一株苯系化合物兼性厌氧降解菌.pdf

具体实施方式

1一株苯系化合物兼性厌氧降解菌的筛选方法

1.1材料准备

1.1.1菌源

采集大庆油田油污区，表层以下5-10cm的土壤样品。

1.1.2培养基

无机盐分离培养基：0.42g·L^-1NaNO₃，0.27g·L^-1NH₄Cl，7.9g·L^-1Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g·L^-1KH₂PO₄，1.0g·L^-1MgSO₄·7H₂O，1.0mL·L^-1微量元素溶液(微量元素溶液的配比为：2.14g·L^-1ZnCl₂，2.5g·L^-1MnCl₂·4H₂O，0.3g·L^-1CoCl₂·6H₂O，0.2g·L^-1CuCl₂·2H₂O，0.4g·L^-1NaMoO₄·2H₂O，4.5g·L^-1CaCl₂·2H₂O，2.9g·L^-1FeCl₃·6H₂O，1.0g·L^-1H₃BO₃，0.1g·L^-1KI，1L去离子水)，0.472g·L^-1丁二酸钠，1L蒸馏水，pH＝7.0。

琼脂培养基：1L无机盐分离培养基+20g·L^-1琼脂。

LB培养基：1.0g·L^-1酵母粉(YEAST EXTRACT)，2g·L^-1蛋白胨(TRYPTONE)，2g·L^-1NaCl，1L蒸馏水，pH＝7.0。

斜面培养基：1.0g·L^-1酵母粉(YEAST EXTRACT)，2g·L^-1蛋白胨(TRYPTONE)，2g·L^-1NaCl，15g·L^-1琼脂，1L蒸馏水，pH＝7.0。

以上培养基分别于121.5℃条件下蒸汽灭菌30mins后备用。

1.1.3实验仪器和设备

气相色谱仪：HP 6890N气相色谱(具FID检测器)；

色谱柱：HP-5毛细管柱30m×0.32mm×0.25μm；

SW-CJ-2FD超净工作台；

TGL-16A台式高速冷冻离心机；

CA-1型静音无油空气泵；

SHZ-82A气浴恒温振荡器；

LDZX-40SAI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅；

PHX型智能生化培养箱；

DHG-9423A型电热恒温鼓风干燥箱；

SHA-C型恒温水浴振荡器；

HH-4数显恒温水浴锅；

78-1磁力搅拌器；

海尔BCD-301W H冰箱；

Mastercycler ep gradient S银质梯度PCR仪；

UVP EC3600凝胶成像系统等。

1.2松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A的分离

1.2.1菌株的驯化筛选

取5g土壤样品于50mL离心管中，用自来水洗涤，在8000r/min条件下离心5mins，共3次以去除腐殖酸。在100mL的摇瓶中加入50mL无机盐分离培养基，分析纯的苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯各6.25μL，丁二酸钠23.6mg和离心洗涤的土样摇匀，用硅胶塞和Parafilm封口膜密封。在30℃、200r/min条件下振荡培养2-4天，视菌悬液的浑浊程度决定是否结束第一个周期的驯化培养。此后，取菌悬液200μL，丁二酸钠含量等梯度递减(按4个梯度，等梯度递减)，苯系化合物含量等梯度递增(按4个梯度，等梯度递减)，其他条件不变驯化培养。第四个周期时，50mL培养基中丁二酸钠含量为零，苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯各50μL，得到驯化培养的菌悬液。驯化周期结束后，菌悬液中的降解菌群能够利用苯系化合物作为唯一碳源和能源。驯化条件如表1所示。

表1降解菌驯化实验条件

1.2.2菌株的分离纯化

在1.5mL灭菌的离心管中，加入驯化培养的菌悬液50μL，无菌水1.0mL，等梯度稀释6个梯度。琼脂培养基灭菌冷却至40℃左右时，加入分析纯的苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯各200μL，摇匀，快速倒平板，冷却得分离菌落用平板。将第五、第六个浓度梯度稀释的菌悬液20μL涂布平板上。将平板于30℃条件下，恒温培养3-5天。挑取长势好的一个菌落进行纯培养，得到纯培养后的菌落。

于18mm×180mm的试管中加入10mL无机盐分离培养基，加入苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯各10μL，用接种环挑取纯培养后的菌落接种于其中，硅胶塞和Parafilm封口膜密封。于30℃、200r/min条件下振荡培养36小时，取菌悬液涂板，方法同上所述。纯培养2-3次，直至获得单一菌株，记为菌株HBSD-A[即松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A]，观察记录平板上菌株生长状况、菌落特征。

