发明内容
本发明人经研究现已发现穿心莲内酯及其衍生物尤其是穿心莲内酯二琥珀酸半酯或脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯或脱氧穿心莲内酯二琥珀酸半酯经聚乙二醇共价修饰后，毒副作用降低，活性有所提高，且显著增加其水溶性及稳定性，延长了其在体内的半衰期。
本发明涉及式(I)所示穿心莲内酯或脱水穿心莲内酯或脱氧穿心莲内酯及其衍生物的聚乙二醇化偶合物：
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其中，D为![]()
或![]()
或![]()
R1、R2分别独立的为H或结构X1-mPEG，但不同时为H；其中，mPEG为CH2CH2(OCH2CH2)n1-OCH3，n1＝0-1000；X1为![]()
n2为0-4，X2可以为A、B或Y；
A＝-(NH-CR3R4-CO)n3-(NH-CR5R6-CO)n4-(NH-CR7R8-CO)n5-(NH-CR9R10-CO)n6-Z-；R3到R10分别独立的为H，取代或未取代的C1-C6直链或者支链烷基，取代或未取代的C2-C6直链或者支链烯基或者炔基，取代或未取代的C1-C6直链或者支链烷氧基，取代或未取代的C1-C6直链或者支链烷硫基，取代或未取代的C2-C6直链或者支链烯基或者炔基氧基，取代或未取代的C2-C6直链或者支链烯基或者炔基，环烷基或环链烯基，芳基，杂环基；-(CH2)n7-CO-O-mPEG；-(CH2)n7-CO-N-mPEG；n7为1-6，mPEG定义同前；其中，优选地，杂环烷基为其环结构中含1-5个(优选1-3个)独立地选自N、O和S等的杂原子的环状基团；芳基为未取代的或被独立地选自卤素，硝基，羧基或C1-C4烷基的取代基单取代或二取代或三取代的4、5、6、或7元单环或双环芳香基团，如苯基或者或萘基等；杂环基可为未取代的或被独立地选自卤素，硝基，羧基或C1-C4烷基的取代基单取代或二取代的、含有1-5个独立地选自N、O和S等的杂原子的4、5、6、或7元单环或双环芳香基团，如吡咯基，呋喃基，吡啶基等；n3到n6分别独立的为0或1；Z为O或NH。
B＝-NH-(CH2)n8-S-S-(CH2)n9-C(O)-Z-；n8为2-5，n9为1-4；Z为O或NH。
Y＝-NH-(CH2)n10-S-M-，n10为2-5；
M为![]()
或![]()
或![]()
更为优选的，M为![]()
n10＝2。
本发明再一方面涉及含至少一种式(I)化合物及药用载体或赋形剂的药物组合物。
本发明还涉及至少一种式(I)化合物在制备抗菌消炎、镇痛、抗病毒等相关的药物中用途。
根据本发明，在本发明中使用的缩写词具有下面的含义：
PEG-聚乙二醇
mPEG-单甲氧基聚乙二醇
Et3N-三乙胺
RP-HPLC-反相液相色谱
TLC-薄层色谱
EDC·HCl-1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐
DCM-二氯甲烷
DMAP-二甲胺基吡啶
Ts-Cl-对甲苯磺酰氯
MALDI-TOF-MS-基质辅助激光解析飞行时间质谱
TCID50-半数培养感染剂量
MDCK-犬肾细胞
DMEM-一种培养基
根据本发明，本发明所涉及的mPEG-OH可以作为商品化试剂从德国Fluka公司购买，mPEG-NH2可以购买或通过以下反应得到：
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本发明以平均分子量为350、500、550、750、1000、1100、2000和5000的CH3O-PEG-OH(mPEG)，其也可表示为mPEG350，mPEG500，mPEG550，mPEG750，mPEG1000，mPEG1100，mPEG2000和mPEG5000为原料，合成了系列单位点mPEG修饰以及双位点mPEG修饰的脱水穿心莲内酯衍生物。各化合物经RP-HPLC以及TLC分析为单一峰，经质谱和氢谱、碳谱核磁分析，确证结构正确。
根据本发明，本发明的药物组合物制成适用于哺乳动物用的各种剂型，例如用甘露醇作赋形剂制成注射剂。
具体实施方式
实施例
下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。实施例所用平均分子量为350、500、550、750、1000、1100、2000和5000的CH3O-PEG-OH(mPEG)为德国Fluka公司产品，1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与二甲胺基吡啶(DMAP)均为国产分析纯试剂。
实施例1以穿琥宁为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的单位点mPEG1100衍生物。
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称取穿琥宁2.85g(5mmol)置于500ml反应瓶中，加入125ml乙醇和175ml水的混合溶液，固体溶解后，在冰浴条件下，滴加5.0ml1M的HC l水溶液，滴加完毕后搅拌10分钟，室温(25℃)旋转蒸发除去大量乙醇后，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发除去溶剂，定量得脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯2.60g。
将2.6g(5mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM，加入1.95g EDC·HCl(10mmol)溶解后，搅拌反应10分钟，再加入8.25gmPEG1100(7.5mmol)。冰浴条件下，加入0.061g DMAP(0.5mmol)。反应5小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状液体，用无水乙醚沉淀出白色固体，得4.55g产物，收率55.8％。经经MALDI-TOF-MS鉴定，分子量在1826左右呈正态分布(mPEG1100原料分子量在1244左右呈正态分布)，分子量正确。
实施例2以脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的单位点mPEG1100衍生物。
