h后去上清，每孔加入二甲基亚砜150μL，摇匀10min。

8) 酶联免疫监测仪测定492nm处各孔光密度A值。

5、侵袭实验

1) 将细胞传代至6孔培养板中，选3孔用于实验。A孔为未转染组，B孔为空质粒pSilencer2.0转染组，C孔为pSilencer2.0/c-Met-siRNA转染组。

2) 同上MTT转染方法，分别取空质粒pSilencer2.0、pSilencer2.0/c-Met-siRNA2各2μg与脂质体Lipofectamine2000 5μL混合后转染B、C孔细胞，A孔加入等量无血清的1640液。

3) 转染6h后换成1640＋10％FCS液继续培养。

4) 常规培养36h后再换成无血清1640液饥饿培养。

5) 饥饿培养12h后，用0.25％胰酶消化细胞，悬浮细胞于含1％FCS的1640培养基中，调整其密度达10⁶/ml。

6) Transwell 小室底部为 8μm 孔径乙烯滤膜，预先铺上 Matrigel 凝胶(1mg/ml)100μl，将小室置于 24 孔板内，超净台内37℃风干1小时。

7) 将500μL细胞悬液分别移入Matrigel上，transwell的下室加入含 20％FCS的1640培养基。

8) 37℃、5％CO₂常规培养48h后移出transwell小室。

9) 以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞，吸净 24 孔板内培养液。

10) 侵袭并黏附至下室面的细胞以 10％甲醛固定，常规 HE 染色。

11) 在 200 倍高倍镜下细胞计数，各组设3个平行孔，上下左中右5个高倍视野下计数侵袭细胞的数目，取其平均值作为结果。

12) 200 倍高倍镜下观察拍照。

6、趋向运动实验

体外趋向运动实验的原理及方法步骤均和侵袭实验相同，只是侵袭小室的滤膜不用人工基质胶覆盖。体外趋化运动能力测定和计算的方法亦与体外侵袭能力测定相同。

二、实验结果

1、MTT 试验

转染后24h、48h、72h、96h，MTT 检测结果见表 3，将其生长曲线绘制成图5所示。

可见，在转染后1、2、3、4d每个时间点，各孔光密度A_492nm的平均值中，空质粒转染组相对于未转染组无明显下降，而pSilencer2.0/c-Met-shRNA2转染各浓度组(转染组1～4分别代表质粒0.05、0.1、0.15、0.2μg/孔浓度转染组)均下降显著、且呈浓度依赖性，随着浓度的增加而下降，在质粒最大浓度0.2μg/孔时对细胞增殖达最大抑制效应。

2、细胞侵袭实验

侵袭实验结果(见表4及图6)，pSilencer2.0/c-Met-shRNA2转染组细胞的侵袭运动实验结果显示，穿膜细胞数为(15.003.61)个，而未转染组、空载体组分别为(32.003.61)、(31.334.04)个，2组之间差异无统计学意义(P值为0.974)，转染组与另2组比较，P值均为0.004。

3、细胞运动实验

趋化运动结果(见表5)，显示pSilencer2.0/c-Met-shRNA2转染组穿膜细胞数为(72.674.73)个，而未转染组及空载体转染组分别为(105.338.62)、(99.333.21)个，2组之间差异无统计学意义(P值为0.480)，转染组与这2组比较，P值分别为0.001、0.004。高倍镜下细胞摄像见图7。

本研究根据 Genbank 中报道的c-Met基因核苷酸序列，参考 siRNA 设计原则设计出了三条阻断c-Met基因表达的 RNAi 序列，并成功构建了c-Met基因siRNA 重组质粒pSilencer2.0-c-Met-shRNA1、pSilencer2.0-c-Met-shRNA2 、pSilencer2.0-c- Met-shRNA3。通过脂质体介导转染喉癌Hep-2细胞，观察其对Hep-2细胞 c-Met基因表达的影响，并通过MTT法、运动实验及侵袭实验比较转染前后Hep-2细胞的生长、运动及侵袭能力。得到如下结论：

1．成功构建了c-Met基因siRNA 重组质粒 pSilencer2.0-c-Met-shRNA1、pSilencer2.0-c-Met-shRNA2 、pSilencer2.0-c-Met-shRNA3。

2．重组质粒pSilencer2.0-c-Met-shRNA2可显著降低Hep-2细胞 c-Met mRNA及蛋白的表达。

3．重组质粒pSilencer2.0-c-Met-shRNA2在体外显著抑制了喉癌Hep-2细胞的生物学活性。

4．siRNA重组质粒介导的基因治疗有可能成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略，为喉癌的临床治疗提供了实验基础。