将菌株HBSD-A(即纯化的菌种)划线接种于斜面培养基上，于4℃冰箱储存，每个月都用无机盐分离培养基和苯系化合物活化培养(即入10mL无机盐分离培养基，加入苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯各10μL)、涂布平板再接种于斜面上以备后续试验用。为了长期保藏菌株HBSD-A，已于2009年11月27日将菌株HBSD-A送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。

2松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A的鉴定

2.116S rDNA全序列测定

2.1.1细菌基因组DNA的提取(革兰氏阳性菌)

a)超净台内将分离得到的菌种HBSD-A接种于含10g·L^-1葡萄糖的LB培养基(用无菌牙签蘸取)，5mL/tube×2，于37℃220rpm离心过夜。

b)超净台内将10mL菌液转移至50mL圆底离心管。4℃5000rpm离心20min。

c)弃上清，加入1.2mL 10mM Tris-Cl(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)(PH8.0)/25％Sucrose，vortex悬浮，分装到2只1.5mL EP管(0.6mL/EP)。

d)加入10mg/mL溶菌酶(新鲜配制)，使终浓度为1mg/mL，混匀，37℃水浴10min。

e)加入200g·L^-1SDS(十二烷基磺酸钠溶液)，使其终浓度为5g·L^-1；加入蛋白酶K，使终浓度为100μg/mL，轻柔混匀。50℃水浴3h，期间不时颠倒混匀。

f)冷至室温，加入等体积酚/氯仿，充分颠倒混匀10min。

g)室温5000rpm离心15min，取上清。

h)重复步骤f)、步骤g)一次。

i)加入等体积氯仿，充分颠倒混匀10min。室温5000rpm离心15min，取上清。

j)两只EP合并，分至3只EP管(约0.4mL/EP)。

k)每EP管加入2体积预冷的无水乙醇和1/10体积的3M NaOAC(醋酸钠)(使其终浓度为0.3M)，-20℃沉淀2h或过夜。

l)0℃离心，最大转速(或5000rpm)，弃上清。

m)加入半管(约700μl)70％乙醇洗涤，4℃离心，最大转速(或5000rpm)，弃上清。

n)室温干燥。

o)溶于适量TE(PH7.4)(20～50μL)，加入10mg/mL RNase(RNA水解酶)，使终浓度为20μg/mL，37℃水浴2h。

p)重复酚/氯仿抽提，无水乙醇/3M NaOAC沉淀，70％乙醇洗涤。(步骤及方法同上)。

q)用适量3dH₂O(灭菌三蒸水)溶解DNA沉淀。

r)-20℃保存。

2.1.216S rDNA基因的PCR扩增

①PCR扩增引物：

P1：正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’

P2：反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’

②反应体系：

在50μL反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μLP1和P2(终浓度为0.5μM)，1μLdNTP(每种NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2.1.316S rDNA全序列测定

PCR产物的纯化和测序由上海英骏生物技术有限公司完成，用Applied Biosystem 373ADNA测序仪进行测序。

本发明采用对16S rDNA全序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1403bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，PCR产物经纯化后，测定其全序列。

序列如下：

<110>中国地质大学(武汉)

<120>一株苯系化合物兼性厌氧降解菌

<160>1403

<210>1

<211>1403bp

<212>DNA

<213>松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A

<400>1

1    CCGGCTAGAATGCAGTCGAGCGAAGTACGAGTAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGA

61   CGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGG

121  CTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGGTTTCGGCTGTC

181  ACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGA

241  CGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGAC

301  TCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACG

361  CCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAATTT

421  GTTAGTAACTGAACAAGTCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC

481  AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCG

541  CGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGG

601  AAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGC

661  GCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGA

721  TGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGA

781  TGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACT

841  CCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAA

901  GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATC

961  CTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCAT

1021 GGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT

1081 AAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAG

1141 GAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTAC

1201 AATGGATAATACAAAGGGCAGCGAATCCGCGAGGCCAAGCAAATCCCATAAAATTATTCT

1261 CAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATAGCTAGTAATCGTAGA

1321 TCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG

1381 AGTTTGTAACACCCGAAGCCGGT

2.2菌落形态特征以及生理生化特性

2.2.1菌落形态特征

见图1。松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A的菌落呈乳白色、圆形、不透明、边缘呈锯齿状、微凸、表面光滑。

