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参与脱落酸信号过程的蛋白质
    本发明涉及一种脱落酸(ABA)信号成分，编码该信号成分的核酸，和使用该成分的方法。

    植物激素ABA在植物生长和发育中起着重要作用。它在种子中帮助完成胚胎发生和种子储存蛋白的形成。它能防止很多种子和芽的超前发芽和生长。在营养组织中ABA保护植物不受诸如干旱、高盐度、低温或霜冻的不利环境条件的影响。ABA的许多作用会导致相当长时间的生理学变化，并且，主要表现在在转录水平上参与修饰基因表达。业已从各种植物中分离了超过150个ABA效应基因。

    ABA作为应急激素与缺水联系在一起的重要性是由伦敦大学怀依学院的STC Wright和RWP Hiron在1969年第一次提出的。他们发现在发生枯萎的头半个小时内小麦叶片中的ABA含量增加了40倍。现在已经在单子叶植物和双子叶植物的叶片中检测到ABA的类似的增加。在很多物种上已经发现，将ABA喷洒在叶片上会导致气孔关闭或抑制气孔打开。因此，在缺水阶段，提高ABA含量能减少水的损失。

    我们业已发现了一种介导由ABA引起的信号传导的新型蛋白，并且该蛋白能对ABA作出反应。

    现在，根据本发明，提供了一种能够影响ABA反应的蛋白，该蛋白包括下列部分中的一个或几个：

    (ⅰ)疏水性C-末端；

    (ⅱ)至少一个卷曲螺旋区；

    (ⅲ)一个EF-手共有序列；

    (ⅳ)一个核苷酸结合位点；和

    (ⅴ)一个亲水性N-末端；

    或其变体。

    在一种优选实施方案中，所述蛋白具有上文所述的(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)、和(ⅳ)，和选择性地具有(ⅴ)。

    另外，所述蛋白还能够用肉毒杆菌C毒素裂解。因此，所述蛋白优选包括肉毒杆菌C毒素的两个识别结构域和／或裂解位点。

    优选至少有一个卷曲螺旋区相当于上皮形成素模式。

    优选具有三个卷曲螺旋区。

    优选具有三个卷曲螺旋区，至少有一个相当于上皮形成素模式。所述蛋白优选还包括磷酸化位点。

    所述蛋白可以被描述为一种新的突触融合蛋白(t-SNARE)同系物。在细胞水平上，最好是通过ABA在气孔保卫细胞的质膜上调节K+和Cl-通道中的作用鉴定ABA，这种调节作用会导致气孔关闭，并减少叶片中水分的蒸腾损失。本发明地蛋白可以是与质膜相关的膜锚锭蛋白。在活体内，业已证实通过肉毒杆菌C毒素裂解所述蛋白和用该蛋白的可溶性C-截短的片段竞争，能够抑制ABA在所述保卫细胞中控制K+和Cl-通道的作用。以上结果和其它结果表明，本发明的蛋白与ABA信号复合体相关，并对ABA有反应。

    序列2所示蛋白的特征可定义如下。

    特征                                内部-氨基酸

    (ⅰ)疏水性C-末端                    282-296／280-294

    (ⅱ)卷曲螺旋区／上皮形成素模式      210-247／216-240

    (ⅲ)一个EF-手共有序列               16-28

    (ⅳ)一个核苷酸结合位点              116，118和120／114-119

    (ⅴ)一个亲水性N-末端                1-281／1-279

    (ⅵ)肉毒杆菌毒素裂解位点           269-274

    在一种特别优选的实施方案中，所述蛋白包括序列2或序列4所示氨基酸序列。

    本发明包括上述蛋白的变体。所述变体包括与序列2的序列具有50％或更高总体同源性的蛋白。所述同源性通常为60％或更高，更通常为65％，优选为70％，更优选为75％，进一步优选为80％或85％，特别优选为90％、95％、98％或99％。

    百分比同源性优选是根据两个有关的序列在相应位置上相同的氨基酸而计算的。保守性取代不计算在内。在计算被研究的推测蛋白与序列2或4的同源性时，如果被研究的蛋白具有不同的长度，则所述计算是基于被研究分子与序列2或4所示序列重叠部分的氨基酸而进行的。

    具体地讲，本文所说的“同源性”与术语“相同性”等同。

    在这里，序列同源性可以通过对所述序列的任一个或几个和其它序列进行简单地“目测”比较，看所述其它序列是否与所述序列具有至少75％的相同性而确定的。

    相对序列同源性(即序列相同性)还可以通过市售计算机程序测定，这种程序能计算两个或两个以上序列之间的百分同源性。所述计算机程序的一个典型例子是CLUSTAL。

    序列同源性(或相同性)还可以通过任何合适的同源性算法，用预设的参数测定。优选使用BLAST算法，所使用的参数是预设值。BLAST算法详细披露于http：／／www．ncbi．nih．gov／BLAST／blast_help．html中，有关内容内收作本文参考文献。检索参数被确定如下，并优选设定确定的预设参数。

    优选地，BLAST所认定的“显著同源性”相当于与EXPECT值吻合的序列至少为大约7，优选为至少大约9，最优选为大约10或更高。在BLAST检索中，EXPECT的预设阈值通常为10。

    BLAST(基础定位比较检索工具)是被程序blastp，blastn，blastx，tblastn，和tblastx所使用的启发式检索算法；所述程序用作过一些改进的Karlin和Altschul统计方法确定其发现的显著性。

    还可以用Lasergene DNA(Madison，美国)进行分析。

    可以理解的是，源于其它物种的能够影响ABA反应和／或对ABA有反应的蛋白会具有种间差别，例如，在蛋白长度、氨基酸序列和糖修饰方面的差别。例如，在C-和／或N-末端残基和分子量方面可能有所不同。

    一般来说，术语“变体”包括保留了其主要特性的蛋白，在本发明中，该特性为影响ABA反应和／或对ABA作出反应的能力。变体包括等位变体，和具有保守氨基酸改变差别的蛋白。所述变体可以是天然的或非天然存在的变体，例如，通过诱变产生的变体。我们所说的保守氨基酸改变是指用一种类型的氨基酸(即疏水性、极性、酸性或碱性氨基酸，取代同一种类型的另一种氨基酸。所述改变的一种例子是用甲硫氨酸取代缬氨酸和相反。

    证实一种蛋白是能够影响ABA反应的可以通过考虑序列同源性和／或考虑其结构关系而完成。

    除了完整长度的蛋白之外，本发明还包括含有不够完整长度序列的分子。所述分子或片段可以是多肽或肽。为了用作取代物，一个片段应当保留其亲代分子的一种或几种生物学活性。

    可用来测试一种推测的分子影响ABA反应能力的一种方法是将爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞作为异源表达，如下文所述。

    本发明不包括以下本发明的天然蛋白，即该蛋白存在于其天然环境中，由同样存在于其天然环境中的天然核苷酸编码序列表达的，并且该核苷酸序列处于也存在于其天然环境中的其天然启动子控制之下。本发明的蛋白还可以是分离的，就是说它基本上不含有通常与其相关的其它蛋白。另外，本发明不包括处于其天然环境中的本发明的天然核苷酸编码序列，该序列在也处于天然环境中的其天然启动子的控制之下。

    尽管在下文所述的特定的非限定实施例中ABA信号成分获自烟草(Nicotiana tabacumm)，本发明总体上涉及ABA信号成分。例如，源于双子叶和单子叶植物的ABA信号成分，所述植物包括诸如小麦、大麦、稻、玉米和高粱的禾谷类；除烟草之外的大田作物，如canola、向日葵、甜菜和棉花、水果和蔬菜。例如，玉米中的相应ABA信号成分可以用反向转录方法发现，这一目的是用已知技术和根据序列1的序列设计的引物通过聚合酶链式反应(RT-PCR)进行的。证实ABA信号成分的获得可以用本文所披露的本发明的分析方法完成。

    我们用该方法还测定了源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的相应ABA信号成分。其核酸序列如序列3所示，相应的氨基酸序列如序列4所示。本发明还包括本文所限定的序列的变体。

    为了消除怀疑，术语“能够影响ABA反应的蛋白”和“ABA信号成分”可以互换使用。所述术语是指参与激素脱落酸的信号传导途径的分子。类似地，与本发明的分析方法相关，“信号成分”是指参与激素信号传导途径的分子。

    本发明的蛋白可用于筛选检测蛋白-蛋白相互作用。具体地讲，所述蛋白可用于筛选一种信号传导途径的其它成员。一种合适的方法是所谓的双杂交系统，其中，GAL4蛋白的DNA结合域融合在本发明的蛋白上。构建第二种质粒，该质粒包括与被研究的蛋白(或肽或多肽)融合的GAL4蛋白的激活域。本发明蛋白和被研究蛋白的相互作用会导致报导基因的转录激活，如通过GAL1-lacZ融合基因的表达检测。

    因此，本发明还提供了包括本发明蛋白的融合蛋白，同样包括含有本发明蛋白的蛋白／核酸复合体。本发明的蛋白和／或核酸还可以与诸如将编码所述蛋白的核酸导向到细胞膜上的序列的导向序列结合。

    因此，本发明还提供了一种检测能与本发明蛋白相互作用的蛋白的方法。用所述筛选方法发现的相互作用的蛋白也是本发明的主题。例如，我们业已发现，在本发明的SYR蛋白(见下文)和克隆4(见表1)存在相互作用，克隆4被鉴定为具有磷酸酶抑制剂域。

    本发明还包括源于上述蛋白的截短的蛋白。通常，所述截短的蛋白能够在ABA信号途径中与未截短的蛋白竞争，和／或能够产生抗未截短的蛋白的抗体。所述截短的蛋白的例子包括含有序列2的115-127号氨基酸的Sp1，和含有序列2的1-179号氨基酸的Sp2。因此，本发明还包括生产免疫球蛋白的方法，该方法包括给诸如兔子或人的哺乳动物服用本发明的蛋白，并视需要分离所产生的免疫球蛋白。

    本发明还提供了编码本发明蛋白的核酸。

    具体地讲，根据本发明的另一方面，提供了包括序列1所示18-917号位置或序列3所示77-991号位置的序列的核酸。

    本发明还包括与本发明序列有同源性的DNA。通常，同源性是指有50％或更多的核苷酸相同，更通常具有60％或65％的同源性，优选70％，更优选75％，进一步优选80％或85％，特别优选90％、95％、98％或99％或更高的同源性。

    本发明还包括能与本发明DNA杂交的DNA。所述DNA优选编码ABA信号成分的至少一部分。

    本发明还包括互补于本文所述本发明序列的核苷酸序列，或任何衍生物、片段或其衍生物。如果所述序列互补于它的一个片段，则该序列可用作探针鉴定其它生物中的类似编码序列。

    本发明还包括与互补于本文所述序列的序列杂交的核苷酸序列，或任何衍生物、片段或其衍生物。

    术语“互补”还包括能够与所述编码序列的核苷酸序列杂交的核酸序列。

    术语“变体”还包括互补于能够与本文所述核苷酸序列杂交的序列的序列。

    所述杂交优选是在低严格条件或高严格条件或介于两者之间进行的。一般来说，低严格条件可以定义为3×SSC，大约为环境温度至大约65℃，而高严格条件为0．1×SSC，大约为65℃。SSC是指由0．15M氯化钠、0．015M柠檬酸三钠组成的缓冲液，3×SSC是指浓度比SSC高三倍，依此类推。

    本发明还包括用源于本发明序列的引物通过PCR技术获得的序列。

    本发明的DNA可以是分离形式的cDNA或DNA。

    本发明还包括由于本发明的DNA发生遗传密码简并而产生的DNA，该DNA编码一种能够影响ABA反应，和／或对ABA作出反应的蛋白。

    本发明还涉及包括本发明核酸的载体，用本发明载体进行遗传工程改造的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明的蛋白。所述系统为本领域技术人员所熟知。术语“载体”包括表达载体和转化载体。术语“表达载体”是指能够进行体内或体外表达的结构。

    所述宿主细胞优选为植物、种子、真菌或哺乳动物细胞。为了消除怀疑，真菌包括酵母。因此，本发明还提供了适当转化过的植物、种子、真菌和哺乳动物。

    因此，本发明提供了根据本发明的可操作地连接于启动子上的核酸。有人建议可将该系统用于筛选能够影响植物对胁迫的反应的化合物的方法。所述方法可以包括筛选结合表达的ABA信号成分的化合物，并选择具有所述结合能力的化合物。

    本发明还提供了用所述筛选方法选择的化合物，特别是将其用作农药。

    农药配方是已知的，本领域技术人员可以方便地配制出含有有效量的该农药的可以接受的组合物。

    本发明的一个特别优选的特征是用本发明核酸转化过的植物或种子，以便本发明的ABA信号成分在所述植物或种子中表达或超量表达。

    在这种情况下，所述启动子可以是诱导型启动子。使用该系统的优点是可以控制表达。

    所述转化过的植物(可以是单子叶和双子叶植物)与未转化过的植物相比具有改进的生长和发育。所述改进可以包括减弱的芽的超前生长和对诸如干旱、高盐度、低温和霜冻的不利环境条件的改进的保护／承受能力。一种特定的特征可以是改进的对水胁迫的抗性。可以证明这一点的是水损失的减少。可以预计植物具有减弱的枯萎变化。

    所述转化的种子与野生型种子相比，可以具有改进的胚胎发生和更好的种子储存蛋白形成能力。它们还可以具有减弱的超前发芽和生长作用。

    对本发明来说，用于转化宿主细胞的方法并不是特别重要，可以使用适合于靶宿主的任何方法。例如，转基因植物是通过由转化的细胞再生而获得的。文献中披露了多种转化技术，如用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或其Ti质粒进行的农杆菌感染，电穿孔，植物细胞和原生质体的显微注射，和微粒轰击转化。

    对本发明来说，待插入所述序列的植物种不是特别重要。可以转化双子叶和单子叶植物。本发明可应用于能用转化技术转化的任何植物。因此，本发明可用于各种植物，包括诸如canola、向日葵、烟草、甜菜和棉花的大田作物；诸如小麦、大麦、稻、玉米和高粱的禾谷类；水果和蔬菜。本发明还适合于各种组织，包括根、叶、茎和繁殖性组织。

    源于植物的所述序列的哺乳动物同系物可用于治疗，特别是用于基因治疗。因此，根据本发明的另一方面，提供了含有本发明蛋白和核酸以及可以药用的稀释剂、赋形剂、载体或佐剂的药用组合物。

    所述药用组合物可以是人或动物使用的。通常，医生可以确定最适合于受治对象的实际剂量，该剂量因特定个体的年龄、体重和反应而不同。

    所述组合物可以选择性地含有可以药用的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂。可以根据预期的服用途径和标准药理学实践选择药用载体、赋形剂、佐剂或稀释剂。所述药用组合物可以含有-或添加-除所述载体、赋形剂、佐剂或稀释剂以外的任何合适的粘接剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂、及其它有助于输送的载体。

    如果合适的话，所述药用组合物可以通过下述方法中的任一种或几种服用：吸入、栓剂或阴道药形式，以洗液、溶液、霜剂、软膏或干粉形式外用，使用皮肤膏，以含有诸如淀粉或乳糖的赋形剂的片剂形式口服或为单独的或与赋形剂混合的胶囊或小丸形式，或为含有芳香剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式，或可以通过肠胃外途径注射，例如，肺内注射、静脉内注射、肌内注射或皮下注射。对于肠胃外服用来说，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，该溶液可以含有其它物质，例如，足够的盐或单糖，以便使得该溶液与血液等渗。对于口腔或舌下服用来说，所述组合物可以片剂或锭剂形式服用，这种制剂可用常规方法制备。

    本发明还提供了反义序列，而宿主细胞还包括本发明核酸的反义序列。所述序列同样可用于筛选方法。

    下面将结合附图通过非限定性实施例的形式对本发明的各种其它优选特征和实施方案作进一步说明，其中：

    图1是证实ABA和信号中间产物对向内K+通道的影响示意图。实心箭头表示由IP3释放的Ca2+的增加。空心箭头表示抑制作用。加斜线的箭头表示由ABA导致的胞质Ca2+含量的增加是可变的。

    图2A是预期的植物ABA信号成分与卵母细胞内源信号成分的联系的示意图。将ABA线性反应用作在RNA注射的卵母细胞中ABA信号成分表达的分析。

    图2B是用于分离功能性ABA cDNA克隆的克隆方法的示意图。

    图3表示第9号克隆(rek-Nt)的推测氨基酸序列与不同植物序列的相关受体激酶蛋白序列的比较。同源受体激酶是源于甘蓝(Brassica oleracea)的SRK4(S39911，Kumar和Trick，1993)；源于芸苔(Brassica campestris)的SRK9(D30049)或源于Ipomoeatrifida(U20948)的IRK1。

    A．N-末端：根据用T7引物获得的核苷酸序列推测

    B．C-末端：根据用M13(f)引物获得的核苷酸序列推测。

    图4A表示构建表达文库的步骤；

    图4B是用于克隆所述cDNA文库pSPORT1表达载体的图谱。

    图5表示三种没有明显同源性的蛋白的亲水性曲线和推测的疏水性结构域。氨基酸序列是根据2号克隆(A)、8号克隆(B)和12号克隆(C)推测的。亲水性曲线和疏水性区是用Kyte-Doolittle算法推测的。大小：水平方向：20个氨基酸；垂直方向：1个单位(Kyte-Dooli ttle)。

    图6表示15号克隆(smG-Nt)的推测氨基酸序列与源于其它植物种的相关的小的Rab G-蛋白的比较：GRM1源于大豆(S47101，Borg和Poulsen，1994)；RAB11G源于日本百脉根(L．japonicus)(Z73955，Borg等1997)，ARA-4和RAB11均源于拟南芥(P28187，Anai等，1994和Y08904，Lin和Lin，1997)；烟草的另一种小的GTP结合蛋白NT-RAB11E(L29272，Haizel等1995)。

    图7表示19号克隆(Cal-Nt)的推测氨基酸序列与拟南芥的相关的钙视网膜蛋白序列CRT1的比较(U66243，Nelson，1997)。

    A．根据用T7引物获得的核苷酸序列推测的cal-Nt的N-末端的比较。方框：疏水性前导序列

    B．根据用M13(f)引物获得的核苷酸序列推测的cal-Nt的C-末端的比较。方框：HDEL保守域。

    图8是在小泡停靠和融合步骤期间在主要成分之间蛋白-蛋白相互作用的示意图。

    图9A表示syr基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列；

    图9B表示所述序列反应的重叠群。

    图11表示SYR-Nt(烟草)的氨基酸序列与KNOLLE-At(拟南芥Lukowitz等，1996)和人突触融合蛋白家族的两个不同成员SYNIA-HUM(Bennett等，1992)和SYN1B-HUM(保藏号R08740)的比较。

    黑色实心方框表示4种序列之间的相似性；空心方框表示SYR和KNOLLE之间(偶尔也与SNY1A或SNY1B进行比较)的相同性；双线条方框是上皮形成素模式，在所述突触融合蛋白之间是高度保守的；加引线的方框是疏水性-有可能跨膜-区，而星号表示仅存在于SYR上的核苷酸结合位点的特征。

    图11：表示突触融合蛋白家族的代表性成员的系统树。

    图12：表示在烟草中SYR表达的Northern分析。

    A．mRNA是从茎(泳道1和3)和叶(泳道2和4)中分离的。泳道1和2的植物生长条件为潮湿(接近100％的湿度)，而对泳道3和4来说为干燥条件(温室条件)。

    B．从叶片中分离mRNA。从左到右的植物条件为：100％湿度(对照，c)，干旱胁迫(dr)并用ABA处理1小时、24小时、48小时。

    C．从叶片中分离总RNA。植物是在高度潮湿的条件下生长，从左至右为：对照c，用ABA处理30分钟(1／2)、1小时、3小时、6小时、9小时、24小时和48小时、并用IAA处理30分钟(IAA)。

    D．用于C中的凝胶用EtBr染色的核糖体带在紫外线照射下的照片。

    图13A表示卵母细胞电压控制时的装置的照片；

    图13B表示所述腔室的关闭照片。

    图14是用在卵母细胞膜上的电压控制电路的示意图。Vm：自由膜电势；Vcommand：指令电压；Im：通过膜电压调节的与指令电压相应的电流。

    图15表示由Cl-携带的向外调整的卵母细胞电流，该电流依赖于钙离子Ca2+。每一幅图表示来自一个卵母细胞的数据：电压循环方案和相应的控制电流与时间。

    卵母细胞电流被记录为90mM[Cl]o或30mM[Cl]o。电压控制循环(上)：前脉冲，-60mV；8个测试脉冲，从-180mV至+40mV；后脉冲：-60。

    B．在正常Ringer’s缓冲液中向外调整电流的反向电势。电压控制循环(左)：调整脉冲，+50mV；实验脉冲从-160mV到+30mV。箭头表示电流是反向的(在-3mV和-34mV实验脉冲之间)。

    C．用不同[Ca2+]o记录的[Cl-]电流。电压控制回路(上)：前脉冲-60mV；实验脉冲从-180mV到+40mV；后脉冲：-60mV。大小：水平方向，500nA；水平方向，500ns。

    图16表示mRNA注射的卵母细胞的ABA反应。

    A．在接触ABA之前(圆形)、接触ABA之后20秒(方形)和5分钟(三角形)之后记录的典型mRNA注射细胞的电流轨迹。电压控制循环(上)：前脉冲和后脉冲，-120mV；8个实验脉冲在-180mV至+60mV之间。大小：垂直方向1μA；水平方向1秒。

    B．从在实验脉冲结束时的电流获得的稳态电流-电压关系。

    符号与A交叉引用。

    C．在正常Ringer’s缓冲液中在ABA反应期间测定的一种mRNA注射的卵母细胞的向外调整电流的反向电势。电压控制循环(上)：调节脉冲，+20mV；实验脉冲从-180mV到+20mV。箭头表示放电反向(在-15mV和-35mV实验脉冲之间)。大小：垂直方向500nA；水平方向500ms。

    图17表示ABA-诱导的电流的稳态电流-电压关系。稳态电流是在实验电压脉冲结束时，在接触ABA之前和期间记录的。ABA-诱导的电流是通过从ABA处理头1分钟记录到的反应稳态电流中减去背景稳态电流(在ABA之前)而计算的。每一个点分别是mRNA注射的细胞的平均值±SE，所述细胞具有类似于图16所示的ABA反应(n=3)。

    图18表示蔗糖梯度的某些组分和源于所述文库的cRNA琼脂糖凝胶照片。

    泳道1-6分别是1-6种蔗糖梯度组分，泳道7是RNA分子标记。泳道8：来自所述文库的2000个克隆的cRNA。

    图19表示用不同的蔗糖梯度mRNA收集物注射的卵母细胞将膜电压控制在+60mV条件下ABA诱导的稳态电流的平均值±SE。

    图20表示在添加ABA之前和之后用来自下面的含有20000，2000，200或20个转录物的阳性文库的cRNA注射过的卵母细胞的控制电流轨迹。电压控制方案显示在该图的上部。前、后脉冲，-120mV；8个测试脉冲为-180mV至+60mV。大小：垂直方向500nA；水平方向，1秒。

    图21平均值±SE弦导作为每个文库的转录物的绝对量的函数的半对数曲线。

    图22表示当表达SYR的卵母细胞膜被控制在+60mV时测定的电流。测定是在刺穿细胞之后以所标明的间隔进行的。前后脉冲为-120mV。大小：垂直方向：500nA；水平方向：500ms。

    图23表示表达SYR的卵母细胞的向外调整电流。

    A．电流轨迹是在含有2．5mMK+的正常Ringer缓冲液或在含有25mMK+的改进的Ringer缓冲液中记录的。条件为：电压控制方案：前脉冲和后脉冲为-120mV，8个测试脉冲为-160mV至+60mV。大小：垂直方向1μA；水平方向1秒。

    B．瞬时的(圆形)和时间依赖型(三角形)分量的电流-电压关系。2．5mM K+；和25mM K+。

    图24表示在2．5mM K+；和25mM K+中进行的源于表达SYR的卵母细胞的向外调整电流的尾电流分析。电压控制循环(下左)：调节脉冲为+50mV；测试脉冲为-160mV至+30mV。箭头表示放电反向。大小：垂直方向1μA；水平方向1秒。

    图25表示证实各种毒素、TEA、Ba2+、和niflumic acid的作用的电流轨迹，与对照(无毒素)进行比较。电压方案：前后脉冲为-120mV，8个测试脉冲为-160mV至+60mV。大小：垂直方向μA；水平方向1秒。0

    图26表示pQES，克隆在pQE-30表达载体上的SYR亲水性片段。所述载体含有氨苄青霉素抗性基因，一个强启动子-操纵子元件(噬菌体T5启动子和两个lac操纵子序列)，一个合成核糖体结合位点(RBS)，SYR基因前面有6个框内组胺酸残基，随后是一个终止密码子，以及两个强终止子(源于λ噬菌体的t0和源于大肠杆菌的T1)。复制起点(ori)是ColE1。

    图27表示作为BotN／C的模板所需要的序列基序。

    A．裂解位点；B．SYR的识别基序X1和X2：左面主要是疏水性的(对于X1来说为34，41和37；对于X2来说为175，182和178)；右面主要是带负电荷的(对于X1为35，39和36；对X2来说为176，180和177)。

    图28表示在不同处理条件下，ABA对N.benthamiana的典型的保卫细胞的阴离子电流的影响的电流轨迹。电压控制循环(上)：8个测试脉冲为-230mV至30mV。左：没有ABA，右：有ABA。

    大小：垂直方向100μA／cm2，水平方向2秒。

    A．对照细胞，不进行处理

    B．用BotC处理的细胞

    C．用BotD处理的细胞。

    图29表示根据图28中的电流轨迹推测的瞬时(左)和稳态(右)电流的电流电压关系。圆形：没有ABA，三角形：有ABA。

    A．对照细胞，不进行处理

    B．用BotN／C处理的细胞

    C．用BotN／D处理的细胞。

    图30表示瞬时阴离子电流的正交最大增加。示出了对照细胞的三个细胞，BotN／C的6个细胞和BotN／D的处理细胞的2个细胞的平均值。将在-200mV下的值与添加ABA之前的阴离子电流的大小校正。

    图31表示在不同处理条件下，ABA对N.benthamiana的典型的保卫细胞的[IK]in的影响的电流轨迹。电压控制循环(上)：调节脉冲在-100mV下1秒；4个测试脉冲为在-230mV和-130mV之间4秒。左：没有ABA，右：有ABA。

    大小：垂直方向100μA／cm2，水平方向1秒。

    A．对照细胞，不进行处理

    B．用BotC处理的细胞

    C．用BotD处理的细胞。

    图32表示从图31所示电流轨迹推测的稳态电流的电流电压关系，并进行漏电调节，圆形：没有ABA，三角形：有ABA。

    A．对照细胞，不进行处理

    B．用BotN／C处理的细胞

    C．用BotN／D处理的细胞。

    图33表示在-200mV的电压下由ABA介导的IK，in值以在添加ABA之前电流值校正。示出了5个对照细胞，4个用BotN／C处理的细胞，和3个用BotN／D处理的细胞的平均值±SE。

    图34表示在-200mV的电压下由ABA介导的Ik，in值以在添加ABA之前的电流值校正。示出了3个BotN／C处理细胞的平均值(圆形)，仅记录对照细胞的1个值(三角形)。

    图35表示A．SDS PAGE的考马斯染色：泳道1和泳道2：在用IPTG诱导之前(用泳道1)和之后(泳道2)的大肠杆菌M15[pREP14][pQES]的总蛋白提取物。泳道3：在Ni2+树脂结合之后洗涤。泳道4：纯化的SP2。

    B．用免疫前血清(泳道1和2)和SYR抗体(泳道3和4)杂交的5ng(泳道1和3)纯肽和50ng(泳道2和4)纯肽的Western印迹。

    图36表示A．用免疫前(泳道1和2)和抗SYR抗体血清(泳道3和4)进行的Western杂交。泳道1和3：W303-1A：泳道2和4：W303-1A(SYR)2。

    B．用肉毒杆菌毒素处理之后用抗SYR抗体作为探针所做的W303-1A(SYR)膜蛋白提取物的Western印迹。泳道1：W303-1A(SYR)对照；泳道2：W303-1A(SYR)+BotN／C；泳道3：W303-1A(SYR)+BotN／D；泳道4：分子量标准。

    图37表示Southern印迹。DNA印迹来自N．benthamiana(泳道1和2)，和烟草(泳道3和4)。DNA用EcoRI(泳道1和3)或HindIII(泳道2和4)消化。