后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院

<120> c-Met基因的siRNA片段及其运用

<160> 16

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> c-Met mRNA

<400> 1

gtatcagctt cccaacttca ccg 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met mRNA

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gcaagccaga ttctgccgaa cca 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met mRNA

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ggagggacaa ggctgaccat atg 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met RNAi-1 F

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gatccgtatc agcttcccaa cttcaccgtc aagagcggtg aagttgggaa gctgatactt ttta 64

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met RNAi-1 R

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gcatagtcga agggttgaag tggcagttct cgccacttca acccttcgac tatgaaaaat tcga 64

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met RNAi-2 F

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gatccgcaag ccagattctg ccgaaccatc aagagtggtt cggcagaatc tggcttgctt ttta 64

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met RNAi-2 R

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gcgttcggtc taagacggct tggtagttct caccaagccg tcttagaccg aacgaaaaat tcga 64

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met RNAi-3 F

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gatccggagg gacaaggctg accatatgtc aagagcatat ggtcagcctt gtccctcctt ttta 64

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met RNAi-3 R

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gcctccctgt tccgactggt atacagttct cgtataccag tcggaacagg gaggaaaaat tcga 64

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> pSilencer2.0/c-Met-shRNA2

<400> 10

gcggcatccc tcactaaggg aggagaagca tgaattcccc agtggaaaga cgcgcaggca 60

aaacgcacca cgtgacggag cgtgaccgcg cgccgagcgc gcgccaaggt cgggcaggaa 120

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 180

ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 240

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 300

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt tatatatctt gtggaaagga 360

cgcgggatcc gcaagccaga ttctgccgaa ccatcaagag tggttcggca gaatctggct 420

tgctttttaa gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 480

gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa 540

gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg 600

atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc 660

agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct 720

gacgcgccct gacgggcttg tgtgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc 780

tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaaacgcg cgagacaaag 840

ggcctcgtga tacgcctatt ttttataggg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga 900

cgtcaggagg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaat 960

acattcaaat atgtatccgc ttatgaaaca ataaccctga taatgcttca tatattgaaa 1020

aaggaagata tgaatattca 1040

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> control F

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gatccgtcag cactctcgaa tcagatgctc aagaggcatc tgattcgaga gtgctgactt ttta 64

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> control R

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gcagtcgtga gagcttagtc tacgagttct cgctagacta agctctcacg actgaaaaat tcga 64

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met引物 F

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gaggttcact gcatattctc c 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> c-Met引物 R

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gtctgagcat ctagagtttc c 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> GAPDH内参引物 F

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caccagggct gcttttaact c 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> GAPDH内参引物 R

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gatgatgacc cttttggctc c 21

资源描述

《CMET基因的SIRNA片段及其运用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CMET基因的SIRNA片段及其运用.pdf（21页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN102154292A43申请公布日20110817CN102154292ACN102154292A21申请号201110021761122申请日20110119C12N15/113201001C12N15/63200601A61K48/00200601A61P35/0020060171申请人中国人民解放军第三军医大学第三附属医院地址400042重庆市渝中区大坪长江支路10号72发明人姬长友刘蓉蓉霍文谦陈继川李洪涛74专利代理机构北京同恒源知识产权代理有限公司11275代理人赵荣之54发明名称CMET基因的SIRNA片段及其运用57摘要本发明涉及基因治疗领域，特别涉及CMET基。

2、因的SIRNA片段及其运用,CMET基因的SIRNA片段如SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3任一序列,CMET基因SIRNA重组质粒的序列PSILENCER20CMETSHRNA2如SEQIDNO10所示，CMET基因的SIRNA片段及重组质粒明显降低喉癌HEP2细胞CMET基因在MRNA和蛋白水平的表达，显著抑制喉癌HEP2细胞的生长、运动及侵袭用于制备治疗肿瘤药物的用途效果明显，能成为治疗喉癌的潜在药物。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页序列表5页附图3页CN102154293A1/1页21CMET基因的SIRNA片段。

3、，其特征在于，具有如SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的任一序列。2权利要求1所述的CMET基因的SIRNA片段用于制备治疗肿瘤药物的用途。3根据权利要求2所述的用途，其特征在于，CMET基因的SIRNA片段用于制备治疗喉癌药物的用途。4CMET基因SIRNA重组质粒，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的CMET基因的SIRNA片段。5根据权利要求3所述的CMET基因SIRNA重组质粒，其特征在于，CMET基因SIRNA重组质粒的序列PSILENCER20CMETSHRNA2如SEQIDNO10所示。6权利要求4所述的CMET基因SIRNA重组质粒用于制备治疗肿瘤药物。