将2.53g(5mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM，加入1.95g EDC·HCl(10mmol)溶解后，搅拌反应10分钟，再加入8.25gmPEG1100(7.5mmol)。冰浴条件下，加入0.061g DMAP(0.5mmol)。反应5小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状液体，用无水乙醚沉淀出白色固体，得4.42g产物，收率54.2％。
实施例3以穿琥宁为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG1100衍生物。
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称取穿琥宁2.85g(5mmol)置于500ml反应瓶中，加入125ml乙醇和175ml水的混合溶液，固体溶解后，在冰浴条件下，滴加5.0ml 1M的HCl水溶液，滴加完毕后搅拌10分钟，室温(25℃)旋转蒸发除去大量乙醇后，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发除去溶剂，定量得脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯2.60g。
将2.6g(5mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM，加入2.14g EDC·HCl(11mmol)溶解后，搅拌反应10分钟，再加入12.12g mPEG1100(11mmol)。冰浴条件下，加入0.061g DMAP(0.5mmol)。反应8小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状液体，用无水乙醚沉淀出白色固体，得5.59g产物，收率42.5％。经MALDI-TOF-MS鉴定，分子量在2962左右呈正态分布(mPEG1100原料分子量在1244左右呈正态分。布)，分子量正确。氢谱数据如下：脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯结构上H归属：δ0.86(3H，s，17-CH3)，1.00(3H，s，18-CH3)，1.20-1.27(1H，m，1-CH2)，1.31(1-H，d，5-CH)，1.53-1.57(2H，m，1-CH2，6-CH2)，1.64-1.69(2H，m，2-CH2)，1.81(1H，d，6-CH)，2.05(1H，m，7-CH2)，2.33-2.74(10H，m，7-CH2，9-CH，22-CH2，23-CH2，26-CH2，27-CH2)，4.15(1H，d，19-CH2)，4.39(1H，d，19-CH2)，4.56(1H，s，20-CH2)，4.64(1H，t，3-CH)，4.80(1H，s，20-CH2)，4.82(2H，s，15-CH2)，6.12(1H，d，12-CH)，6.92(1H，dd，11-CH)，7.18(1H，s，14-CH)；mPEG结构上H归属：δ3.38(6H，s，-OCH3![]()
，3.56-3.67(200H，m，-OCH2CH2-)。氢谱确证含有小分子特征峰和mPEG1100特征峰。结合氢谱和质谱确证结构正确，为双mPEG1100偶合的脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯衍生物。
实施例4以脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG1100衍生物。
将2.53g(5mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM，加入2.14g EDC·HCl(11mmol)溶解后，搅拌反应10分钟，再加入12.14g mPEG1100(11mmol)。冰浴条件下，加入0.061g DMAP(0.5mmol)。反应8小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状液体，用无水乙醚沉淀出白色固体，得5.64g产物，收率42.9％。
实施例5以脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯和平均分子量为350的mPEG350为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG350衍生物。
将0.53g(1mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于25ml DCM，加入0.50g EDC·HCl(2.5mmol)溶解后，搅拌反应15分钟，再加入0.77g mPEG350(2.2mmol)。冰浴条件下，加入0.012g DMAP(0.1mmol)。反应10小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状产物0.58g，收率47.9％。mPEG350重复单元氢数与脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯12位(见实施例3示意图)的特征氢数比例为74∶1，证明结构正确。
实施例6以脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯和平均分子量为500的mPEG500为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG500衍生物。
将5.32g(10mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于150ml DCM，加入5g EDC·HCl(25mmol)溶解后，搅拌反应15分钟，再加入11gmPEG500(22mmol)。冰浴条件下，加入0.122g DMAP(1mmol)。反应10小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状产物6.90g，收率45.6％。经MALDI-TOF-MS鉴定，分子量在1596左右呈正态分布(mPEG500原料分子量在548左右呈正态分布)，分子量正确。