    图38表示在含有半乳糖的培养基(A)和缺少半乳糖的培养基(B)上酵母菌株的生长。使用了三种菌株。WT：野生型酿酒酵母(S.cerevisiae)，H440(Aalto等，1993)，和H440(SYR)：表达SYR基因的H440菌株。

    C．酵母菌株H440的膜蛋白提取物的Western印迹。泳道1和3：H440；泳道2和4：H440(SYR)。所使用的探针是免疫前血清(泳道1和2)和抗SYR血清(泳道3和4)。

    图39表示拟南芥DNA的Southern杂交。将用EcoRI消化过的DNA与EST、P16862(左侧泳道)和SYR(右侧泳道)杂交。

    图40(或序列5)表示克隆在pG3SA上的反义cDNA SYR；

    图41表示Nt-Syr蛋白的疏水性、比较和表达分析。(A)Nt-Syr的重要特征包括推测的Ca2+-结合(EF手)和核苷酸结合(NBS)位点，部分保守的两亲性X1和X2域(*)供BotN／C毒素识别和裂解，以及3个推测的卷曲螺旋域(H1-H3)。在上皮形成素模式域(=H3)和C-末端疏水尾上发现了与拟南芥的Knolle(15)和人突触融合蛋白-1A(Syn1A)(3)之间的高度氨基酸保守性。相当于头279个氨基酸的截短的蛋白(Sp2)是N-His-标记的，并被用于制备抗体。

    图42表示神经毒素BotN／C而不是BotN／D在烟草的保卫细胞中寻找Nt-Syr并阻断ABA有反应的离子通道。(A)微粒体蛋白部分是从烟草叶片中分离的，用或者不用1mM APT预处理，并与BotN／C和BotN／D温育。通过SDS-PAGE分离蛋白，并用抗-Sp2抗血清通过Western印迹分析进行测定。每个泳道加样6克蛋白。(B)在有和没有BotN／C的条件下在保卫细胞中对20M ABA的Cl-通道反应的电压控制分析。电压控制步骤(上)：调节电压(5秒)，+30mV(未示出)；测试电压(6个循环)，-160到+30mV。测定在15 mM TEA-Cl和15 mM CsCl中进行，以消除K+通道电流。电流轨迹来自加载0．1MBotN／C、添加20M ABA之前和之后8分钟的1个保卫细胞。来自ABA中的第二个细胞的数据作为比较。加载和未加载毒素的细胞在无ABA时观察的电流特征未见明显差异。大小：垂直100 A cm-2，水平2秒。(C)BotN／C和BotN／D加载(n5)和未加载(对照)细胞的Cl-电流(ICI，上)和向内调整K+电流(IK，in，下)的ABA反应的平均值+／-SE。数据在-200 mV时记录，校正成ABA处理前的相应测定值。(D)(B)中符号交叉引用的瞬时电流的电流-电压关系。

    图43表示截短的Nt-Syr蛋白(Sp2)在烟草保卫细胞中是如何阻断ABA的离子通道反应。(A)在保卫细胞中对20M ABA的K+通道反应的电压控制分析。电压控制步骤(上)：调节电压，-100mV；测试电压(16个循环)，-250mV至+30mV；尾电压，-100mV。测定是在10mM KCl中进行的。电流轨迹是来自加载20M Sp2、加入20M ABA之前和之后10分钟的保卫细胞。示出了第二个细胞在ABA中的细胞的数据，以便比较。在没有ABA的条件下，在非加载的细胞和加载Sp2蛋白的细胞之间在电流特征方面没有明显差别。大小：垂直方向100Acm-2，水平方向1秒。(B)在非加载的(对照)和Sp2加载的细胞中在添加ABA之前和之后10分钟的平均值+／-SE。数据是在添加ABA之前和之后10分钟向内调整(IK，IN，空心向下的棒)和向外调整(IK，OUT，空心向上的棒)K+电流和Cl-电流(ICl，阴影向下的棒)。电流是在-200mV(IK，in)，+30mV(IK，OUT)，和-100mV(ICl)的电压下在稳态状态下记录的。以上三种电流在特定电压下的稳态幅度如下：IK，in(-200mV，向下的棒)，IK，out(向上的棒)和ICl(灰色的棒)。(C)来自图A的稳态电流的电流-电压关系。电流值是从总的稳态电流中减去泄露的瞬时电流的结果。在A中符号是交叉引用的。表达克隆脱落酸信号成分的方法

    为了分离脱落酸信号成分蛋白，选择异源爪蟾卵母细胞表达系统。选择该系统的原因有三个。但没有有关受体分子结构或受体DNA或蛋白序列的有关资料，并且在受体位点上(膜结合或胞质性的)没有共有序列。(2)有确切的证据表明，Ca2+在ABA信号途径中起着第二信使的作用，因此，当ABA感受蛋白在卵母细胞中表达时，所述激素应当能够诱导卵母细胞Cl-电流。ABA信号传导和内源Ca2+依赖型Cl-通道的结合可以在该途径的任何步骤上进行。(3)在爪蟾卵母细胞中表达植物膜蛋白业已得到成功地再现。我们使用的是类似于由Julius等(1988)披露的方法(科学241：558-564)，做了某些改进。最初，该方法需要用富含poly(A)+mRNA注射卵母细胞，所述mRNA是从幼小的烟草叶片中纯化的。筛选是通过常规电生理学进行的，分析爪蟾Ca2+依赖型Cl-通道的活化(图2A)。用诸如乙酸钾的弱酸作为负对照证实所述反应的专一性。还可以进行其它对照，以便用未注射的和用水注射的卵母细胞证实ABA反应的mRNA专一性。

    一旦证实了卵母细胞Cl-通道对ABA的反应，即可进行目的在于分离活性转录物的实验。可以用蔗糖梯度根据大小将mRNA分离成若干组分，可以分别注射每一种组分。然后将产生阳性ABA反应的组分用作模板构建cDNA文库。为了进行表达分析，将cDNA不定向地克隆在表达载体pSPORT上，其中，在插入片段的旁侧是RNA聚合酶T7和SP6的启动子。在制备质粒DNA和线性化之后，来自所述克隆文库的亚组分的cDNA模板用T7 RNA聚合酶在体外转录，并且在该合成步骤中对RNA加上mGpppG分子帽，以便产生所述cDNA插入片段的功能性cRNA拷贝。用该cRNA注射爪蟾卵母细胞，并按上述方法分析ABA对Cl-通道的激活作用。这样，产生阳性反应的cDNA克隆文库将总是包括完全实现ABA感受的最低完整需求。该组合可以逐渐细分成较小的文库(同胞选择)，直到获得最小的阳性组分(图2B)。

    分子克隆和生物化学方法到目前为止尚未得到一种编码可能的ABA受体的基因。筛选ABA受体的主要困难如下：通过生理学分析有理由相信可能存在多种ABA受体，每一种起着不同的作用。ABA信号被证实在不同的分子水平上针对不同的目标。一方面，ABA在细胞体内稳态方面介导快速生理学调节，包括在保卫细胞膜上控制转运蛋白，导致气孔关闭。另一方面，ABA能在转录和翻译水平上引起多种较慢的反应，导致发育和营养胁迫抗性所必须的ABA效应基因的表达的改变。在ABA受体的细胞定位(细胞质或膜结合)方面有很少的共同性。即使在气孔保卫细胞中的体内稳态转运控制情况下也是如此。另外，不同的细胞对高含量的ABA产生不同的反应，例如，叶绿素细胞与保卫细胞。尽管所述对ABA的各种反应在一定程度上取决于与每一种反应相关的因子的差别，有关发现还表明存在多种ABA受体，并且难于预测其细胞定位。

    为了克隆ABA信号成分，我们采用了另一种技术，利用使用爪蟾卵母细胞的表达克隆方法。用该方法克隆ABA信号成分的优点是没有必要预测其分子结构。人们所关心的是，以前在植物上尚未证实的将信号成分结合到卵母细胞信号途径上的能力。尽管不希望受任何理论的限制，但我们相信ABA刺激位于爪蟾卵母细胞信号途径之上，因为有共同的第二信使，无细胞质Ca2+浓度。

    第一个步骤是证实来自爪蟾卵母细胞的Cl-通道对Ca2+的依赖性。然后，在通过异源表达克隆ABA信号成分之前，我们分析了所述卵母细胞将表达的烟草mRNA转录物通过Ca2+与其内源通道结合的效力，该分析是通过测定Cl-电流对ABA的反应而进行的。将爪蟾卵母细胞用作异源表达系统爪蟾及其卵母细胞

    爪蟾是源于南非的有爪蟾蜍。爪蟾的卵子发生是一种连续的、不同期的过程，而且，在雌性动物的成年生命的所有时间，卵母细胞在发育的所有阶段都存在于卵巢中。完全长成的不成熟的卵母细胞(第Ⅵ期，见下文)的产生需要5-7周时间。卵母细胞发育分成六个阶段，第Ⅰ阶段包括小的(50-100微米)无色卵母细胞，其细胞质是透明的，其大型细胞核和线粒体在完整的卵母细胞中清晰可见。第Ⅱ阶段的卵母细胞其直径达450微米，并且出现白色和不透明性。第Ⅰ和第Ⅱ阶段都是卵黄生成前期。色素和卵黄积累(卵黄生成)始于第Ⅲ阶段。卵黄生成持续到第Ⅳ阶段(600-1000微米)，卵母细胞迅速生长，并且动物(棕色)和植物(黄色)半球开始分化，到第Ⅴ阶段(1000-1200微米)，卵母细胞已接近其最大体积，并且卵黄积累逐渐停止。第Ⅵ阶段卵母细胞的特征是必须的无色赤道带的出现。其大小为1200-1300微米，此时处于卵黄生成的后期，并做好了排卵和成熟的准备。

    完全长成的卵母细胞(第Ⅵ阶段)包围着下列各层(从最里边一层开始)。所述细胞有一个连续的卵黄磷蛋白膜包围，该膜是非细胞纤维状层。在它上面有一层卵泡细胞。所述细胞通过间隙连接与卵母细胞结合，它能容许高达1kD的分子自由通过，并提供电传导。包围卵泡细胞的teca是一种结缔组织层，其中，埋有平滑肌细胞、神经纤维、和毛细管。最后，最外面的一层是上皮细胞层，它形成连续的卵细胞壁。除了卵黄磷蛋白膜之外，所有外层通常都被称为‘卵泡层’，并可以用胶原酶通过酶促方法除去。爪蟾卵母细胞的第二信使和电特性卵母细胞中的Ca2+信号传导。

    Ca2+介导的信号传导途径包括通过G-蛋白和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)合成介导的途径，业已通过分析卵母细胞受精和通过引入新的受体在卵母细胞中对其进行了分析。与爪蟾卵母细胞受精相伴的是Ca2+的释放波和膜去极化作用，而该过程被认为是由IP3引起的。业已证实注射IP3能在成熟的爪蟾卵母细胞中诱导细胞内Ca释放。无细胞质Ca2+浓度([Ca2+]i)对细胞膜上的电流活性，特别是Ca2+依赖型Cl-通道有影响(见下文)。卵母细胞Ca2+依赖型Cl-通道。

    在八十年代初期，电生理学家描述了在爪蟾卵母细胞膜中由电压激活的Ca2+依赖型Cl-电流(Icl(ca))。在将卵母细胞膜从-120mV的滞留电势去极化至更偏向于正电压的-20mV时，引起了瞬时向外电流。所述向外电流的大小在卵母细胞中是高度可变的，在大部分卵母细胞中，在正常生理状态下该电流是不可检测的，而在某些场合下其峰值在100nA范围内。所述电流取决于外部Cl-，而不是K+或Na+。并具有大约-25-大约30mV的反向电势，该值接近Cl-的平衡电势(Ecl)。另外，所述电流对诸如四乙铵(TEA)的典型的K+通道抑制剂无反应，但会受到一种Cl-通道抑制剂niflumic acid的破坏。以上结果可以导致这样的结论，向外的电流主要是由进入细胞的Cl-流入量携带的。[注意，向外的调整电流取决于带正电荷的阳离子的流出量或带负电荷的阴离子的流入量]。

    Ca2+依赖性最初是通过离子取代和通过改变外部Ca2+浓度而测定的。通过用Mg2+或Sr2+取代外部Ca2+消除所述电流。相反，提高外部Ca2+浓度([Ca2+]o)可以提高向外电流的大小。

    最近，业已了解到存在两种具有不同动力学的Ca2+激活的Cl-电流，首先，发现注射IP3会对膜电势的去极化作用产生迅速的刺激和瞬时向外Cl-电流(ICl-1)。在30秒之后达到最大电流(2-4μA)，并在1．5分钟内降低到接近基线。这种早期诱导的电流具有接近Ecl的反向电势，并表现出两种动力学分量。一种分量是具有线性电流-电压(IV)关系的瞬时电流。第二个分量包括时间依赖型电流，该电流增加得更慢一些，在20mV的电压下其半衰期为250ms。第二种电流Icl-2在IP3注射之后3分钟缓慢形成1／2最大反应，达到1-2μA的最大峰值，并稳定至少15分钟。Icl-2也具有接近Ecl的反向电势，并同样包括两个分量：一个时间独立型Icl-2I和时间依赖型Icl-2D分量。瞬时电流Icl-2I的电流-电压关系是线性的，而对于Icl-2D的电流电压关系是高度向外调整的。

    Cl-电流Icl-1和Icl-2是Ca2+激活的，因为在用Ca2+螯合剂BAPTA注射细胞时可以破坏IP3诱导的两种电流。以上两种电流取决于不同来源的Ca2+。Icl-1取决于从内部储存来源释放的Ca2+和Ca2+流入量。不过，Icl-2D取决于外部Ca2+的流入量，因为当消除外部Ca2+或阻止外部Ca2+进入细胞(通过添加Ca2+通道抑制剂如Mn2+)，可以消除电流Icl-2D。在相同条件下，ICl-1保持不变。其它卵母细胞通道

    如上文所述，爪蟾卵母细胞具有在其膜中具有电压控制的Ca2+通道，并预期能造成Ca2+流入以便激活Cl-电流。所述Ca2+通道是其它二价阳离子可以渗透的。用40mM外部Ba2+消除Cl-电流的干扰，因为它不会通过改变内部Ba2+浓度而被激活。采用40mM的外部Ba2+，在用比-30mV更偏向阳性的电压对膜进行去极化时，检测到向内的电流。该电流受诸如Co2+和Cd2+的典型的Ca2+通道抑制剂的抑制。以上结果表明，所观察到的电流是由Ba2+通过电压依赖型Ca2+通道携带的。假设Ba2+和Ca2+的渗透性相似，Ca2+电流被计算为1nA，因此，低于在生理条件下的分辨极限(2mM外部[Ca2+]0)。

    在使用Ca2+通道抑制剂以便消除背景Cl-电流时，观察到小的(30-40nA)向外调整K+电流，表明存在Ca2+-不敏感K+通道。该电流的反向电势受外部K+浓度的影响，并随K+的平衡电势而变化，表明该电流主要是由K+携带的。该电流对典型的K通道抑制剂TEA(四乙铵)敏感。

    由Na+携带的最终电流在该细胞中是已知的。在对细胞膜进行长时间的去极化作用(以分钟计)时，由电压启动的Na+通道被打开。该通道在卵母细胞中的生物学功能尚不清楚。可以理解的是，Na+再极化电流可能在防止过度的膜去极化和在卵母细胞成熟和受精期间提供平衡的向内和向外的电流方面起着作用。它们可能是存在于受精卵中的通道的前体。

    总之对卵母细胞的详细分析业已发现了多种具有电压依赖型和[细胞内和细胞外]Ca2+依赖型的典型特征的电流。所有电流可以通过离子选择性和动力学特征鉴定。哺乳动物受体在爪蟾卵母细胞中的表达和克隆异源表达的效率和准确性

    业已对爪蟾卵母细胞进行了生理学和电生理学方面的详细鉴定，并被反复用于表达通过注射纯化的mRNA或体外转录的RNA引入的离子通道和膜受体的异源哺乳动物基因。所述卵母细胞是自我容纳的系统，不仅能够翻译外源mRNA，而且能进行翻译后修饰。所述修饰对于受体表达来说可能是重要的，并包括磷酸化、糖基化和亚基组装，以及将该分子插入细胞膜的能力。蛋白被定向于任何其它预定的亚细胞区室而且分泌蛋白被外泌。G-蛋白结合受体的功能性表达

    G-蛋白结合的受体属于一个特征在于7个膜区段的跨膜受体家族(7TMS)。7TMS受体可以在爪蟾卵母细胞中功能性表达，并成功地连接于内源信号传导成分上。有证据表明外源7TMS受体可以连接到卵母细胞所固有的G蛋白和磷酸酶C(PLC)上。因此，当用乙酰胆碱刺激表达毒蝇碱性受体的卵母细胞时会发生IP3诱导的Ca2+移动。通过细胞内Ca2+将TMS受体结合于内源通道上的方法是已知的。最近，业已证实一种腺苷酸环化酶结合的受体也可以在卵母细胞中功能性表达，并结合于内源G蛋白上。在这种情况下，发现EP2和IP前列腺素类受体的激动剂通过刺激腺苷酸环化酶提高细胞内cAMP水平，能够激活一种cAMP-依赖型Cl-通道，即共表达的囊性纤维化跨膜导电调节物。

    图2归纳了从以上有关研究中获得的有关表达和结合的一般模式。将全面表达的和功能性的受体插入卵母细胞膜中，并连接于卵母细胞内源G蛋白上。在通过合适的配体刺激之后，会发生PLC的活化。磷肌醇二磷酸(PIP2)水解会导致IP3和二酰甘油(DAG)的合成，IP3能刺激Ca2+从内部来源中释放。细胞内Ca2+的增加会激活内源Ca2+依赖型Cl-通道。事实上，任何最终会导致[Ca2+]结合的途径都会促进天然Cl-电流。另外，G蛋白可以激活腺苷酸环化酶，导致cAMP的产生，并刺激异源cAMP-依赖型Cl-通道。受体的表达克隆

    业已证实，从哺乳动物大脑中提取poly(A)+RNA并注射到爪蟾卵母细胞中，可以导致功能性离子通道的合成和结合，该通道随后可以通过电压或通过神经递质药物激活。该表达系统还可用于部分克隆神经递质受体和电压操纵的通道的方法。因此，该系统的作用可被用于分离并分析膜转运蛋白和受体。

    在用烟草mRNA注射时，爪蟾卵母细胞的内源Cl-电流可以由ABA诱导。

    我们业已发现从植物组织中分离的或用cDNA克隆作模板在体外合成的植物mRNA在注射到爪蟾卵母细胞之后也可以翻译。

    首先对未注射过的爪蟾的未注射的脱卵泡卵母细胞进行电压控制记录。在细胞上测定的具有波动电流的向外调整电流是由Cl-携带的，并且包括两个分量，一个是瞬时性的，另一个是时间依赖型的。该电流的大小是[Ca2+]i依赖型的。当外侧[Ca2+]o提高时，Cl-电流增加到500nA的最大值，它在40mV电压下在4分钟之后出现t1／2为300ms的激活，然后在5分钟之内降低到背景水平。所述Ca2+刺激最有可能是由于Ca2+通过电压依赖型通道进入细胞所导致的，这一结果与上述以前观察到的结果一致。

    将烟草poly(A)+RNA注射到卵母细胞中并进行功能性表达。通过注射mRNA，卵母细胞能够识别ABA。测定的针对ABA的很强的向外调整Cl-电流很有可能是通过细胞内[Ca2+]的提高诱导的，并在5分钟之内减弱。在60mV电压下测定的3．1μA的最大电流和t1／2100ms的动力学与在文献中披露的Icl-1电流分析的结果相当(在20mV电压下，2．5μA，t1／2250ms)。ABA-卵母细胞信号传导途径的结合

    通过注射烟草mRNA将这种特定的ABA反应移植到卵母细胞中，业已在上游植物激素感受成分和下游卵母细胞信号成分之间建立了联系。这种联系是由电流反应的专一性暗示的。只有当ABA施加到mRNA注射过的卵母细胞上时才记录到信号。如果取消或取代ABA或者mRNA注射都不会记录到信号。(1)乙酸钾，一种像ABA那样的弱酸不能在mRNA注射的卵母细胞中引起ABA信号。(2)水注射的卵母细胞对ABA没有反应。

    在植物和卵母细胞ABA反应之间的最终的平行表明在每一种情况下具有相似的上游调节成分。当获得有说服力的ABA反应时，就再也不可能用ABA再一次重新诱导向外的调整电流(对两个阳性细胞进行过测定)。这表明激素感受分子的脱敏作用。脱敏是通过负反馈获得的，并且通常是通过受体分子上氨基酸残基的磷酸化而完成的。

    以上实验证实在源于植物的激素感受蛋白和爪蟾卵母细胞的更下游一些的传导成分之间形成了联系。这种联系使得在异源卵母细胞中检测并分析ABA专一性反应成为可能。只有当ABA感受所必需的植物成分得到表达时，ABA才能在卵母细胞中刺激电压依赖型向外调整的Cl-电流。现在，转录物特定性和ABA诱导的向外调整电流可以在该方法中连续使用，以便富集并克隆该联系所必需的基因。

    到目前为止，业已涉及到转录物的总的混合物，正是在这一阶段我们试图富集并确定所述候选材料，以便分离更重要的成分。用于克隆的方法基于由Julius等(1988，同上)披露的方法，进行了某些改进，包括分离mRNA，并随后构建cDNA文库，以便制备同胞选择方法，分离在卵母细胞中决定ABA敏感性的克隆。

    根据大小在连续的蔗糖梯度上将mRNA分成10种组分。用pSPORT1表达载体将一个阳性组分克隆到cDNA文库中。将来自20，000克隆的质粒DNA的体外转录的cRNA注射到卵母细胞中，并且在体内翻译之后观察到小的但是明显的ABA反应，即向外调整Cl-电流的瞬时增加。同胞选择会导致以2，000∶200的比例分离阳性文库，最后有20种转录物在每一种情况下能引起相似的ABA反应。随着文库规模的降低，有关信号增强，这与活性转录物的纯化一致。

    为了制备所述文库，将一种质粒用作载体，并将大肠杆菌用作细菌宿主。选择使用pSPORT1载体的BRL Superscript质粒试剂盒。在将转录物安排到cDNA文库中之前，在连续的蔗糖梯度上分离mRNA。

    通过同胞选择，分离到含有编码可能的ABA信号成分的基因的20个cDNA克隆。在爪蟾卵母细胞中表达互补于所述基因的cRNA转录物，并产生ABA信号，导致内源Cl-通道的激活。对该文库进行细分的努力没有成功，就是说不可能用单一的克隆或少于20个克隆的文库在表达cRNA的卵母细胞中恢复ABA信号，即当将20个克隆的文库分成更小的克隆组时，不能记录到ABA信号。

    对所有20种cDNA的核苷酸序列进行分析，以便了解哪一个克隆可能是ABA信号成分的候选者，哪些克隆被从进一步研究中明确排除。将由该核苷酸序列推测的所有可能的氨基酸序列与蛋白数据库进行比较。相似性表明某些基因相当于具有与信号无关或不可能有关系的功能的酶或蛋白，其它基因对该数据库中的任何东西都没有相似性，但被认为是有意义的，因为它们含有若干推测的跨膜区。最后，最干兴趣的几个基因与已知在信号传导中具有明确功能的蛋白具有同源性。其中，包括小的G-蛋白(smG-Nt)、钙视网膜蛋白(cal-Nt)、受体激酶(rek-Nt)和突触融合蛋白样(syr)蛋白。

    仅仅是在这一部分中，通过NCBI提供的序列相似性结果给出了评分和可能性。当得分高于80时，其相似性是高度可能的，正如在大多数情况下看到的(表1)。当得分低于80时，则认为相似性不很明显。对于5号克隆(转录因子)、8号(可能的表面蛋白)和9号(rek-Nt)来说情况如此。5号克隆的低的得分可能是由于这里的相似性存在于植物和爪蟾序列之间。不再对该克隆作进一步研究，因为在爪蟾卵母细胞中可能已经存在同源性。8号克隆与该数据库中的任何序列都没有明显的同源性，但与推测的表面蛋白的低同源性是有趣的，因为其序列包含着推测的跨膜区。9号克隆是受体激酶样基因，在其5’末端表现出与甘蓝的受体激酶蛋白(表2)具有相似性，其高达151的高得分是显著的。在3’末端(65)的低得分也表现出重要性，因为较大的DNA片段与受体激酶的一部分非常吻合(图3)。其可能性同样与得分负相关。

    在头300bp上，序列资料的总体准确率估计＞99％。对序列误差的作用所作分析表明，所述误差不会明显降低通过BLAST检索鉴定所述DNA序列的可能性。

    另外，没有用完整长度的序列进行比较，因为这可能导致仅有同源区而不是完整的序列同源性。只是将末端区(5’和／或3’)用于BLASTX检索，不过它们占总的cDNA插入片段长度的50％以上，因此可以提供有关基因序列相似性的正确信息。对11号克隆(没有ORF)、13号克隆(人类的信号识别颗粒)和20号克隆(甲基转移酶)进行的序列测定低于50％。

    因为不可能用包括少于20个样品的文库再现ABA信号，用一种不同方法来揭示20种单一克隆的功能。对20个克隆的cDNA插入片段进行部分或全部测序，以便确认哪些基因有可能参与ABA信号传导，哪些基因可以被排除(表1)。首先，用Not1-EcoR1限制性内切核酸酶消化所述克隆，然后在琼脂糖上估计所述插入片段的大小。10号和17号克隆所含的插入片段小于200bp。对这两个克隆不再作进一步研究。用Taq聚合酶PCR-序列反应和ABI PRISM310遗传学分析仪获得所有其它克隆的核苷酸序列。用T7引物完成PCR反应。T7启动子序列位于SPORT1载体上，位于cDNA插入片段的5’末端(图4)，对于大于900bp的插入片段来说，进行两次测序反应，5号、11号和20号克隆除外。所述第二次反应是用M13(f)引物进行的。M13(f)互补序列位于pSPORT1载体上，位于cDNA插入片段的3’末端。每一次反应获得大约700bp的序列。

    对序列进行人工编辑(EDITSEQ程序)，以便消除位于所述序列5’末端的载体和poly(T)序列，并辨别不能由自动测序仪确认的模棱两可的序列。通过该方法产生的平均序列大约为400bp长。将cDNA核苷酸序列的6个可能的推测氨基酸序列与非丰余蛋白数据库进行比较，使用由NCBI提供的BLASTX e-mail服务器。所述BLASTX检索的结果归纳在表1中，在表中给出了最高评分的同源性以及该同源性的得分和可能性特征。一般，所述得分是从来自具有最高相似性的序列区域的排列氨基酸的整数值的总和确定的。对这一部分来说，只有当得分高于80时，才认为所述cDNA和已知序列之间的序列同源性显著。所给出的每一个序列同源性的可能性P(N)表示在数据库检索中一个序列预期出现的次数。该值越接近零，该检索就越可靠。该值越接近1，其相似性就越不显著。可能性值取决于多种因素，包括采用哪一种评分方案，查询序列的残基组成，一种典型数据库序列的假设残基组成，查询序列的长度，和该数据库的总长度。

    表1来自阳性文库的20个克隆BLASTX结果

    最有可能参与信号传导的克隆。nr大小T7aM13a可能的功能P(N)D得分D保藏号1750*-----2850*-----3900-**-PAR-病原体相关蛋白(烟草)PAR-病原体相关蛋白(烟草)8．3e-511．4e-16386136S57419S5741941100*-*无机磷酸转运蛋白(马铃薯)无机磷酸转运蛋白(马铃薯)3．9e-1131．4e-33850267X98890X9889051000*-磷酸酶抑制剂(兔)Rubisco活化酶(烟草)0．0365061100*--*Rubisco活化酶(烟草)病原体相关pr4B-蛋白(烟草)6．0e-533．9e-43239348S25483S254837750*-推测的表面蛋白(紫苜蓿)8．3e-98480S2380081300*--9．9e-0573U28149-*S受体激酶K4(甘蓝)---91200*--*受体激酶(I．trifida)3．7e-403．2e-0515165S39911U2094810---未发现ORF---111250*-----122100*------*信号识别颗粒受体(人)---131300*-突触融合蛋白相关蛋白(拟南芥)3．9e-16167W68942141250*-突触融合蛋白相关蛋白(拟南芥)7．3e-38180U39452-*小G蛋白(rab)(日本百脉根)1．0e-32141U3945215750*-未发现ORF3．2e-59333Z7395516500*-----17200--碳酸酐酶(烟草)---181000*-碳酸酐酶(烟草)1．4e-117765M94135-*钙网蛋白(拟南芥)2．0e-61430M94135192500*-钙网蛋白(拟南芥)2．1e-62495U27698-*SAM甲基转移酶(大豆)8．3e-09131U27698201200*--2．6e-61267U43683

    a．*表示在测序反应中是使用T7或M13(f)引物。

    b．有关BLASTX结果的得分和可能性P(N)的详细解释在正文中给出。

    表1中还给出了由所述cDNA插入片段所编码的20种蛋白的可能的功能。10号和17号克隆是“空”的克隆，其插入片段可能太小以至于不能编码功能性蛋白。另外，11号和16号两个克隆似乎不包含ORFs(开放读框)。3、4、5、6、7、13、18和20多个克隆与业已鉴定的具有明显与信号传导无关的功能的序列同源。事实上，所述基因的大部分具有与信号感觉系统完全不同的酶促功能。另外，用BLASTX检索时1号克隆未表现出任何相似性。不过，在与包含短的测序模式(Prosite13，Lasergene，DNA*，Madison，美国)的数据库进行比较时，所述基因表现出精确率为100％的多铜氧化酶特征。与该模式的同源性表明，由1号基因编码的该蛋白属铜结合氧化镁家族。