4、的用途。7根据权利要求6所述的用途，其特征在于，CMET基因SIRNA重组质粒用于制备治疗喉癌药物的用途。权利要求书CN102154292ACN102154293A1/11页3CMET基因的SIRNA片段及其运用技术领域0001本发明涉及基因治疗领域，特别涉及CMET基因的SIRNA片段及其运用。背景技术0002喉癌占全身恶性肿瘤的15，是头颈部最常见的肿瘤之一，占头颈部肿瘤的139，我国部分地区发病率约为1534/10万人，已成为严重威胁人民生命健康和生活质量的疾病，以鳞癌多见。虽然近几十年来传统的治疗方式如手术、放疗、化疗等已有很大改进，提高了患者的五年生存率，但手术治疗易使患者的喉功能严。

5、重破坏而致残；放疗仅对早期喉癌疗效好，对于大多数就诊时即为中、晚期或治疗后又出现复发、转移的患者往往效果不佳；而化疗又由于毒副作用严重常使得患者无法耐受，从而使这些治疗方式仍受到很大限制。因此，积极寻求治疗喉癌的新途径即成为耳鼻咽喉科研究者面临的新课题。0003肝细胞生长因子HEPATOCYTEGROWTHFACTOR，HGF是一种多功能的细胞因子，为一种多肽，其生物学活性由CMET蛋白所介导。CMET蛋白属酪氨酸激酶活性的生长因子受体，研究发现其在促进细胞增殖分化、细胞扩散、新生血管的生成方面具有重要作用。异常表达的CMET激活下游分子导致肿瘤的发生、发展和转移。研究表明CMET在喉癌中强表。

6、达，与喉癌的增殖及转移关系密切。RNA干扰技术具有特异、有效的基因沉默效应，能够简单、高效地抑制特定基因的表达，目前已成为肿瘤基因治疗研究的热点。发明内容0004有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种SIRNA片段，该片段通过RNAI方法沉默CMET基因表达，从而达到抑制HGFCMET信号转导系统，发挥抑制肿瘤功能。0005为实现上述目的，本发明的技术方案为CMET基因的SIRNA片段，具有如下任一序列序列1正义链RNAI1F5GATCCGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGTCAAGAGCGGTGAAGTTGGGAAGCTGATACTTTTTA3；反义链RNAI1R3GCATAGTC。

7、GAAGGGTTGAAGTGGCAGTTCTCGCCACTTCAACCCTTCGACTATGAAAAATTCGA5；序列2正义链RNAI2F5GATCCGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCATCAAGAGTGGTTCGGCAGAATCTGGCTTGCTTTTTA3；反义链RNAI2R说明书CN102154292ACN102154293A2/11页43GCGTTCGGTCTAAGACGGCTTGGTAGTTCTCACCAAGCCGTCTTAGACCGAACGAAAAATTCGA5；序列3正义链RNAI3F5GATCCGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTCAAGAGCATATG。

8、GTCAGCCTTGTCCCTCCTTTTTA3；反义链RNAI3R3GCCTCCCTGTTCCGACTGGTATACAGTTCTCGTATACCAGTCGGAACAGGGAGGAAAAATTCGA5。0006本发明的目的之二在于提供一种SIRNA重组质粒，其根据GENBANK中报道的CMET基因核苷酸序列，参考SIRNA设计原则设计并构建的重组质粒。0007为实现上述目的，本发明的技术方案为CMET基因SIRNA重组质粒，其含有如SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3任一序列的CMET基因的SIRNA片段。0008进一步，CMET基因SIRNA重组质粒PSILENCER20CM。

9、ETSHRNA2如SEQIDNO10所示。0009本发明的另一目的在于提供CMET基因的SIRNA片段的用途，该用途为抗肿瘤提供了一种新思路。0010具体方案为CMET基因的SIRNA片段用于制备治疗肿瘤药物的用途。0011进一步，CMET基因的SIRNA片段用于制备治疗喉癌药物的用途。0012本发明的目的之四提供了CMET基因SIRNA重组质粒的用途，该用途为抗肿瘤提供了一种新思路。0013其具体方案为CMET基因SIRNA重组质粒用于制备治疗肿瘤药物的用途。0014进一步，CMET基因SIRNA重组质粒用于制备治疗喉癌药物的用途。0015本发明的有益效果在于本研究根据GENBANK中报道的。