实施例7以脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯和平均分子量为750的mPEG750为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG750衍生物。
将5.32g(10mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于150ml DCM，加入5g EDC·HCl(25mmol)溶解后，搅拌反应15分钟，再加入11gmPEG750(22mmol)。冰浴条件下，加入0.122g DMAP(1mmol)。反应10小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色蜡状产物7.21g，收率35.8％。经MALDI-TOF-MS鉴定，分子量在1904左右呈正态分布(mPEG750原料分子量在702左右呈正态分布)，分子量正确。
实施例8以脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯和平均分子量为1000的mPEG1000为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG1000衍生物。
将2.53g(5mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM，加入2.14g EDC·HCl(11mmol)溶解后，搅拌反应10分钟，再加入11.02g mPEG1000(11mmol)。冰浴条件下，加入0.061g DMAP(0.5mmol)。反应8小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状液体，用无水乙醚沉淀出白色固体，得5.68g产物，收率45.2％。经经MALDI-TOF-MS鉴定，分子量在2565左右呈正态分布(mPEG1000原料分子量在1047左右呈正态分布)，分子量正确。
实施例9以脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯和平均分子量为2000的mPEG2000为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG2000衍生物。
将0.53g(1mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于25ml DCM，加入0.5g EDC·HCl(2.5mmol)溶解后，搅拌反应15分钟，再加入4.4gmPEG2000(2.2mmol)。冰浴条件下，加入0.012g DMAP(0.1mmol)。反应10小时，HPLC监测反应完全后，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状液体，用无水乙醚沉淀出白色固体，得产物1.78g，收率39.5％。经氢谱鉴定，mPEG2000重复单元氢数与脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯12位(见实施例3示意图)的特征氢数比例为487∶1，证明结构正确。
实施例10以脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯和平均分子量为5000的mPEG5000为起始原料，制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG5000衍生物。
将0.53g(1mmol)脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯溶于25ml DCM，加入0.5g EDC·HCl(2.5mmol)溶解后，搅拌反应10分钟，再加入11gmPEG5000(2.2mmol)。冰浴条件下，加入0.012g DMAP(0.1mmol)。反应10小时，HPLC监测反应完全，浓缩反应液，通过硅胶柱层析，得淡黄色油状液体，用无水乙醚沉淀出白色固体，得3.28g产物，收率31.2％。mPEG5000重复单元氢数与脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯12位(见实施例3示意图)的特征氢数比例为1126∶1，证明结构正确。
实施例11穿琥宁与脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的单位点mPEG1100以及mPEG2000衍生物稳定性评价
按药典规定现配磷酸钾缓冲液，并按比例加入20％的乙醇，取穿琥宁原料药、PEG修饰物分别溶于上述溶液中，置于光照条件下，分别于5天、10天后取样，用HPLC进行检测。结果：在三个pH值以及光照条件下，原料药穿琥宁5天即全部分解，而脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的单位点mPEG1100以及mPEG2000衍生物在10天时，几乎所有样品含量仍大于90％，其稳定性明显好于穿琥宁原料药。详见表1、表2和表3。
表1溶液pH为3.56时样品含量变化
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表2溶液pH为5.46时样品含量变化
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表3溶液pH为6.56时样品含量变化
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实施例12脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG1100衍生物活性评价-对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
