一种利用单核甘酸多态性生物遗传标记进行防伪的印泥
技术领域
本发明属于生物防伪技术领域，具体是涉及一种利用单核甘酸多态性(SNP)生物遗传标记进行防伪的印泥。
背景技术
近年来，由于假冒活动日益严重，出于防范的需要，采用防伪技术越来越受到各国企业的重视。激光防伪、油墨纸张防伪、电码防伪等许多常规的防伪技术已得到广泛的应用。传统的技术虽然技术成熟，应用广泛，但是存在技术公开，配方原理轻易可得，非常容易模仿，难以辨别真伪的缺点。传统防伪技术已逐渐失去防伪效力，急需升级换代。同时传统的防伪技术无法做到针对个人的信息防伪。新兴的光聚合物全息标识，超薄安全塑封薄膜等技术，虽然防伪效果佳，但是生产成本高，应用领域狭窄。而生物特征信息防伪技术应其能针对个体，操作简单，且其技术日益成熟而受到亲睐。现代生物技术的发展为防伪技术的提升提供了强有力的技术支持。
新兴的生物技术近年来发展迅速，具有强大的应用潜能。单核苷酸多态性(SNP)作为新的遗传标志在基因定位及相关疾病的研究中意义重大。DNA水平遗传多态性迄今为止经历了三个阶段：限制性酶切长度多态性(RFLP)，DNA重复序列多态性(小卫星、微卫星DNA重复序列)和单核苷酸多态性(SNP)，其中，单核苷酸多态性(SNP)具有数量多，发布广泛等特点。SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异，在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×106个。由于基因组上单个核苷酸间的变异，SNP在个体间存在着差异，使得它除了在生物研究和疾病治疗领域中的重要作用外，在防伪领域也发挥着重要作用。它有效的解决了传统的防伪技术不能针对个人的缺点，同时又能很好的与传统的技术结合在一起应用，具有应用广泛，技术成熟，简单易行的优点。
发明内容
本发明的目的在于将生物学手段应用于防伪技术领域，从而提供一种很难被破解和仿制、结果稳定、重复性好的利用单核甘酸多态性(SNP)生物遗传标记进行防伪的印泥。
按照本发明提供的技术方案，一种利用单核甘酸多态性生物遗传标记进行防伪的印泥，包括普通印泥，其特征在于：所述印泥还包括目的基因片段PCR扩增产物混合物和DNA酶抑制剂溶液，所述目的基因片段PCR扩增产物混合物在印泥中的重量百分含量为0.1～10％，目的基因片段PCR扩增产物是由包含有SNP位点的基因片段扩增获得；所述DNA酶抑制剂溶液在印泥中的重量百分含量为0.001～0.1％。
所述目的基因片段PCR扩增产物混合物通过如下方法获得：
(1)、样品DNA的提取：选取带有个人遗传信息的人体组织如口腔拭子、血液、头发毛囊，获取基因组DNA；
(2)引物的设计：选择基因组DNA上含有单核甘酸多态性(SNP)位点的基因片段作为目的基因片段，利用primer premier 5.0、BLAST primer和GeneBank软件，查询设计出与该目的基因片段相对应的上游引物和下游引物的序列；
(3)荧光定量PCR扩增：在荧光PCR仪上进行DNA聚合酶链反应，获得不同的目的基因片段PCR扩增产物；
(4)目的基因片段PCR扩增产物的混合：将上述获得的多个目的基因片段PCR扩增产物混合，即得到目的基因片段PCR扩增产物混合物。
作为本发明的进一步改进，所述目的基因片段PCR扩增产物混合物中的DNA浓度为0.1-10000ng/ul。
作为本发明的进一步改进，所述目的基因片段PCR扩增产物混合物中的DNA浓度为10-100ng/ul。
作为本发明的进一步改进，所述DNA酶抑制剂采用金属离子螯合剂。
所述荧光定量PCR扩增方法详细如下：
1)、扩增反应体系(25ul)：模板(基因组DNA)，2ul；10mM上游引物和下游引物，2ul；2×Taq PCR MasterMix(0.1U Taq Polymerase/ul，500uM dNTP，20mM Tris-HCl pH8.3，100mM KCl，3mM MgCl2)，12.5ul；ddH2O：8.5ul；
2)、循环反应：根据步骤(1)中的扩增反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、94℃预变性，1个循环；(b)、94℃变性，52-60℃退火，72℃延伸，30个循环后反应结束，得到反应产物；所述预变性、变性、退火和延伸阶段的反应时间根据引物的不同和目的基因片段的大小不同而有所差异，最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
作为本发明的进一步改进，所述金属离子螯合剂为EDTA，EDTA溶液的浓度为0.001％-5％。
作为本发明的进一步改进，所述EDTA溶液的浓度为0.01-0.02％。
作为本发明的进一步改进，所述目的基因片段PCR扩增产物混合物包括任意两种目的基因片段PCR扩增产物，两种目的基因片段PCR扩增产物的比例为1∶1～10∶1。优选地，所述任意两种目的基因片段PCR扩增产物的比例为1∶1。