10、CMET基因核苷酸序列，参考SIRNA设计原则设计出了三条阻断CMET基因表达的RNAI序列，并成功构建了CMET基因SIRNA重组质粒PSILENCER20CMETSHRNA1、PSILENCER20CMETSHRNA2、PSILENCER20CMETSHRNA3。通过脂质体介导转染喉癌HEP2细胞，观察其对HEP2细胞CMET基因表达的影响，并通过MTT法、运动实验及侵袭实验比较转染前后HEP2细胞的生长、运动及侵袭能力。得到如下结论1成功构建了CMET基因SIRNA重组质粒PSILENCER20CMETSHRNA1、PSILENCER20CMETSHRNA2、PSILENCER20CME。

11、TSHRNA3。00162重组质粒PSILENCER20CMETSHRNA2可显著降低HEP2细胞CMETMRNA及蛋白的表达。00173重组质粒PSILENCER20CMETSHRNA2在体外显著抑制了喉癌HEP2细胞的生物学活性。00184SIRNA重组质粒介导的基因治疗有可能成为喉癌靶向性CMET治疗的新策略，说明书CN102154292ACN102154293A3/11页5为喉癌的临床治疗提供了实验基础。附图说明0019为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为PSILENCER20U6质粒物理图谱；图2为PSILENCER20/C。

12、METSHRNA酶切电泳图片，其中M分子量标准SI1、SI2、SI3、SIC分别表示靶序列1、2、3、随机对照序列的PSILENCER20重组质粒；图3为RTPCR检测目的基因CMETMRNA在靶细胞中的转录，3A中M分子量标准；1未转染组；2空载体组转染了空质粒PSILENCER20的HEP2细胞；3随机序列组转染了随机对照序列的HEP2细胞；4SI1组转染了PSILENCER20/CMETSHRNA1的HEP2细胞；5SI2组转染了PSILENCER20/CMETSHRNA2的HEP2细胞；6SI3组转染了PSILENCER20/CMETSHRNA3的HEP2细胞。3B为分析图，其中纵坐标。

13、为CMET与GAPDH光度DU比值。0020图4为WESTERNBLOT检测各组细胞CMET蛋白的表达分析图，其中1未转染组；2空载体组；3随机序列组；4SI1组；5SI2组；6SI3组。0021纵坐标CMET与ACTIN光度DU比值。0022图5为MTT实验的生长曲线绘制图。0023图6为各组细胞侵袭能力的比较分析图，其中1空白治疗组；2阴性治疗组；3阳性治疗组。0024图7为细胞趋化运动实验细胞图，A为空白对照组，B为阴性组，C为阳性治疗组。具体实施方式0025以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第。

14、三版，J萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0026为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。0027实施例1CMET基因的SIRNA片段、重组质粒的制备一、实验方法1靶向CMET的SHRNA的设计从GENBANK中找出CMETMRNA序列登录号NM_000245,经AMBION公司网址HTTPS/WWWGENSCRIPTCOM/SSLBIN/APP/RNAI寻找人CMET的RNAI靶点序列并设计对应的寡核苷酸序列。针对CMET筛选的23个碱基的3个靶序列如下5GTATCAGCTTCCCAACTT。

15、CACCG3编码区119141位、5GCAAGCCAGATTCTGCCGAACCA3编码区10451067位、5GGAGGGACAAGGCTGACCATATG3编码区17281750位，经BLAST基因同源性分析以确保基因抑制的特异性。并设置一随机对照序列5GGACTGTGCTAATGCTCCAGTAGC3，经BLAST基因同源性分析，此序列不与任何人类基说明书CN102154292ACN102154293A4/11页6因序列同源。针对靶点序列，参考SIRNA的设计策略BAMH酶切位点正义链LOOP反义链终止信号HIND酶切位点分别设计四对SHRNASHORTHAIRPINRNA，SHRNA序。

16、列3对干扰序列及1对随机对照序列如下序列1正义链RNAI1F5GATCCGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGTCAAGAGCGGTGAAGTTGGGAAGCTGATACTTTTTA3反义链RNAI1R3GCATAGTCGAAGGGTTGAAGTGGCAGTTCTCGCCACTTCAACCCTTCGACTATGAAAAATTCGA5序列2正义链RNAI2F5GATCCGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCATCAAGAGTGGTTCGGCAGAATCTGGCTTGCTTTTTA3；反义链RNAI2R3GCGTTCGGTCTAAGACGGCTTGGTAGTTCTCACCAAGCCG。