    具有所示功能的克隆(表1)可能因为不同的原因而引人关注。对2号、8号和12号克隆进行的BLASTX检索未能将这些序列与数据库中保存的任何已知序列对上号。有趣的是，这些克隆都具有跨膜区。所述基因的部分推测的氨基酸序列的亲水性曲线在图5中示出，同时示出了可能的跨膜域。可能的跨膜区是由具有20或更多个疏水性氨基酸残基的序列识别的。

    (1)2号蛋白在头109个氨基酸序列中含有4个疏水性区，随后是一个高度亲水性区(图5A)。(2)8号蛋白在所述序列的5’末端表现出与推测的表面蛋白具有某种相似性，不过该相似性的得分低于80为73，这表明同源性的显著程度较低。推测的表面蛋白源于紫苜蓿(Medicago Sativa)，对此没有进一步的资料。用T7引物在5’末端和M13(f)在3’末端进行的两个序列片段的退火的疏水性曲线表明可能有3个不同的疏水域，每个区域为20或更多个氨基酸，并且一个区域接近20个氨基酸残基(图5B)。(3)最后，12号蛋白头130个氨基酸的疏水性曲线表现出长度至少为20个氨基酸的3个疏水性域(图5C)。小G-蛋白

    所述克隆之一，即15号可能编码Rab／Ypt型小G-蛋白。尽管它有可能不是一种受体，但它可能参与比最初的感受过程更靠下游一些的信号途径。相似性检索是用从烟草(SMG-Nt2)(图6)中分离的cDNA(15)的109个氨基酸序列进行的，最高相同性(74．2％)是用从大豆(Glycine max)，GRM1中分离的组成型表达的Rab／Ypt相关序列是检测到的。其它高度同源的小G蛋白源于日本百脉根，RAB11G或源于拟南芥(ARA-4，RAB11)。另外，SMG-Nt2表现出与烟草的另一种小的GTP结合蛋白NT-RAB11E具有70．2％的同源性。

    小GTP结合蛋白能够特异性结合并随后水解鸟嘌呤核苷酸，用GTP／GDP循环作为分子开关，其中，激活／失活状态分别取决于GTP或GDP的结合。小GTP结合蛋白可以分成5个家族，即Ras、Rho、Rab／Ypt、Crf、和Ran。业已证实Rab／Ypt家族的smG-Nt成员参与了小泡介导的转运和分泌。业已证实Rab／Ypt通过C-末端半胱氨酸基序，通过脂肪酸与膜结合，该基序主要是修饰过的异戊烯部分。钙视网膜蛋白

    图7表示19号克隆cal-Nt与拟南芥钙视网膜蛋白的比较。5’末端的178个氨基酸片段的比较得到63．1％的相似性，而3’末端的86个氨基酸的比较在两个序列之间得出48．8％的相似性。钙视网膜蛋白是内质网中的钙结合蛋白，并具有作为分子伴侣蛋白的确定作用。还提出它们可能在信号传导中起作用，特别是在钙分配中起作用。某些报导支持钙视网膜蛋白在内质网外起特殊作用，如与类固醇激素受体的相互作用。所述序列在钙蛋白的N-末端位点具有一个疏水性前导序列，而一个HDEL基序表明其定位于内质网中(图7)。受体激酶

    9号克隆rek-Nt似乎与源于甘蓝或芸苔或Ipomoea trifida的受体激酶型蛋白同源。图3表示两个分别测序的氨基酸链的比较。发现N-末端序列之间的相似性高于C-末端的相似性(大约60％)(图3B)，它表现出与源于其它植物种的受体激酶具有大约40％的同源性。

    源于甘蓝的受体激酶位于S基因座上。该基因座编码参与所述植物的自身不相容性系统的蛋白，该蛋白能抑制花粉在柱头表面的萌发和生长，该柱头表面表达匹配的S等位基因。该受体激酶是一种跨膜蛋白，具有细胞外受体样结构域和细胞质结构域，它具有丝氨酸／苏氨酸激酶活性。不过，在进行表达分析时，发现所述受体激酶存在于营养组织中，这表明这些受体激酶具有其它细胞-细胞信号作用，如植物激素信号传导。突触融合蛋白相关蛋白

    实验证据表明，14号克隆syr与拟南芥的突触融合蛋白相关基因具有同源性，该克隆特别有价值。上述结果之一是通过观察当该蛋白在卵母细胞中表达时的电流而得到的。

    通过同胞选择方法分离的一个克隆psyr当过量表达时在卵母细胞中产生电流。BLASTX检索发现了与拟南芥蛋白KNOLLE(该蛋白是突触融合蛋白样蛋白)具有同源性。突触融合蛋白是一个大家族的成员，并被认为起着转运小泡的受体的作用，以该家族的不同同种型定位于有关细胞的各种膜上。Syntaxin(突触融合蛋白)是希腊文，其含义是“按顺序排列在一起”。小泡停靠和融合

    分子在细胞内和细胞间的定向运动取决于将小泡转运到特定膜区室的精确定向。分子研究业已发现了在源于酵母的分泌系统与神经元之间存在显著的相似性。组成型和调节型分泌的分子机构基于源于供体(小泡)和受体膜(质膜)的蛋白之间的动态相互作用。小泡停靠和与靶膜的融合的分子水平的机制被普遍接受。两种区室之间的融合是通过细胞质蛋白NSF(N-乙基马来酰-敏感型融合蛋白)和SNAPs(可溶性NSF结合蛋白)的蛋白复合物介导的，它能与三种突触蛋白SNARE(SNAP受体)蛋白、SNAP25(突触小体相关蛋白25k蛋白)、VAMP(小泡相关膜蛋白或小突触泡蛋白)和突触融合蛋白相互作用。以上三种SNARE蛋白包括停靠和融合机构的最低核心蛋白。VAMP驻留在小泡膜上，并且被称为v-SNARE(小泡相关SANRE)。突触融合蛋白和SANP-25位于质膜上，并且被称为t-SNARE(靶-膜SANRE)。‘SANRE假说’提出小泡定向和融合及其专一性是由v-SNARE和t-SNARE之间的相互作用控制的。可溶性NSF起着分子开关的作用(通过ATP水解)并且驱动SNARE复合体的分离，释放突触融合蛋白，SNAP-25和VAMP，并导致膜融合(图8)。最近，所述‘SANRE假说’受到挑战，而且业已披露了突触融合蛋白和VAMP在果蝇的停靠下游在小泡融合中是如何起作用的。突触融合蛋白，t-SNARE复合体的主要成分

    突触融合蛋白似乎可能在胞吐作用中起着重要作用。突触融合蛋白家族(突触融合蛋白1-6)似乎仍在扩大。所有突触融合蛋白具有共同的结构特征：在羧基末端具有一个疏水性跨膜域，而氨基末端域位于细胞质中。所述细胞质域含有具有形成螺旋卷曲结构的很高可能性的不连续区域。一种同种型突触蛋白1A含量非常丰富，并且在进化关系上很远的生物中，如果蝇和酵母中是高度保守的。最初的突触融合蛋白1A是从脑膜中分离的。它与几种相关的小泡或质膜蛋白相关，包括VAMP和SANP-25和胞质蛋白NSF以及两种形式的SANPs。作为t-SNARE的突触融合蛋白1A在‘SANRE假说’中具有两种推测的功能。第一种功能是作为靶蛋白存在于质膜中，所述质膜与位于接近小泡(VAMP或v-SNARE)上的配体相互作用，以确保停靠过程的专一性。另一种功能是作为可溶性SNAPs的受体，这可能是导致融合的途径中的一个必要步骤。

    后来发现，突触融合蛋白还可能与参与所述分泌系统的其它蛋白相关。业已证实突触融合蛋白与Munc13和Munc18(又被称为n-sec1，rop，或rbsec1)蛋白相互作用。所述蛋白的功能尚不完全了解，它们可能是在小泡融合过程中形成的核心复合体的调节物[注：只有这两种类型的蛋白(Munc13和Munc18)是对结合来说重要的突触融合蛋白分子的N-末端区，所有其它突触融合蛋白结合蛋白结合在预测的螺旋卷曲域上，紧靠氨基末端疏水域的上游]。

    还证实突触融合蛋白与结合蛋白相互作用。突触结合蛋白是结合在小泡膜上的胞吐Ca2+传感器。随着Ca2+升高，突触结合蛋白形成二聚体，这些二聚体与突触融合蛋白相互作用，并引发胞吐作用。

    突触融合蛋白、SNAP-25和突触结合蛋白以Ca2+依赖型方式结合电压控制的N-型Ca2+通道。突触融合蛋白与N-型Ca2+通道在爪蟾卵母细胞中的共表达降低了Ca2+电流强度，并改变了控制特征。突触融合蛋白的C-末端的缺失破坏了对Ca2+通道的作用，这表明所述相互作用位于跨膜区上。以上实验表明突触融合蛋白影响Ca2+流入的速度，并在Ca2+调节和小泡融合之间建立了联系。

    参与所述各种复合体的能力使得突触融合蛋白1A成为一种可能的候选蛋白，它与其邻居的相互作用能够控制不同机制的重要方面。突触融合蛋白的其它可能功能

    业已确定了突触融合蛋白的其它功能。就在最近有人提出突触融合蛋白1A能够在果蝇发育过程中介导膜组装过程。有趣的是，最初是报导源于大鼠的突触融合蛋白1B能够起着谷氨酸受体的作用。突触融合蛋白是通过用抗谷氨酸结合蛋白的抗体筛选而挑选的。当突触融合蛋白在爪蟾卵母细胞中表达时，它形成谷氨酸活化的离子通道。这表明所述蛋白的氨基末端亲水性部分的某一些位于细胞外，正如通过抗体筛选所证实的。有人提出融合蛋白在作为metabotropic谷氨酸受体时，能够调节从突触末端释放谷氨酸。植物突触融合蛋白相关基因

    业已披露了拟南芥中的两种突触融合蛋白相关的克隆。第一个克隆KNOLLE是通过拟南芥属突变型筛选分离到的基因。当对KNOLLE基因进行剔除时，所述植物的细胞分离受到破坏，其作用方式类似于用咖啡因处理植物。有人认为所述蛋白在新形成的细胞平板上小泡的融合中起作用。

    所克隆的第二个基因被称为aPep12，并可能功能性地与酵母pep12突变型互补。APEP12是一种突触融合蛋白同系物，它在将小泡从跨高尔基体网络转运到液泡中的小泡转运中起作用。序列比较和分析核苷酸序列和测序方法

    图9A表示syr克隆的cDNA插入片段的核苷酸序列。其衍生的氨基酸序列表示的是开放读框，始于17位上的ATG序列，并止于920位上的TGA终止密码子。所述氨基酸序列的长度为300个氨基酸。图9B表示在测序中所使用的方法。在所述cDNA插入片段的任一个末端形成两个缺失。为了使该基因的3’末端缺失，用BglII和BamHI限制酶消化psyr，并对剩余链进行再连接。将这种新的结构psyrbb用作模板用于采用M13(f)引物的测序反应。通过用SacI和EcoRI消化psyr克隆时另一个5’末端缺失，用T4聚合酶将突出的单链DNA末端补平，然后对该载体进行再连接。将这种新的结构psyrse用作模板用于采用T7引物的测序反应。将位于BglII和SacI限制酶之间的cDNA的中间部分克隆到pBluescript载体上，以便该插入片段的旁侧是两个M13引物：正向M13(f)和反向M13(r)引物，将其用于结构psyr2的两个测序反应中。通过将上述反应的序列合并成一个重叠群(图9B)，可以分辨所有不确定的核苷酸序列，并获得突触融合蛋白相关基因的完整长度的序列(图9A)。序列比较和蛋白结构

    将SYR氨基酸序列与源于拟南芥的KNOLLE突触融合蛋白样蛋白和突触融合蛋白家族的两种蛋白即源于人类的突触融合蛋白A和B进行比较(图10)。该蛋白序列包含三个主要部分。(1)疏水性C-末端，它可能是一个跨膜域。(2)一个位于所述疏水域上游的区域，包括一个上皮形成素模式，与Posite数据库(Lasergene，DNA*，Madison，美国)的‘框’进行比较。(3)该蛋白序列的N-末端是亲水性的并且不包括与已知序列特征的显著同源性。

    (1)对于突触融合蛋白家族的所有成员来说，总体上的疏水性特征是相同的。C末端所存在的21-24个疏水性氨基酸的序列可能代表一种跨膜区。(2)上皮形成素模式在突触融合蛋白之间是高度保守的，在氨基酸水平上大鼠和人类突触融合蛋白A和B蛋白之间的相同性＞80％。烟草SYR蛋白在该上皮形成素模式区的最高氨基酸相同性水平与KNOLLE比较为64．1％，与果蝇的突触融合蛋白A比较为53．8％，与人和大鼠的突触融合蛋白A和B相比为51．3％。该上皮形成素模式具有一个螺旋区，这表明在突触融合蛋白家族中蛋白-蛋白相互作用是普遍的。(3)N-末端是差别最大的区域，烟草的SYR蛋白的头62个氨基酸与KNOLLE蛋白相比仅具有17．7％的相同性，而头209个氨基酸与KNOLLE有34％的相同性，不过，该N-末端亲水区与所有其它哺乳动物突触融合蛋白的差别更大，最高相同性得分是与人类突触融合蛋白A和大鼠突触融合蛋白B的相同性为17．3％。不过，在人类和大鼠的突触融合蛋白A和B之间具有较高的同源性。对上皮形式素模式来说检测到相似的相同性得分，该相同性高于77％。另外，在SYR蛋白中观察到一个有趣的结构域，即核苷酸结合位点(NBS)，该位点在KNOLLE基因(拟南芥)或任何其它突触融合蛋白中都没有，该结构域的序列已被公开。该NBS结构域和N-末端亲水区的总体不同性表明SYR蛋白与迄今所鉴定的突触融合蛋白家族的成员相比具有不同的调控。

    业已将该家族的其它基因克隆到植物中，即pep12，源于拟南芥的突触融合蛋白样蛋白。不过，SYR烟草蛋白与该蛋白的同源性很低，仅有18．3％的总体氨基酸相同性，蛋白PEP12位于高尔基体后区室，它具有与突触融合蛋白1A或1B蛋白不同的功能，后者位于质膜中。为了从总体上进行比较，在图11中用系统树表示突触融合蛋白家族的成员。该系统树基于完整氨基酸序列的比较。

    更具体地讲，对转录物cDNA进行的测序表明，它包括一个编码突触融合蛋白-(t-SNARE-)相关蛋白(Nt-Syr)的开放读框，该蛋白具有300个氨基酸，预测的分子量为34．01kD，等电点为7．95。通过Clustal方法用Megalign(DNAstar，Madison，美国)对Nt-Syr蛋白进行的比较证实与源于植物的另一种突触融合蛋白样蛋白(在拟南芥中鉴定的Knolle基因产物)具有37．7％的相同性，与其由人类突触融合蛋白基因SYN-1A编码的最接近的哺乳动物同系物具有低的但是显著的同源性(22．8％的氨基酸相同性)。对Nt-Syr进行的结构和原位分析发现了突触融合蛋白共同的特征(图41)，包括位于其C-末端的单一的推测跨膜(疏水性)结构域，和三个很可能在蛋白-蛋白相互作用中形成卷曲螺旋结构的结构域(H1-H3)。在所述推测的卷曲螺旋结构域中，靠近推测的跨膜区的第三个结构域与哺乳动物突触融合蛋白-1A的上皮形成素共有序列具有84％的相同性(92％的同源性)。Nt-Syr还在三个分散的位点上具有部分保守性，这三个位点是肉毒杆菌型C毒素(BotN／C；图41)结合和裂解所述蛋白所必需的。不过，与迄今为止的其它突触融合蛋白的特征不同，发现Nt-Syr包括一个EF手共有序列，位于16号和18号氨基酸之间，以及一个位于114号和119号残基之间的推测的核苷酸结合位点。新的筛选

    所述20个克隆的文库不能够细分，或者说该文库的一部分不能检测ABA反应信号。Syr基因只能在卵母细胞中表达，导致记录到加强的向外调整K+电流的记录，和ABA信号的丧失。诱导K+电流

    SYR蛋白是一种突触融合蛋白相关蛋白，它在卵母细胞中表达时产生随时间加强的向外的调整电流。突触融合蛋白同样与Ca2+通道(N-类型)相互作用。不过，由SYR蛋白产生的电流对ω-芋螺毒素不敏感，该毒素是特异性抑制N型Ca2+通道的毒素。相反，在SYR表达卵母细胞上观察到的电流似乎是由K+携带的，其特征是具有反向电势和各种毒素(TGA和Ba2+)。以上实验以及在未注射的卵母细胞中检测到相似的电流表明，当SYR以较大量在卵母细胞中表达时，它与卵母细胞内源性电压依赖型K+通道相关。这样，SYR蛋白起着预先存在的静息通道复合体的调节亚基的作用，而不是形成通道。

    在刺穿表达SYR的卵母细胞之后，会随时间推移诱导向外的调整电流。

    下面提供的实验是为了揭示SYR蛋白在植物中的功能。第一种实验包括通过特殊的毒素(肉毒杆菌毒素)消除Nicotiana benthamiana和蚕豆(Vicia faba)中的突触融合蛋白样蛋白，导致保卫细胞中ABA反应的丧失。所述剔除SYR蛋白的实验使用肉毒杆菌毒素，该毒素能非常专一地消化SNARE蛋白。肉毒杆菌毒素家族是由肉毒杆菌产生的神经毒素，并能通过抑制神经递质的释放导致神经麻痹综合征。有7种不同类型的肉毒杆菌毒素，并且它们都包括两个二硫键多肽链。较大的亚基决定识别和细胞穿透。在细胞质中减少较小链的释放，在这里它表现出对胞吐装置的成分专一的锌内肽酶活性。肉毒杆菌毒素B、D、F和G能特异识别VAMP。肉毒杆菌毒素A和E能特异识别SNAP-25。肉毒杆菌C型神经毒素能裂解突触融合蛋白(有关综述可参见Montecucco和Giampietro(1995))。在保卫细胞上实验这种突触融合蛋白特异性肉毒杆菌毒素C(BotN／C)的作用，将肉毒杆菌D毒素(BotN／D)用作对照。肉毒杆菌毒素BotN／C能在保卫细胞中破坏ABA反应

    在正常情况下，ABA作用于Nicotiana benthamiana保卫细胞，导致阴离子电流的加强和向内调整的K+电流的减弱。当对保卫细胞施加BotN／C时，破坏了保卫细胞膜中的对以上两种电流的拮抗作用，确保了所述消除实验的可靠性。有趣的是，我们注意到BotN／C毒素在所述保卫细胞中对电流本身未表现出任何直接反应，只有在用ABA刺激该细胞时才表现出BotN／C的作用。以上结果特别表明，受BotN／C抑制的突触融合蛋白样蛋白在保卫细胞的ABA信号反应途径中起作用。另外，通过消除ABA在蚕豆的Ikin中的抑制作用证实了BotN／C的作用。以上结果表明，BotN／C在所有植物中普遍起作用。通过将另一种内肽酶BotN／D作为对照实验其作用进一步证实了BotN／C毒素的专一性。在用BotN／D处理之后在N．benthamiana的保卫细胞中每一种电流(阴离子和K+)的ABA反应不受影响。

    其它分析得到了有关SYR在烟草中的功能的更多的信息。检查了在受到胁迫或ABA处理时基因表达的模式。在烟草中和Nicotianabenthamiana以及拟南芥中分析了基因组构，以便检验存在于不同植物中的SYR基因是否是在像哺乳动物世界中那样是一个密切相关的家族的成员。另外，对在其突触融合蛋白样基因上发生突变的酵母菌株中进行转化，以便表达SYR蛋白。烟草的SYR蛋白被证实功能上不能便与酵母类似物互换。

    我们使用BotN／C毒素在植物中使Nt-Syr(又称为SYR)蛋白失效。BotN／C毒素能特异性裂解人类突触融合蛋白-1A和含有必需的识别和裂解位点的相关突触融合蛋白，从而破坏分泌。Nt-Syr包括BotN／C识别所必需的X1和X2识别位点的同系物，并且在上皮形成素模式共有序列和C-末端跨膜域之间BotN／C裂解位点具有部分保守性(图41)。对烟草叶片微粒体蛋白进行的Western印迹分析表明，Nt--Syr能由BotN／C毒素特异性识别和裂解，而Nt-Syr不受BotN／D毒素的影响(图42A)，毒素针对v-SNARE蛋白小突触泡蛋白。在用BotN／C分析时蛋白裂解(30kD)带的丧失可能与裂解产物的不稳定性和其随后被内源蛋白酶降解有关。不过，只有当用ATP对蛋白提取物进行预处理时才观察到裂解的事实证实了BotN／C作用的专一性(图42A)。突触融合蛋白对BotN／C的易感性取决于突触蛋白-SNARE复合体的分离，这一过程是由NSF ATPase促成的。根据以上结果，以及在叶片蛋白提取物中观察到的Sp2抗体与高分子量带(51kD和＞120kD，未示出)的结合，似乎有可能Nt-Syr在活体内参与了相似的复合体。我们在烟草和蚕豆中实验了BotN／C和BotN／D毒素对ABA介导的保卫细胞K+和Cl-通道的控制的影响。用含有0．1M的一种或另一种毒素的微电极进行穿刺，或者在对照实验中用仅含有正常乙酸钾电解质的微电极穿刺之后对完整保卫细胞施加。在保卫细胞中，ABA处理通常会导致显性的、向内调整的K+通道电流的40-60％的激发，和对通过C1-通道电流的2-4倍的激发。图42B-D归纳了来自烟草的资料，获得了在记录蚕豆保卫细胞时所得到的类似结果(未示出)。在对照实验中，以及在施加BotN／D毒素的保卫细胞中，ABA处理会导致特有的K+和Cl-通道反应。对于在图42B和D中示出的数据来说，测定是在有15mM氯化铯和15mM TEA-Cl的条件下进行的，以便消除K+电流背景，而Cl-电流是在将电压调整到+50mV以便激活该电流的预调节步骤之后将电压调整到+30mV和-200mV之间的步骤中测定的。添加20M ABA，会导致Cl-电流大小增加3倍(图41B，D：，-ABA；，+ABA)，并导致与对照相比(图41B，见上文)，该电流在负电压(图41B，见下文)下释放的特有的变慢。相反，在施加BotN／C毒素电压控制之后记录表明完全丧失了对ABA的敏感性(图41B，中以及图41D，)。在用BotN／C处理之后，同样观察到向内调整的K+通道对ABA的敏感性的丧失，以上结果与有关Cl-通道的资料一起归纳在图42C中。在独立的实验中，我们使用截短的Nt-Syr(Sp2)蛋白(见图41A)，以便在植物中“毒杀”Nt-Syr的功能。我们认为，如果SNARE样复合体和Nt-Syr为传导ABA刺激所必需，添加截短的Nt-Syr(包括推测的蛋白-蛋白相互作用域，但缺少C-末端膜锚定物)会与其天然蛋白竞争配偶体，并因此阻止功能性复合体的形成。另外，在这种情况下，在穿刺之后用含有20或100M的Sp2蛋白的微电极对完整的保卫细胞加样。图43A、C表示来自一组实验的两种K+电流的结果，而其它数据，包括Cl-通道电流的测定归纳在图43B中，对于在图43A和C中示出的数据来说，测定是在10mM外部K+的条件下进行的，而K+通道电流是在将电压调整到-100mV的预调整步骤(图43A，上)以便使该电流失活之后在将电压调整到+30mV和-250mV之间的步骤中测定的。在所述条件下，向外调整的K+通道的激活表现为在-50mV的控制电压下正电流的S形增加，而向内调整的K+通道的激活以在接近-150mV的控制电压下负电流的单向增加为特征(图43A，上)。添加20M ABA会导致向外调整的电流增加大约二倍，而在-200mV电压下，向内调整的电流比对照降低24％(图43A，C：，-ABA；，+ABA)。ABA处理还会造成向内调整的K+通道的电压敏感性的明显变化(图43C，插入)，与ABA-刺激的[Ca2+]i的增加和所述K+通道对[Ca2+]i的敏感性一致。不过，在施加Sp2蛋白之后，电压控制记录表明，完全失去了对ABA的敏感性(图43A，中和图41C，)。在用Sp2蛋白处理之后观察到Cl-通道对ABA的敏感性的相似的丧失，以上结果与有关K+通道的结果一起归纳在图43B中。以上结果表明，Nt-Syr在ABA信号传导和对水胁迫的适应中起着重要作用，并且在刺激感受和传导的早期步骤中与其它蛋白因子密切相互作用。在第一种情况下，我们的数据表明，Nt-Syr作为与其它蛋白的功能性异源多聚体复合物的一部分。SYR是由ABA上调的

    Northern分析表明，在烟草叶片中SYR是由干旱胁迫和ABA上调的。用ABA进行的两个独立的Northern实验都发现了SYR的瞬时诱导。SYR不是来自大的家族，但存在于不同植物种中

    通过用哺乳动物突触融合蛋白的分析研究，并由于某些基因在拟南芥中是已知的(KNOLLE和PEP12)，人们会预计在烟草中存在一个突触融合蛋白样蛋白家族。用烟草的DNA和SYR作探针进行的Southern分析意外地表明，只有少数的带表明SYR不是同源克隆的大家族的成员，并且仅存在一个或两个拷贝的SYR。如果SYR是基因家族的一部分，它与其它成员的序列同源性预计低于70％。在其它植物种N．benthamiana和拟南芥中发现了烟草SYR的同源基因。另外，在所述植物中似乎存在一个或两个拷贝。农杆菌属介导的瞬时表达。

    为了分析syr的功能，通过将一个反义结构导入该植物从烟草叶片中剔除该基因。将反义cDNA导入叶片细胞的基因组中是通过使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的瞬时表达系统进行的。根癌农杆菌是一种植物病原体细菌，它能将确定的DNA片段，即转化DNA(T-DNA)输入植物细胞。

    以上结果表明，当通过反义方法剔除syr基因时，叶片组织对干旱条件的蒸腾适应能力受到损害，换句话说，气孔闭合调节可能受到损害，这实际上正是ABA的“任务”。以上结果表明，syr在体内参与植物胁迫相关激素脱落酸的信号传导途径。例1从烟草叶片中分离poly(A)+加尾的RNA植物生长条件

    在温室中，在浸水土壤上使烟草种子发芽，所述土壤上覆盖有塑料薄膜，以便尽可能的保持最大湿度。用Osram400W钠灯作为光源施加12∶12小时昼-夜周期，温度保持在25-28℃。在一周之后，当种子萌发之后去掉所述塑料薄膜。在5-6周之后，用解剖刀收获嫩叶，并马上称重，并在液氮中冷冻。将冷冻的组织保存在-70℃下待用。制备poly(A)+加尾的RNA

    所使用的所有水溶液是用DEPC(0．001％)预处理过的，将该化合物加入所述溶液中，在室温下温育过夜，并在120℃和1巴压力下高压灭菌20分钟。不能用DEPC处理的Tris溶液是用DEPC处理过的水制备的，并按上述方法高压灭菌。所使用的所有塑料材料直接购自生产商，并且仅仅用一次性手套处理。