取昆明种小鼠70只，按性别体重随机分为7组，每组10只，雌雄各半。即阴性对照组(葡萄糖溶液)，穿心莲内酯组，穿琥宁组，代号为Lkq109030脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG1100衍生物的高、中、低剂量组，阳性对照组(地塞米松)。对穿心莲内酯组以200mg/kg尾静脉给药，穿琥宁组以100mg/kg尾静脉给药，Lkq109030高剂量以200mg/kg尾静脉给药，中剂量以100mg/kg静脉给药，低剂量以50mg/kg尾静脉注射给药。阳性对照组(地塞米松注射液)以0.01375％的浓度给小鼠尾腔注射2.75mg/kg。上述各组小鼠均每日给药一次，连续给药三天，于末次给药后30min，用二甲苯0.02ml/只涂抹每鼠左耳致炎，右耳作对照，致炎后20分钟脱颈椎处死小鼠，以9mm直径打孔器取下耳缘左、右耳片，分别用电子天平称重，以左、右耳片重量差表示肿胀度，进行组间显著比较。实验结果见表4。
表4化合物Lkq109030对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
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与阴性对照组比较 ***P＜0.001
由表4显示，将穿心莲内酯，穿琥宁，Lkq109030(高、中、低)，每日一次，连续三天，静脉给药后。穿琥宁、Lkq109030高剂量组、中剂量组及低剂量组肿胀度与阴性对照组比较有显著差异性，且穿琥宁、Lkq109030中剂量组对二甲苯致炎的抗炎效果相当。
实施例13脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的双位点mPEG1100衍生物活性评价-对醋酸所致小鼠疼痛的影响
取昆明种小鼠70只，按体重随机分为7组，每组10只，雌雄各半。分别为阴性对照组(5％葡萄糖溶液)，穿心莲内酯组(200mg/kg)，穿琥宁组(100mg/kg)，Lkq109030高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低剂量组(50mg/kg)，阳性对照组(吗啡)。除阳性对照组外其余各组均以尾静脉注射给药，连续给药3天，给药剂量为0.2ml/10g。阳性对照组于实验当日腹腔注射0.06％吗啡溶液0.4ml/20g。于末次给药30mi n后，给小鼠腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，记录给醋酸后20min内小鼠因腹膜受刺激而引起扭体反应次数，进行组间显著性比较。实验结果见表5。
表5化合物Lkq109030对醋酸所致小鼠疼痛的影响(n＝10，X±S)
组别
药物剂量(mg/kg)
扭体反应(次数)
穿心莲内酯
200
23.1±12.3*
穿琥宁
100
22.4±12.4
组别
药物剂量(mg/kg)
扭体反应(次数)
Lkq109030
200
12.2±9.8**
Lkq109030
100
13.9±10.2*
Lkq109030
50
23.1±11.8*
吗啡
12
0.0±0.0***
(阴性组)
-
44.0±17.7
与阴性对照组比较 *P＜0.05 ***P＜0.001
表5结果表明，穿心莲内酯、穿琥宁、化合物Lkq109030(高、中、低)尾静脉注射给药，每日一次，连续三天，能抑制小鼠腹腔注射醋酸所引起的扭体反应次数，与阴性对照组比较具有显著性的差异，说明穿心莲内酯、穿琥宁、化合物Lkq109030(高、中、低)具有显著的镇痛作用。
实施例14脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的单位点mPEG2000衍生物抗流感病毒体外活性评价
一、实验材料：
1、样品：1-3号样品，配制起始浓度为1∶20。
1号：穿心莲内酯
2号：穿琥宁
3号：MPEG2000穿琥宁修饰
4号：MPEG4100穿琥宁修饰
2、病毒株：流感病毒甲1亚型，实验前测定其TCID50为10-6.83/100ul，100TCID50/100ul为10-4.83。
3、细胞株：MDCK细胞，生长液为含10％胎牛血清的DMEM。
4、试剂耗材：DMEM(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；96孔细胞培养板(美国Corning公司).
二、实验方法
1、样品配制
用DMEM对样品进行倍比稀释，其药液浓度分别为50mg/ml(1∶20)、25mg/ml(1∶40)、12.5mg/ml(1∶80)、6.25mg/ml(1∶160)、3.13mg/ml(1∶320)、1.56mg/ml(1∶640)、0.78mg/ml(1∶1280)、0.39mg/ml(1∶2560)、.................等浓度。
2、MDCK细胞毒性实验
取1∶40～1∶5120的1-3号样品稀释液，分别加入到长成单层的96孔MDCK细胞培养版中，100ul/孔，每浓度3孔，置37℃，5％CO2培养箱中96h，观察细胞病变，测定样品对MDCK细胞的毒性反应。
3、抗病毒实验
将100TCID50流感病毒液分别加入到长成单层的96孔MDCK细胞培养版中，100ul/孔，2h后顷去病毒液，每孔内再加入不同浓度的、对细胞无毒性作用的样品稀释液，100ul/孔，每浓度3孔，置35℃，5％CO2培养箱中24h后观察细胞病变，96h后进行血凝实验。
三、实验结果
1.样品对MDCK细胞的毒性实验
表1MDCK细胞的毒性实验
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表1结果提示：1号样品从1∶320开始对细胞无毒性，2号样品从1∶160开始对细胞无毒性，3号样品从1∶320开始对细胞无毒性。
2、抗流感病毒实验
表2样品对流感病毒致MDCK细胞病变的抑制实验
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表2结果提示：1号样品从1∶320稀释浓度开始，对流感病毒感染MDCK细胞没有抑制作用；2号样品从1∶160稀释浓度开始，对流感病毒感染MDCK细胞没有抑制作用；3号样品从1∶320到1∶1280稀释浓度，对流感病毒感染MDCK细胞有抑制作用，之后浓度没有抑制作用。
结论
1、1号样品1∶40～1∶160均对细胞有明显毒性作用，从最大无毒性浓度1∶320～1∶40960，1号样品对流感病毒致MDCK细胞病变无抑制作用。
2、2号样品从1∶40～1∶80均对细胞有明显毒性作用，从最大无毒性浓度1∶160～1∶20480，2号样品对流感病毒致MDCK细胞病变无抑制作用。
3、3号样品从1∶40～1∶160均对细胞有明显毒性作用，从最大无毒性浓度1∶320～1∶1280，3号样品对流感病毒致MDCK细胞病变有抑制作用，其他浓度对细胞病变无抑制作用。