17、TCTTAGACCGAACGAAAAATTCGA5。0028序列3正义链RNAI3F5GATCCGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTCAAGAGCATATGGTCAGCCTTGTCCCTCCTTTTTA3；反义链RNAI3R3GCCTCCCTGTTCCGACTGGTATACAGTTCTCGTATACCAGTCGGAACAGGGAGGAAAAATTCGA5。0029对照序列正义链CONTROLF5GATCCGTCAGCACTCTCGAATCAGATGCTCAAGAGGCATCTGATTCGAGAGTGCTGACTTTTTA3；反义链CONTROLR3GCAGTCGTGAGAGCTTA。

18、GTCTACGAGTTCTCGCTAGACTAAGCTCTCACGACTGAAAAATTCGA5。0030引物及双链寡核苷酸由金思特科技有限公司代理合成。00312重组质粒的构建及鉴定PSILENCER20载体是利用RNAPOLYMERASEPOL类启动子的SIRNA表达用质粒载体，其结构见图1。在POL类启动子下游处插入与U型HAIRPIN型RNA相对应的OLIGODNA序列后，便可以构建成SIRNA表达质粒，将得到的质粒导入细胞可以进行RNAI实验。003221单链目的基因片段CMETSHRNA的制备1将化学合成的CMETSHRNA单链用165LTEBUFFER溶解。说明书CN102154。

19、292ACN102154293A5/11页700332上链和下链各取45L于PCRTUBE中，而后加1LT4DNALIGATIONBUFFER，混匀。00343在PCR仪上进行以下循环952MIN，685MIN，3710MIN，45MIN，共计3H。00354合成的片段储存于20以备用。003622PSILENCER20载体的制备1PSILENCER20的酶切，按下列组分加样2琼脂糖凝胶电泳，提纯较大的片段作为构建重组质粒的载体使用PSILENCER/BH。23线性化PSILENCER20载体“PSILENCER/BH”与CMETSHRNA片段的连接1在PCR管中配制下列连接反应体系，全量为1。

20、0L216反应12H。00373取4L做细菌转化实验，其余4保存。003824连接液转化DH5感受菌各取4UL过夜连接产物转化感受态细菌DH5，涂布于分别含AMPR抗性的LB平板上，37恒温倒置培养过夜。003925重组克隆PSILENCER20CMETSHRNA质粒的筛选从每个培养皿上各挑取2个单克隆菌落接种于5ML分别AMPR抗性的LB培养液中，37恒温摇床振荡培养过夜。004026PSILENCER20CMETSHRNA质粒的提取，并做酶切鉴定用试剂盒小量提取质粒，PSILENCER20CMETSHRNA质粒用BAMH/HIND作双酶切鉴定二结果1、酶切鉴定重组质粒质粒PSILENCER。

21、20里面是没有BAMH及HIND酶切位点的，而在我们的插入序列里设计了BAMH及HIND的酶切位点，如果插入正确，就应该能被BAMH及HIND所酶切；质粒能被BAMH及HIND酶切，即均为插入正确的质粒见图2。00412、重组质粒序列测定挑取酶切鉴定正确的已转化质粒菌液去大连宝生物公司测序。经测序，测序结果均与目的序列相同，符合设计要求。测序图见附图。说明书CN102154292ACN102154293A6/11页80042实施例2CMET基因的SIRNA片段、重组质粒对HEP2细胞株CMET达的抑制一实验方法1细胞培养HEP2细胞生长于含有10胎牛血清的RPMI1640培养基，置37、5CO。

22、2混合气体的孵箱中培养。00432、实验分组共设立6组组空白对照组仅予以培养液处理；组正常对照组PSILENCER20阳离子脂质体LIPOFECTAMINE1640培养液；组阴性治疗组PSILENCER20/CMETSHRNACONTROLLIPOFECTAMINE1640培养液；组阳性治疗组PSILENCER20/CMETSHRNA1LIPOFECTAMINE1640培养液；组阳性治疗组PSILENCER20/CMETSHRNA2LIPOFECTAMINE1640培养液；组阳性治疗组PSILENCER20/CMETSHRNA3LIPOFECTAMINE1640培养液。00443、基因转染采用。