    用研钵和研棒在液氮中对20克冷冻的植物材料进行充分研磨，直到获得细末。可以使用10克植物组织，并将所有必需的溶液分成两份，以便所有过程都相同。将所述粉末悬浮在100ml提取缓冲液(0．1M氯化钠，0．01M EDTA，2％SDS和0．05M Tris-HCl，pH9)，在45℃预热，并在使用之前添加20毫克蛋白酶K。在45℃的水浴中剧烈震荡所述悬浮液10分钟。加入50ml苯酚，并将该混合物转移到一个离心管中，并在20℃下在GSA转子中以6000g(6000rpm)的速度离心。将上部水相转移到新的离心管中，并用50ml苯酚加50ml氯仿重复以上提取过程，第三次提取用100ml氯仿。一旦澄清，在确定其体积之后将水相放到冰上。加入10％的氯化钠(5M母液)(v／v)，并将该混合物放在冰上20分钟，然后，在4℃下在GSA转子中以23500g(12000rpm)的速度离心10分钟，弃上清液，并放在冰上。

    通过寡脱氧胸苷酸层析纯化mRNA。在这一步骤中，通过在一个新的50ml的塑料管中用30ml 0．1M NaOH洗涤对0．5克寡脱氧胸苷酸纤维素(Boehringer Mannheim)进行预处理。通过以1500rpm的速度离心5分钟使寡脱氧胸苷酸纤维素沉淀。在所述预处理之后，用水进行两次类似的洗涤，并用结合缓冲液(0．4M NaCl，0．2％SDS，0．01MTris-HCl，pH7．5)洗涤两次。将寡脱氧胸苷酸纤维素均分到两个50ml试管中，每个试管中总共加入10ml结合缓冲液，并将植物提取物加入两个试管中。通过在室温下上下转动所述试管30分钟对所述悬浮液进行轻微震荡，以便让转录物的poly(A)+链与结合在纤维素上的寡脱氧胸苷酸杂交。然后以1500rpm的速度对所述试管进行离心5分钟，弃上清液，并用结合缓冲液洗涤所述纤维素两次，用洗涤缓冲液(0．1M NaCl，0．01M Tris-HCl，pH7．5)洗涤两次。将所述纤维素悬浮在每只试管中的45ml洗涤缓冲液中，并转移到一个塑料柱(直径1厘米，长度10厘米，BioRad)，在这里用洗涤缓冲液(≈100ml)继续洗涤，直到在通过分光光度计测定(A260=0)洗脱液中不含RNA为止。保留在纤维素上的poly(A)+加尾的RNA用预热到55℃的洗脱缓冲液(0．01M Tris-HCl，pH7．5)洗脱。将1ml洗脱缓冲液注入所述柱，并且每次收集1ml洗脱液，分别收集在10个独立的微量离心管中。通过斑点试验法(见下文)估计所述试管中的RNA量。通过加入10％的NaCl(5M母液)(v／v)和2．5倍体积的冷却(-20℃)乙醇对含有RNA的式样(通常为第三和第四号微量离心管)进行乙醇沉淀。将所述溶液在-20℃下冷却至少1小时，以便使RNA沉淀。将RNA储存在乙醇中数周。如果需要，在一台离心机上以可能达到的最大速度对poly(A)+加尾的RNA进行离心20分钟，并用70％的冷却(-20℃)乙醇洗涤所产生的沉淀物。将所述沉淀溶解在适量的DEPC处理过的水中，达到大约1μg／μl的浓度。斑点试验

    通过与具有已知浓度的标准RNA样品比较对低浓度的RNA样品进行定量。所述标准样品可以从商业渠道购买，或者是通过分光光度法测定过其浓度的未使用的RNA样品。对于具有1μg／μl的合适浓度的标准RNA样品来说，通过将10μl该溶液稀释在990μl水中进行稀释，并在260nm的波长下测定OD，并用以下转换系数测定其浓度：1．0的A260=40μg／ml RNA。一旦了解其浓度，就将该标准RNA样品稀释到10ng／μl的浓度。用一个称量舟皿制备一系列标准物液滴，在用UV灯检测之前最后加入溴化乙锭(EtBr 10μg／ml)，其方案如下： RNA(ng)   0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 RNA(μl)  0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 H20(μl)  9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 EtBr(μl) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

    同时，将2μl的未知样品加注到独立的液滴中，用8μl水稀释，并添加1μl EtBr。将所述称量舟皿放在UV灯上，通过比较发光强度测定RNA浓度。例2爪蟾卵母细胞及其制备爪蟾卵母细胞的维持

    源于南美的雌性爪蟾是从英国的Blades Biologicals购买的。将这些爪蟾放养在18-20℃温度下的装有大约10厘米深的脱氯水(通过空气蒸发过夜获得)的大水箱中，给予10∶12小时昼／夜周期，使这些动物可以不受限制的到达表面。每周用碎牛肉或切碎的心脏(脂肪＜5％)饲喂所述蟾蜍三次。在饲喂之后大约3-4小时清洗所述水箱。为了识别，用编码的异频雷达收发机(Animalcare有限公司，York，英国)对每一只蟾蜍进行皮下标记。制备注射用卵母细胞

    在冰上麻醉3小时之后，通过外科手术从爪蟾体内取出卵母细胞。用解剖手术刀在蟾蜍腹部下面1／3处形成一个小的切口(大约1厘米)，该切口透过松弛的皮肤和体腔壁。卵巢叶容易识别，并用镊子轻轻地取出。切除所述卵巢叶并放入Barth’s溶液的培养皿(88mM氯化钠；1mM氯化钾；0．33mM硝酸钙；0．4mM氯化钙；0．82mM硫酸镁；2．4mM碳酸氢钠和10mM Hepes，pH7．5，通过高压灭菌消毒，并添加硫酸庆大霉素(0．1mg／ml)和青霉素钠(0．05mg／ml))。用肠线(p1ain3／0，26nm切段，75厘米长，W250，Ethicon，爱丁堡，英国)缝合所述切口，缝了两针，穿过外层表皮和内部体壁。然后将爪蟾转移到装有2-3毫米深蒸馏水的隔离水箱中，让其恢复。一旦恢复完全的运动能力将爪蟾送回其主水箱。

    为了制备卵母细胞，将卵巢叶剥开，以便得到大约5-10个卵母细胞的小块。在添加了1mg／ml胰蛋白酶抑制剂的含有2mg／ml胶原酶的Barth’s溶液中通过酶促方法去掉包围卵母细胞的卵泡细胞层，同时在20℃下在定轨摇床上震荡(0．5转／秒)1小时。通过用Barth’s溶液洗涤卵母细胞若干次结束所述处理。最后通过人工清除残留的卵泡层释放卵母细胞。

    重要的是筛选未受损伤的存活的卵母细胞。将充分生长的，V-VI期的未成熟卵母细胞用于表达实验。健康的卵母细胞具有清晰的动物(黑色)和植物(浅色)半球极和一个清晰的赤道带。将在动物极上具有浅斑或斑点外观的卵母细胞去掉。用巴斯德移液管截断处理卵母细胞，以便形成大约3-4毫米的孔，在火焰上使该管垫平。注射选择的卵母细胞

    用浓度为1μg／μl的RNA注射V-VI期的选择的卵母细胞(直径大约1．2毫米)。注射是在外科手术之后24小时用一个用玻璃毛细管制成的微量移液管完成的，该管的壁厚为0．3毫米，截面直径为1．8毫米(Kimax51，Kimble产品，美国)。用水平拉伸机(P-D5，Narashige科学研究所，日本)将所述毛细管拉伸成大约1厘米长的棒。断开该微量移液管的顶端，以便得到顶端直径为大约10微米的孔。将该微量移液管安装在微操作器上，并连接在一个气动微型泵(世界精密仪器，Sarasota，美国)，该泵是由惰性氮气驱动的，该泵可以调整其控制压力，以便微量移液管中的溶液不会因为毛细作用力而流动。它还可以调节注射压力，通过脚踏开关控制，并且注射体积是综合设定注射压力和注射时间的脉冲次数而决定的。

    注射体积是通过用1μl DEPC处理过的水在一片石蜡膜上预校正注射移液管而设定的。通过消除保持压力，利用毛细作用力将所述溶液吸入移液管中。然后对该移液管进行校正，以便以15-20个注射脉冲释放相同体积对该移液管进行校正，因为卵母细胞可以最大75nl的量注射。然后将1μl RNA溶液加在石蜡膜的表面，并通过毛细作用力吸入移液管中，消除保持压力。将20个卵母细胞在显微镜载玻片上排成一排，该载玻片放在培养皿盖上，添加最少量的Barth’s缓冲液，以防止所述细胞干燥。通过将移液管插入所述细胞中然后施加注射脉冲将RNA注射到每一个卵母细胞中。在注射之后，马上将这些卵母细胞转移到装有足够的新鲜Barth’s溶液的新的培养皿中。在20℃下培养卵母细胞两天，每天更换Barth’s溶液。例3电压控制方法实验设置

    所有电压控制实验是在Faraday笼中进行的，以确保电绝缘(图13A)。测定是通过将卵母细胞保持在特别设计的腔室中进行的，容许微电极进入和连续的缓冲液流动。为了进行电学测定，用两个微电极刺穿所述细胞，并测定电流和电压。微电极是通过Ag／AgCl半电池电连接到一对高阻抗放大器(μP12系统，WyeScience，Wye Kent)上。将计算机(Compuadd，C466D，Austin，Texas，美国)控制的μLab程序(WyeScience，Wye Kent，英国)用于产生指令电压，在电压控制测定期间记录膜电流和电压。电压控制测定是通过两个常规的电极电路进行的，其中电压信号是通过一个放大器调整的，然后在以电流形式送回所述细胞之前通过另一个高差分放大器(WyeScience，Wye Kent，英国)与所述指令电压进行比较。所有信号都在示波器上监测(示波器(DSO)400，Gould电子有限公司，Ilford，Essex，UK)，并且还将膜电压记录在记录仪(BD112型，Kipp&Zonen，荷兰)，用6极Bessel过滤器(fc=0．3或1kHz)过滤所述电流信号，并在2kHz下将所述电流和电压信号数字化(WyeScience，Wye Kent，英国)，并以二元代码形式保存在磁盘上。腔室设计和超级融合

    腔室是由2毫米厚的有机玻璃元件制成，通过在中心开3个相互连接的槽，并在其底部用一个盖板封闭(图13B)。将单个的卵母细胞放入中间槽中，以便两个微电极能够从一侧刺穿而不会移动所述细胞。将所述腔室加满，并用一个放在第一个孔中的注射器针头保持固定的Ringer’s缓冲液流，用一个巴斯德移液管从第三个槽中清除多余的溶液，该移液管通过一个真空长颈瓶与一个泵连接。将装有在所述实验中使用的溶液的吸瓶安装在位于所述Saraday笼上方的外壳中，并通过重力输送实现灌流。每一个吸瓶与一个通向六路开关，然后再通向一个四路开关，通向所述腔室或废物烧杯。用最少的时间实现有效的溶液交换，让新的溶液到达所述腔室和细胞。在所述水浴中的溶液交换是通过记录顶端电势的变化而测定的。将电极放在中央孔中进行的测定表现出在新的溶液到达所述腔室之前来自溶液交换的40-45秒的延迟，而交换的半衰期为5-6秒。微电极和半电池

    微电极是用具有内部细丝(GC150TF-10，克拉克电子医学仪器，雷丁，英国)的圆形薄壁玻璃管(截面直径：1．5毫米，壁厚：0．3毫米)制成的。用一个垂直拉伸机(PP83，Narishige，日本)拉出具有5微米直径的尖头，并用2毫升注射器和针头向所述电极中填充3M氯化钾。

    半电池是用银线(直径1毫米)制成的，将银线焊接在标准2毫米有插销的接线板上，插入一片(3-5平方毫米)的硅橡胶中，并插入塑料移液管部分。通过用新鲜次氯酸盐填充所述移液管过夜用氯化银涂敷所述银丝。然后漂洗所述半电池数次，填充3M氯化钾。在测定期间每天重复所述过夜涂敷过程。用牙科蜡(Kerr压印化合物，Kerr生产商，美国)固定微电极。在进行电压控制的穿刺中使用两个微电极和半电池。用第三个电极作为参考，并将其连接到电路基础上，在这种情况下与水浴的接触是通过一个玻璃毛细管(截面直径：1．5毫米，克拉克电子医学仪器，雷丁，英国)，该毛细管弯成45的钩，并填充存在于2％琼脂糖中的3M氯化钾，按上述方法将其连接到半电池上。电压控制测定

    用单个的(未注射)注射的卵母细胞进行全细胞电压控制，以便记录在电压控制下达到膜电势Vm所需要的电流Im。使用两个电极控制。因此，将两个独立的电极插入所述细胞的细胞质，一个电极是电压记录电极，将其用于监测膜电势Vm。保持所述电势稳定，即使当所述膜的导电性改变时也保持稳定所需要的电流Im，是通过能通电流的第二个电极注射的。图14表示简化的电压控制电路。膜电势Vm是用一个放大器记录的，并随后与由控制放大器产生的指令电压进行比较。将两个电压信号之间的差颠倒，通过第二个放大器和电流通过微电极送回所述细胞。这样，将膜电压控制在实验控制之下。

    在进行电压控制时必须考虑的一个因素是水浴误差电势。按上述方法用一个接地电极将所述水浴溶液接地。所有测定都是相对该基础的，假设所述水浴均匀地接地。当控制电流大到足于(10μA)导致通过所述水浴的电阻有明显的电压下降时，该假设不成立。这意味着通过电压记录电极所测定的电压实际上是膜电势Vm和水浴电势的总和。在本文所述实验中，在3．5μA的电流下最大误差为7mV，该误差是可以忽略的。

    当表面积为106μm2时，卵母细胞的膜容量很高，并有必须充电的大量的膜，以便控制所述细胞。电压控制的快速反应时间是必要的，以便分析电压控制通道的动力学。在这种情况下的快速控制时间(＜5ms，达到电压稳定)是通过减小注射微电极电流的电阻(大约1M)而实现的。例4爪蟾卵母细胞的外向Cl-电流是Ca2+依赖型的卵母细胞中的内源外向调整电流

    在第一个实施方案中，在控制电压下检查未注射的卵母细胞，以便鉴定和分析内源Ca2+依赖型Cl-通道。在大部分细胞中观察到很低的导电性，同时在正常Ringer’s溶液中控制膜电压。电流活性与爪蟾相关。某些爪蟾产生非常“紧凑的”卵母细胞，没有可见的时间依赖型电流，并且在正常Ringer’s溶液中的背景很低(gm范围为0．01-0．05μS)。来自其它爪蟾的卵母细胞不能用于表达分析，因为其在背景电流幅度或背景导电性方面的差别很大(＞0．4μS)。表现出波动的电流的卵母细胞被用于用新的电压控制设置在实验中鉴定内源电流。

    如图15A所示，外向调整电流在正常Ringer(87．5mM Cl-)中是可检测的。所采用的电压控制方案是标准的：控制电势为60mV，以便设定标准水平进行比较，接下来是8个电压测试脉冲中的一个，其范围为-180mV至+40mV，每一次1000ms长，以便恢复到-60mV的控制电势。为了简化图形，通过不同循环的电流的重叠显示其轨迹。在将所述膜从保持电势(-60mV)去极化至更偏向正电压的-10mV时，激活了较强的向外调整电流。该电流表现出两个分量，一个瞬时增加，随后是一个缓慢发展的向外的电流，其t1／2大约为300ms，+40mV。所述电流的向外的分量在水浴中的Cl-浓度降低到30mM Cl-时大大降低(Cl-被SO42-所取代)，与通过所述膜的对Cl-的驱动力的偏移吻合。该作用是可逆的，当用正常Ringer(87．5mM Cl-)再填充时，所述外向电流恢复。这是第一次表明所述外向电流是由流入细胞的Cl-流携带的1。

    外向调整电流是由带正电荷的阳离子外流或带负电荷的阴离子向内流所产生的。向内的电流是由阳离子的流入或阴离子的流出导致的。Cl-电流的反向电势为了确定携带电流的离子，对所述反向电势进行实验测定，并与理论计算的特定离子的平衡电势进行比较。平衡电势是平衡扩散力的电力，该扩散力取决于位于所述膜的任一侧的离子浓度。为了简化扩散方案并测定活性的单位系数，S离子的平衡电势是通过Nernst方程确定的，内侧[S]i和外侧[S]o离子浓度是可变的；Es=RT／zsF ln([S]o／[S]i)(I)

    其中，R是气体常数，T是温度，Zs是离子的电荷而F是法拉第常数。在25℃下，RT／F是25．69mV。卵母细胞的[Cl-]i是大约30mM，而在正常Ringer’s溶液中的[C1-]o是87．5mM。因此，根据方程1，Cl-的平衡电势Ecl=-28mV。

    为了测定实验反向电势，在前脉冲将所述细胞控制在+50mV 500ms，以便激活所述电流。随后逐渐将膜电压范围调整到-160mV到+30mV。在+60mV到-3mV的电压下，电流释放(拖尾)为负走向，而在-34到-160mV的电压下，电流释放为正走向。由于所述放电是活化电流失活的后果，在其平衡电势上预计不会记录到电流的变化。在该电势的正电压和负电压下，所述放电的特征相反。反向电势是在电流被改变方向时的电势，并测定其为-10到-30mV之间，与预计的Ecl吻合(-28mV)。所述电流可能是由Cl-携带的(图15B，箭头)。在未注射的卵母细胞的实验中观察到的另一种相关性是Cl-电流随时间而下降。在任一批卵母细胞中，都会出现自主的Cl-电流，这在操作之后若干天通常会逐渐成为“沉默的”。Cl-电流的Ca2+依赖性

    图15C中的最后一幅图表示外部[Ca2+]o对向外的Cl-电流的影响。在该实验中，当在正常Ringer’s缓冲液中控制1mM的Ca2+浓度时所述卵母细胞不会出现太多的电流。不过，当Ca2+浓度增加到10mM，-而保持[Cl-]o为87．5mM时-在经过4分钟的时间延迟之后，记录到去极化的电流激活作用，将改变所述腔室中溶液的时间计算在内。所述反应是瞬时的，并在最大高峰电流之后5分钟时间内降低到背景电流水平。所述诱导电流也是由Cl-携带的，正如通过尾电流分析所证实的(未显示)。在所述反应中4分钟时间的延迟可能是由于Ca2+必须首先通过Ca2+通道进入细胞所致，因为所述Cl-通道取决于细胞内[Ca2+]i浓度。例5 ABA在注射烟草纯化mRNA的卵母细胞上的反应纯化烟草的poly(A)+RNA

    在营养组织中，叶片是脱落酸的一个主要目标。将叶片器官用作ABA受体克隆工程的原始材料。选择烟草SR1作为原型植物。

    poly(A)+RNA是直接从源于不同植物的植物组织库中分离的，在用苯酚和氯仿提取之后用寡脱氧胸苷酸纤维素分离。用另一个步骤纯化poly(A)+RNA(乙醇沉淀)，在通过斑点试验测定其浓度之后，将其溶解在DEPC处理过的水中，得到终浓度为1μg／μl的溶液。典型mRNA注射的卵母细胞的ABA反应。

    用50-75μl的1μg／μl poly(A)+RNA悬浮液注射卵母细胞，并在转录表达之后2天用单个细胞进行电压控制测定。图16表示典型的mRNA注射细胞对ABA的电学反应。采用Cl-电流分析的标准电压方案：在为期500ms的调节时间之后将膜的控制电势从-120mV逐渐调整到-180mV到+60mV的范围内，保持1秒，然后再恢复到控制电势。该循环重复8次，以便电势均匀分布在-180mV到+60mV之间。不同电压循环的电流重叠显示在图16A中。在正常Ringer’s缓冲液中，在任何电压下都没有记录到明显的时间依赖型电流。当ABA(20μM)加入正常Ringer’s溶液中之后，在控制电势从-120mV逐渐调整到更偏向正的电势的-10mV时检测到时间依赖型向外调整的电流。所述电流在25mV电压下产生200ms的t1／2，并随着重新极化到-100mV以大体上单一的指数方式失活(t1／2为100ms)(图16A，中)。ABA的刺激是瞬时的，并且电流减弱在5分钟内完成(图16A，右)。还观察到自由运行膜电势的去极化作用，这与电流的增加吻合。

    图16B表示按上述方法记录到的全细胞稳态电流，以及在ABA处理期间的两个时间点上的电流(20秒和5分钟)。在这种情况下，所述稳态电流来自在每一个测试脉冲结束时的电流，并且以控制电压的函数形式给出。很明显，ABA能引起一种电流，该电流在大约-160mV时激活。在+60mV下，超过3μA的增加清晰可见。

    按上述方法测定ABA引起的电流的反向电势(Cl-电流的反向电势)。在+20mV的电压下施加调节脉冲，以便激活所述电流，接下来是在-180mV到+20mV之间的8个测试脉冲之间的一个。对于高于-10mV的电压来说由所述测试脉冲产生的放电是负走向的(而对于低于-35mV的电势来说是正走向的)。所述反向电势是电流反向时的电压(为-15mV到-35mV)，相当于Ecl(图16C)。

    所述ABA反应是在3个细胞中记录的，一共试验了5个细胞。在所述3个ABA反应细胞中的两个，再一次使用ABA。在任何情况下，都没检测到2次反应。在该特定mRNA制剂中，ABA引起的电流类似于在未注射的卵母细胞中观察到的电流，此时使用了10mM的外部Ca2+(图15C)。ABA反应的统计学分析

    在图17中示出了3个阳性细胞的诱导稳态电流的平均值。所述ABA诱导电流的稳态是通过从由ABA激活的电流中减去在添加ABA之前记录的卵母细胞背景电流而计算的。将诱导的稳态电流作为控制膜电压的函数作图。

    用于mRNA纯化的植物有足够的水分。相反，在另一种实施方案中，植物受到干旱胁迫或用20μM ABA溶液处理1小时(将该溶液喷洒在叶片上，有关详情参见第8章)。当从所述后一种植物中纯化的mRNA在卵母细胞中表达时，在所有试验的细胞中都记录到ABA反应(当使用源于干旱胁迫植物的mRNA时n=3，而对于ABA处理的植物的mRNA来说n=1)。另外，卵母细胞的批次具有可变性，因为当将源于干旱胁迫植物的阳性mRNA样品注射到另一批卵母细胞中时，所述ABA反应可能不会再现(n=3)。阴性控制证实ABA专一性

    阴性控制证实，所述信号对ABA和mRNA注射的卵母细胞是专一的。被注射的卵母细胞不会对所述植物激素产生反应。在添加ABA之前和之后在电压控制期间在自由膜电势或电流之间没有发现差别(n=8，分布在不同卵母细胞批次之间)。另外，通过在所述实验的过程中注射的20个不同RNA文库证实了一般来说特定转录物的专一性而不是RNA的专一性(ntotal=78，参见下文)。

    还考虑了弱酸影响。脱落酸是一种弱酸(pKa4．8)，而且在pH7．5(Ringer’s缓冲液的pH)下，将主要为离子化ABA-形式，但会存在某些质子化ABAH。由于该分子不再带电，它可以分布在卵母细胞质膜上。不过，很少有弱酸捕获，因为细胞外和细胞内pH大体上相等(pH7．5)，所以细胞内pH不会有明显变化。然而，由弱酸ABA导入的缓冲能力的增加会影响pH的改变，并因此影响[Ca2+]I的变化。为了证实这不是卵母细胞细胞内缓冲能力的增加，该能力会促进向外Cl-电流的活性，还进行了负对照，在不同的试验中用20μM乙酸钾(pKa4．8)取代ABA。在每一种情况下，当添加乙酸钾时，没有观察到反应。因此，可以得出这样的结论，ABA是由卵母细胞特异性识别的，但只有当注射植物mRNA时才能识别，而且这种识别会导致内源向外调整Ca2+依赖型Cl-通道的诱导。例6蔗糖梯度分离

    mRNA分离是用蔗糖梯度完成的。为了制备蔗糖梯度，制备了两种母液：一种溶液含有30％蔗糖，其中含有10mM Tris-HCl(pH7．5)，1mM EDTA(pH8)和0．1％LDS(十二烷基硫酸锂)，另一种溶液包括相同的成分，所不同的是缺少蔗糖。以不同比例混合以上两种缓冲液，以便得到蔗糖百分比为30％、26％、22％、18％、14％和10％的溶液。用DEPC清洗体积为4ml的聚苯乙烯试管，并彻底漂洗，因为这种试管是不能进行高压灭菌的。将所述试管放入超速离心机转子TST60(Solvay)上的吊桶中。首先用650μl 30％的蔗糖混合物填充不含RNase的离心管-确认所有液体都装在所述试管的底部-并在-70℃下静置20分钟。在冷冻以后，加入650μl 26％的溶液，并用相同方法再次冷冻。用22％、18％和14％的蔗糖混合物重复以上过程。最后将蔗糖梯度储存在4℃下，并在使用之前在上面覆盖650μl 10％的蔗糖溶液。

    通过在4℃下温育至少12-14小时制成连续的梯度。在65℃下将mRNA(以1μg／μl的最终浓度溶解)变性5分钟，并在冰上冷却。将50μl mRNA溶液小心加在蔗糖梯度的顶部，并在TST60转子(Solvay)中以34，000rpm的速度离心该梯度15小时。用移液管从顶部取400μl组分，并转移到放在冰上的微量离心管中。为了除去蔗糖，通过乙醇沉淀纯化RNA：加入1／10体积的乙酸钠(3M)和2．5倍体积的乙醇，并在-20℃下温育该混合物过夜，在台式微量离心机上以最大速度离心15分钟，用70％的冰镇乙醇洗涤，在冰上干燥并溶解在水中。例7互补DNA表达文库制备

    用Gibco BRL Superscript质粒系统制备cDNA文库(其概述参见图4A)。双链cDNA合成

    用mRNA(1-5μg)作为模板制备第一股cDNA链。用于该反应的引物是NotI引物-含有15dT残基的接头。混合引物(1μg)和mRNA，并加热到70℃保持10分钟，在冰上快速冷却。加入缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8．3)，75mM氯化钾，3mM氯化镁，10mM DTT)和dNTP混合物(终浓度为0．5mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，逆转录酶SuperscriptIIRT(200-1000单位，取决于RNA的量)同时加入，并用0．05μCi的[-32P]dCTP作为标记在该过程中对cDNA进行示踪。该反应混合物在37℃下温育1小时。第二股链的合成是用大肠杆菌DNA聚合酶I和大肠杆菌RNaseH和DNA连接酶同时催化的。该反应的最终组合物为20μl第一股链反应混合物加上25mM Tris-HCl(pH7．5)，100mM氯化钾，5mM氯化镁，10mM硫酸铵，0．15mM NAD+，dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)各250μM，1．2mM DTT，65U／ml DNA连接酶，250 U／ml DNA聚合酶I，13 U／ml RNaseH，最终体积为150μl。在16℃下温育该混合物2小时。然后加入聚合酶4在相同温度下再温育5分钟。此时，用10μl 0．5M EDTA提取，并用150μl苯酚和氯仿(50／50v／v)溶液提取。加入70μl 7．5M乙酸铵和0．5ml预冷却(-20℃)的乙醇到水溶液中使cDNA沉淀，并离心该混合物20分钟。在70％的乙醇中洗涤沉淀，离心2分钟，最后在蒸发掉剩余的乙醇之后，溶解在25μl水中。通过平端连接将接头加到双链cDNA上，反应混合物中含有50mM Tris-HCl(pH7．6)，10mM氯化钾，1mM ATP，5％(w／v)PEG8000，1 mM DTT，200μg／ml SalI接头和100U／ml T4 DNA连接酶。所述接头的自由末端包括4个碱基的5’延长，相当于由SalI限制性内切酶产生的末端。在用NotI(50mM Tris-HCl(pH8．0)，10mM氯化镁，100mM氯化钠，和1200U／ml NotI)消化之后，按上述方法通过苯酚氯仿提取和乙醇沉淀纯化DNA。插入片段的柱纯化

    将DNA溶解在100μl TEN缓冲液中：10mM Tris-HCl(pH7．5)，0．1mM EDTA，25mM氯化钠。将预先调整的柱安装在分离cDNA的系统上。首先用0．8ml TEN缓冲液洗涤所述柱4次进行制备。让cDNA和另外的100μl TEN缓冲液流过该柱。加入剩余的100μl TEN缓冲液，并将单一的洗脱液(大约35μl)收集在独立的微量离心管中，该收集过程持续到另外3个100μl TEN试样。通过在闪烁记数器上检测放射性标记检测DNA的组分，取所述组分的3μl样品在凝胶上电泳，以确定其大小。所得组分的双链cDNA能产生与原始mRNA大小一致的宽的带。插入片段的连接

