一种大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法 本发明一种大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法，属于蔬菜种苗生产技术领域，专用于大蒜种苗的脱毒快繁。
大蒜(Allium sativum L.)是药、菜兼用的世界性蔬菜，也是我国重要的出口创汇蔬菜。因长期用蒜瓣进行无性繁殖而使病毒积累，种性退化，蒜头(鳞茎)变小，严重损害其商品品质，削弱其国际国内市场竞争力。努力改善蒜头(鳞茎)质量是当务之急。目前普遍使用的脱毒方法是结合热处理进行茎尖生长点组织培养，但繁殖系数低，通常从一个茎尖只能获得2-3苗，且在解剖镜下剥离生长点对技术要求严格，容易污染，成活率亦很低，劳动强度大，从而使脱毒种苗生产成本高，难以实用化。
目前通过试管苗驯化、移栽途径对驯化条件要求严格，成活率低，且受大田生长季节的限制，难以与大田生产接口。试管鳞茎属于休眠及储藏器官，对气候适应性广，不需经过驯化，可周年直接移栽，因而培育试管鳞茎则成为一种最有前途的方式。然而，试管鳞茎的形成目前还有赖于培养过程中的偶发性，尚不能定向控制其形成，且形成的鳞茎较小，影响随后的正常萌发生长。
据报道，以蒜薹为外植体，所获试管苗脱毒率高，甚至优于只带1-2个叶原基(0.3-0.5mm)的茎尖。但目前尚无以蒜薹为外植体直接获得脱毒苗的研究报道，前人是用蒜薹先诱导形成愈伤组织再分化成苗，这难免会发生变异，从而不符合要求保持种性的脱毒快繁的要求。
本发明的目的是提供一种大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法，提出快速获得大量脱毒苗、试管苗健壮生长、诱导鳞茎形成、促进鳞茎膨大地最优培养方案，可定向诱导鳞茎形成，且形成的鳞茎大，适合工厂化育苗，适于移栽田间生长。
本发明所提供的一种大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法实施方案如下：
1．取未熟蒜薹为外植体，将蒜薹切分后接种在附加0.5-2.0mg/LBA和0.05-0.2mg/L NAA的MS或B5培养基中。培养40-60d后，切取试管苗基部继代培养。
2．诱导试管鳞茎形成与促进鳞茎膨大：将上述试管苗转接于附加0-5.0mg/L BA,0-0.2mg/L NAA,90-120g/L糖，0.2-20mg/L乙烯利的MS或B5培养基中。60-90天后即可形成大量鳞茎供移栽用。大蒜试管鳞茎诱导形成与膨大方法中所用培养基如果添加水杨酸(SA)1-150mg/L或茉莉酸甲酯0.01-5mg/L，鳞茎诱导率更高，形成的鳞茎更大。(Me-JA)
上述大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法中，各培养基中琼脂含量为0.6-0.8％,pH5.8-7.5，各阶段培养条件为温度20-25℃，光照强度1800-2500 Lux，光照12-14小时/天。所用糖类是指蔗糖、白糖等，以蔗糖为最好。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1)与目前普遍使用的茎尖生长点组织培养获得脱毒苗相比，本发明首次以蒜薹为外植体建立大蒜脱毒快繁体系，操作极为简便，勿需在解剖镜下剥离生长点，成活率亦很高，劳动强度小，从而突破性地解决了大蒜脱毒苗繁殖系数低，种苗生产成本高，难以实用化的瓶颈问题。本发明以刚抽出的蒜薹为外植体，培养40-60d后可以获得50-76苗，且生长正常，繁殖系数为50-76，可同时获得大量脱毒苗，且不会发生变异。
2)与目前通过试管苗驯化、移栽途径相比，本发明通过培育试管鳞茎途径，不需经过驯化，可直接移栽大田，且不受大田生长季节限制，从而建立了一种高效的驯化途径。与目前试管鳞茎形成偶发性相比，本发明试管鳞茎的诱导率达80％以上，鲜重达300mg以上，移栽成活率在95％以上。
3)本发明还证明Me-JA和SA在大蒜鳞茎形成与膨大中均具有重要的调控作用。茉莉酸甲酯诱导试管鳞茎形成和促进试管鳞茎膨大，鳞茎诱导率高达97％，鳞茎鲜重达460mg。SA对试管鳞茎形成的诱导率可达95％；且促进试管鳞茎膨大，鳞茎鲜重可达500mg。这是首次发现水杨酸与鳞茎形成的关系。
4)本发明所提供的大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法适用于各种能抽薹的大蒜品种。
实施例1：
1)．脱毒试管苗的获得：供试品种为太仓白蒜(Allium sativumL.)。取未熟蒜薹为外植体，用70％乙醇表面消毒1分钟，再用0.1％氯化汞消毒15分钟，无菌水冲洗4遍后，剥去外层苞叶，将薹尖四切分后接于同一瓶中，以B5为基本培养基，附加1.0mg/L BA和0.1mg/L NAA。培养60d后，每薹可获得50苗。
2)．试管鳞茎诱导及膨大：选用生长整齐一致的试管苗，切取幼苗基部接种于B5基本培养基中，附加蔗糖120g/L，乙烯利0.5mg/L。灭菌前将pH值调至6.4。培养室温度为25℃±2℃，每日光照14h，光强20001x,85天后统计鳞茎形成率为85％，并称量鳞茎鲜重达310mg，鳞茎移栽大田成活率为91％。
实施例2：
1)．脱毒试管苗的获得：供试大蒜品种为徐州白蒜(Alliumsativum L.)。取未熟蒜薹为外植体，用70％乙醇表面消毒1分钟，再用0.1％氯化汞消毒15分钟，无菌水冲洗4遍后，剥去外层苞叶，将薹尖切分后接于同一瓶中，以MS为基本培养基，附加0.5mg/L BA和0.06mg/L NAA。培养50天后，每薹可获得65苗。选用生长整齐一致的试管苗，切取幼苗基部作为处理材料。
2)．试管鳞茎诱导及膨大：选用生长整齐一致的试管苗，切取幼苗基部接种于MS基本培养基中，附加4.0mg/LBA，白糖90g/L，乙烯利10mg/L。灭菌前将pH值调至6.0。培养室温度为25℃±2℃，每日光照14h，光强20001x,60天后统计鳞茎形成率为86％，并称量鳞茎鲜重320mg，鳞茎移栽大田成活率为96.5％。实施例3：