23、阳离子脂质体LIPOFECTAMINE转染法。00454、RTPCR检测CMETMRNA表达细胞总RNA的提取采用TRIZOL法提取细胞总RNA，按照TRIZOL试剂盒所提供的操作说明书进行。00462RNA含量及纯度的测定紫外分光光度计测定260NM、280NM处的吸光值OD。00473RTPCRCMETRTPCR引物根据GENEBANK中CDNA序列设计为上游5GAGGTTCACTGCATATTCTCC3下游5GTCTGAGCATCTAGAGTTTCC3CMET扩增的片段长度为350BP阳性对照人GAPDH内参RTPCR引物根据GENBANK中CDNA序列设计为上游5CACCAGGGCTG。

24、CTTTTAACTC3下游5GATGATGACCCTTTTGGCTCC3说明书CN102154292ACN102154293A7/11页9PCR扩增4琼脂糖凝胶电泳电泳条件05TBE电解质液，12琼脂糖，电压120V，电流15MA以GAPDHMRNA作为内参照。反应完成后各取5LPCR反应液，经含有EB的12琼脂糖凝胶电泳鉴定，用DNAMARKER作分子量标准。电泳完毕后用凝胶成像分析系统并用密度扫描分析PCR产物带。为消除系统及定量误差，CMETMRNA的表达水平以相对表达量即CMET/GAPDH的比率计算。00486、WESTERNBLOT检测CMET蛋白的表达细胞总蛋白的提取2蛋白浓度检。

25、测用紫外分光光度计测定提取液的蛋白浓度按仪器操作说明进行。00493SDSPAGE电泳按常规方法。00504免疫检测1PVDF膜放入封闭液中5的脱脂奶粉,用PBST配制，常温孵育4H。00512于脱色摇床上用PBST洗膜，10MIN3次。00523以1250的稀释度配制一抗ACTIN按11000配制，将膜浸入其中，4放置过夜。00534弃一抗液，同上洗膜。5以15000的稀释度配制二抗，将膜浸入其中，室温孵育1H。00546弃二抗液，同上洗膜。00555显色1化学发光试剂A和B以11比例混匀，将PVDF膜浸入其中发光5MIN。说明书CN102154292ACN102154293A8/11页10。

26、00562将PVDF膜放入暗室中压片10MIN。00573显影后清水漂洗，再定影。00584将PVDF膜上的目的蛋白条带在凝胶成像系统上分析处理，CMET蛋白含量以光密度INT面积表示。以ACTIN作为内参照，CMET蛋白的表达水平以相对表达量即CMET/ACTIN的比率计算。0059二结果1、RTPCR电泳结果CMET的RTPCR结果进行计算机图象分析，用ANOVA/HOLMSIDAK分析软件计算各条带的积分光密度值INTEGRALOPTICALDENSITY，IOD，目的基因IOD与GAPDHIOD比值代表目的基因MRNA表达水平，即标准化积分光密度值NORMALIZEDINTEGRATE。

27、DINTENSITY，NII，计算NII100，以NII为单位，比较RTPCR结果。RTPCR结果见表1和图3。00602、WESTERNBLOT检测CMET蛋白表达的变化WESTERNBLOT检测结果显示，用兔抗人CMET多克隆抗体检测到各组细胞中均有CMET蛋白的表达，在相对分子质量大约为145KD处显示一条特异的条带，但是表达量不同。将CMET蛋白的WESTERNBLOT结果进行计算机图象分析，同样用ANOVA/HOLMSIDAK分析软件计算各条带的积分光密度值IOD，目的蛋白IOD与ACTINIOD比值代表目的蛋白表达水平，比较WESTERNBLOT结果。与未转染组细胞相比，转染空质粒。

28、组及随机对照序列组细胞CMET的表达量未见明显改变；PSILENCER20/CMETSHRNA1、2、3组CMET蛋白的表达均有所下降，SILENCER20/CMETSHRNA1、3组下降不明显P值分别为0216、0227，SILENCER20/CMETSHRNA2组下降显著P002。WESTERNBLOT结果见表2和图4。0061实施例3CMET基因的SIRNA片段、重组质粒对HEP2细胞株的影响一、实验方法1、转染法脂质体LIPOFECTAMINE转染方法说明书CN102154292ACN102154293A9/11页112、实验分组组空白对照组仅予以培养液处理组阴性治疗组PSILENCE。

29、R20阳离子脂质体LIPOFECTAMINE1640培养液组阳性治疗组PSILENCER20/CMETSHRNA2LIPOFECTAMINE1640培养液3、MTT试验1接种细胞。取对数生长期的HEP2细胞用025胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2104/ML。00622取96孔板4个，每板共设6组孔，每组设5个复孔，4个观察时间点。每孔接种150L，即每孔细胞数为03104。做好分组标志。00633370C、5CO2条件下培养。00644培养24H后，实验15组分别准备A液与B液。A液取500L无血清及无抗生素的1640培养液于15MLEP管后再依次分别加入16L025G/L空质粒。