    将所述cDNA连接到用NotI-SalI线性化的pSPORT1表达载体上(参见下文和图4B)。连接混合物包括50 mM Tris-HCl(pH7．6)，10mM氯化镁，1mM ATP，5％(w／v)PEG8000，1mM DTT，2．5μg／ml质粒pSPORT1，NotI-SalI-酶，0．5μg／ml cDNA和50U／ml T4 DNA连接酶。将该混合物加入cDNA中。在室温下温育连接混合物3小时。为了通过电穿孔将DNA导入细菌细胞，必须通过用乙醇沉淀将连接混合物脱盐。向20μl连接混合物中加入5μl酵母tRNA(1μg／ml)，12．5μl乙酸铵(7．5M)，和70μl无水乙醇(-20℃)。到所述混合物进行涡旋搅拌，并马上以14，000g的速度离心2分钟。弃上清液，并在37℃下干燥沉淀10分钟。将cDNA溶解在6μl水中，并进行4次电穿孔反应。每一次将1．5μl的连接混合物加入40μl的电穿孔细胞中(ElectroMAX DH10B细胞，BRL)，在冰上温育1-3分钟，并转移到电穿孔样品池(BioRad)中。电穿孔是用为200的脉冲控制器(BioRad)和设定为25μF和2．5V的基因脉冲器(BioRad)进行的。加入1ml SOC培养基，并在37℃下培养所述细胞1小时。将所述文库的一部分铺平板到含有LB amp(氨苄青霉素)的培养皿(2000个转化体的10倍)上，所述文库的其余部分保存在液体LB或SOC培养基中，在-70℃下作为40％(v／v)甘油母液保存。

    为了测定自身连接的百分比，将一部分转化体铺平板到含有Lbamp的平板上，该平板含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基N-乙酰-D-半乳糖酰胺40μg／5ml，Sigma)和IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，40μg／5ml，Sigma)在37℃下温育过夜，含有重组克隆的菌落由于质粒中所含的半乳糖苷酶基因的失活而呈白色(参见下一段)。含有再环化载体的菌落是兰色的。PSPORT1载体的特征

    PSPORT1载体(图4B)包括4109个碱基对，并包括位于多克隆位点(MCS)一端的lacP启动子。其它的lac操纵因子(lacO和-lacZ基因(lacZ’)的因子)为MCS中断。该载体的特征还在于具有一个lacI抑制基因，因此所述启动子对cDNA插入片段的转录受到有效抑制，除非加入1mM IPTG到生长培养基中。除非特别需要表达，文库不在诱导条件下铺平板。可以用SP6和T7 RNA聚合酶启动子体外合成RNA，使用纯化的质粒DNA和SP6或T7 RNA聚合酶。所述启动子彼此相反，并抑制MCS，以便每一股cDNA链可以拷贝成cRNA(参见下面的体外转录段落)。将所述质粒上的f1基因间片段(IG)用于合成单链形式的质粒。复制的质粒起始位点(ori)属于colE1家族。所述载体含有一个氨苄青霉素抗性基因，以便筛选含有pSPORT1的菌株。例8 DNA和RNA操作和体外转录质粒制备和DNA消化

    源于大肠杆菌菌落的质粒DNA是用购自Quiagen的Quiaprep spin质粒试剂盒制备的，该试剂盒含有所需要的柱和缓冲液。通过在台式BR401离心机(Denley)上以4500g的速度离心10分钟使来自过夜LB培养物的5ml制备细菌或直接从含有LB的琼脂平板上收集的细胞沉淀。将细菌沉淀物溶解在250μl缓冲液P1和100μg／ml RNase中，然后加入250μl缓冲液P2，混合该溶液然后添加350μl N3。以10000g(13000rpm，在台式离心机上)的速度离心该混合物10分钟。将上清液倾倒到Qiaprep柱上，并以相同的速度离心1分钟。用750μl缓冲液PE洗涤该柱，并再次离心1分钟。为了稀释DNA，将50μl Tris-HCl(10mM，pH=8．5)加至所述柱上，并在室温下温育1分钟，然后按上述方法离心1分钟，将洗脱液收集到新的试管中。在-20℃下保存DNA。

    为了对DNA进行限制性消化和修饰，使用购自新英格兰生物实验室的NEB酶系统。使用由该公司提供的所有NEB缓冲液和反应条件。

    用DNA琼脂糖凝胶电泳分离并分析一部分DNA。将0．8-1％的琼脂糖溶解在1×TAE(40mM Tris-HCl乙酸，1mM EDTA中。将购自BioRad的凝胶系统和电源(1000／500型)用于电泳。将样品加样到1×加样缓冲液(10×加样缓冲液母液：0．4％溴酚兰，0．4％二甲苯青FF，25％Ficoll，400型)中。一旦电泳，将所述凝胶放在0．5-1％溴化乙锭溶液中染色30分钟，用水清洗，并在紫外线透射仪上观察DNA。作为标准物，使用GibcoBRL的1KB DNA梯。通过与在相同凝胶上电泳的该标准物比较估计DNA的大小和浓度。

    消化之后的DNA纯化是通过苯酚氯仿(50／50，v／v)提取接着进行沉淀而完成的。因此，将1／10乙酸钠(3M)和二倍体积的预冷却的乙醇加入并将该混合物放在-20℃下冷却至少15分钟，然后通过在可能达到的最大速度下离心使DNA沉淀。在用70％的乙醇洗涤之后，让DNA沉淀物干燥，并溶解在适量的水中。体外转录

    体外转录反应是用Boehringer Mannheim的T7 Cap-Scribe包进行的，该试剂包包括T7 RNA聚合酶和10倍浓度的缓冲液。该缓冲液含有优化浓度的核糖核苷三磷酸和帽-核苷酸mGpppG，由它确保合成加帽的mRNA。

    所述反应是用0．5μg线性化DNA作为模板进行的，并且与1×的缓冲液和40单位的T7聚合酶在37℃下温育1小时。在该反应之后用1单位的不含RNase的DNase(Promega)进行DNase处理15分钟。用0．5μg DNA模板通常能得到10μg cRNA。RNA凝胶电泳

    将1．2克琼脂糖放入80ml水中，在微波炉中熔化，并冷却到65℃。加入10ml 10×MOPS缓冲母液(10×MOPS缓冲液，0．4M MOPS，6mM EDTA(pH8)，50mM乙酸钠，最终pH7)，并加入17．5ml甲醛。充分混合该混合物，并注入凝胶成型装置(BioRad)中，冷却使琼脂糖聚合并形成凝胶。RNA样品的加样混合物包括100μl 10×MOPS，350μl甲醛，1ml甲酰胺，200μl加样染料(50mg溴酚兰和5克Sicoll，在20ml水中混合)。将RNA样品溶解在1-8μl的体积中，与16．5μl的加样混合物和2μl EtBr混合(0．5mg／ml)，并加热到65℃保持10分钟，然后在冰上冷却，并加样到所述凝胶上，让所述凝胶在1×MOPS缓冲液中以100-150V的电压电泳4-5小时。在紫外线透射仪上观察RNA。通过与0．24-9．5KB RNA梯(Gibco BRL)比较估计RNA片段的大小。例9通过大小分离富集决定转录物的RNA

    为了减少转录物的数量，在连续的蔗糖梯度上根据大小将总的烟草叶片mRNA分离成不同部分。将ABA反应样品的100μg变性mRNA加样到两种梯度中，并离心15小时。从位于所述梯度顶部的含有最小片段的部分开始收集10个组分，每个组分有大约10μg RNA。用含有甲醛的琼脂糖凝胶分析每个组分的1／10的样品，用溴化乙锭染色以便观察RNA(图18)。根据凝胶上的DNA条带可以清楚地看出通过大小进行的分离，所述条带的大小随着不同的组分而增加。所述组分的RNA浓度通过斑点试验测定，参见例1，并在通过苯酚／氯仿纯化和乙醇沉淀之后将每一个组分调整到最终浓度为1μg／μl。

    我们认为1-3号组分含有的RNA太小，以至于不能编码受体类型的蛋白，而10号组分不含有可以注射的足够数量的RNA。将4-9号组分注入爪蟾卵母细胞中(每个卵母细胞大约±50ng)。在蛋白合成2天之后检测所述卵母细胞对ABA的敏感性。按第三章所披露的方法对总mRNA进行电压控制测定。用来自4、5、7、8和9号组分的mRNA注射的卵母细胞不能针对ABA产生可检测的电流变化(每个组分平均3个或3个以上卵母细胞，表2)。表达6号组分的转录物的卵母细胞在添加ABA时5个细胞中的3个表现出独特的信号。在对所述膜去极化，使控制电势从-120mV变成高于-10mV的电压时检测到向外调整电流的升高，并在施加ABA之后在几分钟(5分钟)之内电流减弱到原始电流水平。用6号组分的mRNA注射的卵母细胞的瞬时ABA反应类似于在总mRNA注射的卵母细胞上记录到的Ca2+依赖型向外Cl-通道(参见段落3．4．2)。

    在图19中示出了每一个注射组分在+60mV电压下诱导ABA电流的平均值。在+60mV的电压测试脉冲结束时记录在ABA处理期间检测到的稳态电流，并通过扣除在添加ABA之前记录到的在相同控制电压下稳态电流进行调整。在注射来自6号组分的RNA的3个阳性细胞中检测到针对ABA的显著的电流强度的增加。通过比较，其它蔗糖梯度组分的诱导电流平均值在0左右波动。阴性组分的平均值是用所有测定的细胞计算的(4号组分，n=6；5、7和9号组分，n=4；和8号组分，n=3)。

    能产生所述阳性ABA信号的mRNA组分在琼脂糖凝胶上的堆积带为1．5-2kb(图18)，并且将它用于进一步的克隆和同胞选择。例10 cDNA文库克隆

    将能在卵母细胞中引起ABA反应的6号mRNA组分用作模板，构建cDNA表达文库。采用用于cDNA合成和质粒克隆的BRL Superscript质粒系统(其略图参见图4)。在制备cDNA第一股链的反应中使用4μgmRNA。用于该反应的引物-接头包括15dT残基，它可以与mRNA的poly(A)+尾杂交，并结合到NotI限制性识别位点上。所述反应是用逆转录酶(Superscript II RT)进行的，该酶是Moloney鼠白血病病毒(MMLV)的衍生物，并缺乏RNaseH活性，以便提高完整长度cDNA的产量。

    用第一股cDNA链作为模板再生mRNA的一级序列，作为第二股DNA链。该系统使用缺口翻译取代mRNA合成第二股cDNA。第二股链的合成是由大肠杆菌DNA聚合酶I与大肠杆菌RNaseH组合催化的，以便在mRNA和DNA连接酶上形成缺口。业已证实该组合能够改善由较长的mRNA(±2kb)(Gibco BRL)合成的双链cDNA的克隆。用T4聚合酶处理第二股链合成的产物，以确保所述cDNA链含有平端。

    克隆的定向是通过在cDNA的末端引入不对称性而获得的，通常通过在所述末端引入两个不同的限制性内切酶位点(图4)。为了提高所述载体的连接效率，通过在所述插入片段上添加接头将所述cDNA的平端转化成含有5’延长的末端。所使用的接头是短的双链寡聚体，具有一个平的末端，并在另一个末端具有4-碱，5’延长，相当于通过SalI限制性内切酶产生的末端。所述接头的平端连接是由于接头的过量而启动的。实现定向克隆所需要的不对称性因子是在第一股cDNA链合成期间通过引物-接头导入cDNA的NotI限制位点。在连接SalI接头之后，用NotI消化DNA。所得到的cDNA的NotI末端相当于mRNA的3’末端，而另一个末端SalI相当于mRNA的5’末端。

    在实际连接到所述载体上之前，根据大小在与试剂盒一起提供的柱上分离cDNA。这样做是重要的，因为存在以大的摩尔比超出的残余接头，并可能通过连接于预先消化的载体的SalI末端上而妨碍载体接到cDNA。另外，通过NotI消化从所述cDNA上释放的片段在其一端具有SalI末端，而在其另一端具有NotI末端，并有可能用表现为‘空的’克隆污染所述克隆，这会增加筛选的负担。大小分离还有可能减少含有完整的cDNA的较小插入片段在所述文库中占主要地位的倾向。

    最后，将柱纯化的大小合适的13ng的cDNA(在琼脂糖凝胶上证实为1．3-3kb)连接到50ng预先消化(NotI-SalI)的pSPORT1表达载体上，以便所述基因被克隆在T7 RNA聚合酶启动子的下游。所述菌株的转化是通过用购自BRL的ElectroMAX DH10D细胞通过电穿孔完成的。一共获得了4×105个克隆，其中有10％是自身连接的。为了储存，将所述转化体稀释在液体LB培养基(1×104细胞／毫升LB)，使甘油的最终浓度为40％，并在-70℃下保存。例11同胞选择20000个集落，所述文库的代表

    将大约20000个集落均匀分散在装有含氨苄青霉素的LB培养基的10 LB培养皿上进行生长，以便筛选pSPORT1转化的集落。用消毒的滤纸将具有2000集落的每一个平板复制两个到其它的平板上。同胞选择如表2所示。用玻璃移液管将一个拷贝的细菌菌落划线到培养基上，并将每一个平板分别溶解在10毫升水中，并将所述文库编号为1-10。通过在台式离心机BR401(Denley)上以4500g的速度离心10分钟收集细胞。制备质粒DNA，并通过NotI限制性消化线性化。在体外转录之后分3次收集cRNA，其中两份含有大约6000个转录物(文库1+2+3和文库4+5+6)，而第三个文库含有大约8000个菌落(文库7+8+9+10)。作为对照，在图11中示出了来自1号文库的含有2000个克隆的cRNA的代表。

    将以上三种文库注射到爪蟾卵母细胞中，并在表达两天之后进行电压控制方案，并检测对ABA的反应。电压控制方案是标准的，并在整个同胞选择过程中使用。在设定脉冲之前将Cl-通道活性设定为最低基线的调节电势设定为-120mV，8个测试脉冲在-180mV到+60mV之间，随后是--120mV的后脉冲电压。示出了具有6000个克隆的文库(1+2+3)，在添加外部ABA时4个测试细胞中两个有反应。当膜电压被控制在从-120mV的控制电势到+60mV的脉冲时，在有ABA的条件下产生时间决定型电流。不过，瞬时ABA诱导的电流强度是很小的，在100nA范围内(参见表2)。对于第一个近似值来说，所述电流与所披露的mRNA注射的卵母细胞的Cl-电流吻合。

    相反，用来自其它文库，文库6000(4+5+6)和文库8000(7+8+9+10)的cRNA注射卵母细胞在添加ABA时不会出现控制电流的任何变化(试验的细胞数：n=4／文库)(参见表2)。将所述20000文库代表细分成2000和200个组分

    通过缩小单一转录物的文库分离控制ABA敏感性的克隆。将2000个集落的3个文库(1、2和3)的cRNA(是6000个克隆的活性文库的部分(1+2+3))分别注射到卵母细胞中。ABA试验在2000个克隆的文库中的一个(1号文库)中产生信号。在使用标准电压控制方案时，用1号文库注射的卵母细胞在高的正电压(+60mV)下表现出ABA引起的电流增加，大约为20-50nA(表2，图20)。检验了3个细胞，所有3个细胞都表现出ABA诱导的电流，这表明了所述小的但明显的信号的高度再现性。当2号和3号文库在卵母细胞中表达时，不会产生针对ABA的信号(2号文库，n=5；3号文库，n=6)。

    另一个同胞选择步骤是通过将有活性的包括2000个克隆的文库分成具有大约200-250个克隆的8个文库。这一目的是通过将含有1号文库的2000个克隆的复制LB平板的培养基切成8块而完成的。将每一块培养基上的克隆刮去，并溶解在10毫升水中。制备DNA，并用NotI限制酶使其线性化，并在体外合成cRNA，再将其注射到卵母细胞中，一个具有200个克隆的文库表现出对ABA的反应信号，不过这在某些批次的卵母细胞中是不固定的：在一种情况下从5个细胞中得到一个阳性细胞，而在另一批卵母细胞中从3个细胞中获得一个阳性细胞。不过，该文库在第三批卵母细胞中在所试验过的5个细胞中有3个表现出非常有说服力的由于ABA的作用而使得瞬时电流量增加。在采用标准电压控制方案期间，当控制膜使前脉冲的-120mV改变到+60mV时，ABA诱导的电流强度为300nA。与以前用cRNA注射的卵母细胞相比，由ABA引起的电流强度的增加至少增加了两倍(图20，图21)。因此，有理由认为获得了卵母细胞中功能性ABA信号途径所必需的转录物的富集。源于所述阳性2000文库的所有其它7个小的文库都是阴性的(表2，每个文库试验了3到4个细胞)。

    在继续进行之前，重复这一阶段的测定，以避免由于不同批次的卵母细胞差别所产生的问题。将所有阳性文库分别注射到同一批次的卵母细胞中。这里所进行的ABA试验证实，在整个同胞选择过程中，瞬时向外的电流是小的，但对于阳性选择的文库来说是显著的(图20)。表2归纳了所测试的细胞。在具有20000个克隆的文库中得到2个阳性细胞，测定这2个细胞所得到的平均诱导电流为150nA；在具有2000个克隆的文库中从3个注射的卵母细胞产生一个ABA反应细胞，所产生的诱导电流为150nA。200个克隆的文库在4个卵母细胞中产生2个阳性细胞，所产生的诱导电流为200nA。源于原始cDNA文库的另一个具有6×104个转录物的文库对ABA没有反应。证实了所述信号对这种特定转录物的专一性(n=3)。20种困难的生长候选物

    挑取(用无菌牙签)活性200文库的单个菌落，并复制到新的LB培养皿上。分别操作3次，以便细分并测定阳性ABA反应。最初，在具有50个转录物的4个子文库中在注射之后没有一个能产生对ABA的反应。只是在做第三次尝试时，当收集到20个克隆特定小组并且当其cRNA在卵母细胞中表达时，才回收到所述信号(图20和表2)。将该文库与在复制之后生长缓慢的所有大肠杆菌转化体合并。

    用所述20文库注射2个独立批次的卵母细胞，并且在一批卵母细胞中5个细胞中有4个，而在另一批细胞中2个细胞中有1个表现出阳性ABA反应。不过，当用3个其它的200-文库-衍生的子文库(n=3-4／60个克隆的文库)注射时，添加ABA卵母细胞没有反应。与以前注射2000或20000转录物的卵母细胞中检测到的ABA信号相比，所述20文库的ABA诱导电流的强度也有所增强。在一个细胞中，在60mV电压下，ABA引起的电流达到500nA，表明信号的增强幅度超过了用阳性200文库的cRNA注射的卵母细胞(图20，表2)。在20文库中ABA测定的平均幅度(270nA)超过200文库的幅度(140nA)。作为候选物的可能性越小，导电性越大

    计算在每一个文库(20000-6000-2000-200-20)中ABA在卵母细胞中能诱导阳性反应的细胞的弦导电性(g)。所述弦导电性表示代入Cl-Ecl平衡电势和在+60mV下ABA诱导电流的曲线的斜率。所述诱导电流是由ABA诱导的电流减去在添加ABA之前存在于卵母细胞中的背景电流而得到的。将所述弦导电性的平均值±SE对在所述代表性文库中的转录物的量进行半对数规模的作图。所述曲线的发展表现出在ABA反应中导电性随着所述文库中不相同的转录物的数量而呈反比例增加。这表明ABA感受信使的增加。表2注射卵母细胞一揽，在所述克隆方法和同胞选择期间检测向外电流的ABA瞬时增加。最有希望的文库是阳性的，并用于进一步的同胞选择。文库号转录物数爪蟾号日期IABAa(nA)Posbnb1阳性文库6000130-4／1-5-9550，100242阴性文库6000130-4／1-5-950043阴性文库8000515／17-5-950041阴性文库2000515／17-5-950052阴性文库2000515／17-5-950063阳性文库2000515／17-5-9530，40221阳性文库200612／13-6-95100151阳性文库200520／22-12-95250，200，150，120451阳性文库200527／28-2-96100132阴性文库250612／13-6-950043阴性文库250612／13-6-950044阴性文库250612／13-6-950035阴性文库250612／13-6-950046阴性文库250612／13-6-950037阴性文库250612／13-6-950038阴性文库250612／13-6-95004阴性文库6×528／30-8-95003104528／30-8-95100，20223阳性文库20000528／30-8-95150131阳性文库2000528／30-8-95100，10024阳性文库2001阳性文库20612／14-3-96500，300，150，150451阳性文库2073／4-6-96250132阴性文库60612／14-3-960033阴性文库60612／14-3-960044阴性文库60612／14-3-96003a：IABA是在每一个细胞上分别测定的在+60mV下的ABA诱导电流B：在通过电压控制测试的注射细胞的总数量中对ABA有反应的卵母细胞的数量(Pos)。

    下面所使用的涉及DNA和RNA操作以及在爪蟾卵母细胞中进行表达分析的方法是按上文所述方法进行。例12 DNA测序

    为了进行DNA测序，使用ABI PRISMTM310遗传学分析仪(应用生物系统，Perkin Elmer，Foster市，CA)。采用‘染料终止子’方法，该方法使用了用萤光素标记物标记过的ddNTP’s(双脱氧-核糖-核苷三磷酸)。ddNTP’s能防止DNA聚合酶延长DNA的复制。以正确比例使用ddNTP’s和正常的dNTP’s，以便其插入模板DNA拷贝的随机位点上，并得到不同长度的DNA链。每一个DNA链的末端由一个萤光ddNTP标记。将所述反应物加样到由2微升凝胶装在毛细管(直径75微米)中构成的柱上。通过激光束检测ddNTP’s，并在不同波长下读每一种ddNTP(ddATP、ddNCTP’s、ddGTP’s、或ddTTP’s)。

    模板DNA是用购自Quiagen的Qiaprep spin质粒试剂盒制备的质粒DNA。为了制备所述样品，用Taq聚合酶进行PCR反应。所述反应混合物含有4．0微升终止子反应混合物，0．5微克模板双链质粒DNA，3．0pmol引物，并添加水使总体积为10微升。在下列条件下在Gene AmpPCR系统2400(Perkin Elmer，Foster市，CA)上扩增所述模板。1．快速加热到96℃。2．在96℃下保持10秒。3．快速调整温度到50℃。4．在50℃下保持5秒。5．快速调整温度到60℃。6．在60℃下保持2分钟。7．重复1-6 25轮次。8．快速调整温度到4℃。

    纯化所述反应混合物，然后上柱。为了除去所有多余的标记物，纯化是必要的。每一个试管装有10微升乙酸钠(3M)和80微升水。将所述溶液转移到装有250微升95％的乙醇的0．5毫升的微量离心管中。将该溶液放置在冰上保持10分钟，然后在实验室台式微量离心机上以最大速度离心20分钟。小心除去所有乙醇，并用250微升乙醇(70％)漂洗沉淀物。再次将所有乙醇除去。通过重复涡旋搅拌所述试管将沉淀物重新悬浮在12．5微升模板抑制剂(Perkin Elmer，Foster市，CA)中，在95℃下加热该反应混合物2分钟，并再次涡旋搅拌。将所述溶液进行简单地离心沉淀，然后即可将所述试管中的反应物加样到所述遗传学分析仪的柱上。引物

    T7引物是二十聚体：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

    M13(f)序列引物(十七聚体)：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’例13测序分析

    将购自DNA*(Madison，美国)的Lasergene软件与ABIView V1．0(Perkin Elmer，Foster市，CA，David H．Klatte版权，1996)用于分析序列。ABIView是一种程序，它可以展示直接从所述遗传学分析仪上记录的序列的未编辑的痕迹。将平面序列拷贝到Lasergene的子程序EDITSEQ中，在这里对序列进行编辑和翻译。一旦所述序列被保存为EDITSEQ文件，就可以进入Lasergene的所有下列子程序。将SEQMAN用于从重叠序列产生重叠群。将MAPDRAW用于测定开放读框，并确认限制性内切酶位点。将MEGALLIGN用于在核苷酸和氨基酸水平上与不同的已知序列进行比较，并计算它们之间的相似性百分比。相似性是根据相同的氨基酸数量在两个蛋白序列的总长度所占比例计算出来的。用PROTEAN在结构水平上分析预测的蛋白序列，包括疏水性曲线，并在测序水平上包括鉴定可能的保守功能域。

    序列同源性检索是用由NCBI(国家生物技术信息中心，http：：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／)提供的BLAST序列相似性服务器完成的。例14在20个克隆的文库中ABA信号丧失

    从所有20个单一菌落中制备质粒DNA。通过将等量的DNA收集在一起形成各有4个克隆的5个文库，并在体外合成cRNA。将cRNA样品注射到卵母细胞中。在表达之后，按上述方法测定卵母细胞对ABA的反应。在所述5个文库中的4个的总共9个细胞中没有发现明显的ABA反应。有一个文库在该文库的试验过的3个细胞中有2个表现出与向外调整的电流(低于50nA)的波动相关，但ABA专一性不确切。为了检验所述电流的显著性，将所述最后一个文库克隆的4个单一的cRNA注射到卵母细胞中。同样未检测到ABA反应(n=每个克隆2个细胞)。不过，所述cRNA样品之一产生显著的电流，尽管该电流不取决于ABA。例16综合所述克隆不能恢复所述信号

    以1(smG-Nt)∶1(cal-Nt)∶0．1(syr)的相对浓度比在卵母细胞中表达smG-Nt(小的G-蛋白-样)和cal-Nt(钙视网膜蛋白-样)与syr突触融合蛋白样克隆的cRNA组合物。检测到与所述突触融合蛋白样克隆相关的某些电流波动，但未记录到对ABA的可检测的反应。用不同批次的卵母细胞重复以上过程两次，ntotal=7。另外，当以(1(2)∶1(8)∶1(12)∶0．1(syr))的比例在卵母细胞中共表达2号、8号和12号克隆的三种未知膜蛋白和突触融合蛋白样蛋白时，没有记录到ABA信号。另外进行了两次所述测定，ntotal=4。

    在本章中与电生理学记录和DNA测序相关的所有试验方法均如上文所述。例17亚克隆连接

    使用上述DNA操作，在琼脂糖凝胶上电泳，然后用购自Boehringermannheim的‘琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒’纯化所述片段和载体，该试剂盒使用了特殊处理过的能结合核酸的硅基质，洗去污染物，最后获得由50微升10mM Tris-HCl(pH8)溶液洗脱的DNA。用T4 DNA连接酶(Boehringer mannheim)将DNA片段连接到质粒上。连接缓冲液含有50mM Tris-HCl(pH7．5)，10mM氯化镁，10mM DTT，1mM ATP和25μg／ml BSA。将含有5×摩尔数的插入片段和载体的反应物在17℃下温育过夜。转化

    将所述连接混合物转化到大肠杆菌电感受态细胞中。所述电感受态细胞是由大肠杆菌菌株DH12S制备的。挑取一个菌落并在37℃下在10mlSOB-Mg培养过夜。用所述过夜培养物接种500ml SOB-Mg，并在37℃下生长细菌，直到OD550达到0．75。在GSA转子离心机(SORVAL)上以4000g的速度离心使细胞沉淀。在400ml冰镇10％甘油中洗涤沉淀物两次，并重新悬浮在2ml 10％甘油中。在液氮中快速冷却所述试管，然后以100微升的体积将高度浓缩的溶液在-70℃下保存在微量离心管中。

    为了在大肠杆菌中进行电穿孔，必须将所述连接混合物脱盐。用0．7ml的管制备一个小的柱，在其底部开孔。在所述管的底部填充玻璃球(用水平衡)，并在该管的其余部分填充Sepharose CL6B(用水平衡)。将所述管放入无底1．5ml微量离心管中，以700g的速度离心2分钟，(2000K，在台式离心机Denley BR401上，放置在10ml支撑管中。用一个新管取代所述无底管，并将连接混合物小心加样到Sepharose的顶部。按上述方法离心所述管2分钟。洗脱液中含有纯化的DNA。

    将所述连接混合物一半的体积加入40微升电感受态大肠杆菌细胞中，在冰上温育1-3分钟，并转移到一个电穿孔样品池中(BioRad)。电穿孔是用为200的脉冲控制器(BioRad)和设定为25μF和2．5V的基因脉冲器(BioRad)进行的。加入1ml SOC培养基，并在37℃下培养所述细胞1小时。将所述悬浮液铺平板到含有合适抗生素的LB培养基上。对于pBLUESCRIPT载体来说，自身连接的检验是通过将转化体铺平板到LB培养基上进行的，该培养基含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基N-乙酰-D-半乳糖酰胺40μg／5ml，Sigma)和IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，40μg／5ml，Sigma)。在37℃下培养过夜，然后含有重组克隆的菌落由于质粒中所含的半乳糖苷酶基因的失活而呈白色。含有再环化载体的菌落是兰色的。载体和引物所使用的结构载体特征参考pBluescr SK(+)，ampr，colE1复制起点，f1(+)Stratagene ipts在pSPORT1(NotI-SalI)中文库克隆本研究psyr psyr BglII-BamHI本研究psyrbb psyr SacI-EcoRI本研究psyrse将psyr的BhlII-SacI片段克隆到本研究psyr2 pBluescript引物特征参考M13(f)5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’StratageneM13(r)5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’Stratagene例18对爪蟾卵母细胞进行第二次筛选