本发明与现有技术相比，优点在于：本发明通过在基因库(genebank)中查找现有已知的SNP位点所在序列，通过设计引物的特异性扩增个体的基因片段，从复杂的基因组DNA中扩增部分片段，并有效的防止他人的破译和伪造；同时，DNA也比较稳定，存续时间长，甚至可以达上万年。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
(1)、选取口腔拭子为样品，利用天根生化科技有限公司产品(快速DNA提取扩增套装)获取基因组DNA；
(2)、选择该基因组DNA中的含有SNP位点的VEGF、P53、P21基因片段作为目的基因片段，利用现有的公共数据库资源查询、筛选出现率较高的SNP位点，利用primer premier 5.0、BLAST primer和GeneBank软件，查询设计出与目的基因片段相对应的上游引物和下游引物的序列，引物的设计方向为5’-3’；详细如下所示：
(2.1)VEGF 287bp
5’-TCGGAAGCCGGGCTCATGGACGGGTGAGGCGGCGGTGTGCGCAGACAGTGCTCCAGCCGCGCGCGCTCCCCAGGCCCTGGCCCGGGCCTCGGGCCGGGGAGGAAGAGTAGCTCGCCGAGGCGCCGAGGAGAGCGGGCCGCCCCACAGCCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGTCGGGCCTCYGAAACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGGTAAGCGGTCGTGCCCTGC-3’
VEGF基因片段中的196位碱基为SNP位点，针对该VEGF基因片段设计引物如下：
上游引物(Forward primer) TCGGAAGCCGGGCTCATGGA
下游引物(Reverse primer) GCAGGGCACGACCGCTTACC
(2.2)P53 340bp
5’-AGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCSCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGGTCAGTTGCCCTGAGGGGCTGGCTTCCATGAGACTTCAATGCCTGGCCGTATCCCCCTG-3’
P53基因片段中的121位碱基为SNP位点，针对该P53基因片段设计引物如下：
上游引物(Forward primer) AGTCCCCCTTGCCGTCCCAA
下游引物(Reverse primer) CAGGGGGATACGGCCAGGCA
(2.3)P21 171bp
5’-GACACAGCAAAGCCCGGCCAGGTAACATAGTGTCTAATCTCCGCCGTGACCAGGGCCTTCCTTGTATCTCTGCTGCAGGCGCCATGTCAGAACYGGCTGGGGATGTCCGTCAGAACCCATGCGGCAGCAAGGCCTGCCGCCGCCTCTTCGGCCCAGTGGACAGCGAGCAGC-3’
P21基因片段中的94位碱基为SNP位点，针对该P21基因片段设计引物如下：
上游引物(Forward primer) GACACAGCAAAGCCCGGCCA
下游引物(Reverse primer) GCTGCTCGCTGTCCACTGGG
(3)荧光定量PCR扩增：在荧光PCR仪上进行DNA聚合酶链反应，获得不同目的基因片段PCR扩增产物。详细步骤如下：
1)、扩增反应体系(25ul)：模板(基因组DNA)，2ul；10mM上游引物和下游引物，2ul；2×Taq PCR MasterMix(0.1U Taq Polymerase/ul，500uM dNTP，20mM Tris-HCl pH8.3，100mM KCl，3mM MgCl2)，12.5ul；ddH2O：8.5ul。2)、循环反应：根据步骤(1)中的扩增反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、94℃预变性，1个循环；(b)、94℃变性，56℃退火，72℃延伸，30个循环后反应结束，得到反应产物。所述预变性、变性、退火和延伸阶段的反应时间根据引物的不同和目的基因片段的大小不同而有所差异，最后一个循环后，反应在72℃维持12分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
(4)目的基因片段PCR扩增产物的混合：将上述获得的目的基因片段PCR扩增产物混合，即得到基因片段PCR扩增产物混合物。
最后按照发明内容部分的比例将获得的目的基因片段PCR扩增产物混合物和浓度为0.01％EDTA溶液加入到普通印泥中，即制得本发明产品。