桑根酚A化合物,其制备方法和其应用.pdf

本发明披露了一种新的化合物——桑根酚A化合物，其结构如式(I)所示，本发明进一步披露了该化合物的制备方法，和其在制备治疗或预防口腔疾病的药物中、以及在制备口腔护理用品中的应用。

1、  一种如结构式(I)所示的化合物：


2、  如权利要求1所述的化合物，其提取自桑白皮。

3、  如权利要求1所述的化合物，其纯度为50％-99.9％。

4、  如权利要求1所述的化合物，其纯度为75％-99.9％。

5、  如权利要求1所述的化合物，其纯度为高于98％。

6、  一种制备如权利要求1所述的化合物的方法，包含将植物用有机溶剂提取以及将提取物用柱层析分离。

7、  如权利要求6所述的方法，所述植物是桑白皮。

8、  一种用于治疗或预防口腔疾病的药物组合物，其中含有治疗或预防有效量的如权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。

9、  一种用于口腔护理的用品，其中含有口腔护理有效量的如权利要求1所述的化合物和口腔护理可接受的辅剂。

10、  如权利要求8或9所述的用于治疗或预防口腔疾病的药物组合物或用于口腔护理的用品，其中如权利要求1所示的化合物的含量为0.0005-99％(质量百分比)。

11、  如权利要求10所述的用于治疗或预防口腔疾病的药物组合物或用于口腔护理的用品，其中如权利要求1所示的化合物的含量为0.001-10％(质量百分比)。

12、  如权利要求10所述的用于治疗或预防口腔疾病的药物组合物或用于口腔护理的用品，其中如权利要求1所示的化合物的含量为0.025-5％(质量百分比)。

13、  如权利要求11所述的用于治疗或预防口腔疾病的药物组合物或用于口腔护理的用品，其中如权利要求1所示的化合物的含量为0.05-0.5％(质量百分比)。

14、  如权利要求11所述的用于治疗或预防口腔疾病的药物组合物或用于口腔护理的用品，其中如权利要求1所示的化合物的含量为0.5-90％(质量百分比)。

15、  如权利要求1所述的化合物在制备治疗或预防口腔疾病的药物中的应用。

16、  如权利要求1所述的化合物在制备口腔护理用品中的应用。

桑根酚A化合物，其制备方法和其应用
1.技术领域
本发明属于药物技术领域。特别地，本发明涉及一种新的，如结构式(I)所示的，提纯的桑根酚A化合物，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及其在治疗或预防口腔疾病和在口腔护理用品中的应用。
2.技术背景
人类常见口腔疾病有龋病和牙周病。龋病是发生在牙齿硬组织的一种慢性细菌性疾病，表现为牙齿硬组织出现色，形，质的变化。牙周病的临床症状是牙龈出血，溢脓，牙齿松动，牙槽骨吸收以及牙周袋形成。龋齿和牙周病是造成成年人失牙的主要原因之一。目前认为，龋病和牙周病的病因都是口腔正常菌群在口腔生态失调情况下所致的内源性感染的疾病，即始动因子为菌斑微生物，而且是由特异性病原菌所致。细菌是龋病发生的必要条件，变形链球菌(Streptococcus mutans)、粘放线菌(Actinomyces viscosus)等可使碳水化合物分解产酸，导致牙齿无机质脱矿形成龋洞。变形链球菌还是牙菌斑形成的先锋菌，同粘放线菌、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)共同形成牙菌斑。牙菌斑内的细菌所产生的毒素及其他有害物质可引起宿主的炎症反应，使血管渗透性增高、炎症扩散，破坏牙龈、牙骨质和牙槽骨，引起牙龈炎和牙周病。因此抑制口腔致病菌是预防龋齿、牙龈炎和牙周病的重要手段。
目前治疗龋病和牙周病的药物非常有限。一方面，用化学药物消灭或抑制菌斑细菌，但长期使用广谱抑菌药物会产生耐药菌株及其它副作用。比如，近年来国内外使用的化学控菌斑剂洗必泰(Chlorhexidine)，是一种具有明显抑菌作用的二胍己烷(diguanido-hexane)，但长期使用含有0.12-0.20％洗必泰的含漱剂，虽不会形成耐药菌株或对人体造成损害，但它会使牙齿着色，舌背也可能有棕色舌苔。另一方面，利用中医辨证疗法，如含漱金银花等清热解毒中药，也有外敷法，如敷冰硼散，或细辛于患处。这些方法使用起来有很多不方便之处，而且欠缺确凿的证据证明其疗效。然而牙龈炎若不及时治疗或治疗不当，其炎症可能会扩散至根尖周引起尖周组织炎症，进而波及牙槽骨或临近组织。基于以上原因，可以看出，从天然植物里研究开发治疗常见口腔疾病如龋病和牙周病的新药，以及开发能够抑制口腔主要致病菌和牙菌斑，牙龈炎，抑制口臭的口腔药物或口腔护理用品是非常有意义的。
天然植物抑制口腔致病菌的研究具有鲜明的地域特性，根据全球各地不同的地理环境和国情，不同的国家和地区发现了一些具有防龋作用的一些植物，如非洲和中东的榆绿木、斑鸠菊、藤黄；拉美国家的血根草、可可果；东南亚的槟榔；澳洲的桉叶。中国和日本则多集中在中草药的研究。
3.发明内容
本发明的目的在于提供一种新的，如结构式(I)所示的，具有药用价值的，桑根酚A的化合物。
本发明的另一目的是提供一种从桑白皮植物中提取本发明所述的新的，如结构式(I)所示的化合物的方法。
本发明的进一步目的是提供一种以该式(I)所示化合物为有效成分的治疗和预防口腔疾病的药物组合物。
本发明的另一目的是提供一种该式(I)所示化合物和以该式(I)所示化合物为有效成分的组合物在制备治疗或预防口腔疾病的药物方面的用途，以及其在口腔护理用品中的用途。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
如结构式(I)所示的化合物：