    如上文所述，一个单一的克隆psyr当其蛋白表达到卵母细胞中会产生电流。该psyr电流与当注射烟草叶片的mRNA或阳性20文库的cRNA时观察到的电流的一个重要区别是在正常Ringer溶液中ABA存在的独立性。用两个微电极刺穿注射了50ng cRNA并表达SYR蛋白的卵母细胞。以大约5分钟的间隔记录电压控制循环。电压控制方案包括前脉冲和后脉冲的-120mV的电势500ms，和8个1500ms的测试脉冲，其范围为-160mV到+60mV。在缓慢穿刺之后，当将所述膜控制在高于-50mV的电压时，记录到向外调整电流。在所述第一个电压控制周期中测定的电流是最低的，不过在随后的电压控制循环中所记录到的电流随着时间而加强。所述向外调整电流的加强在将膜控制在+60mV时观察得最清楚，并且在所有测试的细胞中都记录到该电流(n=10，使用3个不同批次的卵母细胞)。在图22中示出了在穿刺之后一个卵母细胞在+60mV下电流随时间的变化。电流的增加表现出平均为20分钟的估计1／2时间，并且所记录的最大值为3μA。所述电流似乎存在两个分量，一个为时间依赖型(在+60mV下t1／2大约为200ms)，和一个瞬时分量。这两个分量在穿刺以后随时间而加强。

    ABA依赖性是明确的，因为所述电流是波动的，并且有时该电流能稳定几分钟，然后再次开始加强。因此，不可能得出所述电流是ABA依赖型的结论。为了避免这一问题，对syr cRNA进行稀释，并注射到卵母细胞中。将所述cRNA(1μg／μl)稀释10倍，以大约5ng的量注射到卵母细胞中。所述卵母细胞的电压控制分析表明，仍然出现与注射50ng的量时的相同的电流，但向外调整电流的增加变慢(再也测定不到t1／2，因为当该试验结束时电流仍在加强)，在+60mV下记录到的最大值为1．5μA(ntotal=4)。电流的波动仍然太大，以至于不能记录到有关ABA依赖性的结论性数据。同样注射进一步稀释(1／100)的syr cRNA(大约0．5ng)，但同样可以观察到所述电流，不过在+60mV下的最大值不超过1μA(ntotal=5)。未检测到ABA依赖性。

    为了研究SYR蛋白是否与所述20文库的其它蛋白相互作用，进行了若干共注射。两种组合如上文所述。一方面，共注射syr的cRNA(1／10)和smG-Nt和cal-Nt的cRNA，另一方面，将syr的cRNA(1／10)与三种未鉴定的蛋白组合。两种共表达试验都没有发现有关ABA依赖性的结论性数据，这主要是由于syr注射卵母细胞中通常见到的背景电流。最后一个组合是用源于最后的ABA反应型文库的所有20个候选物的子文库进行的。注射20个阳性克隆文库的5个子文库，各自与syr基因的cRNA组合。对每个子文库的至少3个细胞进行ABA依赖型信号检测，不过由SYR蛋白表达引起的波动同样使得其结论不明确。例18电流特征表明在SYR表达卵母细胞中激活了内源K+通道。

    为了揭示当卵母细胞表达SYR蛋白时出现的电流加强的性质，使用了两种不同方法。首先分析改变外部离子浓度所导致的平衡电势变化，另外用毒素抑制特异的离子通道。反向电势和对外部K+浓度的敏感性

    第一种方法表示电流和反向电势对外部离子浓度改变的依赖性。用两个电极对表达SYR蛋白的卵母细胞进行穿刺，同时其腔室中填充有正常Ringer缓冲液。在穿刺之后30分钟，所述电流变得更加稳定，而且电流的波动变得更小。此时，采用标准的电压控制循环(前脉冲和后脉冲电势为-120mV，1秒，8个测试脉冲为-160mV到+60mV，3秒)。图23A表示在[K+]o为2．5mM的正常Ringer缓冲液中进行的标准电压控制循环时的电流轨迹。然后将所述水浴溶液中[K]o提高10倍达到25mM。在图23A中还示出了根据标准电压控制方案的电流轨迹。所述电流对外部[K+]的敏感。时间决定型电流的变化不明显，但瞬时分量显著增加，在+60mV下超过两倍。当显示总的稳态电流的Iv-曲线时这一结果最为清楚(图23B)。所述电流增加是可逆的。当水浴溶液被改变成正常Ringer时，电流减弱到原始水平。

    为了确认携带所述电流的离子，对所述反向电势进行试验测定，并与理论计算的K+的平衡电势进行比较。用Nernst方程(公式3．1)确定的卵母细胞在正常Ringer溶液中的K+的平衡电势为-95mV。当外部水浴中K+的浓度为25mM时，Ek=-35mV。如图23B所示，当[K+]o从2．5mM改变成25mM时，出现了EK变化的最初迹象。在固定电压下通过代表性电流值的代入IV-曲线与平衡电势下的X-轴相交。在正常Ringer条件下的数据点的代入IV-曲线与大约-90mV的X-轴相交。在25mV K+中的数据点的代入曲线发生了偏移，因此与X轴线的相交位于大约-40mV处。以上值与在类似条件下计算的相应的Ek吻合。

    为了更精确地测定所述试验的反向电势，将表达SYR蛋白的卵母细胞控制在+50mV的前脉冲电压下1秒钟，以便激活所述电流。然后将所述膜逐渐调整到-160mV到+30mV的电压范围内。在正常Ringer条件(2．5mM K+)下，在+30mV到-65mV的电压下所述电流的释放呈负走向，而在从-97mV到-160mV的电压下的所述电流的释放(拖尾)呈正走向。所述电流在反向电势下改变方向(参见段落3．3．1)，测定该电势为-80mV到--97mV(图24)，与预测的Ek(-95mV)一致。在[K+]o为25mM的条件下重复相同的电压控制方案。在+30mV到-3mV的电压下所述电流为负走向，而在-65mV到-160mV的电压下所述电流为正走向。在-35mV的电压下，未观察到明确的放电，因此，所述反向电势被确定为大约-35mV(图24)，与预测的Ek的偏移一致(-35mV)。通过在卵母细胞中表达SYR蛋白所产生的电流主要是由K+携带的。例19抑制电流的毒素

    用于分析未知电流的方法之一采用了能抑制特异性取决于离子的电流的毒素，所述离子是携带电流的。所使用的电流及其有效浓度在表3中示出。

    表3通道抑制剂毒素专一性有效浓度来源TEA非常专一的K+通道抑制剂30mM Sigma Ba2+可能有副作用的K+通道抑制剂，因为它可能取代Ca2+1mM BaCl3；Sigma Niflumic阴离子通道抑制剂，很不专1mM Sigma acid一，可以部分抑制K+通道Ca2+(N型)通道抑制剂1 Alomone实验室ω-芋螺毒素(耶路撒冷，以色列)

    药理学资料支持以上发现，即在表达SYR的卵母细胞中检测到的电流主要是由K+携带的。将各自具有不同专一性的若干种毒素加入水浴中的Ringer溶液中，同时用上文所述的标准电压控制循环控制卵母细胞的膜。记录电流轨迹的改变，并在图25中示出。

    (1)首先将30mM的四乙铵(TEA)加入Ringer溶液中，仅仅改变Na+的浓度。TEA是一种毒素，它能特异性抑制K+通道。所述时间依赖型分量和瞬时分量都降低50％。TEA的作用是可逆的。

    (2)Ba2+也是一种典型的K+通道抑制剂，但它可能具有某种并发症，因为它还能通过取代Ca2+影响Ca2+通道的特征。Ba2+的作用会导致将瞬时分量转化成时间依赖型分量。当洗去Ba2+时，可以检测到完全恢复。以前业已披露了来自酿酒酵母(S．cereviciae)的K+通道TOK1的类似现象。当在爪蟾卵母细胞中表达时，TOK1电流显著向外调整，并且该电流包括两个动力学分量。当使用Ba2+时，瞬时分量受到抑制而时间依赖型分量得到加强。

    (3)所使用的另一种毒素是niflumic acid。这种毒素相当的不专一，它能抑制阴离子通道和K+通道。该毒素还能几乎100％的破坏在表达SYR的卵母细胞中检测到的电流。在将niflumic acid洗去之后，所述减弱可以完全恢复。

    (4)在该试验中所使用的最后一种毒素是ω-芋螺毒素，一种专一性Ca2+通道抑制剂。以前业已证实，哺乳动物细胞的突触融合蛋白与N型Ca2+通道相关。因此，我们检验了该电流是否能被典型的N-型Ca2+通道抑制剂破坏。不过，没有检测到其作用，所记录到的电流与Ca2+通道无关，这表明哺乳动物细胞的突触融合蛋白与烟草的SYR基因具有不同的调节。水注射的卵母细胞

    为了证实未注射的卵母细胞是否能够出现所述电流，在水浴中使用25mM的K+浓度。所产生的电流是瞬时的，未发现时间依赖型分量。该电流能被niflumic acid破坏。Ba2+具有上文所述的类似作用，能消除所述瞬时电流，并产生时间依赖型电流。TEA的作用不可见，因为电流太小。改变K的浓度和毒素的作用小但明显，这表明至少瞬时分量对卵母细胞来说是内源电流。另一方面，时间依赖型分量似乎对SYR注射的卵母细胞专一。这似乎表明，SYR蛋白通过与内源K+通道的结合不仅增强了所述电流的强度，而且改变其动力学。例20缺失

    为了避免ABA反应丧失问题，用另一种方法检验了SYR的作用。进行下面的缺失试验的目的是为了在从转录物的文库中消除SYR基因之后实现ABA反应的丧失，所述文库最初在卵母细胞中表达时能产生阳性ABA反应。通过混合18个克隆的质粒DNA重新构建20个克隆的最后一个文库(表1，省略10号和17号)。在另一种制备物中，混合17个克隆的DNA，除了syr基因之外，这些克隆是与以前相同的克隆。用分别被称为18+S和17-S的新构建的类型体外合成cRNA，并注射到卵母细胞中。在表达之后，进行电压控制分析，以便检测ABA反应。表达17-S的卵母细胞未表现电流或膜电压波动，无论在水浴溶液中有或没有ABA。表达18+S的卵母细胞不能像以前那样表现ABA引发的信号。再次出现了由SYR引起的电流波动，这一次比较微弱，并延续几分钟，并且在100％的细胞中都不能检测到，但仅在4个测定的细胞中的2个中检测到，4个细胞中的3个表现出对ABA的某种反应。该反应在电压控制循环期间在所述电流轨迹中不可见，但对自由流动的膜电势有弱的去极化作用。该去极化作用在0．5-2mV之间，该电势是小的，但它是可以再现的，并且对18+S文库专一。因此，SYR蛋白似乎是传递ABA信号所必需的。例21保卫细胞电压控制

    保卫细胞的电压控制技术的基础与爪蟾卵母细胞电压控制(见上文)的基础相同。下面将说明有关腔室和微电极方面的主要技术差别。将组织安装在专门设计的腔室上

    用于保卫细胞电压控制试验的植物是蚕豆或N．benthamiana。蚕豆的生长条件为18℃，并将其生长在蛭石上，给以12∶12的昼夜周期。N．benthamiana植物在20℃下生长给以12∶12小时的昼夜周期，该植物生长在塑料大棚里的土壤上，以便保持高湿度。

    用4-6周龄植物的幼小叶片制备表皮条。所述条取自叶片的远轴表面，并安装在所述腔室上，在腔室上涂有压敏型硅粘接剂(No．355医用粘接剂，Dow Corning，Midland，MI，美国)。让所述胶干燥大约15分钟，粘接所述表皮条，使外表面向下贴在所述腔室底部。所述腔室底部包括一片显微镜载玻片(大约0．5mm厚×7mm宽×40mm长)，具有两决不锈钢板连接在每一端。立即用溶解在5mM Ca2+MES中的0．1mM氯化钾覆盖所述条，并将一块盖玻片放在所述溶液的顶部，由所述两个钢板支撑。通过用巴斯德移液管将溶液吸到一个小点上实现溶液的流入和抽吸。所使用的标准溶液是5mM Ca2+MES和10mM氯化钾。通过穿越所述钢板之一的一个孔施加装在一个管中的琼脂(2％)盐(1M氯化钾)桥，并起着水浴电极的作用。所使用的显微镜是Zeiss IM倒置显微镜(Zeiss，Oberochen，FRG)。微电极

    电极是用具有三角形截面的毛细管硼硅玻璃拉制而成，其壁厚为0．25mm，总体截面直径为1．2mm(Dial玻璃制品，Stourbridge，WestMidlands，英国)。用水平拉伸仪拉伸所述电极(Narashige科学仪器实验室，东京，日本)。通过加热大约30秒时两个毛细管软化，然后就可以通过360℃缠绕。为了拉伸融合的毛细管，施加最初的弱的传感拉伸力，直到毛细管被拉伸到预定的长度为止，接着进行第二次较强烈的最终拉伸。此时关闭用于加热线圈的电流，让玻璃在拉伸状态下冷却。用200mM乙酸钾(pH7．55)填充该电极的导电和电压记录管。使用与所述卵母细胞电压控制相似的半电池，不过在这种电池中填充的是1M氯化钾。C和D型肉毒杆菌毒素

    为了检测肉毒杆菌C毒素的作用，在所述保卫细胞内添加毒素(BotN／C或BotN／D作为对照)内肽酶(Sigma)。所述毒素包含在所述电流注射电极的填充溶液中，并让该溶液在刺穿细胞之后扩散20分钟时间进入细胞。然后，检测该细胞的ABA反应，同时控制其膜处于不同的电压。BotN／C和BotN／D使用100nM的标准浓度。例22 Southern杂交DNA制备

    用按上述方法生长的烟草，在20℃下生长在土壤上、昼夜周期为12：12的N．benthamiana，和在22℃下生长在土壤上、昼夜周期为16：8的拟南芥制备DNA。

    植物DNA制剂是用5克重量的新鲜组织制备的，用研棒和研钵充分磨碎所述组织，同时在液氮中冷冻。将粉碎的组织转移到装有15ml提取缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8．0，50mM EDTA，pH8．0，500mM氯化钠，10mM巯基乙醇)的30ml体积的异丙烯管中。加入1．2ml的20％SDS，在充分混合之后将所述试管放在65℃下保持10分钟。加入5ml的5M乙酸钾，并轻轻摇动所述试管，在冰上温育20分钟。大部分蛋白和多糖以与不可溶的十二烷基钾的沉淀物的复合体形式被除去。在SS34转子(12000g，Sorvall)上以10，000rpm的速度对所述试管进行离心，并用Mirecloth滤膜过滤上清液。为了澄清上清液，在一个新的试管(50ml)中加入10ml异丙醇。可以用一个灼烧过的巴斯德移液管缠绕沉淀的DNA。让DNA在巴斯德管上干燥，并将沉淀溶解在3ml水中。添加20μl RNase(10mg／ml)，在37℃下温育DNA 30分钟。通过用1．5ml苯酚和1．5ml氯仿提取进一步纯化所述DNA。以5000g的速度离心15分钟，然后除去水相，并按上述方法用3ml氯仿提取。用0．8×体积的异丙醇和0．2×体积的3M乙酸钠使DNA沉淀。再次将DNA缠绕在巴斯德移液管上，在70％乙醇中洗涤，干燥并溶解在100μl体积中。通过将10μl DNA溶液稀释在990μl水中并在260nm波长下测定0D值确定DNA浓度。使用以下换算系数计算DNA浓度：1．0的A260=50μg／ml DNA。将DNA吸印到滤膜上

    用合适的限制性内切酶消化待检测的DNA，并通过在琼脂糖凝胶上电泳分离。一旦在紫外线透射仪上对所述凝胶进行照相，即可将多余的凝胶切掉，将DNA吸印到膜上。通过切掉所述凝胶的左下角对凝胶进行定向。首先通过在0．25M HCl中处理15分钟对琼脂糖凝胶中的DNA进行脱嘌呤，并在水中漂洗。吸印装置包括具有200ml 0．4M NaOH的水浴，用玻璃板覆盖。切割两个预先湿润的3MM滤纸(Whatmann)，并挂在所述玻璃板的边缘，浸入所述溶液中，并起着吸纸的作用。将所述凝胶放置(上面向下)到所述吸纸上，确保在里面没有气泡，因为气泡会妨碍DNA的转移。将具有凝胶大小的一片尼龙膜(吸印薄膜，BDH)放在凝胶表面，并通过用玻璃移液管滚压除去气泡。所述吸纸的没有被凝胶覆盖的部位用塑料膜密封。将两张预先浸泡的3MM纸切成凝胶的大小，并放在所述滤膜底部，接下来是5-10cm高的吸水纸巾，一块玻璃板和500克的重物。让所述转移进行移液。将脱水的凝胶和滤膜小心翻转，并使凝胶一侧向上，以便用铅笔标记吸印在滤膜上的槽的位置。用2×SSC(1×SSC=0．15M NaCl，0．015M柠檬酸三钠)洗涤所述滤膜，并在3MM纸上风干1小时。然后将所述滤膜包装在塑料薄膜中，并通过将所述滤膜放置在紫外线透射仪上使DNA与所述薄膜交联，使DNA一侧向下，2-3分钟。探针标记

    用作模板的DNA片段是用Boehringer mannheim“琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒”(第六章)从琼脂糖凝胶中纯化的。将50ng片段溶解在34μl水中，并通过煮沸5分钟变性，并在冰上快速冷却。向所述DNA中添加10μl试剂混合物(Pharmacia Oligo标记试剂盒)、1μl Klenow酶(Pharmacia Oligo标记试剂盒)和5μl 32P dCTP(Amersham)。在37℃下温育该反应混合物1小时。然后，从游离标记物中纯化所述探针，所述柱是用0．7ml的管制备的，在其底部开有一个孔。用玻璃珠填充所述管的底部(用水平衡，并用Sepharose CL6B(Pharmacia)填充所述管的其余部分。同样用水平衡。将所述管放在一个无底的1．5ml微量离心管中，并以700g的速度离心2分钟(在台式离心机Denley BR401上，2000rpm，将所述管放在10ml管中以便支撑)。用一个新的试管代替所述无底管并将所述探针混合物小心加样到Sepharose的顶部。按上述方法对所述管进行离心2分钟。洗脱液含有纯化的DNA探针。然后通过煮沸5分钟并在冰上快速冷却使探针变性。杂交

    用于杂交的滤膜首先在65℃下预杂交2小时(预杂交缓冲液包括6×SSC，5×Denhardt’s(起着抑制剂的作用)和0．1％SDS+100μg／ml变性精子DNA。在预杂交之后，弃缓冲液，并添加新的杂交缓冲液：6×SSC，0．1％SDS，5×Denhardt’s+变性的探针，杂交在65℃下进行至少16小时，除非另有说明。然后洗涤所述滤膜，以便消除背景。洗涤在65℃下用2×SSC进行两次10分钟(除非另有说明)。

    然后在-70℃下在一个装有增感屏(杜邦Cronex lighting plus，或富士高速X)的盒中让所述滤膜对X-光胶片(柯达XAR-5；IB165-1678)曝光。曝光时间取决于用一个小型监测仪测定的所述滤膜上的放射性强度。在所述估计的时间(通常为12小时至5天)之后，对所述X-光胶片进行显影。例23 Northern杂交

    用于Northern吸印的RNA是按上述方法纯化的mRNA或按下述方法纯化的总RNA。所使用的所有水溶液都是用DEPC预处理过的(0．001％)，将其加入所述溶液中，在室温下温育过夜，并在120℃和1巴压力下高压灭菌20分钟。不能用DEPC处理的Tris溶液是用DEPC处理过的水制备的，并按上述方法高压灭菌。所使用的所有塑料材料直接购自生产商，并仅仅用一次性手套操作。用研钵和研棒将5克新鲜组织重复匀浆，并在液氮中保持冷冻。将所述粉末转移到装有15ml提取缓冲液(100mMTris-HCl，pH9．0，200mM NaCl，5mM DTT，1％十二烷基肌氨酸钠，20mMEDTA)的新的50ml一次性试管中，并摇动直到所述粉末解冻并悬浮为止。将7ml苯酚和7ml氯仿加入该混合物中，倒转该试管几分钟，并在一个台式离心机(Denley BR401)上以3000rpm(4000g)的速度离心10分钟。测定水相的体积，并以2M的终浓度添加氯化锂(母液为10M的氯化锂)，混合该溶液，并在一个用石蜡膜覆盖的cotlex管中在4℃下温育过夜。然后在SS34转子(Sorvall)上在4℃下以10000rpm(12000g)的速度离心10分钟。除去上清液，并用2ml的2M氯化锂洗涤沉淀两次，并按上述方法离心。将RNA最终溶解在不含RNase的水中。通过将10μl的RNA溶解在990μl水中，并通过在260nm波长下测定OD值确定RNA的浓度。所述浓度是用下列转换系数计算的：1．0的A260=50μg／ml RNA。将RNA从甲醛凝胶上转移到滤膜上

    将待检测的RNA加样到含有甲醛的凝胶中，所述凝胶是用1．2克琼脂糖制备的，将所述琼脂糖在微波炉中熔化于75ml水中。当所述溶液冷却到大约50℃时，将50ml 10×MOPS(10×MOPS：0．4M MOPS，0．5MEDTA pH8，50mM乙酸钠)和15ml甲醛加入。搅拌该混合物并注入凝胶盘中。与此同时制备加样样品：将16μl加样染料(100μl MOPS，350μl甲醛，1ml甲酰胺，200μl加样混合物(加样混合物：50mg溴酚兰，5g ficoll400，溶解在20ml体积中)加入200μg mRNA和15μg总RNA中，并在65℃下让所述RNA变性10分钟。然后让所述样品冷却，并加样到所述凝胶上。电泳之后，通过在紫外线透射仪上对所述凝胶照相和切掉凝胶上的空闲泳道和左下脚用于制备吸印的凝胶。在2×SSC中漂洗所述凝胶，并按照Southern吸印方法将RNA转移到尼龙膜(吸印膜BDH)上，所不同的是用于Northern吸印(RNA)的转移缓冲液是10×SSC。在转移过夜之后，在2×SSC中漂洗滤膜，并在3MM纸上风干1小时。然后将所述滤膜包装在塑料膜中，并通过将所述滤膜放在紫外线透射仪上让RNA与所述膜交联，使RNA一侧向下，2-3分钟。

    所述滤膜可用于杂交。探针的标记和杂交条件与Southern杂交的相同。例24 Western杂交肽的选择

    第一个肽SP1包括SYR氨基酸序列的13个氨基酸长度抗原性片段。因为该肽的体形较小，将其缀合在匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)上。KLH通常被用作肽载体蛋白，并且基本上没有抗原性。所述肽缀合物是从Pacemaker(Exeter，英国)订购的。肽：KLH-CGPGSSSDRTRTS

    为了纯化第二种肽SP2，选择Quiagen的Qiaexpress系统。所述肽纯化机制包括三个主要步骤：(1)将一个核苷酸序列片段克隆到所述表达载体上，(2)表达所述肽和(3)纯化所述肽。

    (1)通过PCR纯化SYR的亲水性部分。制备两个引物。第一个引物是STX1，它是为了在转录位点对SYR的反义链进行退火而专门设计的，其前面是BamHI限制性消化识别位点。第二个引物是STX2，它是为了在所述SYR序列的亲水性部分的C-末端区对SYR序列的有义链退火而专门设计的，其后面是一个终止密码子TAA和一个EcoRI识别位点。PCR条件是标准的，PCR反应缓冲液：5mM氯化镁，100mM氯化钠，10mMTris-HCl(pH8．4)(Biolabs)，添加每一种引物20μM，每一种dNTP各0．25mM，和2单位的TaqI(Biolabs)。所使用的模板是1ng／μl psyr(质粒制备)。反应条件为：96℃30秒，然后是96℃30秒，55℃30秒和72℃1．5分30轮次，接着最后一步是在72℃下5分钟。对PCR片段进行凝胶纯化(Boehringer mannheim“琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒”)，并用BamHI和EcoRI消化产生粘性末端。在sepharoseCL6B柱上纯化所述片段(与探针纯化相同)，然后即可将所述片段连接到预先用BamHI和EcoRI消化过的表达载体pQE-30(氨苄青霉素抗性)上(连接和转化是按上述方法进行的)，得到新的结构pQES(图7．1)。因此，pQES载体在SYR片段前面的读框内含有编码6个组氨酸残基的密码子，在克隆片段的上游是T5启动子，该启动子可以用IPTG诱导。还存在两个lac操纵子序列，该序列能加强lac抑制阻遏物结合并确保在没有IPTG的条件下有效抑制T5启动子。在克隆片段的下游是导入的翻译终止密码子和两个强的转录终止子t0和T1，以便避免连读转录并确保所述表达结构的稳定性。用所述结构转化大肠杆菌菌株M15[pREP4]。该菌株含有具有lac阻遏物的质粒pREP4(卡那霉素抗性)，以便调节并抑制T5启动子。选择大肠杆菌菌株M15菌株是为了进行蛋白的高水平表达。

    (2)为了表达所述蛋白，用M15[Rep4][pQES]接种10ml LB Amp(100μg／ml)、Km(25μg／ml)，并在37℃下温育过夜。将10ml稀释到预热的500ml LB Amp Km中，并且在37℃下温育4小时之后加入2mM IPTG。在4小时之后通过离心收集细胞。

    (3)为了纯化所述肽，首先裂解细胞，然后让可溶性组分通过Ni2+柱，以便分离所述肽。将沉淀物溶解在14ml(4ml／g湿重)超声缓冲液(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，pH8)中。将所述样品在-20℃下冷冻过夜。在冷水中让所述样品解冻，然后在冰上用SONIPREP150(MSE，Leicestershire，英国)进行超声处理5次，每次1分钟，波长为20微米，直到细胞被裂解。为了降低该溶液的粘度，通过用针头抽吸和排出冲洗的方式将RNA和DNA断开。在SS34转子(Sorvall)上在4℃下以9500rpm(10000g)的速度离心该悬浮液20分钟。将上清液收集在一个新的试管中。同时用超声缓冲液平衡Ni2+-树脂。通过在台式离心机(Denley BR401)上以500-600rpm的速度离心1-2分钟收集4ml Ni2+-树脂。倾出上清液，并用4ml水洗涤3次，用4ml超声缓冲液洗涤3次。将用4ml超声缓冲液平衡的树脂加入所述裂解物中，并在冰上轻摇1小时。收集Ni2+-树脂和结合的肽，并总共用100ml洗涤缓冲液(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，10％甘油，pH8)充分洗涤，直到A280低于0．01。将所述树脂注入一根柱中(直径1cm，5ml聚丙烯一次性柱，Qiagen)，并用梯度洗脱缓冲液洗脱所述肽：洗涤缓冲液为pH6到pH4．25。收集1ml的组分，并在SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)上检测。

    将购买的(SP1)和纯化的(SP2)肽分别注射到UKC动物饲养场的两只兔子体内(肯特大学，Canterbury)，4周以后采集血清，并对所述兔子进行第二次注射。2-3周之后第二次采血，然后对所述兔子第三次注射，并在2周之后将所述兔子宰杀同时收集血液。SDS-PAGE和Western印迹

    用SDS-PAGE分析蛋白。凝胶是用Mini-proteanII电泳仪(BioRad，Hertfordshire，英国)制备的。该系统提供有说明书。所述凝胶包括两个部分，分离凝胶和堆积凝胶，该凝胶是在用1mm厚的垫片隔开的两个玻璃板之间制备的。先注入分离凝胶(12％丙烯酰胺，0．375M Tris-HCl(pH8．8)，0．1％SDS，0．1％APS(过硫酸铵)和0．04％TEMED)，并在凝固之后注入堆积凝胶(5％丙烯酰胺，0．125M Tris-HCl(pH6．8)，0．1％SDS，0．1％APS(过硫酸铵)和0．1％TEMED)，在其顶部放置一个梳于以便形成槽。将所述样品溶解在50μl SDS凝胶加样染料(50mMTris-HCl(pH6．8)，2％巯基乙醇，1％SDS，0．05％溴酚兰，5％甘油)中煮沸5分钟并加样。电泳是在电泳缓冲液(25mM Tris-HCl，250mM甘氨酸和0．1％SDS)中在100V的恒定电压下进行大约45分钟。当所述凝胶不是用于Western杂交时，用考马斯兰染色溶液(0．1％考马斯兰R-250(BioRad)，溶解在40％甲醇和10％乙酸中)固定染色30分钟。在用40％的甲醇和10％的乙酸脱色之后所述蛋白带变得可见。将所述凝胶放在两个cellophane板之间干燥，首先在10％甘油中与所述凝胶一起平衡，然后固定在一个支架上。

