一种由乙二胺修饰的痂囊腔菌素A类衍生物及其制备方法.pdf

本发明公开了一种由乙二胺修饰的痂囊腔菌素A类衍生物及其制备方法，它是在氩气保护下，将乙二胺H2NCH2CH2NH2与痂囊腔菌素A在无水乙醇CH3CH2OH中加热反应后，利用薄层色谱进行分离，得到乙二胺修饰的痂囊腔菌素A衍生物EDEA。

1.  一种由乙二胺修饰的痂囊腔菌素A类衍生物，其特征在于：它是由下述重量的原料制成：
乙二胺5ml  痂囊腔菌素A 50mg  无水乙醇50ml。

2.  根据权利要求1所述乙二胺修饰的痂囊腔菌素A类衍生物的制备方法，其特征在于：它包括下列步骤：
(1)乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)的制备：量取50ml无水乙醇加入150ml的三口瓶中，称取50mg痂囊腔菌素A，将其转移至三口瓶中，将三口瓶置于磁力搅拌加热器上加热搅拌，待其完全溶解后，用恒压滴液漏斗将5ml乙二胺逐滴加入三口瓶内，在氩气保护下采用水浴加温，保持温度35℃，反应12h；
(2)乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)的分离提纯：反应结束后，将反应液移入旋转蒸发器中浓缩，控制温度在65℃，时间15min，浓缩后再按重量比为0.2-0.4ml的浓缩液中加入三氯甲烷1-2ml溶解，用毛细管吸取样品，在酸性硅胶薄层层析板上点样，待样品干燥后，置于盛有展开剂的密闭层析缸中，利用酸性硅胶薄层层析板进行分离，得乙二胺取代的痂囊腔菌素A类衍生物(EDEA)，产率为45％，其中展开剂为三氯甲烷(CHCl₃)和无水甲醇(CH₃OH)体积比为25∶1，利用核磁共振光谱和质谱，对乙二胺取代的痂囊腔菌素A(EDEA)进行了结构确认，相关数据如下：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃，δ，ppm)：16.12(2H，s)，6.59(2H，s)，5.18(2H，s)，5.08(NH，1H，m)，4.29(3H，s)，4.04(6H，s)，3.40-3.71(4H，m)，2.03(6H，s)；m/z(MALDI-TOF MS)555.09(M+1)。

一种由乙二胺修饰的痂囊腔菌素A类衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种由乙二胺修饰的痂囊腔菌素A类衍生物EDEA及其制备方法，所述的由乙二胺修饰的痂囊腔菌素A类衍生物EDEA在光照条件下可以产生单重态氧和超氧负离子自由基。
背景技术：
光动力疗法(Photodynamic Therapy，简称PDT)是近年来发展起来的一种新型治疗方法。该疗法在治疗鲜红斑痣、微血管疾病、视网膜黄斑变性和动脉粥样硬化等方面取得了突破性进展。此外，作为一种全新的治疗癌症的手段，与传统的治疗技术(如化疗、放疗和手术等)相比，具有特异性杀伤癌症细胞、对健康组织损伤小、毒副作用低、手术后并发症少以及经济方便等独特的优点。尤其对于属于癌症晚期和由于年龄、体质等原因不适合使用传统治疗技术的病人，光动力疗法是一种较为理想的治疗手段。因此该治疗方法被认为是一种非常有前景的癌症治疗技术，成为倍受重视的研究领域。目前，美国、日本与加拿大等国家相继批准用于支气管癌、肺癌、胃癌、膀胱癌等的临床治疗。但是，这类血卟啉衍生物光敏剂的公认缺点是红光吸收不够强和光敏副作用持续时间长(几天到十几天)等。因此，高效、低毒的光敏剂仍是人们大力寻求的目标。
另外，由于生物体内红血球的存在和光散射等原因，不同波长的光对组织的穿透程度存在差别。总的说来，光的波长越长对组织的穿透深度越大。如在630nm(临床治疗所用波长)处，光的有效穿透深度平均为3mm左右，而在700-850nm左右时光的穿透深度能增加到一倍以上。因此，寻找在光疗窗口(600-900nm)具有强吸收的光敏剂一直是人们在努力的方向。此外，针对实体肿瘤组织的部位存在缺氧的特点，设计以自由基机制(Type I机制)为主的光敏剂也是光动力药物发展的新战略之一。