本发明同时提供了式(I)化合物的制备方法，即将桑白皮用90％乙醇回流提取三次，每次3小时，回收至于，得浸膏，将该浸膏溶解混悬，用乙酸乙酯萃取3次，回收至干得乙酸乙酯浸膏，所得浸膏用丙酮溶解，吸附于硅胶上，室温挥发致干，经硅胶柱层析，用V/V，8：2的石油醚：丙酮洗脱，每50升为一流分，共计得27个流分Fr.1-Fr.27，流分Fr.6经硅胶柱层析，90：10氯仿：甲醇洗脱即可。
本发明进一步提供用于治疗或预防口腔疾病的药物组合物，所述药物组合物含有治疗或预防有效量的式(I)化合物和药学上可接受的载体。
本发明还提供一种用于口腔护理的用品，其中含有口腔护理有效量的式(I)化合物和口腔护理可接受的辅剂。
本发明式(I)的桑根酚A化合物可用于制备治疗或预防口腔疾病的药物中，也可用于制备口腔护理用品中。
本发明首次发现式(I)所示化合物对口腔致病菌具有一定的抑制作用，并具有抗炎效果。其可作为有效成分应用在抗龋齿，抑制口臭的口腔药物或口腔护理用品中，也可用于抗牙龈炎、抗牙菌斑、口腔去敏感、抗牙垢、牙齿增白的口腔药物或口腔护理用品中。
以下结合实施例具体说明本发明。
实施例1.式(I)所示化合物的制备结构确定
桑白皮50kg用90％乙醇500kg回流提取三次，每次3小时，回收至干，得10.5kg浸膏。将该浸膏用8kg热水及90％的乙醇4kg溶解混悬，用50kg乙酸乙酯萃取3次，回收至干得4kg乙酸乙酯浸膏。所得浸膏用丙酮溶解，吸附与6kg硅胶上，室温挥发致干，经硅胶柱层析(30目，30kg)，用石油醚：丙酮(V/V，8：2)洗脱，每50升为一流分，共计得27个流分Fr.1-Fr.27。流分Fr.6经硅胶柱层析，氯仿：甲醇(90：10)洗脱得式(I)化合物。
经此方法制得的如式(I)所示的化合物可以具有很高的浓度。在某些实施例中，经此方法制得的如式(I)所示的化合物的浓度高于98％。在某些其它实施例中，经此方法制得的如式(I)所示的化合物的浓度为50％-99.9％。在另一些实施例中，经此方法制得的如式(I)所示的化合物的浓度为75％-99.9％。
在上述实施例中，使用了桑白皮来提取如式(I)所示的化合物。本领域的普通技术人员可以认识到，其他植物也可能是适用的，例如与桑白皮同属或同科的植物。
所述如式(I)所示的化合物的结构式由质谱(MS)和核磁共振谱(¹HNMR和¹³C NMR)确定。质谱(MS)使用Auto SPEC 3000型质谱仪来测定。核磁共振谱(¹H NMR和¹³C NMR)用Bruker DRX-500超导核磁共振仪测定，TMS作内标。柱层析材料和薄层层析用硅胶为青岛美高集团有限公司的产品。
所测定的如式(I)所示的桑根酚A化合物的结构式为：