    为了将蛋白从凝胶上吸印到硝酸纤维素膜上进行Western杂交，在电泳之后，将所述凝胶和膜一起浸泡在转移缓冲液(25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸和20％甲醇)中15分钟，然后将两张3MM滤纸剪成凝胶的大小。吸印是用Mini电转移印迹槽(BioRad)进行的。将所述凝胶挤入盒式固定装置中，让预先浸泡过的膜紧挨着它，在每一面放置一张3MM的滤纸，最后在外面放置预先浸泡过的纤维垫。通过以100V的电压电泳1小时将蛋白从凝胶上转移到所述膜上。通过用丽春红(BioRad)对所述膜进行染色检测所述蛋白印迹，所述染料能够对蛋白进行染色。用自来水洗涤所述印迹。Western杂交

    在与抗体杂交之前，用1×TBS(0．15M氯化钠，3mM氯化钾，25mMTris pH7．4)和5％Marvel(奶粉)封闭所述膜1小时。抗体杂交是在添加了0．1％Tween和0．1％叠氮化物的相同缓冲液(1×TBS，5％Marvel)中进行的，并与用兔子制备的抗体杂交过夜，该抗体的估计浓度为1ng／μl。然后将抗体溶液倾出，并保存在冰箱中直到使用。用1×TBS和0．1％Tween溶液洗涤三次，添加与碱性磷酸酶(Sigma)缀合的第二种抗体(抗兔山羊抗体)，以便与第一种杂交。第二次杂交是在1×TBS，5％Marvel和0．1％Tween中进行2小时。将抗体溶液倾出，并用1×TBS和0．1％Tween洗涤三次。通过在显影溶液(10 mM Tris-HCl pH9，25mM氯化镁，2mM氯化钠，200μg／ml NBT(氮兰四唑)和200μg／ml BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚))中对所述膜进行染色观察第二种抗体。显影一直进行到所述带出现，然后用水彻底洗涤所述膜。例25酵母转化

    酵母转化是用已知技术进行的。在28℃下让0．5ml的培养基生长过夜，并在微量离心管中离心10秒让细胞沉淀。将上清液倾出并将1μg的转化DNA加入沉淀中。对该混合物进行涡旋搅拌，加入0．5ml PEG／乙酸锂／TE(40％PEG4000，0．1M乙酸锂，10 mM Tris-HCl pH7．5，1mMEDTA)并再次涡旋搅拌。在室温下温育该混合物过夜，并将50μl混合物直接铺展在选择平板上。

    用于酵母的培养基是YPG(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％半乳糖)，YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)和SG(有半乳糖的合成基础培养基：0．67％酵母氮碱，2％半乳糖)，有或没有尿嘧啶(20μg／ml)、腺嘌呤(20μg／ml)、色氨酸(20μg／ml)、组氨酸(20μg／ml)或亮氨酸(30μg／ml)。

    所使用的载体是pMAT1，它是含有启动子PGK1(磷酸甘油酸激酶)并含有LEU2选择基因的高拷贝表达质粒。例26从酵母中提取膜蛋白

    将酿酒酵母菌株接种到2ml加富YPG培养基中，并在28℃下培养过夜。将该培养物的200μl样品稀释到100ml YPG中，并在28℃下再次培养至少20小时。以1000g的速度离心5秒钟(2500rpm，Denley台式离心机)使所述细胞离心沉淀，并将沉淀物溶解在蛋白提取缓冲液(10mM EDTA，100mM Tris(pH8)，400μM PMSF)中，并放在冰上。加入等体积的玻璃珠(直径0．5mm)，并涡旋搅拌该混合物3次，每次1分钟，间隔1分钟。裂解所述细胞后，用10ml GTED20(20％甘油，1mMEDTA，1mM DTT，10 mM Tris(pH7．6))稀释粘稠的溶液。在4℃下以1000g的速度离心10秒钟(2500rpm，Denley台式离心机)使所述玻璃珠和细胞碎片沉淀。小心将上清液倾出，并通过在4℃下以16000rpm的速度离心(SamIg，SS-34，Sorvall上)使所述膜沉淀。在处理了上清液之后，将膜沉淀溶解在0．5ml GTED20中，确保蛋白浓度大约为5μg／μl。将蛋白提取物于-20℃下保存。例27肉毒杆菌C毒素减弱保卫细胞中的ABA信号

    为了测定突触融合蛋白相关蛋白与植物中ABA信号反应途径的关系，用肉毒杆菌C毒素(BotN／C)剔除所述蛋白。BotN／C裂解位点在突触融合蛋白1蛋白中是非常保守的，它存在于靠近疏水性C-末端的5个氨基酸上(图27)。BotN／C能通过另外两个结构域X1和X2识别突触融合蛋白，这两个结构域位于所述氨基酸序列的上游。X1和X2基序包括9个氨基酸，构成一种螺旋型结构，产生一个具有3个负电荷的表面，该表面与由疏水性残基构成的表面相邻(图27)。由于X1、X2的保守性和所述裂解位点的部分保守性以及总体保守的三级结构(图27)，肉毒杆菌C毒素很可能切入SYR蛋白。BotN／D能消化VAMP，而不能消化突触融合蛋白1A型分子，用它作为对照。

    在添加ABA时保卫细胞关闭，而在其它过程中保卫细胞的关闭是通过增加阴离子的流出和K+流入抑制而介导的。在有ABA的条件下，并且有或没有BotN／C和BotN／D的条件下研究了这两种特征的修饰性反应。用膜电压控制分析BotN／C和BotN／D的作用。该试验是用N．benthamiana的保卫细胞进行的，并且还用蚕豆检验了ABA对向内调整的K+的减弱作用。在使用BotN／C时，ABA不能增强N．benthamiana中的阴离子电流

    刺穿N．benthamiana的保卫细胞，以便分析ABA反应。为了测定阴离子电流，在Ca-MES缓冲液中用15mM TEA-Cl和15mM氯化铯以化学方法消除K+电流。图28表示在对保卫细胞进行电压控制将膜的电压控制在-230mV到+30mV之间7秒钟时记录到的电流轨迹。在测试脉冲之前是一个+30mV 5秒钟的调节脉冲(在图中未示出)。未处理的(对照)细胞在ABA的作用下表现出瞬时阴离子电流的较大增加。不过，所述电流的稳态也会改变，该图中更难于分析(图28)。当将BotN／C注射到所述细胞中时ABA不起作用，在ABA处理的至少6分钟时间内没有记录到阴离子电流的改变(图28)。不过，当用BotN／D注射细胞时检测到ABA对瞬时电流的增强(图28)。

    在图29中示出的IV曲线比较了在用或不用肉毒杆菌毒素处理所述细胞时ABA对阴离子电流的瞬时点(左)或稳态点(右)的影响。瞬时IV曲线源于在图28中测试脉冲开始时的点。在-170mV电压下，ABA对对照细胞的瞬时IV曲线的影响使电流增加4倍(图29A，左)。选择用于绘制稳态阴离子电流的IV曲线的电流点是选择图28中7秒时间的测试脉冲结束时。对照细胞表现出由ABA导致的电流增强(图29A，右)。在0mV左右和高于0mV电压下测定的电流的倾斜的导电性有所增强。在低于-50mV电压下在不同细胞之间的电流波动很大。稳态电流的这种ABA作用与ABA诱导的瞬时相关。与未处理过的细胞相比，BotN／C处理过的细胞，ABA对瞬时或稳态阴离子电流不会产生任何影响(图29B)。BotN／D处理过的细胞表现出ABA对瞬时阴离子电流的影响，在-170mV下的电流比对照细胞增加了4倍(图29C左)。ABA对BotN／D处理过的细胞的作用在所述阴离子电流的稳态阶段也可以观察到。在0mV和高于0mV电压下记录到所述倾斜导电性的增强(图29右)。

    统计分析表明，通过注射BotN／C而不是BotN／D一般可以减弱ABA对保卫细胞的影响。选择-170mV下的瞬时电流值进行分析。在ABA诱导电流加强之后的最大值对在添加ABA之前由电压控制周期测定的电流值进行校正。所测定的所述细胞的平均的最大增加在图30中示出。当所述细胞不用肉毒杆菌毒素处理时，ABA诱导的电流增加3．5倍(n=3)。BotN／C能破坏对瞬时阴离子电流的加强，导致无(1倍)加强(n=6)。当用BotN／D注射保卫细胞时，所述加强作用与对照细胞(n=2)相当(3倍)。在N．benthamiana中BotN／C破坏由ABA介导的IK，in抑制

    用双管电极刺穿N．benthamiana的保卫细胞，以便在标准缓冲液(5mM Ca2+MES和10mM氯化钾)中进行膜的电压控制。为了测定向内调整的K电流，电压控制方案包括1秒钟的-100mV的前脉冲，和8个4秒钟的测试脉冲，其范围为-230mV到+30mV。图31表示该方案的4个最低测试电压的电流轨迹。在未处理过的对照细胞中，在-120mV更偏负一些的电压下记录到的向内调整的K+电流受ABA的抑制。不过，当把BotN／C注射到所述细胞中时，在6分钟内没有观察到由ABA导致的向内调整电流的差别。不过，当使用BotN／D时，向内调整的电流能对ABA做出正常反应，导致电流的抑制。

    分析了所述向内调整器的稳态电流，并在图32中示出。所述稳态是在测试脉冲结束时选择的，并通过扣除在即将开始步进脉冲之前记录到的瞬时电流调整其泄露。在正常对照细胞中，向内的时间和电压依赖型K+电流在-230mV下由于ABA的作用能受到大约40％的抑制(图32A)。不过，用BotN／C处理过的细胞对添加ABA没有反应。在没有和有ABA的条件下IK，in的IV曲线实际上相同(图32B)。用BotN／D处理过的细胞的IV曲线表现出与对照细胞的IV曲线的相似的抑制作用。当使用ABA时，在-230mV下记录到IK，in的抑制作用大约为30％(图32C)。

    在图33中示出了IK，in的最大抑制的统计学分析。数字表示在-200mV下的向内K+电流的ABA诱导值的平均值±SE以在添加ABA之前的IK，in校正。在未处理过的细胞中由ABA造成的平均IK，in抑制值大约为原始电流的46％(n=5)。对于BotN／C处理的细胞(n=7)来说所述抑制作用不显著(95％)。对于BotN／D处理的细胞(n=3)和对照细胞来说，电流的抑制在标准误(45％)之内是相同的。在蚕豆中BotN／C破坏由ABA介导的IK，in抑制

    在蚕豆上重复测定BotN／C对IK，in的ABA敏感性的作用。用与上述方法相同的方案对保卫细胞的膜进行电压控制，以便测定向内调整的K+电流：前脉冲-100mV 1秒，8个4秒的测试脉冲在-230mV到+30mV之间。通过扣除所述测试脉冲的瞬时电流对在-200mV下的稳态电流值进行泄露电流调整。将ABA中的电流以在添加ABA之前相同电压的稳态电流进行校正。在图34中将校正值与添加ABA之后的时间作图，同时对来自对照细胞的数据作图(同样参见Blatt，1990和Thiel，1992)。在300秒之后对照细胞表现出大约80％的抑制作用。在添加ABA之后BotN／C处理过的细胞的平均值没有出现显著变化。以上结果表明BotN／C在所有植物中普遍起作用。例28抗体

    为了检测BotN／C毒素对细胞膜的作用是否是由BotN／C裂解SYR蛋白所致，必须制备抗体以便在Western印迹上检测SYR。抗体最初通过两种肽制备的(如上文所述)。用合成肽SP1进行的Western印迹

    肽SP1是从SYR蛋白中选择的115-127号氨基酸。预计该片段具有高度的抗原性和亲水性，并且具有很高的表面可能性，该预测是用Lasergene(DNA*)的PORTEAN程序完成的。将SP1与KHL蛋白的缀合物注射到两只兔子体内(肯特大学，Canterbury，英国)。在第一次、第二次和第三次SP1-KHL注射2-3周之后从每一只兔子上采集血清样品，检测其对肽SP1-KHL的识别和SYR蛋白在酵母中的表达(参见下文)。用SP1-KHL和SYR都没有检测到反应，因此，抗体是针对第二种肽产生的。纯化SP2

    通过PCR扩增编码SYR蛋白的完整亲水性部分的DNA序列。由此在该片段的末端产生两个限制性内切酶识别位点BamHI和EcoRI，以便能够将其克隆到表达载体pQE30(Quiagen)上，位于强IPTG诱导型启动子(T5)的后面，得到pQES，将该质粒转入大肠杆菌菌株M15[pREP4](图26)。当在含有所述肽的前6个组氨酸残基的液体LB培养物中生长时，IPTG能表达SYR肽SP2，这使得所述肽能结合到用于纯化该肽的Ni2+的树脂上，通过将所有其它蛋白洗去进行纯化。从所述树脂上洗脱纯化的SP2。将在表达和纯化期间来自所有不同组分的样品加样到SDS PAGE上。并用考马斯兰染料染色(图35A)。含有SP2的样品仍然含有某些污染性的大肠杆菌蛋白(在图35A中为弱的兰色带)，有可能产生针对这些蛋白的抗体，不过由于是将抗体混合物用于酵母，所述抗体不可能产生影响。将SP2样品注射到位于UKC的两只兔子体内。SP2的Western印迹

    在SDS PAGE上对两种浓度(5ng和50ng)的肽SP2重复进行变性，并吸印到硝酸纤维素滤膜上。然后让所述滤膜与所述两只兔子的免疫前的血清、第一次取得血、第二次取得血和最后一次取得血杂交。免疫前的血清绝不会出现与肽SP2的任何交叉反应(图35B)。在第一次注射SP2到两只兔子中之后的所有血样都与所述肽发生交叉反应。图10B表示当SP2与所述兔子之一的第二个血样杂交时可以观察到的带。所述带的强度与肽SP2的浓度相关，在50ng下的杂交比在5ng下的杂交强，这表明所述抗体的专一性。例29在体外BotN／C不能消化SYR

    为了检验BotN／C是否能裂解SYR蛋白，设计了一种生化反应。用超量表达SYR的WT酿酒酵母菌株(W303-1A)制备膜蛋白提取物(Rothstein，1983)。在实际裂解反应之前，在37℃下在10mM DTT中对肉毒杆菌毒素进行减毒30分钟，必须用该步骤来使两条链解开。在体外试验中，负责穿透细胞的较大的链不重要。是所释放的现在有活性的小的链使得所述毒素可用于突触融合蛋白的裂解。如果在体外BotN／C毒素能消化SYR蛋白，在Western印迹上将会出现SYR带从34kD改变成30kD。反应条件的制备与前面报导的体外BotN／C试验相似。所述条件为15mM氯化钠，5mM氯化镁，5mM硫酸锌，1mM DTT，1mM EDTA和10mM Tris pH7．6，以及100nM的毒素BotN／C和BotN／D。所述反应在37℃进行4小时。在SDS PAGE上分离大约20微克蛋白，吸印到一个滤膜上，并与抗SYR抗体杂交。图36B表示该Western印迹。没有出现预期的一条SYR蛋白带，而是当SYR在酵母菌株W303-1A中表达时检测到4条带。不过，所有4条带都与SYR相关，因为这4条带没有一个出现在没有SYR表达质粒的相同菌株的蛋白膜提取物中，或者没有一个是由免疫前的血清识别的，如该图的图A(图36A)所示。所述4条带中的最小的一条与SYR蛋白的预测大小相当(34kD)。其它的较大的带有可能具有某些修饰。如图36B所示，在所使用的条件下，BotN／C不能够裂解SYR，因为没有检测到4条带中任一条的改变。正如所预料的，BotN／D也不能消化SYR蛋白。例30 SYR同样存在于N．benthamiana

    由于用肉毒杆菌毒素进行的保卫细胞电压控制试验是用N．benthamiana植物来做的，检查该植物中是否存在烟草SYR基因。通过Southern杂交证实相同的或高度同源的基因的存在。从烟草和N．benthamiana中制备DNA。用EcoRI和HandIII消化20微克DNA过夜。在琼脂糖凝胶上分离DNA片段，并吸印到一个膜上。用于检测的模板包括完整的SYR cDNA插入片段，该片段是用EcoRI和NotI从psyr中分离的，并通过凝胶电泳纯化。用放射性标记SYR cDNA，并在65℃下与DNA滤膜在杂交缓冲液中杂交一夜。在65℃用2×SSC和0．1％SDS洗涤所述滤膜2次。用所述膜对X光胶片曝光96小时。通过对所述胶片显影发现了与SYR同源序列相关的某些带(图37)。在二倍体物种N．benthamiana中，在用EcoRI消化的DNA的泳道中检测到两个主要的带为大约12kb和4．7kb，一个弱的带(10kb)。HandIII消化的DNA仅出现了一个强的带(10kb)，和一个弱的带(大约20kb)。以上结果表明，在N．benthamiana中存在一个相同的SYR基因，并且还有可能存在另一个同源性较低的基因。在EcoRI消化的泳道中检测到两个主要的带为8kb和6kb，其中的一条似乎是重复的。另外，检测到一个大约3kb的弱的带。HandIII的图谱比较复杂，可以在12kb、1kb和两个彼此接近的5kb处检测到4个较强的带。在同一泳道中还可以看到3个较弱的带。

    用较低严格的条件进行相同的Southern杂交：在相同的杂交缓冲液中，但在52℃下杂交过夜，接下来仅仅在2×SSC和0．1％SDS中洗涤一次。结果与在65℃下杂交的结果相同，没有出现其它的带。例31表达分析

    为了分析SYR的表达形式，进行了Northern分析。在不同条件下从烟草叶片或茎制备RNA。在该Northern试验中所使用的探针都相同，并且源于SYR cDNA插入片段。杂交条件是标准的：在杂交缓冲液(6×SSC和5×Denhardt’s，和0．1％SDS)中在65℃下杂交过夜。洗涤条件包括用2×SSC，0．1％SDS缓冲液洗涤滤膜一次或二次。SYR在叶片和茎中的表达

    第一个试验表示从生长在两种不同条件下的烟草的叶片和茎中分离mRNA。mRNA是从分别生长在湿度接近100％或生长在温室条件(湿度大约60％)下的叶片和茎中分离的。将2．5微克mRNA加样到含有甲醛的琼脂糖凝胶上，并吸印到一个膜上。在图12A中示出了与该膜的SYR探针的杂交结果。鉴定了叶片与茎的不同的SYR表达形式。在100％湿度的条件下，SYR基因的转录物存在于茎中，但似乎不存在于叶片中。不过，当植物的生长条件比较干燥(温室条件)时，SYR转录物同时存在于叶片和茎中。总之，SYR转录物不局限于叶片中，而存在于潮湿或干燥条件下的茎中，但当植物生长在极潮湿的环境中时不存在于叶片中。胁迫或ABA诱导的SYR表达

    从烟草叶片中分离mRNA。烟草植物是在非常潮湿的条件下在加盖的托盘中生长的。通过喷洒叶片和给土壤浇水的方式用由自来水配置的20μM ABA处理6周龄植物。在用ABA处理之前(作为对照)、处理之后1小时、24小时或48小时收集叶片用于制备mRNA。通过将植物从潮湿条件下取出并将其放置在环境空气条件下对某些植物进行干旱胁迫，不提供水。在72小时之后当叶片开始枯萎时收集用于制备mRNA的叶片。在图12B中示出了印迹的SYR探针杂交的放射性照片，每一个泳道含有2．5微克mRNA。当用ABA处理叶片或者当植物受到干旱胁迫时SYR的转录物含量增加。在开始ABA处理之后的增加被迅速诱导(1小时)，其水平的增加一直持续到停止处理之后24小时，并在48小时之后略有减弱。转录物的诱导似乎是缓慢短暂的。

    为了证实以上结果，他们还用生长在塑料箱中的高湿度条件下的其它烟草植物重复了以上试验。按上述方法用ABA处理6周龄植物，并在30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、48小时之后收集叶片。从所述叶片中制备总RNA，并将15微克RNA放在琼脂糖凝胶上通过电泳组构，并吸印到膜上。在图12C中(左)示出了表示与SYR探针杂交的结果的X光胶片。证实了SYR转录物的瞬时诱导。不过，在该试验中，其时间顺序不同于上述试验。转录物的含量在开始ABA处理之后30分钟达到最高，并在该最大值之后减少，在3小时时接近原始对照水平，并在24小时之后再次缓慢增加。另外，还试验了用生长素(IAA)对烟草植物进行30分钟处理而产生的SYR诱导。尽管Northern分析再一次证实了在ABA处理植物30分钟之后产生的SYR诱导，但在用IAA处理之后30分钟SYR的转录水平没有增加(图12C右)。将等量的RNA加样到每一块凝胶上，正如由溴化乙锭染色的核糖体RNA带的照片所证实的(图12D)。例32酵母互补

    所述酿酒酵母菌株含有两个突触融合蛋白基因SS01和SS02，这两个基因彼此密切相关，并且在功能上可以相互交换。将这两个基因作为酵母突变的阻遏物克隆，所述突变型缺乏其分泌途径。破坏酵母中的两个基因是致死性的。由以上两个基因制备菌株H440，将SS01和SS02从野生型酵母菌株W301-1A中去掉，但该菌株能存活，因为它含有一个具有SS01基因的质粒，该基因受半乳糖诱导型启动子(GAL1)的控制。结果，H440仅能够在含有半乳糖的培养基上生长。

    将源于烟草的SYR基因克隆到酵母表达载体上，使其受一个强启动子的控制。将该结构转入酵母菌株H440，得到H440(SYR)，并在葡萄糖培养基和半乳糖培养基上生长。正如所预料的，菌株H440和H440(SYR)在含有半乳糖的培养基上生长良好，因为SS01基因得到表达(图38A)。当H440被接种到没有半乳糖的培养基上时，没有观察到生长，因为消除了SS01的表达。SYR基因不能抑制这种突变。当H440(SYR)菌株生长在半乳糖缺陷型培养基上时，所述菌株不能回收(图38B)。作为对照，还接种了野生型酿酒酵母菌株，并且在每一种培养基上都生长良好。SYR在H440(SYR)中的表达

    用新制备的抗SYR抗体检测SYR蛋白在新构建的菌株H440(SYR)中的存在。制备酵母菌株H440和H440(SYR)的膜的蛋白提取物。通过电泳在凝胶上进行分离，并吸印到滤膜上。抗SYR抗体能识别存在于SYR表达菌株中的提取物，但在H440本身中不能(图38C)。该蛋白不能与同一只兔子免疫前的样品杂交证实了其专一性。这表明获得了SYR的表达，所以SS01和SS02突变互补的失败不是由于SYR转录的缺乏。例33拟南芥属EST和Southern

    由于拟南芥在分子生物学中被用作模型系统，并且它的很多基因至少被部分测序，因此进行一项检索，以便发现与烟草SYR基因‘相同的’基因。BLASTN检索是在NCBI网站上用dbEST数据库完成的。EST’s是表达的序列标记，源于拟南芥cDNA克隆的部分序列。除了KNOLLE序列之外，通过该检索发现了一种新的序列。EST，P16862在核苷酸水平上表现出70％的相同性，而在氨基酸水平表现出62．6％的相同性。

    为了检查该序列或其它序列是否与SYR相关，用通过EcoRI限制性内切酶消化过的拟南芥DNA进行Southern印迹，并在琼脂糖凝胶上电泳之后吸印到尼龙膜上。杂交条件是标准的，在65℃下在杂交溶液中过夜，然后在65℃下用2×SSC，1％SDS洗涤二次。图39B表示该试验的放射性照片。右侧的泳道表示当SYR探针杂交时的结果。而左侧泳道表示当使用EST，P16862时的结果。在每一种情况下，在每一个泳道中检测到一条带，但具有不同的大小。SYR探针能识别4．7kb的DNA带，而EST，P16862探针能识别3．8kb的带。这表明在拟南芥中存在一个与SYR高度相同的基因，但该基因不能用EST代表。例34-syr的表达

    将syr基因克隆到pG3．3载体上。pG3．3(14．92kb)载体包括编码β-葡糖醛酸酶(GUS)的报导基因uidA，该基因位于35S启动子后面，位于T-DNA的两臂之间。T-DNA还含有卡那霉素(Km)抗性基因。所述载体携带另一个35S启动子。随后是一些单一的限制性位点，以便将外源基因克隆在该35S启动子的控制之下。35S启动子源于花椰菜花叶病毒，并且在烟草中以组成型方式表达。

    沿两种不同的方向将syr基因插入pG3．3载体位于35S启动子后面。获得了两种新的结构：pGSS(syr基因沿有义方向插入35S启动子后面)和pGSA(syr基因沿反义方向插入35S启动子后面)。

    将pG3．3、pGSS和pGSA转入根癌农杆菌菌株LBA4404中，该菌株被用于转化烟草，并含有利福平(Rif)抗性基因。将所述载体从大肠杆菌中转移到根癌农杆菌中是通过三亲交配完成的，使用pRK2013作为辅助质粒。

    在28℃下在含有Km(20微克／毫升)和Rif(25微克／毫升)的20毫升LB中生长含有pG3．3、pGSS或pGSA结构的农杆菌菌株。然后通过离心使细菌培养物沉淀，并重新悬浮在添加了Km(20微克／毫升)的200毫升诱导培养基中。诱导培养基含有10．5g／l磷酸氢二钾，4．5g／l磷酸二氢钾，1g／l硫酸铵，0．5g／l柠檬酸钠·2H2O，1mM硫酸镁·H2O，0．2％葡萄糖，0．5％甘油，50μM 3’，5’-二甲氧基-4’-羟基乙酰苯(Aldrich)和10mM N-吗啉代-乙磺酸(MES)，pH5．6。在28℃下培养过夜。然后通过离心使细菌沉淀，并用含有10mM MES pH5．6的Murashige和Skoog’s培养基(MS，Sigma)洗涤，并重新悬浮在100ml MS-MES培养基中，该培养基含有150μM 3’，5’-二甲氧基-4’-羟基乙酰苯(Aldrich)和0．05％ Silwet(Vac-in-Stuff，Lehle seeds，Round Rock，TX，美国)。该细菌悬浮液可用于转化。

    将4-6周龄的烟草植物用于瞬时表达。在转化之前的最后3天，将植物转移到100％的湿度中。为了进行浸渗，将完整植株连同土壤一起转移到一个真空箱中，同时用塑料膜对土壤进行密封。将一个幼小的但完全展开的叶片轻轻插入装有根癌农杆菌细菌悬浮液的烧杯中。用真空泵抽真空，直到真空箱中大气压力低于0．1毫巴，保持数分钟，直到细菌溶液完全沸腾，然后迅速解除真空。在所述幼小叶片中可以看到溶液的浸渗，从叶片的顶端扩散到整个叶片的大约2／3部位。在23℃下在100％的湿度中培养所述植物72小时，给以12小时光照／12小时黑暗的周期。

    通过测定浸渗植物叶片中GUS的活性控制基因表达，所述活性容易通过组织化学染色测定。将所述组织在37℃下在GUS染色溶液中培养过夜：50mM磷酸钠缓冲液pH7，0．5mM钠亚铁／铁氰化物，0．05％TritonX-100和0．5mg／ml 5-溴-4-氯-3-吲哚--D-葡糖醛酸，0．1mg／ml氯霉素。在染色之后用乙醇对所述组织进行若干次洗涤。

    开始用pGSA浸渗三种不同植物的三种不同叶片，该结构含有syr的反义cDNA(图40；序列3)，该基因受35S启动子的控制。在23℃下在100％的湿度中培养3天，然后检测所述植物叶片上的不同的枯萎表型。将所述植物连同土壤一起从100％湿度的环境中转移到干燥部位，位于180W灯泡下30厘米，用pGSA转化的叶片似乎比对照未浸渗过的叶片更快的枯萎。这意味着在大约5分钟之后，转化叶片的顶端和边缘(在这些部位浸渗了pGSA)开始下垂并枯萎，而其它叶片在转移之后大约10分钟才开始脱水。在3个植株中的2个上记录到这种表型。检测这两种转化叶片的GUS活性。兰色的染色是GUS活性的结果，并且在浸渗部位的细胞中大约有10％能检测到，这表明在所述植物细胞中发生了由35S启动子导致的基因表达。在所检测的两种对照叶片中没有检测到GUS活性。