苝醌类光敏剂是以3，10-二羟基-4，9-苝醌为母体的一类天然光敏剂，主要有竹红菌素(Hypocrellins)、金丝桃蒽酮(Hypercin)和痂囊腔菌素A(Elsinochrome A，简称EA，结构如图1)等，具有三重态量子产率高、单重态氧量子产率高、光毒性高和从正常组织排出速率快等优点。研究表明，该类光敏剂具有杀灭HIV病毒、抗单纯性疱疹类型I病毒和Sindbis病毒的活性。因此，该类光敏剂受到了国内外多个研究小组的重视。但是，苝醌类光敏剂在光疗窗口吸收较弱和水溶性差的缺点，又限制了在临床应用领域的进一步发展。针对该类光敏剂存在的缺点，研究者通过化学修饰等方法来改善其长波吸收强度和提高水溶性。其中，竹红菌素作为我国特有的光敏剂更是得到了广泛的研究。通过在竹红菌素母体的不同反应位点，如芳环、酚羟基、醌羰基、七元环和甲氧基等，采用不同的修饰方法，如巯基化、胺基化和氨基酸修饰等方法，获得了多个系列的竹红菌素衍生物，如：竹红菌素糖苷化、巯基化、光磺化反应得到的衍生物以及和铝离子的络合产物。研究结果表明，这些衍生物的水溶性和光敏性能较竹红菌素母体均有不同程度的改善，其中引人注目的是竹红菌素胺基化衍生物，该类衍生物的最大吸收波长可达到630nm，并且其在长波方向的吸收强度也得到明显提高。
与研究较为广泛和充分的竹红菌素相比，痂囊腔菌素A分子的HOMO和LUMO两能级间能级差更小(0.31352eV)，导致其单重态氧的量子产率明显高于竹红菌素和金丝桃蒽酮，其在氘代甲醇中甚至可以达到0.89。另外，量子化学计算结果表明痂囊腔菌素A分子的价层电子比竹红菌素更易受激而产生激发态，形成正离子自由基。细胞实验证明痂囊腔菌素A的抑菌和抗肿瘤细胞能力均显著高于竹红菌素。
发明内容：
因此目前痂囊腔菌素A已引起许多从事光动力研究者的广泛关注，至今为止，还没有发现关于痂囊腔菌素A胺基衍生物研究的有关报道，本发明的目的就是提供一种由乙二胺修饰的痂囊腔菌素A类衍生物。
本发明的另一目的就是提供了乙二胺修饰痂囊腔菌素A类衍生物的制备方法。
本发明由乙二胺、痂囊腔菌素A以无水乙醇作为溶剂在加热条件下制得，按重量由以下组分组成：
乙二胺  5ml    痂囊腔菌素A  50mg    无水乙醇  50ml
本发明的方案是在氩气保护下，将乙二胺H₂NCH₂CH₂NH₂与痂囊腔菌素A在无水乙醇CH₃CH₂OH中加热反应后，利用薄层色谱进行分离，得到乙二胺修饰的痂囊腔菌素A衍生物EDEA。
(i)在氩气保护下，将痂囊腔菌素A溶于无水乙醇中后，滴加乙二胺于无水乙醇中，加热至35℃。
(ii)反应停止后，利用酸性硅胶薄层层析板进行分离，可以得到化合物EDEA。
本发明所述的痂囊腔菌素A(EA)结构如图1所示，乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)结构如图2所示。
附图说明：
图1为痂囊腔菌素A(EA)的结构图；
图2为乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)的结构图；
图3为痂囊腔菌素A(EA)和乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)在二甲基亚砜(DMSO)中的吸收光谱；
图4为在一定条件下，乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)在二甲基亚砜(DMSO)中的电子自旋光谱。
附图说明：
图1中OCH₃表示甲氧基，OH表示酚羟基，2位与10位上的碳氧双键为醌羰基。
图2中乙二胺其中的一个胺基取代了痂囊腔菌素A中2位的一个甲氧基，另一个胺基与3位的醌羰基发生反应，形成碳氮双键。
图3中在二甲基亚砜(DMSO)中痂囊腔菌素A的最大吸收峰的波长为471nm，而乙二胺修饰的痂囊腔菌素A的最大吸收峰的波长为708nm。
图4中的a是通过用532nm的光源照射含有2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)和乙二胺修饰的痂囊腔菌素A的氧气饱和溶液1分钟得到的电子自旋光谱，b是通过用532nm的光源照射含有5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)和乙二胺修饰的痂囊腔菌素A的空气饱和溶液1分钟得到的电子自旋光谱。
具体实施方式：
1、痂囊腔菌素A的来源
痂囊腔菌素A由中国药科大学提供，校址位于江苏省南京市童家巷24号。