供试大蒜品种为徐州白蒜，取未熟蒜薹为外植体，按照以上方法，调整培养基成份后实施结果如下：
1)试管苗培养基：B5+2.0mg/L BA+0.2mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+白糖100g/L+乙烯利20mg/L,80天后统计鳞茎形成率为82％，鳞茎鲜重300mg，鳞茎移栽大田成活率为95.6％。
2)试管苗培养基：B5+3.0mg/L BA+0.2mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+2.5mg/L BA+0.1mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利0.5mg/L,70天后统计鳞茎形成率为83％，鳞茎鲜重320mg，鳞茎移栽大田成活率为95.8％。
3)试管苗培养基：B5+2.5mg/L BA+0.05mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利8mg/L,85天后统计鳞茎形成率为82％，鳞茎鲜重360mg，鳞茎移栽大田成活率为95.6％。
4)试管苗培养基：B5+1.5mg/L BA+0.12mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.5mg/L BA+0.05mg/L NAA+白糖100g/L+乙烯利18mg/L,80天后统计鳞茎形成率为85％，鳞茎鲜重340mg，鳞茎移栽大田成活率为98.5％。
5)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+水杨酸1.5mg/L,90天后统计鳞茎形成率为95％，鳞茎鲜重420mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％；
6)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+水杨酸1.0mg/L,90天后统计鳞茎形成率为88％，鳞茎鲜重410mg，鳞茎移栽大田成活率为98.2％；
7)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：MS+4.5mg/L BA+0.15mg/L NAA+蔗糖110g/L+乙烯利1mg/L+水杨酸10mg/L,90天后统计鳞茎形成率为88％，鳞茎鲜重340mg，鳞茎移栽大田成活率为96％；
8)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+2.0mg/L BA+0.05mg/L NAA+蔗糖95g/L+乙烯利5mg/L+水杨酸50mg/L,75天后统计鳞茎形成率为93％，鳞茎鲜重460mg，鳞茎移栽大田成活率为97.6％；
9)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+水杨酸150mg/L,90天后统计鳞茎形成率为90％，鳞茎鲜重500mg，鳞茎移栽大田成活率为99.6％；
10)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利10mg/L+水杨酸100mg/L,90天后统计鳞茎形成率为92％，鳞茎鲜重420mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％；
11)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯0.02mg/L,90天后统计鳞茎形成率为97％，鳞茎鲜重430mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％；
12)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯1.5mg/L,90天后统计鳞茎形成率为95％，鳞茎鲜重450mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％；
13)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯2.5mg/L,90天后统计鳞茎形成率为97％，鳞茎鲜重440mg，鳞茎移栽大田成活率为96％；
14)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯5mg/L,90天后统计鳞茎形成率为92％，鳞茎鲜重460mg，鳞茎移栽大田成活率为97％；
15)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利16mg/L+茉莉酸甲酯1.0mg/L,90天后统计鳞茎形成率为96％，鳞茎鲜重455mg，鳞茎移栽大田成活率为96％；
16)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯4.5mg/L,90天后统计鳞茎形成率为95.7％，鳞茎鲜重435mg，鳞茎移栽大田成活率为98.7％；
17)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：MS+3.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+白糖120g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯5mg/L,90天后统计鳞茎形成率为90％，鳞茎鲜重430mg，鳞茎移栽大田成活率为96.7％。
18)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利12mg/L+茉莉酸甲酯0.5mg/L,90天后统计鳞茎形成率为94％，鳞茎鲜重430mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％。