    当把第三个植物从100％的湿度转移到环境空气条件中时仍然具有含水丰富的土壤，这样能更好的记录到枯萎表型。16小时之后(过夜)，浸渗的叶片表现出双重表型。叶片的基础部分保持直立与正常情况一样(野生型)，但朝向顶端的由农杆菌属浸渗的叶片部位下垂并具有枯萎表型。所有其它叶片看上去都健康。此时，将浸渗的叶片用于测定气孔开孔。气孔的关闭是通过充实压力的减弱调节的，由环绕气孔的保卫细胞中的ABA导致。在干燥条件下，为了防止水分的蒸腾损失气孔会关闭。如果缺少信号传导成分，保卫细胞就不能再对ABA作出反应，并因此使气孔保持开放，甚至在干燥条件下也是如此。从所述叶片的两个不同部位，枯萎的和健康的部位取表皮条。所述气孔孔度的平均值是用20个不同气孔测定的。枯萎部位的气孔孔度(3．2μM±0．32)比健康部位的气孔孔度(1．6μM±0．17)更大一些。例35转化植物以便超量表达SYR蛋白

    将SYR基因克隆到转化载体pSLJ 75516上35S启动子的后面(参见瞬时转化方法)，得到pTSS。pTSS是四环素(Tc)抗性的，它含有有义方向的SYR基因，位于强的组成型35 S启动子后面，该基因后面是终止子nos。pTSS的tDNA还含有能产生对膦丝菌素(PPT)的抗性的BASTA抗性基因，该基因能够选择tDNA转化的烟草植物。将质粒pTSS转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中，该菌株是利福平(rif)抗性的，并且适用于转化烟草。转化是通过三亲转化进行的，使用pRK2013作为辅助质粒。通过在70％乙醇中处理1分钟对烟草种子进行消毒，然后在无菌水中洗涤1分钟并在含有0．1％(v／v)Tween的50％家用漂白剂中培养3分钟，然后在无菌水中洗涤5次5分钟。让所述种子在发芽培养基上发芽：1×MS(Murashige and Skoog)盐，20g／l蔗糖和0．05％(w／v)MES缓冲液pH5．7(用1M KOH调节)，将所述培养基煮沸然后添加0．3％(w／v)的植物凝胶。在25℃下培养装有所述种子的培养皿，给以16小时光照和8小时黑暗的周期。在选择条件下将含有pTTS的农杆菌菌株生长过夜(Tc(10mg／l)和rif(25mg／l))。通过离心(3000rpm，在台式离心机DenleyBR401)20分钟收集农杆菌细胞，并重新悬浮在0．85％(w／v)氯化钠中。在3-4周之后选择成熟的但完全绿色的健康烟草植物叶片，并切一块大约1平方厘米的小块进行转化，对所述组织进行创伤并倒放在装有植物再生培养基的培养皿上(1×MS盐，20g／l蔗糖，0．05％(w／v)MES缓冲液pH5．7(用1M KOH调节)，0．3％植物凝胶，并且在对该培养基进行高压灭菌之后，添加来自1000倍母液的植物激素：0．2mg／l萘乙酸(NAA)和2mg／l苄基氨基嘌呤(BA))。将所述叶片浸入农杆菌属溶液(同时避免过分的浸泡)中，然后吸印到滤纸上，并重新转移到再生培养基上，进行选择：2 mg／l林丝菌素(PPT)(用于选择含有pTTS的TDNA的转化体)和100 mg／l奥格门汀(用于杀死农杆菌)。处于该阶段的组织在25℃下培养，给以16小时光照和8小时黑暗的周期，直到产生芽。将所述芽转移到根诱导培养基(1×MS盐，0．05％(w／v)，10g／l蔗糖，MES pH5．7(用1M KOH调节)和1mg／lPPT，用于避免缺少了芽再生阶段而长根)上，并再次在25℃下培养并给予16小时光照和8小时黑暗的周期。当根现出(大约1厘米)时，将小植株尽快地转移到土壤中，并在温室条件下的高湿度中生长。培养基：发芽培养基：

    1×MS(Murashige and Skoog)盐

    20g／l蔗糖

    0．05％(w／v)MES缓冲液pH5．7(用1M KOH调节)，将培养基煮沸

    然后添加0．3％(w／v)植物凝胶再生培养基：

    1×MS盐

    20g／l蔗糖

    0．05％(w／v)MES缓冲液pH5．7(用1M KOH调节)

    在对所述培养基进行高压灭菌之后添加0．3％的植物凝胶，添加来自1000×母液的植物激素：0．2mg／l萘乙酸(NAA)和2mg／l苄基氨基嘌呤(BA)。根诱导：

    1×MS盐

    10g／l蔗糖

    0．05％(w／v)MES pH5．7(用1M KOH调节)，1mg／l PPT转化的植物

    通过Western印迹分析证实，超量表达有义植物中的Nt-SYR含量得到提高。超量表达能加强对ABA的敏感性(能够对诸如突然的霜冻或周期性的干旱胁迫的短期胁迫提供保护)。优选是定向的。

    反义植物表现出多效表型，在转化体中的大约10％中观察到该表型。由于用有义结构转化的成功率(分离到超过两打独立的转化体)高于反义转化体的(≥20个植物，但它们都源于两个独立的转化现象)，我们怀疑大多数的反义转化是致死型的，并且仅有最不严重的(和／或不稳定的)形式能存活。

    在放大镜水平上通过叶片形态的总体变形对反义植物的鉴定表型进行鉴定，包括组织的总体厚度和叶片膨胀的严重减弱，植物的矮化和不育性。在极端情况下，叶片看上去像深绿色的条，具有纵脉而没有叶片的横向膨胀。在显微镜水平上，叶绿素表现出较差的分化，在某些部位具有异常的膨胀，而在其它部位过度生长。在保卫细胞的表层和表皮细胞中出现了处于各种阶段的异常发育。经常会出现单个的保卫细胞而不是成对的(在正常情况下有成对的保卫细胞环绕气孔)。很多保卫细胞表现出异常膨胀，对于准正常的保卫细胞来说，大约比野生型大50％。对这些细胞的分离通道的电学分析证实对ABA敏感性的不同程度的丧失(大约为正常反应的40％对完全丧失敏感性)。不过，由于形态特征的改变，我们在此时不能确定后一种结果是否是异常发育程序的结果而不是生理学变化。根据BotN／C和Sp2试验怀疑有一种直接的生理学作用，并且我们希望通过用正在制备中的诱导型启动子转化体进行的研究证实上述结论(见下文)。诱导方法还可以为我们提供对超量表达效应的控制。通过免疫金标记定位

    还在电子显微镜水平上用抗Nt-SYR的多克隆抗血清(在兔子体内用Sp2肽制备)，和纯化的抗体(纯化是用Sp2-亲和素完成的)分析了Nt-SYR的定位。在对照试验中，使用了同一只兔子的预先免疫的血清(血清取自在对兔子注射Sp2之前)。另一个对照试验包括在标记之前通过抗原(Sp2)对抗血清或抗体进行预吸收。这样，从组织部分滴定了特定的抗体-抗原相互作用。

    固定野生型和超量表达烟草植物的叶片，并用LR White或环氧树脂包埋。用两种树脂观察到了相似的图象，不过用环氧树脂可以检测到较低的背景和更详细的分析。大部分的超薄切片是用切片机在金网格上切成的，将所述网格用于预杂交(2％BSA)30分钟，在4℃下与1／200的血清或1／5的纯化抗体杂交过夜。第二次杂交是用市售与金颗粒(10nm)缀合的抗兔血清的抗体进行的。用一台电子显微镜可以检测所述金颗粒的电子密集点。最终的结果表现出所述抗体与质膜的相关性，因为在用抗原对抗血清或抗体进行预吸收时所述斑点消失。在与免疫前血清杂交的样品中，在质膜区统计到较少的点，不过在诸如细胞质和叶绿体的其它部位仍然具有某些标记。来自有义植物的切片在标记物含量方面与野生型有较大的提高：在质膜中，在细胞质和叶绿体中。质膜中点的数量大约为野生型切片中质膜中点的两倍。诱导型转化体

    用三种系统制备结构。两种诱导型启动子基于哺乳动物地塞米松-敏感型启动子，该启动子在接触地塞米松时被激活。其中之一获自N．-H．Chua(植物杂志(1997)11：605)。第二种包括位于地塞米松启动子后面的多个四环素抑制因子，因此在启动之后可以通过四环素关闭该启动子。该结构获自Christiane Gatz(Goettiegen：植物杂志(1992)2：397)。另一种启动子获自Andy Greenland(Zeneca)，该启动子是由乙醇激活的(自然生物技术(1998)16：177)。所述结构都是被设计用于表达下列物质之一的：(1)截短的蛋白Sp2，(2)反义序列，和(3)完整的Nt-Syr蛋白。(1)和(2)能够控制Nt-Syr功能的消除。很明显，(3)可导致对过量表达的控制。

    序列表(1)一般资料：(ⅰ)申请人：(A)名称：PLANT BIOSCIENCE LIMITED

    (B)街道：COLNEY LANE

    (C)城市：NORWICH

    (D)州：NORFOLK

    (E)国家：英国

    (F)邮编：NR4 7UH(ⅱ)发明名称：参与脱落酸信号过程的蛋白质(ⅲ)序列数：5(ⅳ)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容

    (C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1．0，Version#1．25(EPO)(2)序列1资料：(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1205个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑结构：线形(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅸ)特征

    (A)名称／键：CDS

    (B)位置：18．．917(ⅹⅰ)序列描述：序列1：CCAAATCCCA TCTCAAA ATG AAT GAT CTA TTT TCA GGA TCT TTC TCT CGT           50

                   Met Asn Asp Leu Phe SeR Gly Ser Phe Ser Arg

                     1               5                  10TTC AGA GCT GAC GAT CAA TCG GAC TCT CAC GCC ATA GAA ATG GGA GAC          98Phe Arg Ala Asp Asp Gln Ser Asp Ser His Ala Ile Glu Met Gly Asp

             15                  20                  25ATT ACT GGC GGA GTC AAT CTC GAC AAA TTC TTC GAA GAT GTT GAA GCC          146Ile Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Lys Phe Phe Glu Asp Val Glu Ala

         30                  35                  40ATT AAA GAC GAA CTC AAA GGC CTC GAG AAA ATC TAT TCC CAA CTC CAA          194Ile Lys Asp Glu Leu Lys Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Gln Leu Gln

     45                  50                  55TCT TCC CAT GAA AAA AGC AAG ACT CTT CAC AAC GCT AAA GCC GTT AAA          242Ser Ser His Glu Lys Ser Lys Thr Leu His Asn Ala Lys Ala Val Lys 60                  65                  70                  75GAT CTA AGA TCC AAC ATG GAT AAT GAC GTT TCC ATG GCA TTG AAG AAA          290Aap Leu Arg Ser Asn Met Asp Asn Asp Val Ser Met Ala Leu Lys Lys

                  80                 85              90GCC AAA TTC ATC AAA GTT CGT CTC GAA GCC TTA GAC AGA TCA AAT GCA          338Ala Lys Phe Ile Lys Val Arg Leu Glu Ala Leu Asp Arg Ser ASn Ala

             95                 100                 105GCG AAT CGA AGC CTC CCT GGA TGT GGA CCC GGA AGT TCA TCT GAC AGG          386Ala Asn Arg Ser Leu Pro Gly Cys Gly Pro Gly Ser Ser Ser Asp Arg

        110                 115                 120ACG AGA ACT TCA GTT GTG AAC GGA TTA AGG AAG AAA CTT CAA GAG TCA          434Thr Arg Thr Ser Val Val Asn Gly Leu Arg Lys Lys Leu Gln Glu Ser

    125                 130                 135ATG AAT CAG TTC AAC GAG CTA AGG CAA AAG ATG GCA TCT GAA TAT AGG          482Met Asn Gln Phe Asn Glu Leu Arg Gln Lys Met Ala Ser Glu Tyr Arg140                 145                 150                 155GAA ACA GTT CAA CGA CGA TAT TAT ACC GTC ACA GGA GAA AAT CCT GAT          530Glu Thr Val Gln Arg Arg Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Glu Asn Pro Asp

                160                 165                 170GAA GCA GTT CTT GAT ACA CTC ATA TCT ACA GGT CAA AGT GAG ACG TTC          578Glu Ala Val Leu Asp Thr Leu Ile Ser Thr Gly Gln Ser Glu Thr Phe

            175                 180                 185TTG CAA AAG GCA ATT CAA GAG CAA GGG AGA GGA CAA GTG ATG GAT ACA          626Leu Gln Lys Ala Ile Gln Glu Gln Gly Arg Gly Gln Val Met Asp Thr

        190                 195                 200GTT ATG GAA ATT CAA GAA AGG CAT GAA GCT GTG AAG GAA TTG GAG AGG          674Val Met Glu Ile Gln Glu Arg His Glu Ala Val Lys Glu Leu Glu Arg

    205                 210                 215AAT TTG AAA GAA TTG CAT CAA GTA TTC TTG GAC ATG GCT GTT TTG GTT          722Asn Leu Lys Glu Leu His Gln Val Phe Leu Asp Met Ala Val Leu Val220                 225                 230                 235GAA AGT CAA GGA GCT CAA CTT GAT GAT ATT GAG AGC CAA GTG AAT AGG        770Glu Ser Gln Gly Ala Gln Leu Asp Asp Ile Glu Ser Gln Val Asn Arg

                240                 245                 250GCT AAT TCC TTC GTT AGA GGG GGT GCT CAG CAA CTG CAA GTG GCA AGG        818Ala Asn Ser Phe Val Arg Gly Gly Ala Gln Gln Leu Gln Val Ala Arg

            255                 260                 265AAG CAC CAG AAG AAC ACT AGA AAA TGG ACT TGT TTT GCT ATT ATT CTT        866Lys His Gln Lys Asn Thr Arg Lys Trp Thr Cys Phe Ala Ile Ile Leu

        270                 275                 280CTG CTT ATC ATC ATT TTG GTG GTG GTT CTT TCT ATT CAG CCA TGG AAA        914Leu Leu Ile Ile Ile Leu Val Val Val Leu Ser Ile Gln Pro Trp Lys

    285                 290                 295AAA TGAGAATTTG TCTATGGTCA AAGGTCTTCT GGTGGACCCC TTCAATGTTT             967Lys300TGAATATTCT AAATTTTTAT ATTTTATTAT TTTAGCCATG CTTATTATTT TGTGTTATTT      1027TGGATTTTTT TTTTGTTTTT AATGTGGGGA AGAGTAAACT GGATGGGGGT CCATGTGCTA      1087TTTAGAGAAA TACTTGGGAG TTCTCTTTTT GTAATTATTG CTGTATTTAG AGTATAATTC      1147TTTTTCTATA TTGTTGGCAG GTTAATTTGT TTGTTTGATT ATATTCTCAT TTAGATTT        1205(2)序列2资料：

    (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：300个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线形

    (ⅱ)分子类型：蛋白

    (ⅹⅰ)序列描述：序列2：Met Asn Asp Leu Phe Ser Gly Ser Phe Ser Arg Phe Arg Ala Asp Asp  1               5                  10                  1Gln Ser Asp Ser His Ala Ile Glu Met Gly Asp Ile Thr Gly Gly Val

             20                  25                  30Asn Leu Asp Lys Phe Phe Glu Asp Val Glu Ala Ile Lys Asp Glu Leu

         35                  40                  45Lys Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Gln Leu Gln Ser Ser His Glu Lys

     50                  55                  60Ser Lys Thr Leu His Asn Ala Lys Ala Val Lys Asp Leu Arg Ser Asn 65                  70                  75                  80Met Asp Asn Asp Val Ser Met Ala Leu Lys Lys Ala Lys Phe Ile Lys

                 85                  90                  95Val Arg Leu Glu Ala Leu Asp Arg Ser Asn Ala Ala Asn Arg Ser Leu

            100                 105                 110Pro Gly Cys Gly Pro Gly Ser Ser Ser Asp Arg Thr Arg Thr Ser Val

        115             120             125Val Asn Gly Leu Arg Lys Lys Leu Gln Glu Ser Met Asn Gln Phe Asn

    130                 135                 140Glu Leu Arg Gln Lys Met Ala Ser Glu Tyr Arg Glu Thr Val Gln Arg145                 150                 155                 160Arg Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Glu Asn Pro Asp Glu Ala Val Leu Asp

                165                 170                 175Thr Leu Ile Ser Thr Gly Gln Ser Glu Thr Phe Leu Gln Lys Ala Ile

            180                 185                 190Gln Glu Gln Gly Arg Gly Gln Val Met Asp Thr Val Met Glu Ile Gln

        195                 200                 205Glu Arg His Glu Ala Val Lys Glu Leu Glu Arg Asn Leu Lys Glu Leu

    210                 215                 220His Gln Val Phe Leu Asp Met Ala Val Leu Val Glu Ser Gln Gly Ala225                 230                 235                 240Gln Leu Asp Asp Ile Glu Ser Gln Val Asn Arg Ala Asn Ser Phe Val

                245                 250                 255Arg Gly Gly Ala Gln Gln Leu Gln Val Ala Arg Lys His Gln Lys Asn

            260                 265                 270Thr Arg Lys Trp Thr Cys Phe Ala lle Ile Leu Leu Leu Ile Ile Ile

        275                 280                 285Leu Val Val Val Leu Ser Ile Gln Pro Trp Lys Lys

    290                 295                 300(2)序列3资料：(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1334个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑结构：线形(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅸ)特征(A)名称／键：CDS

    (B)位置：77．．991(ⅹⅰ)序列描述：序列3：GAATTCCTCG AGCTACGTCA GGGATTCATT CCGATCTGAA ATCTCTCTCT AGATTTCTCT       60ATTTTTCGAA TTTTAA ATG AAC GAT TTG TTT TCC AGC TCA TTC TCT CGC           109

                  Met Asn Asp Leu Phe Ser Ser Ser Phe Ser Arg

                    1               5                  10TTC CGC AGC GGA GAA CCA TCC CCT CGC CGA GAC GTT GCC GGC GGT GGC         157Phe Arg Ser Gly Glu Pro Ser Pro Arg Arg Asp Val Ala Gly Gly Gly

             15                  20                  25GAC GGA GTT CAG ATG GCG AAT CCC GCG GGA TCA ACC GGT GGT GTG AAC         205Asp Gly Val Gln Met Ala Asn Pro Ala Gly Ser Thr Gly Gly Val Asn

         30                  35                  40CTC GAC AAG TTC TTC GAA GAT GTT GAA TCT GTG AAA GAA GAG CTA AAG         253Leu Asp Lys Phe Phe Glu Asp Val Glu Ser Val Lys Glu Glu Leu Lys

     45                  50                  55GAG CTA GAT CGG CTC AAC GAA ACA CTC TCT TCA TGT CAC GAG CAG AGC         301Glu Leu Asp Arg Leu Asn Glu Thr Leu Ser Ser Cys His Glu Gln Ser 60                  65                  70                  75AAG ACG CTT CAC AAT GCT AAA GCC GTT AAA GAT CTC CGG TCT AAA ATG         349Lys Thr Leu His Asn Ala Lys Ala Val Lys Asp Leu Arg Ser Lys Met

                 80                  85                  90GAC GGT GAC GTT GGA GTC GCG TTG AAG AAG GCG AAG ATG ATT AAA GTT         397Asp Gly Asp Val Gly Val Ala Leu Lys Lys Ala Lys Met Ile Lys Val

             95                 100                 105AAA CTC GAG GCG CTA GAT CGT GCC AAT GCT GCT AAT CGG AGT CTC CCT         445Lys Leu Glu Ala Leu Asp Arg Ala Asn Ala Ala Asn Arg Ser Leu Pro

        110                 115                 120GGC TGT GGA CCT GGT TCT TCC TCC GAT CGA ACC AGG ACC TCT GTC CTC         493Gly Cys Gly Pro Gly Ser Ser Ser Asp Arg Thr Arg Thr Ser Val Leu

    125                 130                 135AAT GGT CTC AGG AAG AAA TTG ATG GAC TCT ATG GAT AGT TTC AAC CGA         541Asn Gly Leu Arg Lys Lys Leu Met Asp Ser Met Asp Ser Phe Asn Arg140                 145                 150                 155TTG AGG GAG CTT ATC TCG TCC GAG TAT AGA GAA ACT GTA CAG AGG AGG         589Leu Arg Glu Leu Ile Ser Ser Glu Tyr Arg Glu Thr Val Gln Arg Arg

                160                 165                 170TAC TTC ACC GTC ACC GGC GAG AAT CCG GAT GAA CGA ACC CTA GAT CGA         637Tyr Phe Thr Val Thr Gly Glu Asn Pro Asp Glu Arg Thr Leu Asp Arg

            175                 180                 185CTG ATT TCC ACT GGA GAG AGT GAG AGA TTC TTG CAG AAA GCA ATA CAA         685Leu Ile Ser Thr Gly Glu Ser Glu Arg Phe Leu Gln Lys Ala Ile Gln

        190                 195                 200GAA CAA GGA AGA GGA AGG GTG TTA GAC ACC ATT AAC GAG ATT CAA GAA         733Glu Gln Gly Arg Gly Arg Val Leu Asp Thr Ile Asn Glu Ile Gln Glu

    205                 210                 215AGG CAT GAT GCG GTT AAA GAC ATT GAG AAG AAT CTC AGG GAG CTT CAC         781Arg His Asp Ala Val Lys Asp Ile Glu Lys Asn Leu Arg Glu Leu His220                 225                 230                 235CAG GTG TTT CTA GAC ATG GCC GTG CTG GTA GAG CAC CAG GGA GCT CAG      829Gln Val Phe Leu Asp Met Ala Val Leu Val Glu His Gln Gly Ala Gln

                240                 245                 250CTT GAT GAC ATC GAG AGT CAT GTG GGT CGA GCT AGC TCC TTT ATC AGA      877Leu Asp Asp Ile Glu Ser His Val Gly Arg Ala Ser Ser Phe Ile Arg

            255                 260                 265GGC GGA ACT GAC CAG CTA CAA ACC GCT CGG GTT TAC CAG AAG AAC ACG      925Gly Gly Thr Asp Gln Leu Gln Thr Ala Arg Val Tyr Gln Lys Asn Thr

        270                 275                 280CGA AAA TGG ACA TGT ATT GCC ATT ATT ATT CTC ATC ATC ATC ATA ACT      973Arg Lys Trp Thr Cys Ile Ala Ile Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Thr

    285                 290                 295GTT GTG GTT CTT GCT GTT TTAAAACCGT GGAACAACAG CAGTGGCGGC             1021Val Val Val Leu Ala Val300                 305GGCGGCGGTG GTGGTGGTGG GGGTACCACT GGAGGAAGTC AACCAAATTC AGGGACACCA    1081CCAAATCCTC CTCAGGCAAG GCGTCTATTG CGTTGAAGTT GAAGTTGAAG TTGAGTTTCG    1141TTATTTGCAT ATATATTCTT TCTTTGAAAA ACCTTATTAT CAAACCAGCT TTGTGTTACT    1201ACTTTCTACT GCTGGTTTGT TGTTAATCTC CCGTTTATTT GGTTTTTGTG AAAGAATTTA    1261AAATGTGGGT TAGATGAGAA AATTAGTACA ACATTCTCTT GTATCTATGT TTGCTACCCT    1321GACGTAGCTC GAG                                                       1334(2)序列4资料：

    (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线形

    (ⅱ)分子类型：蛋白

    (ⅹⅰ)序列描述：序列4：Met Asn Asp Leu Phe Ser Ser Ser Phe Ser Arg Phe Arg Ser Gly Glu  1               5                  10                  15Pro Ser Pro Arg Arg Asp Val Ala Gly Gly Gly Asp Gly Val Gln Met

             20                  25                  30Ala Asn Pro Ala Gly Ser Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Lys Phe Phe

         35                  40                  45Glu Asp Val Glu Ser Val Lys Glu Glu Leu Lys Glu Leu Asp Arg Leu

     50                  55                  60Asn Glu Thr Leu Ser Ser Cys His Glu Gln Ser Lys Thr Leu His Asn 65                  70                  75                          80Ala Lys Ala Val Lys Asp Leu Arg Ser Lys Met Asp Gly Asp Val Gly

                 85                  90                  95Val Ala Leu Lys Lys Ala Lys Met Ile Lys Val Lys Leu Glu Ala Leu

            100                 105                 110Asp Arg Ala Asn Ala Ala Asn Arg Ser Leu Pro Gly Cys Gly Pro Gly

        115                 120                 125Ser Ser Ser Asp Arg Thr Arg Thr Ser Val Leu Asn Gly Leu Arg Lys

    130                 135                 140Lys Leu Met Asp Ser Met Asp Ser Phe Asn Arg Leu Arg Glu Leu Ile145                 150                 155                 160Ser Ser Glu Tyr Arg Glu Thr Val Gln Arg Arg Tyr Phe Thr Val Thr

                165                 170                 175Gly Glu Asn Pro Asp Glu Arg Thr Leu Asp Arg Leu Ile Ser Thr Gly

            180                 185                 190Glu Ser Glu Arg Phe Leu Gln Lys Ala Ile Gln Glu Gln Gly Arg Gly

        195                 200                 205Arg Val Leu Asp Thr Ile Asn Glu Ile Gln Glu Arg His Asp Ala Val

    210                 215                 220Lys Asp Ile Glu Lys Asn Leu Arg Glu Leu His Gln Val Phe Leu Asp225                 230                 235                 240Met Ala Val Leu Val Glu His Gln Gly Ala Gln Teu Asp Asp Ile Glu

                245                 250                 255Ser His Val Gly Arg Ala Ser Ser Phe Ile Arg Gly Gly Thr Asp Gln

            260                 265                 270Leu Gln Thr Ala Arg Val Tyr Gln Lys Asn Thr Arg Lys Trp Thr Cys

        275                 280                 285Ile Ala Ile Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Thr Val Val Val Leu Ala

    290                 295                 300Val305序列5：TTTAGATTTACTCTTATATTAGTTTGTTTGTTTAATTGGACGGTTGTTATATCTTTTTCTTAATATGAGATTTATGTCGTTATTAATGTTTTTCTCTTGAGGGTTCATAAAGAGATTTATCGTGTACCTGGGGGTAGGTCAAATGAGAAGGGGTGTAATTTTTGTTTTTTTTTTAGGTTTTATTGTGTTTTATTATTCGTACCGATTTTATTATTTTATATTTTTAAATCTTATAAGTTTTGTAACTTCCCCAGGTGGTCTTCTGGAAACTGGTATCTGTTTAAGAGTAAAAAAGGTACCGACTTATCTTTCTTGGTGGTGGTTTTACTACTATTCGTCTTCTTATTATCGTTTTGTTCAGGTAAAAGATCACAAGAAGACCACGAAGGAACGGTGAACGTCAACGACTCGTGGGGGAGATTGCTTCCTTAATCGGGATAAGTGAACCGAGAGTTATAGTAGTTCAACTCGAGGAACTGAAAGTTGGTTTTGTCGGTACAGGTTCTTATGAACTACGTTAAGAAAGTTTAAGGAGAGGTTAAGGAAGTGTCGAAGTACGGAAAGAACTTAAAGGTATTGACATAGGTAGTGAACAGGAGAGGGAACGAGAACTTAACGGAAAACGTTCTTGCAGAGTGAAACTGGACATCTATACTCACATAGTTCTTGACGAAGTAGTCCTAAAAGAGGACACTGCCATATTATAGCAGCAACTTGACAAAGGGATATAAGTCTACGGTAGAAAACGGAATCGAGCAACTTGACTAAGTAACTGAGAACTTCAAAGAAGGAATTAGGCAAGTGTTGACTTCAAGAGCAGGACAGTCTACTTGAAGGCCCAGGTGTAGGTCCCTCCGAAGCTAAGCGACGTAAACTAGACAGATTCCGAAGCTCTGCTTGAAACTACTTAAACCGAAAGAAGTTACGGTACCTTTGCAGTAATAGGTACAACCTAGAATCTAGAAATTGCCGAAATCGCAACACTTCTCAGAACGAAAAAAGTACCCTTCTAACCTCAACCCTTATCTAAAAGAGCTCCGGAAACTCAAGCAGAAATTACCGAAGTTGTAGAAGCTTCTTAAACAGCTCTAACTGAGGCGGTCATTACAGAGGGTAAAGATACCGCACTCTCAGGCTAACTAGCAGTCGAGACTTTGCTCTCTTTCTAGGACTTTTATCTAGTAAGTAAAACTCTACCCTAAACC