2、乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)的制备
量取50ml无水乙醇加入150ml的三口瓶中，称取50mg痂囊腔菌素A，将其转移至三口瓶中，将三口瓶置于磁力搅拌加热器上(85-2型，由上海司乐仪器厂生产出品)加热搅拌，待其完全溶解后，用恒压滴液漏斗将5ml乙二胺逐滴加入三口瓶内，在氩气保护下采用水浴加温，保持温度35℃，反应12h。
所述的氩气保护，是在三口瓶中设置一根导气管，其中一端导气管口置于液面下，另一端显于液面上，将氩气钢瓶用乳胶管与反应液面以下的导气管口相连，再将另一管口与另一乳胶管相连，把另一乳胶管的另一端放入盛有少量水的烧杯中，观察烧杯中的气泡情况，调整氩气钢瓶开关旋钮，调至每分钟上冒25个气泡为止。
3、乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)的分离提纯
反应结束后，将反应液移入旋转蒸发器中浓缩(该蒸发器为RE-3000型，由上海亚荣生化仪器厂出品)，控制温度在65℃，时间为15min，浓缩后再按重量比为0.2-0.4ml的浓缩液中加入三氯甲烷1-2ml溶解，用毛细管吸取样品，在酸性硅胶薄层层析板上点样，待样品干燥后，置于盛有展开剂的密闭层析缸中，利用酸性硅胶薄层层析板进行分离，得乙二胺取代的痂囊腔菌素A类衍生物(EDEA)，产率为45％。其中展开剂为三氯甲烷(CHCl₃)和无水甲醇(CH₃OH)体积比为25∶1。
利用核磁共振光谱和质谱，对乙二胺取代的痂囊腔菌素A(EDEA)进行了结构确认。相关数据如下：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃，δ，ppm)：16.12(2H，s)，6.59(2H，s)，5.18(2H，s)，5.08(NH，1H，m)，4.29(3H，s)，4.04(6H，s)，3.40-3.71(4H，m)，2.03(6H，s)；m/z(MALDI-TOF MS)555.09(M+1)。
4、痂囊腔菌素A(EA)和乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)在二甲基亚砜(DMSO)中的吸收光谱
与母体化合物痂囊腔菌素A相比，乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)在二甲基亚砜(DMSO)中的吸收光谱明显红移。乙二胺修饰后的痂囊腔菌素A(EA)的最大吸收峰有原来的471nm红移到到708nm。这是由于母体化合物中的甲氧基和酚羟基被氨基取代以后的结果。
5、乙二胺修饰的痂囊腔菌素A(EDEA)在二甲基亚砜(DMSO)中的电子自旋光谱
实验采用Bruker ESP-300E电子自旋共振仪在室温下测得(X波段，微波频率为100Hz)，照射光源为Quanta-Ray Nd:YAG型激光(532nm，脉宽为5-6ns，重复频率为10Hz，能量为10mJ per pulse)。测量时仪器参数为：微波功率5mW，调制幅度为1.012G，调制频率100kHz，扫场宽度为100G，信号增益为1.0×10⁵。超氧负离子自由基(O₂^-.)通过5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)进行捕获。单重态氧(¹O₂)利用2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)来捕捉。根据实验不同要求，待测样品需转移至专用的石英毛细管中后，于暗处分别充入空气和氧气30min，并加入相应的捕获剂，进行相关测试。
信号a为一个等强度的三重峰信号。这是典型的TEMP-¹O₂的电子自旋信号(α^N＝13.0G，g＝2.0056)。从电子自旋信号可以计算出裂分常数为16.0G，这一数值与文献中TEMP-¹O₂的裂分常数一致。
信号b的线型及其三个精细裂分常数(α^N＝13.0G、α_β^H＝10.1G和α_γ^H＝1.5G)与文献报道的DMPO-超氧负离子自由基加合物(DMPO-O₂^-.)相一致。g值(2.0056)也与DMPO-O₂^-.一致。
同时通过对照实验c表明，电子自旋信号的产生需要光照、光敏剂、捕获剂、氧气或空气同时存在才可以得到。