2.2.2生理生化特征

生理生化性质的测定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版的方法。见表2。

表2降解菌HBSD-A主要的生理生化特征

表中符号说明：“+”：90％以上的菌株为阳性，“-”：90％以上的菌株为阴性。

表2说明：细胞形状为球形，革兰氏染色阳性，不运动；主要生化特征：氧化酶阴性，接触酶阳性，利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不利用麦芽糖，反硝化阳性，明胶水解阳性，兼性厌氧，生长温度：4℃～41℃(不可以在60℃生长)。

2.3松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A为新的菌株

测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与国际GenBank数据库进行序列同源性比较，结果发现松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A与Staphylococcus sciuri(松鼠葡萄球菌)的同源性高达99％以上。

综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A为新的菌株(即一株苯系化合物兼性厌氧降解菌)。已于2009年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M209283。

3松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A的应用(对苯系化合物的降解特性)

a)用接种环挑取斜面冷藏保存的少量松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A菌苔，接种于含苯、甲苯、二甲苯和均三甲苯各10μL，无机盐分离培养基10mL的已灭菌30mL(Φ18*180mm)试管中，于30℃条件下恒温振荡活化培养36h，得到活化培养的菌悬液；

b)将100mL摇瓶灭菌冷却至常温后，在超净台内，加入50mL无机盐分离培养基，分析纯的苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯各10μL，活化培养的菌悬液50μL，硅胶塞和Parafilm封口膜密封。单一苯系化合物初始浓度约为175.8mg/L，同时设不接种的空白样；

c)将实验样和空白样于30℃恒温水浴振荡培养；

d)72h后，对培养后的实验样和培养后的空白样中四种苯系化合物的含量用顶空——气相色谱法进行测定。测试条件为HP 6890N气相色谱仪，带FID，色谱柱为HP-530m×0.32mm×0.25μm毛细管柱，高纯氮气做载气。柱温：初始温度40℃，保持1min，以6℃/min的速度升温至80℃，保持4min；检测室温度：250℃；汽化室温度：220℃。取100μL顶空气体进样。

苯系化合物降解实验结果如表3和图3所示。

表3松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A对苯系化合物72h的降解率

表3说明：一株苯系化合物兼性厌氧降解菌能够在兼氧条件下高效降解甲苯、二甲苯，能够降解苯、均三甲苯，对环境适应性强。

4松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A对受苯系化合物污染地下水的处理

采集大庆油田油污区受苯系化合物污染地下水500mL(即水样)，将水样于4℃条件下密封保存，2周内分析测试。经测定该受苯系化合物污染地下水中苯、甲苯、邻二甲苯和均三甲苯含量分别为12.546mg/L、4.152mg/L、7.213mg/L、5.976mg/L。

a)用接种环挑取斜面冷藏保存的少量松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A菌苔，接种于含苯、甲苯、二甲苯和均三甲苯各10μL，无机盐分离培养基10mL的已灭菌30mL(Φ18mm*180mm)试管中，于30℃条件下恒温振荡活化培养36h，得到活化的菌悬液；

b)将100mL摇瓶经灭菌冷却至常温后，加入50mL受苯系化合物污染地下水，活化的菌悬液50μL，硅胶塞和Parafilm封口膜密封，得到实验水样；同时设不接种的空白水样；

c)将实验水样于30℃恒温水浴振荡培养；将空白样于30℃恒温水浴振荡培养。

d)72h后，对培养后的实验水样(得到降解后的地下水)和培养后的空白样中四种苯系化合物的含量用顶空——气相色谱法进行测定。测试前，将样品在60℃、200r/min条件下平衡30mins。测试条件同上所述。

苯系化合物降解效果如表4所示。

表4松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A对苯系化合物72h的降解率

5松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)HBSD-A最适生长的基本条件实验

a)为了考察在不同温度、不同pH、不同含盐量条件下，菌株HBSD-A的生长情况，在其他实验条件相同的情况下，分别调节LB培养基的温度为4℃、15℃、25℃、40℃；pH为4、5、7、9；含盐量为1％、2％、3％、4％，每隔24小时测定培养液的光密度值OD₆₀₀。实验结果如图4a至图4c。

b)从图4a可以看出，菌株HBSD-A在4℃环境中生长缓慢，而在15℃、25℃、40℃条件下的OD₆₀₀值均较高，在15～25℃的范围内更为适宜生长，这与它们的陆生环境相符；从图4b可以看出，菌株在酸性环境中生长情况微弱，而在pH7～9的中性及弱碱性环境中均能较好的生长；从图4c可以看出，菌株在1％、2％、3％、4％的盐度中均能生长，在1％盐度环境中生长情况良好，而在3％、4％盐度环境中的OD₆₀₀值略低，适宜在盐度较低的环境生长。