30、PSILENCER20DNA，4L、8L、12L、16L质粒025G/LPSILENCER20/CMETSHRNA2DNA；B液取490L无血清及无抗生素的1640培养液于15MLEP管后再分别加入10L，25L、5L、75L、10L脂质体LIPOFECTAMINE2000。00655将A液移入B液中，轻轻吹打混匀，室温放置20MIN。00666实验各孔分别加入相应的混合液50L。实验6组各孔加入50L无血清及无抗生素的1640培养液。质粒转染后1D换液1次。00677分别于转染后第1、2、3、4D的前4H加入MTT5MG/ML20L，继续培养4H后去上清，每孔加入二甲基亚砜150L，摇匀10。

31、MIN。00688酶联免疫监测仪测定492NM处各孔光密度A值。00695、侵袭实验1将细胞传代至6孔培养板中，选3孔用于实验。A孔为未转染组，B孔为空质粒PSILENCER20转染组，C孔为PSILENCER20/CMETSIRNA转染组。00702同上MTT转染方法，分别取空质粒PSILENCER20、PSILENCER20/CMETSIRNA2各2G与脂质体LIPOFECTAMINE20005L混合后转染B、C孔细胞，A孔加入等量无血清的1640液。00713转染6H后换成164010FCS液继续培养。00724常规培养36H后再换成无血清1640液饥饿培养。00735饥饿培养12H后，。

32、用025胰酶消化细胞，悬浮细胞于含1FCS的1640培养基中，调整其密度达106/ML。00746TRANSWELL小室底部为8M孔径乙烯滤膜，预先铺上MATRIGEL凝胶1MG/ML100L，将小室置于24孔板内，超净台内37风干1小时。00757将500L细胞悬液分别移入MATRIGEL上，TRANSWELL的下室加入含20FCS的1640培养基。0076837、5CO2常规培养48H后移出TRANSWELL小室。00779以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞，吸净24孔板内培养液。007810侵袭并黏附至下室面的细胞以10甲醛固定，常规HE染色。007911在200倍高倍镜下细胞计数，各组设3。

33、个平行孔，上下左中右5个高倍视野说明书CN102154292ACN102154293A10/11页12下计数侵袭细胞的数目，取其平均值作为结果。008012200倍高倍镜下观察拍照。00816、趋向运动实验体外趋向运动实验的原理及方法步骤均和侵袭实验相同，只是侵袭小室的滤膜不用人工基质胶覆盖。体外趋化运动能力测定和计算的方法亦与体外侵袭能力测定相同。0082二、实验结果1、MTT试验转染后24H、48H、72H、96H，MTT检测结果见表3，将其生长曲线绘制成图5所示。0083可见，在转染后1、2、3、4D每个时间点，各孔光密度A492NM的平均值中，空质粒转染组相对于未转染组无明显下降，而P。

34、SILENCER20/CMETSHRNA2转染各浓度组转染组14分别代表质粒005、01、015、02G/孔浓度转染组均下降显著、且呈浓度依赖性，随着浓度的增加而下降，在质粒最大浓度02G/孔时对细胞增殖达最大抑制效应。00842、细胞侵袭实验侵袭实验结果见表4及图6，PSILENCER20/CMETSHRNA2转染组细胞的侵袭运动实验结果显示，穿膜细胞数为1500361个，而未转染组、空载体组分别为3200361、3133404个，2组之间差异无统计学意义P值为0974，转染组与另2组比较，P值均为0004。00853、细胞运动实验趋化运动结果见表5，显示PSILENCER20/CMETSH。

35、RNA2转染组穿膜细胞数为7267473个，而未转染组及空载体转染组分别为10533862、9933321个，2组之间差异无统计学意义P值为0480，转染组与这2组比较，P值分别为0001、0004。高倍镜下细胞摄像见图7。0086本研究根据GENBANK中报道的CMET基因核苷酸序列，参考SIRNA设计原则设计出了三条阻断CMET基因表达的RNAI序列，并成功构建了CMET基因SIRNA重说明书CN102154292ACN102154293A11/11页13组质粒PSILENCER20CMETSHRNA1、PSILENCER20CMETSHRNA2、PSILENCER20CMETSHRNA3。