性状：褐色粉末(甲醇)，  熔点，103-105℃
分子式：C₃₄H₂₆0₉。
分子量：578
FAB-MS(-)m/z(％)：561(M+，100)。¹H-NMR(CD₃OD，400 MHz)δ：7.95(1H，d，J＝8.8Hz，H-4)，7.45(1H，s，H-14″)，7.26(1H，d，J＝8.4Hz，H-13″)，7.22(1H，d，J＝2.4Hz，H-7)，7.21(1H，s，H-20″)，7.05(2H，d，J＝2.0Hz，H-2′，6′)，7.02(1H，s，  H-3)，6.97(1H，d，J＝8.0Hz，H-19″)，6.70(1H，dd，J＝9.8，2.0Hz，H-5)，6.13(1H，d，J＝4.0Hz，H-2″)，4.15(1H，dd，J＝12.4，4.8Hz，H-3″)，3.92(1H，s，H-4″)，3.29(1H，m，H-5″)，2.63(1H，dd，J＝17.2，4.8Hz，H-6″)，2.12(1H，dd，J＝16.0，12.0Hz，H-6″)，1.74(3H，s，H-7″)。
¹³C-NMR(CD₃OD，100MHz)δ：156.7(s，C-2)，102.0(d，C-3)，121.0(d，C-4)，122.5(s，C-3a)，104.7(d，C-5)，155.0(s，C-6)，99.4(d，C-7)，151.0(s，C-7a)，133.3(s，C-1′)，105.2(d，C-2′)，156.7(s，C-3′)，117.6(s，C-4′)，161.0(s，C-5′)，104.3(d，C-6′)，134.8(s，C-1″)，124.5(d，C-2″)，36.5(d，C-3″)，27.8(d，C-4″)，35.8(d，C-5″)，35.9(t，C-6″)，23.8(q，C-7″)，102.7(s，C-8″)，114.2(s，C-9″)，161.0(s，C-10″)，161.0(d，C-11″)，104.3(s，C-12″)，107.2(d，C-13″)，130.8(d，C-14″)，117.1(s，C-15″)，154.0(s，C-16″)，104.6(d，C-17″)，158.9(s，C-18″)，110.4(d，C-19″)，128.0(d，C-20″)。
根据本发明所披露的化合物结构式，本领域的技术人员可以无须经过创造性劳动即可轻易地通过化学方法合成所述化合物，以替代本发明中所使用的提取物或纯化物。故而，本领域的技术人员应当了解，除了本发明实施例所列出的从天然桑白皮中进行提取或纯化外，本发明还可以通过化学合成方法来实现。其它对本发明所披露的化合物的显而易见的修改也被包括在本发明的保护范围之内。
实施例2.  式(I)所示化合物对口腔主要致病菌的抑制实验
A.菌种的培养：
表1：相关的口腔致病菌

从日常储存菌种的胰酶解大豆蛋白胨琼脂血平板(简称TSA5B)中挑取单菌落到相应肉汤培养基中，于37.0℃±1.0℃，95％空气，5％CO2微需氧环境中培养(P.g需厌氧培养)，其中S.m培养18-24h，其余两种培养40-48h。然后用相应肉汤培养基调节菌悬液的混浊度到0.5^#McFarland standard，相当于1.0X10⁸CFU/mL。
B.实验方法：  肉汤稀释法(Broth dilution)
在肉汤中将抗菌药物进行一系列二倍稀释后再定量接种检测菌，37℃孵育18-24h后观察，抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度为测定药物对检测菌的最低抑菌浓度(MIC)。操作步骤为：
a.抗菌药物原液的配制：配制1％各种抗菌药物原液，溶剂为100％纯乙醇。原液配制好后过滤除菌，小量分装备用。
b.测定浓度的范围：本实验选择250ppm作为抗菌药物测定浓度的上限。
c.测定方法：微量稀释法。
先于96孔板上的每个孔加100μl肉汤培养基，  再在第一列的每个孔加100μl经10倍稀释过的无菌抗菌药液(1000mg/l)，然后用多道微量移液器在第一列的每个孔上反复吹打7-8次，使药品与TSB充分混合后移取100μl样品到第二列，同样反复吹打7-8次后再移取100μl样品到第三列，以此类推到最后一列，这样药品的浓度就被二倍梯度稀释了，从第一列的500mg/l到最后一列(第12列)的0.24mg/l。
待测菌和标准菌准备如上。用肉汤培养基将菌液稀释，达到含菌量约10⁶CFU/ml。然后每孔接种100μl。这样每排抗菌药物的最终稀释浓度为250，125，62.5...0.12mg/L，最终接种菌量约5x10⁷CFU/ml或每孔5x10⁶个菌；将96孔板置微型振荡器上振荡1min，使各孔内溶液混匀，微孔板加盖并用胶纸密封以减少孵育过程中的蒸发并置湿盒内，于37.0℃±1.0℃，95％空气，5％CO₂微需氧(或90％N₂，5％H₂，5％CO₂厌氧)环境中培养18-24小时。将96孔板置于酶标仪下，对照检测菌和标准菌的生长特性，以无菌生长孔所含最低抗菌药物浓度即为MIC。
C.实验结果(见表2)
表2  式(I)化合物对口腔致病菌的作用