36、。通过脂质体介导转染喉癌HEP2细胞，观察其对HEP2细胞CMET基因表达的影响，并通过MTT法、运动实验及侵袭实验比较转染前后HEP2细胞的生长、运动及侵袭能力。得到如下结论1成功构建了CMET基因SIRNA重组质粒PSILENCER20CMETSHRNA1、PSILENCER20CMETSHRNA2、PSILENCER20CMETSHRNA3。00872重组质粒PSILENCER20CMETSHRNA2可显著降低HEP2细胞CMETMRNA及蛋白的表达。00883重组质粒PSILENCER20CMETSHRNA2在体外显著抑制了喉癌HEP2细胞的生物学活性。00894SIRNA重组质粒介导。

37、的基因治疗有可能成为喉癌靶向性CMET治疗的新策略，为喉癌的临床治疗提供了实验基础。0090后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。说明书CN102154292ACN102154293A1/5页14中国人民解放军第三军医大学第三附属医院CMET基因的SIRNA片段及其运用16123DNA人工序列CMETMRNA1GTATCAGCTTCCCAACTTCACCG23223DNA人工序列CMETMRNA2。

38、GCAAGCCAGATTCTGCCGAACCA23323DNA人工序列CMETMRNA3GGAGGGACAAGGCTGACCATATG23464DNA人工序列CMETRNAI1F4序列表CN102154292ACN102154293A2/5页15GATCCGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGTCAAGAGCGGTGAAGTTGGGAAGCTGATACTTTTTA64564DNA人工序列CMETRNAI1R5GCATAGTCGAAGGGTTGAAGTGGCAGTTCTCGCCACTTCAACCCTTCGACTATGAAAAATTCGA64664DNA人工序列CMETRNAI2F6GAT。

39、CCGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCATCAAGAGTGGTTCGGCAGAATCTGGCTTGCTTTTTA64764DNA人工序列CMETRNAI2R7GCGTTCGGTCTAAGACGGCTTGGTAGTTCTCACCAAGCCGTCTTAGACCGAACGAAAAATTCGA64864DNA人工序列CMETRNAI3F8GATCCGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTCAAGAGCATATGGTCAGCCTTGTCCCTCCTTTTTA649序列表CN102154292ACN102154293A3/5页1664DNA人工序列CMETRNAI3R9GCCTCCCTG。

40、TTCCGACTGGTATACAGTTCTCGTATACCAGTCGGAACAGGGAGGAAAAATTCGA64101040DNA人工序列PSILENCER20/CMETSHRNA210GCGGCATCCCTCACTAAGGGAGGAGAAGCATGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCA60AAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCGGGCAGGAA120GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAG180ATAATTAGAATTAATTTG。

41、ACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGA240AAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCAT300ATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGGTTTATATATCTTGTGGAAAGGA360CGCGGGATCCGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCATCAAGAGTGGTTCGGCAGAATCTGGCT420TGCTTTTTAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGC480GTT。

42、ACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAA540GAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTG600ATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTC660AGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCT720GACGCGCCCTGACGGGCTTGTGTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCT。

43、GTGACCGTC780TCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAAACGCGCGAGACAAAG840GGCCTCGTGATACGCCTATTTTTTATAGGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGA900CGTCAGGAGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAT960ACATTCAAATATGTATCCGCTTATGAAACAATAACCCTGATAATGCTTCATATATTGAAA1020AAGGAAGATATGAATATTCA10401164DNA人工序列。

44、序列表CN102154292ACN102154293A4/5页17CONTROLF11GATCCGTCAGCACTCTCGAATCAGATGCTCAAGAGGCATCTGATTCGAGAGTGCTGACTTTTTA641264DNA人工序列CONTROLR12GCAGTCGTGAGAGCTTAGTCTACGAGTTCTCGCTAGACTAAGCTCTCACGACTGAAAAATTCGA641321DNA人工序列CMET引物F13GAGGTTCACTGCATATTCTCC211421DNA人工序列CMET引物R14GTCTGAGCATCTAGAGTTTCC211521DNA人工序列GAPDH内参引物F15CACCAGGGCTGCTTTTAACTC2116序列表CN102154292ACN102154293A5/5页1821DNA人工序列GAPDH内参引物R16GATGATGACCCTTTTGGCTCC21序列表CN102154292ACN102154293A1/3页19图1图2图3说明书附图CN102154292ACN102154293A2/3页20图4图5图6说明书附图CN102154292ACN102154293A3/3页21图7说明书附图CN102154292A。

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